Исследовательская статья

Влияние регуляции экспрессии SPRY2 и miR-590-5p на аутофагию в моделях хондроцитов остеоартрита человека

51 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70883

⸱

31 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Воспалительный стресс в модели хондроцита C28/I2, индуцированной IL-1β, увеличил уровень miR-590-5p и снизил экспрессию SPRY2. Модуляция этой оси изменила экспрессию Beclin-1, LC3-II и Bcl-2, что указывает на предполагаемый регуляторный путь miR-590-5p/SPRY2, который может влиять на аутофагические ответы и выживаемость хондроцитов при остеоартрите.

Аннотация

Остеоартрит (ОА) — это распространённое дегенеративное заболевание суставов, характеризующееся прогрессирующей разрушением хряща и потерей гомеостаза хондроцитов. Хотя дисрегулированная аутофагия способствует патогенезу остеофагии, молекулярные механизмы, управляющие ответами, ассоциированными с аутофагией, у хондроцитов остаются неполностью изучены. В этом исследовании изучалась роль регулирующей оси miR-590-5p/SPRY2 в воспалительной микросреде с использованием индуцированных IL-1β человеческих хондроцитов C28/I2. Модель ОА in vitro была создана путём обработки клеток C28/I2 IL-1β. Экспрессия miR-590-5p и SPRY2 была оценена с помощью количественного ПЦР и западного блотинга. Для оценки влияния SPRY2 и miR-590-5p на маркеры, связанные с аутофагией, Beclin-1 и LC3-II, а также на белок, связанный с выживаемостью, были использованы методы прироста и потери функций. Биоинформатический анализ и спасательные эксперименты были использованы для изучения регуляторной связи между miR-590-5p и SPRY2. Лечение IL-1β значительно увеличило экспрессию miR-590-5p, одновременно снижая уровень мРНК и белка SPRY2 (P < 0,05). Гиперэкспрессия SPRY2 заметно снизила экспрессию Beclin-1 и LC3-II, с уменьшением примерно на 65% и 77% соответственно (P < 0,05). В отличие от этого, гиперэкспрессия miR-590-5p увеличивала экспрессию Беклин-1, LC3-II и Bcl-2, тогда как ингибирование miR-590-5p отменяло эти эффекты и восстанавливает экспрессию SPRY2. Функциональные анализы подтвердили использование SPRY2 в качестве предполагаемой регуляторной цели miR-590-5p. Эти результаты определяют ось miR-590-5p/SPRY2 как важный регулятор экспрессии маркеров, ассоциированных с аутофагией, и выживаемости хондроцитов при воспалительных условиях и указывают на её потенциальную значимость как терапевтической цели при ОА.

Введение

Будучи самой распространённой формой артрита в мире, остеоартрит (ОА) является одной из ведущих причин боли, нарушения подвижности и физической инвалидности, возлагая значительную нагрузку на системы здравоохранения и общество1. Патологически ОА характеризуется прогрессирующей дегенерацией суставного хряща, воспалением синовиума и патологической ремоделировкой субхондральной кости1. Эпидемиологические оценки показывают, что примерно 303 миллиона человек по всему миру страдают от ОА, и ожидается, что это число будет расти с возрастом населения и ростом уровняожирения 2. В Китае распространённость симптоматического ОА колена оценивается в 8,1%, при этом непропорционально выше среди женщин и сельского населения3. Несмотря на высокую распространённость, текущие варианты лечения в основном ограничены лечением симптомов с помощью нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВС) и хирургического вмешательства при запущенномзаболевании 4. Отсутствие препаратов, модифицирующих заболевания для остеоартрита (DMOAD), отражает неполное понимание молекулярных механизмов, регулирующих гомеостаз и выживаемостьхондроцитов 5.

Структурная и функциональная целостность суставного хряща зависит от резидентных хондроцитов, которые поддерживают оборот внеклеточного матрикса (ЭКМ) через баланс между анаболической и катаболическойактивностью 6. Во время прогрессирования ОА хондроциты подвергаются воздействию аномального механического стресса и провоспалительных медиаторов, особенно интерлейкин-1β (IL-1β) и фактора некроза опухоли-α (TNF-α), которые способствуют переходу от синтеза матрикса к деградацииматрикса 6. IL-1 β способствует разрушению хряща, стимулируя выработку матриксных металлопротеиназ (MMPs) и аггреканаз, одновременно подавляя синтез коллагена типа II ипротеогликанов 7. Кроме того,IL-1 β вызывает окислительный стресс и дисфункцию митохондрий, что приводит к апоптозу хондроцитов и старению8. Следовательно, выявление внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих выживаемость хондроцитов при воспалительных условиях, остаётся приоритетом для исследований ОА.

