$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все эксперименты с Caenorhabditis elegans проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных организмов Пекинского педагогического университета.
Рисунок 1: Обзор эндогенного флуоресцентного метирования, опосредованного CRISPR/Cas9, у C. elegans. Схематический рабочий процесс, иллюстрирующий основные этапы генерации и валидации эндогенного флуоресцентного knock-in. На этапе проектирования и создания выбираются ген-мишень, обогащённые зародышевой линией, и место вставки, pDD162 используется в качестве плазмиды CRISPR/Cas9 для экспрессии Cas9 и направляющей экспрессию РНК, а pPD95.75 — как донорский картенок, в который субклонируются флуоресцентная метка (например, GFP) и левая и правая гомологические руки. На этапе микроинъекции инъекционная смесь CRISPR/Cas9 (включая плазмиду gRNA/Cas9, донорский шаблон и маркеры совместной инъекции) вводится в гонаду молодых взрослых гермафродитов, после чего происходит извлечение на засеянных пластинах. На этапе валидации отбираются маркерно-положительные потомки для дальнейшего генотипирования, включая идентификацию событий knock-in с помощью ПЦР и подтверждение с помощью секвенирования ДНК, а успешные линии knock-in затем исследуются флуоресцентной микроскопией для оценки экспрессии зародышевой линии и субклеточной локализации маркированного белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
1. Выберите ген-мишень, обогащённый зародышевой линией
- Идентифицировать кандидат-гены с преобладающей экспрессией в гонаде или герминальных клетках с помощью публичных баз данных и опубликованной литературы.
- Выберите подходящий сайт для маркировки, исходя из признаков белка. Запишите выбранную изоформу и позицию вставки метки для дальнейшего проектирования направляющей РНК и шаблона донора (рисунок 1).
2. Разработайте шаблон РНК и донора
- Определите последовательность направляющей РНК (gRNA) размером 20 нт выше соседнего мотива протоспейсера (PAM; NGG), последовательности, необходимой для распознавания Cas9, и разместить её как можно ближе к месту вставки тега.
- Оценить кандидатные gRNA с помощью онлайн-инструмента проектирования (например, инструмента проектирования IDT CRISPR) с выбранным геномом C. elegans. Выберите руководство с высокой прогнозируемой эффективностью резки в цель и отсутствием высокорисковых нецелевых участков.
- Клонируйте последовательность gRNA в область между промотором U6 и гРНК-каркасом внутри плазмидного каркаста экспрессии CRISPR.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проектные праймеры включают последовательность gRNA в виде навесов. Выполнить амплификацию ПЦР, а затем сборку на основе гомологичной рекомбинации — метод клонирования, независимый от лигации, который исключает расщепление ферментов рестрикции и позволяет одноступенчатое клонирование напрямую в экспрессионныйвектор 15.
- Подтвердите правильную вставку с помощью секвенирования Сэнгера.
- Сконструировать донорскую плазмиду с помощью флуоресцентной метки, окружённой примерно 1 000 ударных пор слева и 1 000 ударных пор правой гомологии, полученной из целевого локуса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Амплифицируйте гомологические руки из геномной ДНК N2, подготовленной в виде лизата червя с использованием пищеварения протеиназы K. Проектные праймеры с 15–20 п.п. перекрываются с линеаризованным векторным и флуоресцентным меткой. Соберите гомологические руки и подключите их к позвоночнику посредством гомологичной рекомбинации в одной реакции. Вставьте флуоресцентную метку сразу после стартового кодона ATG для маркировки N-терминала или перед стоп-кодом для маркировки C-терминала. Включите линкерную последовательность между целевой геном и флуоресцентной меткой для поддержания правильного сворачивания и функции белка. Используйте линкер для снижения стерических помех между партнёрами по слиянию и убедитесь, что и линкер, и тег вставлены в кадр вместе с последовательностью кодирования. Тщательно выбирайте место вставки, чтобы не нарушать известные или предсказанные функциональные домены, сигнальные пептиды или трансмембранные области (Дополнительный файл 1).
