Визуализация и количественная оценка межмолекулярного парирования баз РНК in vitro кластеров РНК с использованием репортеров РНК с разделёнными брокколи

Summary

Этот протокол описывает визуальный анализ с использованием разделённых РНК-репортеров брокколи для обнаружения и количественной оценки межмолекулярного спарения основ в кластерах РНК in vitro.

Abstract

Кластеризация РНК, вызванная мультивалентными межмолекулярными взаимодействиями РНК-РНК, может происходить in vitro при отсутствии белков. Хотя для прогнозирования этих взаимодействий использовались химические зондирования и вычислительные моделирования, методы прямой оценки межмолекулярного соединения основ в РНК-кластерах остаются ограниченными. В данном исследовании представлен визуальный анализ на основе расщеплённых РНК брокколи, конъюгированных с флуоресцентно маркированными интересующими РНК. Анализ позволяет обнаруживать и количественно оценивать межмолекулярные пары оснований в РНК-кластерах. Разделённая система брокколи содержит комплементарные репортерные последовательности, которые димеризуются, образуя аптамер РНК брокколи. Получившаяся димеризированная структура РНК связывается с DFHBI-1T — флуорофором, который при связывании излучает зелёную флуоресценцию. При кластеризации РНК появление зелёной флуоресценции свидетельствует о паре оснований, опосредованном комплементарными репортерными последовательностями среди интересующих РНК. Измерение флуоресценции DFHBI-1T позволяет количественно оценить, как условия кластеризации in vitro РНК влияют на межмолекулярное спаривание основ между этими репортерными последовательностями.

Introduction

Транскрибированные in vitro РНК могут самостоятельно собираться в видимые кластеры при добавлении солей и молекулярных реагентов^{для переполнения} 1,2,3,4,5. Примечательно, что эти кластеры РНК могут образовываться при отсутствии других клеточных компонентов, включая белки, что указывает на то, что при определённых условиях межмолекулярные взаимодействия РНК–РНК достаточно для стимулирования конденсации РНК in vitro.

Среди различных типов межмолекулярных взаимодействий РНК–РНК межмолекулярное спаривание оснований получило значительное внимание в области^{конденсатов 1,2,4,6,7,8,9,10}. Эти взаимодействия могут быть вызваны экспонированными комплементарными последовательностями («почтовые индексы») между транскриптами, что демонстрируется кокластеризацией мРНК BNI1 и SPA2 в нитистообразном грибе Ashbya gossypii² или олигомеризацией мРНК оскара у Drosophila melanogaster ^6,7. Альтернативно, межмолекулярное спаривание оснований может быть стимулировано за счёт ремоделирования вторичных структур РНК, обнажая комплементарные последовательности, которые в противном случае структурно вложены. Этот механизм был зафиксирован у повторяющихся РНК в silico⁹ и гуанидиновых рибосвитчах in vitro¹⁰. Как экспонируемые комплементарные последовательности, так и структурное ремоделирование РНК можно измерять с помощью химического^{зондирования 11,12} или моделирования^{методов 4,9,13,14}. Однако методы, непосредственно визуализирующие межмолекулярное спаривание основ в in vitro РНК-кластеризации, остаются ограниченными.

Для изучения межмолекулярного спаривания РНК in vitro широко применяются анализы с использованием сшивателей с парами оснований^{15, 16, 17}и электрофореза с гелем ^4,6,7. Однако эти методы не обладают пространственным разрешением, позволяющим различать пары оснований внутри кластеров от их внешних. Кроме того, выделение РНК-кластеров для дальнейшего анализа технически сложно, поскольку требует сохранения стабильности кластера при обеспечении совместимости буфера с последующим анализами.

Визуальный анализ, основанный на разделённых РНК-репортерах^{брокколи 18} , конъюгированных с флуоресцентно маркированными интересующими РНК, ранее использовался для прямого обнаружения межмолекулярного спарения основ во время конденсации РНК in vitro⁴. В этом контексте разделенная система брокколи сообщает о вероятности межмолекулярных взаимодействий между репортерами или между РНК, несущими их при определённых условиях кластеризации in vitro . Таким образом, анализ исследует, как контекст последовательностей и факторы окружающей среды влияют на склонность к межмолекулярному спариванию оснований в среде, похожей на РНК-кластер.