Аутофагия — это эволюционно консервативный лизосомный путь деградации, который поддерживает клеточный гомеостаз за счёт удаления и переработки повреждённых органелл и белковыхагрегатов 9. Базальная аутофагия необходима для выживания клеток и энергетического баланса; однако дисрегулированная аутофагия может способствовать прогрессированиюболезни 9. При ОА аутофагия обычно рассматривается как защитный ответ, который помогает хондроцитам адаптироваться к клеточному стрессу и противостоятьапоптозу 10. Предыдущие исследования предполагали, что аутофагическая активность снижается при прогрессировании ОА, особенно на поздних стадиях заболевания, что приводит к нарушению контроля качества клеток и увеличению потерихондроцитов 11. В качестве индикаторов активности, связанной с аутофагией, часто используются несколько белков. Беклин-1 участвует в инициации аутофагосом, тогда как превращение белка 1, ассоциированного с микротрубочками, легкой цепи 3 (LC3-I) в LC3-II, широко используется как маркер формированияаутофагосом 12. В отличие от этого, B-клеточная лимфома 2 (Bcl-2) ингибирует аутофагию, зависящую от Беклин-1, одновременно оказывая антиапоптотическиеэффекты 13. Тем не менее, интерпретация маркеров, связанных с аутофагией, требует осторожности, поскольку статические измерения LC3-II и Beclin-1 не могут независимо независимо отличить усиленное формирование аутофагосом от нарушенной деградации лизосом. Несмотря на эти ограничения, модуляция путей, связанных с аутофагией, остаётся перспективной терапевтической стратегией при ОА.

МикроРНК (миРНК) — это короткие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционно, связываясь с комплементарными последовательностями в 3′-нетранслированных областях (3′-UTR) целевых мессенджерных РНК, что приводит к деградации мРНК или трансляционнойрепрессии 14. Экспрессия аберрантных миРНК участвует в патогенезе ОА через воздействие на воспаление, апоптоз и ремоделированиеЭКМ 15. Среди этих молекул miR-590-5p привлек внимание благодаря своей регуляторной роли в метаболизме костей и других патологических процессах. Предыдущие исследования показали, что miR-590-5p способствует остеогенной дифференцировке и подавляет адипогенез в мезенхимальных стволовыхклетках 16. В моделях рака miR-590-5p проявляет контекстно-зависимые функции как онкогенный или подавляющий опухолирегулятор 17. Кроме того, изменённые профили экспрессии микроРНК, включая представителей семейства miR-590, были связаны с патологическим ремоделированием тканей суставов во времяOA 18. Однако данные, полученные на основе моделей стволовых клеток или рака, нельзя напрямую экстраполировать на зрелые суставные хондроциты. Таким образом, роль miR-590-5p в регулировании ответов хондроцитов в воспалительном микроокружении ОА остаётся неполностью изученной.

Для изучения возможных дальнейших механизмов miR-590-5p в ОА были проведены анализы прогнозирования цели in silico , которые идентифицировали Sprouty2 (SPRY2) как предполагаемую дальнюю цель. SPRY2 относится к семейству белков Sprouty, которые негативно регулируют сигнализацию тирозинкиназы рецепторов и подавляют активацию пути RAS/MAPK/ERK 19. Поскольку сигнализация MAPK влияет на дифференцировку хондроцитов, воспалительные реакции и аутофагию, SPRY2 может представлять собой важный регуляторный узел в патофизиологииОА 20. Предыдущие исследования показывают, что SPRY2 может подавлять воспалительные реакции в моделях ревматоидногоартрита 21, участвовать в регуляции апоптоза в эпителиальныхсистемах 22 и связан с ответами, связанными с аутофагией, в моделях ишемическихповреждений 23. Хотя эти наблюдения свидетельствуют о том, что SPRY2 участвует в регуляции как апоптоза, так и аутофагии, его роль в суставных хондроцитах остаётся плохо изученной. Поэтому было выдвинуто гипотезу, что miR-590-5p и SPRY2 образуют регуляторную ось, влияющую на выживаемость хондроцитов при воспалительном стрессе.

На основе этих наблюдений было предложено, что miR-590-5p модулирует ответы, связанные с аутофагией, в хондроцитах путём регуляции экспрессии SPRY2. Хотя miR-590-5p и SPRY2 изучались отдельно в других биологических контекстах, их функциональная связь в хондроцитах ОА не установлена. В настоящем исследовании была использована модель ОА, индуцированная IL-1β, в человеческих хондроцитах C28/I2 для изучения паттернов экспрессии miR-590-5p и SPRY2, а также для оценки их влияния на экспрессию Beclin-1, LC3-II и Bcl-2. Исследуя регуляторную ось miR-590-5p/SPRY2, это исследование даёт представление об эпигенетических механизмах, лежащих в основе выживаемости хондроцитов, и выявляет потенциальную терапевтическую мишень для ОА.