- Вводите тихие замещения в донорскую гомологичную шаблонную последовательность для нарушения PAM или связывающей последовательности с направляющим без изменения белковой последовательности и предотвращения повторного удаления Cas9 после интеграции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включите синонимические точечные мутации в праймеры, используемые для амплификации гомологической руки, нацеленные на кодоны в области PAM.
- Подтвердите целостность донорской последовательности как в гомологических рукавах, так и на меченых соединениях с помощью секвенирования Сэнгера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните подтверждённые плазмиды при −20 °C для краткосрочного хранения или при −80 °C для длительного хранения.
3. Приготовьте инъекционную смесь
- Собрать инъекционную смесь, объединив плазмиду экспрессии CRISPR, донорскую плазмиду (построенную на основе pPD95.75) и маркеры для совместной инъекции в стерильном ddH₂O до конечного объёма 10 мкл при концентрациях, указанных в Таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически оптимизируйте концентрации для баланса читаемости маркеров, восстановления кандидатов и выживаемости после инъекции.
- Центрифугуйте инъекционную смесь при 10 000 × г в течение 10–20 минут, чтобы гранулировать частицы и предотвратить закупорку капилляра микроинжекции.
| Компонент | Функция | Рабочая концентрация (ng/μL) |
| pDD162 | Плазмида CRISPR/Cas9 (экспрессия Cas9 и gRNA) | 50-100 |
| Донорская плазмида (позвоночник pPD95.75) | Шаблон донора HDR с флуоресцентной меткой, по бокам которой расположены гомологические руки размером ~1 кб | 50-100 |
| pRF4 | Маркер ко-инъекции (фенотип ролика) | 50-100 |
| pPD122.11 | Маркер ко-инъекции (экспрессия GFP) | 5-10 |
| СтерильныйddH 2O | Довести к финальному тому | – |
Таблица 1: Состав инжекционной смеси и функции плазмид. Инъекционная смесь содержит плазмиду CRISPR экспрессии, донорную плазмиду, pRF4 и pPD122.11 в указанных концентрациях, что обеспечивает общий объём 10 мкл.
4. Загрузить и подготовить иглу для инъекции
- Втягивайте стеклянные капилляры в микроинъекционные иглы с помощью иголочного вытягивателя, настроенного на длинный конус с острым концем, подходящим для гонадных инъекций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте параметры пуллера эмпирически. Примеры начальных параметров: тепло = 540, натяжение = 20, скорость = 100.
ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с вытянутыми иглами аккуратно, чтобы избежать проколов. Используйте щипцы при работе с иглами и утилизируйте использованные иглы в контейнере для острого изделия.
- Нагрейте микрокапиллярную пипетку и разломите её на две части, чтобы создать инструмент для загрузки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие насадки для загрузки могут использоваться в качестве альтернативы.
- Прикрепите резиновую лампу аспиратора к широкому концу укороченной микрокапиллярной пипетки.
- Аспирировать примерно 1 мкл очищенной инъекционной смеси супернатант в погрузчик.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точная объёмность не критична. Убедитесь, что раствор заполняет кончик иглы.
- Вставьте загрузчик в заднюю часть иглы и аккуратно раздайте смесь для инъекций.
- Поставьте загруженную иглу горизонтально на 10 минут, чтобы раствор оседл ближе к кончику и подтвердил непрерывную колонку.
- Закрепите иглу на инъекционном микроскопе и приведите кончик в фокус с помощью яркой оптики.
- Откройте кончик иглы, аккуратно коснувшись его краем накладки в галоуглеродном масле, и проверьте поток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулировать давление впрыска (30–80 psi), чтобы получить пузырь, примерно равный диаметру гонады, в пределах 1с 16.
5. Подготовьте червей к инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте пластины для среды роста нематод (NGM) и буфер M9, как было описановыше 17. Содержать червей на пластинах, засеянных Escherichia coli OP50 (далее OP50), и проводить инъекции на фоне N2.
- Отбирайте гермафродитов L4 из здоровой пластины и инкубируют при 20 °C в течение 10 часов, чтобы получить молодых взрослых людей с хорошо развитыми зародышевой линиями.