Разделённая система брокколи состоит из двух комплементарных РНК-последовательностей, верхней и нижней, которые димеризуются, восстанавливая аптамер РНК брокколи (рисунки 1A–C⁾¹⁸. При димеризации аптамер связывается с флуорофором DFHBI-1T, что приводит к зелёной флуоресценции (рисунки 1A–C⁾¹⁸. Используя эту систему, степень межмолекулярного парирования основ между репортерными комплементарными последовательностями внутри РНК-кластеров зависит от сворачивания РНК. Сравнивая отношение уровней флуоресценции DFHBI-1T к РНК в различных экспериментальных условиях, можно количественно оценить влияние условий in vitro на репортер-опосредованное межмолекулярное спаривание оснований внутри РНК-кластеров.

Этот анализ дополняет подходы РНК-вытяжения и гель-электрофореза для изучения межмолекулярных пар оснований в РНК-кластерах. Однако устойчивое обнаружение сигналов может потребовать молекулярных реагентов для переполнения, а чувствительность ограничена эффективностью димеризации и сгибания разделённой верхней и нижней РНК брокколи.

Protocol

Этот протокол предоставляет пошаговый метод реализации этого анализа и обсуждает его применение. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка ДНК-шаблонов для транскрипции in vitro РНК

1. Добавьте последовательность промоторов T7 к 5′-концу каждого шаблона ДНК, содержащую разделённые последовательности аптамеров брокколи для транскрипции in vitro РНК. Используйте разделённые последовательности аптамеров брокколи (сверху и снизу) отдельно или вставьте их в любую позицию ниже промотора T7, с дополнительной РНК-последовательностью или без неё.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности для промотора T7, сплит-репортёров брокколи и праймеров, используемых для амплификации ДНК-шаблонов, приведены в Таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полимераза T7 РНК сильно предпочитает инициировать транскрипцию с буквой «G» в позиции +1. Наличие дополнительных G непосредственно ниже по течению на позициях +2 и +3 может увеличить выход^{транскрипции на 19}. Однако, когда низкая последовательность начинается с G, как в верхних и нижних конструкциях, начинающихся с двух G, транскрипция может начинаться с разных^{позиций 20}. В результате транскрипты могут содержать одну, две или три G на 5′-конце (например, GATCC, GGATCC или GGGATCC), что может повлиять на интерпретацию пары баз в проектируемых конструкциях.
2. Используйте коммерчески синтезированные генные блоки, плазмиды или фрагменты ДНК в качестве шаблонов для ПЦР. Если исходный шаблон не содержит T7-промотора, используйте прямой праймер с 5′ T7 overvis вместе с соответствующим обратным праймером.
3. Подготовьте ПЦР-реакцию объёмом 50 мкл в ПЦР-пробирке объёмом 200 мкл, содержащей по 2,5 мкл по 10 мкм прямых и обратно праймеров, 20 нг ДНК-шаблона, 25 мкл 2× высокоточной мастер-смеси и воду без нуклеазы. Тщательно перемешайте, поднимая и опуская трубку, и центрифугуйте при 2000 × г на 2 секунды.
4. Запустите реакцию ПЦР в тепловом циклере с помощью следующей программы: 98 °C в течение 30 секунд (1 цикл); 98 °C в течение 10 с, оптимальная температура отжига 30 с и 72 °C за 30 с на килобазу (35 циклов); 72 °C в течение 2 минут (1 цикл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определите оптимальную температуру отжига с помощью онлайн-инструмента, такого как калькулятор Tm. ПЦР-продукты могут храниться при 4 °C после завершения.
5. Смешайте 2 мкл ПЦР-продукта с 8 мкл безнуклеазной воды и 2 мкл 6× нагрузочной красительницей. Заправьте смесь на 1% агарозный гель для электрофореза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР-продукт должен выглядеть в виде одной полосы. Если наблюдается несколько полос, уберите правильную полосу и очистите её с помощью набора для экстракции геля, прежде чем приступить к процессу.
6. Очистите продукт ПЦР или ДНК, экстракционную гелем, с помощью комплекта для очистки ДНК и элюируйте в воде без нуклеазы 20–30 мкл в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл.
7. Измеряйте концентрацию и чистоту ДНК с помощью микрообъёмного спектрофотометра. Убедитесь, что A260/A280 примерно 1,8, а A260/A230 — больше 2,0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если A260/A230 ниже 2.0, выполните дополнительный этап очистки.
8. Сохраняйте шаблон ДНК при −20 °C до использования.