Протокол

Это исследование проводилось исключительно с использованием коммерчески доступной линейки человеческих хондроцитных клеток C28/I2. В исследовании не участвовали люди, образцы человеческих тканей, материалы, полученные пациентами или живые животные. Поэтому одобрение Институционального совета по надзору (IRB) и Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) не требовалось в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями. Инструменты, химикаты, наборы и реагенты, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Построение клеточной культуры и модели ОА

Линия клеток человеческих хондроцитов C28/I2 (подробности приведены в Таблице материалов) была получена у коммерческого поставщика. Для обеспечения экспериментальной воспроизводимости клетки были аутентифицированы с помощью профилирования короткого тандемного повтора (STR) и регулярно тестировались для подтверждения отсутствия загрязнения микоплазмой. Для всех экспериментов использовались ячейки между проходами 3 и 8. Клетки содержались в DMEM с добавлением 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (все реагенты в культуре описаны в Таблице материалов) при 37 °C в увлажнённой атмосфере с 5%CO2.

Для установления модели остеоартрита in vitro (OA) клетки C28/I2 были стимулированы рекомбинантным человеческим IL-1β. Основываясь на устоявшейсялитературе 6,7, предварительных экспериментах по оптимизации дозы и ответа, направленных на индуцирование устойчивого катаболического состояния без чрезмерной немедленной цитотоксичности, клетки обрабатывались 20 нг/мл IL-1β в течение 24 часов.

2. Экспериментальная группировка и трансфекция

Для разъяснения механистических путей исследование было разделено на три основных экспериментальных модуля, каждый из которых содержал минимум три независимых биологических репликатов:

  1. Усиление/потеря функции SPRY2:
    Клетки были назначены на контрольную модель OA, OA + пустой вектор (NC), OA + SPRY2 сверхэкспрессионную плазмиду (OE-SPRY2) и соответствующие малые интерферирующие РНК-группы (si-NC и три специфических si-SPRY2 конструкции: si-695, si-800, si-896) для проверки эффективности интерференции.
  2. Модуляция miR-590-5p:
    Клетки были разделены на контрольные, OA-модели, OA + имитирующее NC, OA + miR-590-5p, OA + ингибиторные группы (NC) и OA + miR-590-5p ингибиторы.
  3. Функциональная валидация регуляторной связи miR-590-5p/SPRY2:
    Для дальнейшей оценки предлагаемой регуляторной связи между miR-590-5p и SPRY2 клетки подвергались условиям miR-590-5p, имитирующих и ингибиторным условиям, чтобы определить, изменяла ли модуляция miR-590-5p экспрессию SPRY2 в модели OA.
    Для трансфекции клетки C28/I2 сеяли в пластины с 6 лунками при 2 ×10 клеток по 5 клеток на скважину. При достигнении слияния 70–80% трансфекции проводились с использованием коммерческого липидного трансфекционного реагента согласно протоколу производителя и установленным процедурам доставки малых РНК вхондроцитах 24. Кратко времени плазмиды (OE-SPRY2 и NC; 2 мкг/скважина) и олигонуклеотиды (miR-590-5p мимик/ингибитор и siRNA; 50 нМ) разбавлялись в редуцированной сывороточной среде. Комплексы липидной ДНК/РНК инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут, после чего капля добавлялись в клетки в безсывороточном DMEM. Через 6 часов после трансфекции среду заменяли на полный DMEM с 10% FBS, а клетки культивировали ещё 48 часов до извлечения РНК и белка.

3. Обнаружение qPCR

Общая РНК и миРНК были выделены с помощью специального комплекта для экстракции миРНК согласно протоколу производителя. Чистота и концентрация РНК оценивались с помощью спектрофотометра UV-Vis, а для дальнейших анализов использовались образцы с соотношением A260/A280 1,8–2,0. Для синтеза cDNA использовались коммерческие реагенты обратной транскрипции. Процедура циклирования qPCR была следующей: 95 °C в течение 10 минут; 40 циклов при температуре 95 °C в течение 10 с, 58 °C на 30 секунд и 72 °C в течение 30 с; затем проводится анализ кривой плавления для проверки специфичности праймера и отсутствия праймерных димеров. β-актин и U6 служили внутренним контролем для мРНК и миРНК соответственно. Относительная экспрессия генов рассчитывалась с использованием метода 2-ΔΔCt 25. Все последовательности праймеров, включая последовательности Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p и эталонные гены, перечислены в Таблице 1.

Название буквы Передний капсюль (5′-3′)Обратная капсула (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAAGGCACGCGGTGAGTGCAGGGGCCGAGGT
β-актинTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCCCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAACAAAGG
Bcl-2TGGGATTCCTGCGGGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTCTGTGATGTGTTG
Беклин-1TCCCGTGGAATGGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTTAAGCGCCTCTTCTAA

Таблица 1: Праймерные последовательности, используемые для количественного ПЦР-анализа (qPCR). Прямые и обратные последовательности праймеров, используемые для усиления и количественной оценки целевых транскриптов и внутренних референтных контролей с помощью qPCR.

Если не указано иное, данные выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Статистическая значимость определялась с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал пост-хок тест S-N-K. Символы обозначают: *P < 0.05 против Control; #P < 0,05 по сравнению с указанной моделью или отрицательной контрольной группой; &P < 0,05 против OA+ингибитора-NC.