- Перенесите червей на незасеянную пластину, чтобы уменьшить перенос бактерий.
- Подготовьте сухую 2% агарозу на стеклянном стекле и нанесите каплю галоуглеродного масла.
- Перенесите червяка на подушечку агарозы с помощью щипателя ресниц.
- Обездвижите червя и ориентируйте гонаду для инъекции.
ВНИМАНИЕ: Завершите инъекции в течение 20–30 минут, чтобы предотвратить высыхание.
6. Проведите микроинъекцию гонады
Рисунок 2: Локализация синцития дистальной гонады для микроинъекции у молодых взрослых C. elegans hermaphrodites. (A) Изображение с низким увеличением смонтированного молодого взрослого гермафродита. Видны обе гонады; Место инъекции указано для одной руки (стрелка) в качестве примера. Коробчатая область отмечает область, показанную при большем увеличении в панели B. (B) Вид дистальной гонады с большим увеличением DIC в панели A. Стрелка показывает положение инъекции в дистальной гонадальной синцитии, куда подаётся инъекционная смесь. Шкалы: 100 мкм (A) и 20 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
- Найдите обездвиженного червя и идентифицируйте гонаду с помощью объекта с низким увеличением.
- Поместите иглу с помощью микроманипуляторных органов управления.
- Ориентируйте червя под углом 20–40° относительно иглы.
- Сосредоточьтесь на дистальной зародышевой линии с помощью увеличения.
- Продвигайте червя к игле и размещайте кончик внутри гонадального синцития (рисунок 2).
- Введите раствор и подтвердите появление по видимому отёку гонады.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизировать давление впрыска (30–80 psi), давление компенсации (0,1–0,5 psi) и длительность впрыска (0,1–0,3 с).
ВНИМАНИЕ: Избыточное давление или объём могут вызвать разрыв червя.
- Вынимите иглу и переместите её для последующих инъекций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните одностороннюю инъекцию для максимизации выживаемости или двустороннюю инъекцию для повышения эффективности редактирования.
- Добавьте буфер M9 для выпуска червей и перенесите каждого червя на отдельную пластину для восстановления.
- Повторные инъекции для 20–25 червей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замените иглу, если она засорится или повредится.
- Инкубировать введённых червей при 20 °C в течение 2–3 дней для восстановления.
7. Проверьте кандидатов F1 для выявления положительных линий
- Проводите скрининг потомства F1 на коинъекционные маркеры и выбирайте животных, положительных к маркерам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры альтернативных флуоресцентных маркеров для совместной инъекции с разной специфичностью тканей и спектральными свойствами приведены в Дополнительной таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте животных, экспрессирующих оба маркера, для повышения надёжности. Отдавайте приоритет выводкам с высокой частотой маркеров («jackpot broods»).
- Переложите каждого червя F1 на отдельную тарелку и дайте яйцам откладывать 1–2 дня.
- Лизируйте каждого червя F1 в буфере протеиназы K для подготовки ПЦР-шаблонов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте лизаты при −80 °C, если не перерабатываются сразу.
- Проведите ПЦР с переходом с использованием одного геномного праймера вне гомологического рукава и одного внутреннего праймера с меткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте соответствующие пластины животных с ПЦР-положительным F1.
8. Провести скрининг потомства F2 для выделения гомозиготных линий выбивания и подтверждения интеграции
- Изолировать потомство F2 из ПЦР-положительных линий F1 на отдельные пластины.
- Позволить червям F2 производить потомство и лизировать взрослых особей для генотипирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости храните лизаты при −20 °C.
- Проведите ПЦР с использованием праймеров, расположенных по бокам гомологических рукавов, чтобы различать аллели дикого типа и knock-in по размеру продукта.
- Подтвердите правильную интеграцию с помощью секвенирования Сэнгера по обоим вставленным соединениям.
- Проверьте экспрессию и локализацию зародышевой флуоресценции с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Расширяйте подтверждённые гомозиготные линии и поддерживайте запасы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Cryopreserve верифицировали линии для долгосрочного хранения.