2. Подготовка реакции транскрипции РНК in vitro

1. Протрите рабочую поверхность, стойки для трубок и пипетки раствором для дезактивации RNase. Используйте фильтрованные наконечники без РНаз.
2. Буфер для оттаивания реакции и нуклеотидные растворы (АТФ, CTP, GTP, UTP), поставляемые с транскрипционным набором T7 вместе с UTP-Cy5 на льду. Центрифугуйте все трубки при 2 000 × г в течение 2 секунд перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите UTP-Cy5 от света.
3. Рассчитайте количество тиминовых оснований в шаблоне ДНК (исключая промотор T7) и определите необходимые объемы UTP и UTP-Cy5 для транскрипционной реакции размером 20 мкл. Поддерживать единую плотность маркировки между видами РНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, чтобы пометить РНК, содержащую 100 оснований урацилов, примерно тремя урацилами с меткой Cy5, добавьте 4,5 мкл 1 мМ UTP-Cy5 и 1,9 мкл 75 мМ UTP.
4. Подготовьте транскрипционную реакцию на 20 мкл, объединив по 2 мкл АТФ, ЦТФ и ГТФ, рассчитанные объёмы УТФ (все поставляются в комплекте) и UTP-Cy5, 2 мкл 10× реакционного буфера, смесь ферментов 2 мкл, 200 нг ДНК-матрица и воду без нуклеазы. Тщательно перемешивайте, поднимая и опуская трубку, и центрифугуйте при 2 000 × г на 2 секунды.
5. Инкубировать реакцию при 37 °C в течение 6 часов.
6. Добавьте 1 мкл ДНКазу, поставляющуюся в комплекте. Тщательно перемешайте, поднимая и опуская трубку, и центрифугуйте при 2 000 × г на 2 секунды.
7. Инкубировать при 37 °C ещё 15 минут.
8. Перенесите реакцию (~20 мкл) в трубку объёмом 1,5 мл. Добавьте 115 мкл воды без нуклеазы и 15 мкл раствора аммония-ацетата, который поставляется в комплекте. Тщательно перемешайте, поднимая и опуская трубку, и центрифугайте при 2000 × г на 2 секунды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо шагов 2.9–3.7 может использоваться коммерческий комплект для очистки РНК.
9. Добавьте 150 мкл фенол/хлороформ и аккуратно перемешайте.
   ВНИМАНИЕ: Работайте с фенолом/хлороформом в химическом выхлопчике.
10. Центрифуга при 16 000 × г в течение 10 минут при 4 °C.
11. Перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте нарушения межфазы; нижний слой может казаться синим из-за неинкорпорированного красителя.
12. Добавьте равный объём хлороформ и тщательно перемешайте.
    ВНИМАНИЕ: Работайте с хлороформом в вытяжной капсуле с химическим паром.
13. Центрифуга при 16 000 × г в течение 2 минут при 4 °C.
14. Повторите шаги 2.11–2.13.
15. Перенесите водный слой (~100–150 мкл) в новую трубку. Добавьте 900 мкл изопропанола и тщательно перемешайте.
16. Аликвот в три равных объёма в отдельных трубках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый аликвот достаточно для множественных реакций кластеризации РНК.
17. Храните при −20 °C на ночь или до месяца.

3. Очищение in vitro транскрибированной РНК

1. Центрифугировать образец РНК в изопропаноле при 16 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
2. Аккуратно удаляйте изопропанол, не нарушая РНК-гранулу.
3. Добавьте 1 мл 70% этанола, приготовленного в воде без нуклеаз.
4. Центрифуга при 16 000 × г в течение 2 минут при 4 °C.
5. Удалите этанол и повторите шаги 3.3–3.4.
6. Во время финальной промывки этанолом удалите большую часть этанола с помощью пипетки объёмом 1000 мкл. Кратко центрифугуйте при 2 000 × г в течение 2 секунд в настольной миницентрифуге и удалите оставшийся этанол с помощью пипетки объемом 20 мкл.
7. Сушить РНК-гранулы на воздухе 1–2 минуты при комнатной температуре (RT).
8. Суспендировать РНК-гранулу в воде без нуклеазы 20 мкл. Держите образец на льду и защищайте его от света.
9. Измеряйте концентрацию и чистоту РНК с помощью микрообъёмного спектрофотометра. Убедитесь, что A260/A280 примерно равен 2.0, а A260/A230 больше 2.0.