4. Обнаружение западных пятен

Клетки были собраны и лизированы с использованием буфера RIPA с дополнением коктейлей ингибиторов протеазы и фосфатазы, после установленных процедур экстракции белка и иммуноблотации. После центрифугирования при 14 000 × г в течение 15 минут при 4 °C для удаления клеточного мусора был собран супернатант, а концентрации белка измерены с помощью белкового теста BCA. Равные количества белкового лизата (30 мкг) денатурировались, растворялись SDS-PAGE в течение 1,5 часа и передавались на мембраны PVDF при 300 мА в течение 1,5ч 26. Мембраны блокировались сухим молоком с 5% обезжиренным молоком в физиологическом растворе, содержащем 0,1% Tween 20 (TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего следовала инкубация при 4 °C в течение 16 часов с использованием специфических первичных антител (например, анти-SPRY2, разбавление 1:1000). После трёх промывок в TBST мембраны инкубировали соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с HRP, при комнатной температуре в течение 2 часов. Белковые полосы визуализировались с помощью системы обнаружения ECL и количественно оценивались с помощью программного обеспечения ImageJ.

5. Статистический анализ

Данные анализировались с помощью программного обеспечения для статистического анализа. Все эксперименты проводились как минимум с тремя независимыми биологическими репликами (n ≥ 3), а количественные данные представлены как среднее ± стандартного отклонения (SD). До параметрического тестирования нормальность данных оценивалась с помощью теста Шапиро-Уилка, а также оценивалась однородность дисперсии. Статистическая значимость между несколькими группами оценивалась с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), а затем пост-хок теста Студента-Ньюмана-Кюлса (S-N-K) для множественных сравнений. P < 0,05 считался статистически значимым.

Результаты

Установление модели воспалительных хондроцитов in vitro

Для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии остеоартрита, была установлена воспалительная модель in vitro с использованием хондроцитов человека C28/I2, стимулированных IL-1β. Достоверность этой модели была подтверждена оценкой экспрессии цепи коллагена типа II альфа-1 (Col-II), основного компонента внеклеточного матрикса гиалинового хряща и характерного признака здоровых хондроцитов. Количественный анализ показал, что воздействие IL-1β приводило к статистически значимому снижению экспрессии мРНК Col-II по сравнению с контрольной группой. Это фенотипическое изменение указывает на первоначальный сдвиг к катаболическому состоянию, напоминающему остеоартритную микросреду, что стало основой для последующих механистических исследований (см. рисунок 1).

figure-results-1
Рисунок 1: Установление модели остеоартрита in vitro (OA) в хондроцитах человека C28/I2. Клетки обрабатывали 20 нг/мл IL-1β в течение 24 часов. Относительная экспрессия мРНК Col-II была определена методом qPCR, при этом β-актин служил контролем нормализации. Данные представлены как среднее ± стандартного отклонения (SD) от трёх независимых биологических репликат (n = 3). Статистический анализ проводился с использованием одностороннего ANOVA. *P < 0,05 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Валидация эффективности сверхэкспрессии SPRY2 в клетках C28/I2

Перед оценкой функциональной роли Sprouty2 (SPRY2) в этой модели была проверена эффективность трансфекции вектора сверхэкспрессии SPRY2. Хондроциты были трансфектированы либо с помощью плазмиды сверхэкспрессии (OE), либо с отрицательным контрольным пустым вектором (NC). Как qPCR, так и вестерн-блот показали устойчивое повышение уровня SPRY2 на уровнях мРНК и белка в группе OE по сравнению с группами NC и необработанной контрольной группой. Эти данные, представленные на рисунке 2, подтверждают, что экспериментальная система поддерживала повышенные уровни SPRY2, что позволило исследовать её специфические биологические эффекты.

figure-results-2
Рисунок 2: Валидация гиперэкспрессии SPRY2 в хондроцитах C28/I2. Клетки трансфектировали либо пустым вектором (NC), либо плазмидой сверхэкспрессии SPRY2 (OE). Относительные уровни мРНК и белка SPRY2 оценивались с помощью qPCR и Western blot соответственно. β-актин использовался как внутренний регулятор нагрузки. Данные выражаются в виде среднего ± SD (n = 3). *P < 0,05 по сравнению с группой Северной Каролины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Гиперэкспрессия SPRY2 ослабляет аутофагию и модулирует маркеры апоптоза при воспалительных состояниях

Последующие эксперименты пытались определить, функционирует ли SPRY2 как регулятор аутофагии и апоптоза в контексте воспаления. После внедрения модели ОА само лечение IL-1β вызвало заметное увеличение маркеров аутофагии Beclin-1 и LC3-II, что указывает на компенсаторный аутофагический ответ на воспалительный стресс. Одновременно экспрессия Bcl-2 была повышена в группе моделей. Однако введение вектора переэкспрессии SPRY2 значительно изменило этот профиль. Как показано на рисунке 3, группа Model+OE-SPRY2 показала значительное снижение уровней мРНК Beclin-1 и LC3-II по сравнению с группами Model и Model+NC. Кроме того, гиперэкспрессия SPRY2 ослабляла повышение уровня Bcl-2, вызванное воспалением. Эти данные свидетельствуют о том, что SPRY2 негативно регулирует экспрессию маркеров, связанных с аутофагією, в воспалительных хондроцитах.

figure-results-3
Рисунок 3: Гиперэкспрессия SPRY2 ослабляет аутофагию и модулирует маркеры апоптоза при воспалительных состояниях, индуцированных IL-1β. Относительные уровни экспрессии мРНК SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 и LC3-II количественно оценивались с помощью qPCR в группах Control, Model (IL-1β), Model+NC и Model+OE-SPRY2. β-актин служил внутренним контролем. Данные представлены как среднее ± SD (n = 3). Статистическая значимость определялась с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал пост-хок тест S-N-K. *P < 0,05 по сравнению с контрольной группой; #P < 0,05 по сравнению с группой Model+NC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

miR-590-5p усиливает маркеры, связанные с аутофагией, и способствует выживаемости хондроцитов

Далее изучалось функциональное влияние miR-590-5p на маркеры, связанные с аутофагическим и связанными с выживаемостью. Как показано на рисунке 4, трансфекция с мимиком miR-590-5p в модели OA значительно увеличила экспрессию Bcl-2, Beclin-1 и LC3-II, в отличие от тормозящих эффектов, наблюдаемых после гиперэкспрессии SPRY2. Напротив, ингибирование miR-590-5p значительно снижало экспрессию Bcl-2 и Beclin-1, тогда как снижение LC3-II не достигло статистической значимости. Эти результаты свидетельствуют о том, что miR-590-5p увеличивает экспрессию маркеров, связанных с аутофагическим факторами, и связанного с выживаемостью Bcl-2 в хондроцитах, что требует дальнейшего изучения возможных регуляторных мишеней на следующих этапах.

figure-results-4
Рисунок 4: miR-590-5p увеличивает экспрессию маркеров, связанных с аутофагией, и экспрессию Bcl-2, связанную с выживаемостью. Относительные уровни экспрессии мРНК Bcl-2, Beclin-1 и LC3-II измерялись с помощью qPCR в модели OA после трансфекции с помощью miR-590-5p, ингибитора или их соответствующих отрицательных контролей (NC). β-актин служил контролем нормализации. Данные представлены как среднее ± SD (n = 3). *P < 0,05 по сравнению с группой Model+Mimic-NC; #P < 0,05 по сравнению с группой Model+Inhibitor-NC (для Bcl-2 и Beclin-1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

IL-1β модулирует ось miR-590-5p/SPRY2 и экспрессию маркеров, связанных с аутофагией

Для разъяснения регуляторных механизмов, контролирующих SPRY2 и его связь с miR-590-5p, профили их экспрессии были изучены в воспалительных условиях. После морфологического наблюдения модели C28/I2, индуцированной IL-1β (рисунок 5A), была подтверждена эффективность трансфекции для генетической манипуляции SPRY2. И анализ qPCR, и Western blot подтвердили устойчивую апрегуляцию SPRY2 в группе с гиперэкспрессией (OE) и успешный нокдаун в группах малых интерферирующих РНК (siRNA) по сравнению с их соответствующими контрольными группами (рисунки 5B и 5C). В то же время уровень miR-590-5p значительно повышался после обработки IL-1β.

figure-results-5
Рисунок 5: Морфологическое наблюдение и валидация эффективности трансфекции SPRY2. (A) Морфологическое наблюдение клеток C28/I2 после обработки IL-1β (20×, фазово-контрастная микрофотография). (B) Относительные уровни экспрессии мРНК и белка SPRY2 в группах контрольной, NC и SPRY2 с гиперэкспрессией (OE). (C) Репрезентативные изображения западных блотов, подтверждающие сверхэкспрессию SPRY2 (слева) и снижение SPRY2 специфическими siRNA (si-896, si-800, si-695) по сравнению с контролями (справа). β-актин служил внутренним контролем нагрузки. Данные выражаются в среднем ± SD (n = 3). *P < 0,05 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Чтобы определить, отражает ли этот обратный паттерн экспрессии потенциальную регуляторную связь, TargetScan Human 7.1 использовался для выявления предполагаемого 8-мерного участка связывания has-miR-590-5p в пределах 3′-UTR человеческого SPRY2 (нуклеотиды 236–243). Выравнивание последовательностей на рисунке 6 иллюстрирует предсказанную комплементарность семенной области. Затем были проведены спасательные эксперименты для функционального изучения, изменяет ли модуляция miR-590-5p экспрессию SPRY2 в модели OA. После подтверждения эффективности трансфекции мимика и ингибитора miR-590-5p (рисунки 7A, B), спасательные анализы показали, что ингибирование miR-590-5p обратило обратное подавление экспрессии мРНК SPRY2, связанное с OA, (рисунок 7C). Мимик miR-590-5p не снижал экспрессию SPRY2 дальше выраженного подавления, вызванного IL-1β, тогда как ингибирование miR-590-5p значительно увеличивало экспрессию SPRY2 по сравнению с отрицательным контролем ингибитора. Эти данные подтверждают обратную, предполагаемую регуляторную связь между miR-590-5p и SPRY2 в воспалительных хондроцитах.