4. Подготовка реакции кластеризации РНК in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для индукции кластеризации РНК требуется спермин и PEG 8000, согласно предыдущим ^{исследованиям 2,4,5}. В частности, раствор спермина тетрагидрохлорида объёмом 100 мм, приготовленный в воде без нуклеазы, был аликотирован в несколько микроцентрифугных трубок по 1,5 мл и хранился при −20 °C.

1. Разморозить пробирку с раствором спермина 100 мМ и 50% PEG 8000 на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После открытия 50% PEG 8000 следует использовать не более двух месяцев из-за возможного износа.
2. Для приготовления 500 мкл свежеприготовленного буфера с 10× РНК объедините 50 мкл 2M KCl, 50 мкл 1M MgCl₂, 50 мкл 1M Tris (pH 7,0) и 350 мкл воды без нуклеаз. Тщательно перемешивайте, поднимая и опуская пипетер. Центрифуга на 2000 × г в течение 2 секунд в настольной миницентрифугах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для сворачивания должен быть подготовлен в день эксперимента по кластеризации РНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.3–4.4 зависят от экспериментальных условий и могут быть скорректированы по мере необходимости. Два примера условий кластеризации РНК, использованных в этом исследовании, описаны ниже. Условие ко-сворачивания адаптировано из метода, используемого для отжигания антисмысловых олигонуклеотидов в^{РНК 2}. В этом методе РНК смешиваются в соляном буфере и нагреваются вместе для стимулирования межмолекулярного соединения оснований между РНК с комплементарными последовательностями. В отличие от этого, при условии отдельного сгибания каждая РНК сворачивается отдельно перед смешиванием. Это состояние приближено к клеточному сценарию, при котором РНК складываются перед взаимодействием.
3. Кофолдинг
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это состояние способствует межмолекулярному спариванию оснований между РНК, содержащими верхнюю и нижнюю последовательности. Он служит положительным контролем для межмолекулярных оснований, управляемых репортерами, в условиях кластеризации РНК.
   1. В ПЦР-пробирке на 200 мкл смешайте по 16 пмоль каждой in vitro транскрибированной РНК, несущей либо верхнюю , либо нижнюю последовательность, 2 мкл буфера 10× сворачивающейся РНК и воду без нуклеазы до конечного объёма 14 мкл. Тщательно перемешайте, проводя пипеты вверх и вниз. Центрифуга при 2 000 × г в течение 2 секунд в настольной миницентрифугах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вычислить массу РНК, соответствующую 16 пмоль.
   2. Нагрейте образец РНК при 90 °C в течение 2 минут.
   3. Немедленно перенесите образец в RT и защитите его от света. Инкубировать реакцию на RT в течение 1 часа.
4. Отдельное складывание
   1. Нагрейте образец РНК при 90 °C в течение 2 минут, а затем сразу поставьте его на лёд минимум на 15 минут.
   2. В ПЦР-пробирке объемом 200 мкл комбинировать 16 пмоль in vitro транскрибированной РНК с верхней или нижней последовательностью, 1 мкл из 10× буфера сворачивающейся РНК и воды без нуклеазы до итогового объёма 7 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вычислить массу РНК, соответствующую 16 пмоль.
   3. Инкубировать реакцию на RT в течение 30 минут, защищая от света.
   4. Объедините образцы РНК с верхней и нижней последовательностями в одну ПЦР-пробирку. Тщательно перемешивайте, поднимая и опуская пипетер. Центрифуга при 2 000 × г в течение 2 секунд в настольной миницентрифугах. Инкубировать на RT 30 минут.
5. Добавьте 6 мкл премикса 1:2 (v/v) с 100 мМ спермина и 50% PEG 8000. Тщательно перемешивайте, поднимая и опуская пипетер. Центрифуга при 2000 × г в течение 2 секунд в настольной миницентрифугах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 50% PEG 8000 — очень вязкая. Пипетт медленно и осторожно.
6. Добавьте к реакции 2 мкл 1 мМ DFHBI-1T. Тщательно перемешивайте, поднимая и опуская пипетер. Центрифуга при 2000 × г в течение 2 секунд в настольной миницентрифугах. Реакция должна быть жёлто-зелёной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 20 мМ раствора DFHBI-1T из 1 мг лиофилизированного красителя DFHBI-1T (MW: 320.21) добавьте 156 мкл безводного DMSO молекулярно-биологического класса. Аликвотируйте бульон в небольших количествах в нескольких микроцентрифугах и храните при -20 °C. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания красителя. Приготовьте свежеразведенный рабочий раствор DFHBI-1T объемом 1 мм, разбавляя 20 мл запаса в безнуклеазной воде и храня его на льду.
7. Загрузите реакцию в стеклянное стекло с камерой.
8. Инкубировать камеру при RT 4 часа в темноте с крышкой, чтобы минимизировать испарение.