figure-results-6
Рисунок 6: In silico предсказание предполагаемого регуляторного взаимодействия miR-590-5p/SPRY2. Биоинформатический анализ был проведён с использованием TargetScan Human 7.131,32 для выявления предполагаемых сайтов связывания миРНК. Схема иллюстрирует предсказанное выравнивание последовательностей и комплементарность семенной области между has-miR-590-5p и 3′-UTR человеческого SPRY2 (нуклеотиды 236–243). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 7: Влияние модуляции miR-590-5p на экспрессию SPRY2 в хондроцитах. Эффективность трансфекции была подтверждена с помощью qPCR для мимика miR-590-5p (A) и ингибитора (B) относительно соответствующих контрольных групп. (C) Относительная экспрессия мРНК SPRY2 была измерена в указанных экспериментальных группах после модуляции miR-590-5p в модели OA. U6 и β-актин использовались в качестве внутреннего контроля для количественной оценки миРНК и мРНК соответственно. Данные представлены в виде среднего ± SD (n = 3). *P < 0,05 по сравнению с контрольной группой; #P < 0,05 по сравнению с соответствующими группами Mimic-NC или ингибитора-NC; &P < 0,05 по сравнению с группой OA+Inhibitor-NC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

В соответствии с результатами на рисунке 4, изменения маркеров, связанных с аутофагией, совпали с ожидаемыми эффектами снижения экспрессии SPRY2, что позволяет предположить, что miR-590-5p может усиливать их экспрессию, снимая ингибиторы, опосредованную SPRY2. В совокупности эти результаты подтверждают предполагаемую ось сигнализации, при которой IL-1β повышает уровень miR-590-5p, miR-590-5p подавляет экспрессию SPRY2, а сниженный SPRY2 связан с повышением экспрессии маркеров Beclin-1 и LC3-II.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Данные для этого исследования приведены в Дополнительном файле 1.

Дополнительный файл 1: Наборы данных, используемые для этого исследования, включая исходные данные qPCR, изображения исходных материалов Western Blot и результаты статистического анализа.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Предыдущие исследования показали, что миРНК регулируют аутофагию на нескольких стадиях, включая инициацию, удлинение везикулы исозревание 27. Участие миРНК в патогенезе ОА всё чаще документируется, особенно через влияние на воспаление, апоптоз, ремоделирование внеклеточного матрикса и связанные с аутофагией пути. miR-590-5p связан с клеточным гомеостазом и процессами, ассоциированнымис раком 28,29,30. В скелетных и хрящевых контекстах miR-590-5p способствует хондрогенной дифференцировке человеческих мезенхимальных стволовых клеток 16, тогда как в моделях OA хондроцитов он может регулировать пролиферацию, апоптоз и воспалительные реакции, нацеливаясь наFGF 18,24. Однако остаётся неясным, влияет ли miR-590-5p на ответы, связанные с аутофагией, у хондроцитов ОА.

Поэтому RNAInter и TargetScan были использованы для изучения потенциальных медиаторов ниже по потоку, и оба анализа предполагали SPRY2 как предполагаемую мишень, ассоциированную с miR-590-5p. TargetScan Human 7.131,32 выявил прогнозируемый участок связывания 8mer семенной области на нуклеотидах 236–243 SPRY2 3′-UTR (рисунок 6). SPRY2 является отрицательным регулятором сигнализации тирозинкиназы/MAPK рецепторов и экспрессируется в несколькихтканях 19. Сообщается, что внутрисуставный перенос гена SPRY2 снижает адъювантно-индуцированный артрит укрыс 21. Гиперэкспрессия SPRY2 может подавлять рост, инвазию, миграцию и цитокинез с помощью HGF/SF, тогда как потеря функции Spry2 связана с гиперактивацией MAPK-ERK и увеличением пролиферации B-клеток34. SPRY2 также участвует в регуляции 22, связанной с апоптозом, контролемиграции 35 с миРНК, а также в ответах, связанных с аутофагией, в ишемическихмоделях 23. Вместе эти исследования поддерживают SPRY2 как регуляторный узел, связывающий воспалительную сигнализацию, пути, связанные с выживаемостью, и ответы, связанные с аутофагией.

Учитывая ранее не сообщавшуюся связь между miR-590-5p и SPRY2 в хондроцитах ОА, биоинформатическое предсказание их возможного взаимодействия стимулировало дальнейшие экспериментальные исследования. Настоящие результаты показали, что SPRY2 значительно понижался, тогда как miR-590-5p был повышен в хондроцитах C28/I2, стимулируемых IL-1β, что указывает на эту ось в воспалительных ответах хондроцитов. Функционально гиперэкспрессия SPRY2 снижала экспрессию Beclin-1 и LC3-II, что поддерживает тормозящий эффект на экспрессию маркеров, связанных с аутофагией. Напротив, ингибирование miR-590-5p снижало экспрессию Беклин-1 и Bcl-2 и восстанавливает экспрессию SPRY2, что соответствует предполагаемой обратной регуляторной связи. Поскольку Bcl-2 может ингибировать аутофагию, зависящую от Беклин-1, одновременно оказывая антиапоптотические эффекты13, одновременное повышение Bcl-2 с Беклин-1 и LC3-II следует интерпретировать в контекстно-специфическом ключе. В этой воспалительной модели ОА арегуляция Bcl-2 может в первую очередь отражать антиапоптотический ответ, связанный с выживаемостью, тогда как повышение экспрессии Beclin-1 и LC3-II может отражать облегчение подавления, связанного с SPRY2. Эти результаты свидетельствуют о модели, в которой miR-590-5p координирует сигнализацию, связанную с выживаемостью хондроцитов, и экспрессию аутофагических маркеров, подавляя SPRY2 под воспалительным стрессом.

Хотя это исследование даёт ценные механистические сведения о оси miR-590-5p/SPRY2, следует признать ряд ограничений. Во-первых, все эксперименты проводились в двумерной системе in vitro с использованием увековеченной клеточной линии C28/I2. Эта упрощённая модель не может полностью воссоздать биомеханический стресс, многоклеточные взаимодействия и воспалительную микросреду суставного хряща in vivo, что ограничивает непосредственную трансляционную применимость полученных данных. Во-вторых, хотя биоинформатические прогнозы и спасательные анализы подтверждают предполагаемую регуляторную связь между miR-590-5p и SPRY2, отсутствие двухлюциферазного репортерного анализа не позволяет окончательно подтвердить прямое физическое связывание между miR-590-5p и SPRY2 3′-UTR. В-третьих, статические измерения Беклин-1 и LC3-II не могут отличить усиленное формирование аутофагосом от нарушенной деградации аутолизосом; поэтому в будущих исследованиях следует оценивать аутофагический поток с использованием таких подходов, как лечение бафиломицином A1 или тандемные флуоресцентные репортёрные анализы. Будущие исследования также должны включать более широкий спектр фенотипических маркеров OA (например, MMP13 и ADAMTS5), первичных человеческих хондроцитов, 3D-моделей эксплантаций хряща и in vivo OA-моделей, таких как дестабилизация медиального мениска для оценки долгосрочных эффектов модуляции miR-590-5p и SPRY2.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Авторы выражают благодарность кафедре гериатрии больницы Жуйкан Гуансийского университета китайской медицины за предоставление экспериментальных возможностей и технической поддержки для этого исследования. Авторы также благодарят сотрудников лаборатории и коллег за помощь в сборе и анализе данных. Эта работа была поддержана проектом естественных наук Гуансийского университета китайской медицины (грант No 2022MS039; LncRNA-GAS5 опосредует экспрессию SPRY2 для ингибирования аутофагии в хондроцитах ОА колена мышей: исследование механизма и эффект раннего вмешательства рецепта Huayu Cushi) и Национального фонда естественных наук Китая (Региональный фонд) (грант No 82160912; Обсуждение механизма Skp2, убиквитинации, деградации FoxO1, ингибирования аутофагии хондроцитов ОА колена и раннего вмешательства, эффекта рецепта Huayu Qushi).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Anti-β-актин антителиProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Внутренний контроль загрузки для анализа Western blot
Анти-SPRY2 антителиProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324Обнаружение экспрессии белка SPRY2
Комплект для определения белка BCAThermo Fisher Scientific23225Определение общей концентрации белка
Линия клеток человеческих хондроцитов C28/I2PunocelCP-H107Ин витро модель хондроцитов для исследований остеоартрита
Полная DMEMKeyGen BiotecKGM12800SБазальная среда для рутинной культуры клеток
Набор для извлечения ультрачистой miRNA CWBIOCWBIOCW0627SИзоляция общей РНК и miRNA
Система ECL-детекцииThermo Fisher Scientific32106Хемилюминесцентная визуализация белковых полос
Фетальный сывороточный альбумин (FBS)Gibco1891605Добавка для роста культуры клеток
GraphPad Prism версии 9.0GraphPad SoftwareN/AСтатистический анализ и создание графиков
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01Обратная транскрипция мРНК в ДНК
Программное обеспечение ImageJNational Institutes of HealthN/AКоличественное определение интенсивности полос Western blot
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015Трансфекция плазмид и олигонуклеотидов
Мимик, ингибитор и NCs для miR-590-5pRiboBioСпециально синтезированыМодулирование экспрессии miR-590-5p
Набор для синтеза первой цепи ДНК из miRNAVazymeMR101-02Обратная транскрипция miRNA в ДНК
Среда Opti-MEMGibco31985-062Приготовление трансфекционных комплексов
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122Профилактика бактериальной контаминации в культуре клеток
Коктейли ингибиторов протеаз и фосфатазMedChemExpressHY-K0010Защита белков во время экстракции
ПВДФ-мембраныMillipore SigmaISEQ00010Мембрана для переноса белков для иммуноблоттинга
Рекомбинантный человеческий ИЛ-1βMedChemExpressHY-P78459Индукция ОА-подобных воспалительных состояний
RIPA буферBeyotimeP0013BЛизис клеток и извлечение белков
Конструкции si-SPRY2 и si-NCGenePharmaСпециально синтезированыПодавление экспрессии SPRY2
Плазмид с переизбыточной экспрессией SPRY2 (OE) и пустой вектор (NC)GeneChemСпециально созданныеОценка эффектов переизбыточной экспрессии SPRY2
UV-VIS спектрофотометр (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000Измерение концентрации и чистоты РНК