5. Подготовка к визуализации

1. Получайте трёхмерные изображения с помощью структурированного освещения или конфокального микроскопа, оснащённого соответствующими лазерами и объективами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальная микроскопия необходима для минимизации расфокусированного света.
2. Настройте микроскоп так, чтобы он сфотографировал каждую интересующую область (ROI) с каналом Cy5 сначала на каждой z-плоскости, а затем сфотографируйте тот же ROI с помощью канала GFP.
3. Установите время экспозиции на 500 мс для всех каналов. Установите мощность лазера на 80% для GFP и 40% для Cy5.
4. Сфотографируйте область скольжения вне реакционной капли на RT с помощью z-шага размера 150 нм.

6. Количественная оценка межмолекулярных пар оснований

1. Импортировать изображения в программное обеспечение для анализа^{изображений 21}. Определите каналы GFP (DFHBI-1T) и Cy5 (RNA).
2. Нарисуйте ROI в 5 × 5 пикселей внутри РНК-кластера и измерьте интегрированную плотность для обоих каналов на одной z-плоскости. Выберите 5–8 ROI из разных РНК-кластеров в каждом изображении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируйте размер ROI в зависимости от настройки камеры, но сохраняйте единообразие между экспериментами.
3. Выберите 5–8 ROI вне реакционной капли для фонового измерения и рассчитайте среднюю интегрированную плотность для обоих каналов.
4. Рассчитать нормированную интенсивность DFHBI-1T для каждого ROI с помощью следующих факторов:
   

7. Распространённые проблемы и устранение неполадок

1. Если после центрифугирования РНК-гранулы не наблюдаются, рассмотрите деградацию РНК, недостаточное время транскрипции, неактивную полимеразу, остаточные соли или низкую концентрацию РНК. Используйте реагенты без РНазы, продлевайте время транскрипции, используйте свежий фермент и очищайте шаблоны.
2. Если кластеров РНК, маркированных Cy5, не наблюдается, рассмотрите деградацию РНК или деградированный PEG 8000 или UTP-Cy5. Используйте свежие реагенты и условия, не содержащие РНазу.
3. Если сигнал DFHBI-1T не наблюдается при условиях сворачивания, рассмотрите плохое качество красителя, отсутствие образования структуры брокколи или усечённые транскрипты. Используйте свежий краситель, убедите правильный состав буфера и проверьте размер транскрипта с помощью гелевого анализа.
4. Если флуоресцентный сигнал обесцвечивает, уменьшайте мощность лазера и время экспозиции, минимизируйте этапы визуализации и защищайте образцы от света во время инкубации.

Results

В этом демонстрационном эксперименте способность только верхних и нижних РНК-репортеров создавать пары и формировать структуру брокколи была впервые оценена с помощью ранее описанного протокола кластеризации in vitro ^{РНК 4}. Спаривание оснований между верхом и низом образует две руки брокколи, каждая из которых способна интеркалировать одну молекулу DFHBI-1T (см. рисунки 1A–C^)18,22.

При индукции РНК-кластеризации сперминой и ПЭГ 8000 обе РНК образовали кластеры по отдельности или вместе (см. рисунки 1D–Eii). При изолированном исследовании верхней или нижней РНК флуоресценция DFHBI-1T внутри РНК-кластеров была значительно ниже, чем в условиях ко-сворачивания, когда обе РНК комбинировались до тепловой денатурации и повторного сворачивания (рисунок 1F). При условии совместного сворачивания молярное отношение DFHBI-1T (0,1 мМ) к верхнему (0,8 мкм) и нижней (0,8 мкм) оценивалось в 125:1:1. Это соответствует примерно 62,5-кратному превышению DFHBI-1T относительно максимального числа потенциальных структур брокколи.