Ссылки

  1. Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393:1745-59.
  2. GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2020;396:1204-22.
  3. Tang X, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from the China Health and Retirement Longitudinal Study. Arthritis Rheumatol. 2016;68:648-53.
  4. Latourte A, Kloppenburg M, Richette P. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2020;16:673-88.
  5. Glyn-Jones S, et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386:376-87.
  6. Kapoor M, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:33-42.
  7. Goldring MB, Otero M. Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23:471-8.
  8. Lepetsos P, Papavassiliou AG. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta. 2016;1862:576-91.
  9. Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: Renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728-41.
  10. Caramés B, Olmer M, Kiosses WB, Lotz MK. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis Rheumatol. 2015;67:1568-76.
  11. Lotz MK, Caramés B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:579-87.
  12. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720-8.
  13. Pattingre S, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell. 2005;122:927-39.
  14. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-97.
  15. Miyaki S, Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8:543-52.
  16. Wu Z, Lin Y, Zhang Z, Pan Y. Melatonin-mediated miR-526b-3p and miR-590-5p upregulation promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Pineal Res. 2018;65:e12483.
  17. Chen M, Wang S, Chen Y. miR-590-5p suppresses hepatocellular carcinoma chemoresistance by targeting YAP1 expression. EBioMedicine. 2018;35:142-54.
  18. Endisha H, Rockel J, Jurisica I, Kapoor M. The complex landscape of microRNAs in articular cartilage: biology, pathology, and therapeutic targets. JCI Insight. 2018;3:e98630.
  19. Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? J Endocrinol. 2009;203:191-202.
  20. Loeser RF. Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage. Matrix Biol. 2014;39:11-6.
  21. Zhang W, Chen L, Xiong Y. Intraarticular gene transfer of SPRY2 suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:6727-35.
  22. Liu Y, et al. MicroRNA-124 facilitates lens epithelial cell apoptosis by inhibiting SPRY2 and MMP-2. Mol Med Rep. 2021;23:381.
  23. Wu Y, Gao Z, Zhang J. Transcription factor E2F1 aggravates neurological injury in ischemic stroke via microRNA-122-targeted Sprouty2. Neuropsychiatr Dis Treat. 2020;16:2633-47.
  24. Jiang P, Zheng Z, Tang Y. miR-590-5p affects chondrocyte proliferation, apoptosis, and inflammation by targeting FGF18 in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13:8728-41.
  25. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25:402-8.
  26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:4350-4.
  27. Panagopoulos PK, Lambrou GI. The involvement of microRNAs in osteoarthritis and recent developments: A narrative review. Mediterr J Rheumatol. 2018;29:67-79.
  28. Barwal TS, Sharma P. miR-590-5p: A double-edged sword in the oncogenesis process. Cancer Treat Res Commun. 2022;32:100593.
  29. Mou K, Chen M. miR-590-5p inhibits tumor growth in malignant melanoma by suppressing YAP1 expression. Oncol Rep. 2018;40:2056-66.
  30. D'Adamo S, et al. Autophagy in osteoarthritis: a target for new therapies. Curr Rheumatol Rep. 2020;22:37.
  31. Agarwal V, Bell GW, Nam JW, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 2015;4:e05005.
  32. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19:92-105.
  33. Lee CC, et al. Overexpression of sprouty 2 inhibits HGF/SF-mediated cell growth, invasion, migration, and cytokinesis. Oncogene. 2004;23:5193-202.
  34. Frank MJ, et al. Expression of sprouty2 inhibits B-cell proliferation and is epigenetically silenced in mouse and human B-cell lymphomas. Blood. 2009;113:2478-87.
  35. Cui S, et al. Hsa-miR-22-3p inhibits liver cancer cell EMT and cell migration/invasion by indirectly regulating SPRY2. PLoS One. 2023;18:e0281536.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233C28 I2miRNA 590 5pBeclin 1LC3IIBcl 2

Похожие статьи