Низкий, но ненулевой сигнал DFHBI-1T, наблюдаемый только для верхней и нижней частей, соответствует предыдущим отчетам, показывавшим минимальную флуоресценцию DFHBI-1T при индивидуальной экспрессии каждого репортера¹⁸. DFHBI-1T также демонстрировал очень низкую, но обнаруживаемую фоновую флуоресценцию при отсутствии РНК (рисунок 1F). В совокупности эти результаты демонстрируют, что DFHBI-1T совместим с тестом кластеризации РНК in vitro и что кофолдинг усиливает межмолекулярное спаривание основ между верхними и нижними РНК.

После нормализации до интенсивности РНК нормированная флуоресцентная интенсивность DFHBI-1T в условии ко-фолдинга достигла 1,03, что значительно выше, чем только у верхней и нижней (0,054 и 0,023 соответственно) (рисунок 1D, рисунок 1Ei и рисунок 1F). Затем изучались РНК-кластеры, образованные путём смешивания верхних и нижних РНК, которые были свернуты отдельно до кластеризации (рисунок 1D, рисунок 1E, II и рисунок 1F). В этом отдельном состоянии сгибания нормализованный сигнал DFHBI-1T составлял 0,031, что сопоставимо с базовыми уровнями, наблюдаемыми в отрицательных контролях (только сверху или снизу ) (рисунок 1F). Эти результаты показывают, что кофолдинг способствует межмолекулярному спариванию оснований между верхней и нижней РНК, тогда как раздельное сворачивание ограничивает такие взаимодействия.

Верхние и нижние последовательности затем вставлялись в 3′-нетранслированную область (UTR) отключения Drosophila melanogaster (shu), зародышную гранулу^{мРНК 4,23,24} и её антисмысловый аналог (shu^anti). Shu 3′ UTR был выбран потому, что предыдущие исследования показали, что эта РНК преимущественно существует как мономер у Drosophila melanogaster и не димеризуется даже при высоких молярных концентрациях в РНК-гелевых^{анализах 4,24}. Кроме того, шу-топ и шу-боттом не образуют гомодимеров в РНК-гелях⁴, что позволяет более непосредственно оценивать межмолекулярные взаимодействия между топом и боттом, а также влияние флангирующих последовательностей, произтичающих из шу.
Шаблоны ДНК для шу-топ, шу-боттом, шу^{анти-топ} и шу ^{анти-боттом} приведены в таблице 2. Верхняя и нижняя последовательности были вставлены в середину shu или ^{shu anti} 3′ UTR, что требовало структурного ремоделирования для облегчения взаимодействия и лучшего имитирования физиологических взаимодействий РНК-РНК, в которых взаимодействующие области обычно встроены в транскрипты⁴.

При индукции РНК-кластеризации шу-топ, шу-боттом, шу^{анти-топ} и шу анти-боттом по отдельности демонстрировали минимальную флуоресценцию DFHBI-1T, аналогичную только верхней и нижней (рисунки 2A и 2B). Последовательно, совместное складывание shu-top с shu-bottom или ^{shu анти-топа} с shu-анти-нижним обеспечивало более высокий DFHBI-1T сигнал, чем отдельное складывание (см. рисунки 2Ci и Cii). После нормализации интенсивности РНК и отрицательных контролей (определяемых как средний нормированный сигнал DFHBI-1T от каждой РНК отдельно), совместное сворачивание shu-топа и shu-боттома привело к 5,63-кратному увеличению нормированной флуоресценции DFHBI-1T (рисунки 2Di и 2Dii). В отличие от этого, отдельное складывание показало увеличение всего в 1,04 раза, сопоставимо с базовыми уровнями, наблюдаемыми для шу-топа и шу-боттома по отдельности. Похожие тенденции наблюдались для ^{shu anti-top} и shu^anti-bottom при cofolding и отдельных условиях складывания (рисунки 2Di и 2Dii). Эти результаты показывают, что раздельное сгибание не способствует межмолекулярной паре оснований между shu-top и shu-боттом, или shu^anti-top и shu anti-bottom, тогда как cofolding усиливает эти взаимодействия, вероятно, благодаря вставленным репортерным последовательностям.

Чтобы проверить, сочетаются ли базы shu и shu^anti can, shu-top смешали с shu^anti-bottom, а shu^anti-top смешали с shu-bottom. Обе комбинации демонстрировали более высокую флуоресценцию DFHBI-1T как при кофолдинге, так и при отдельных условиях складывания по сравнению с shu-top с shu-боттом или ^{shu-анти-топом} с shu-анти-боттом (рисунки 2Ci и 2Cii). После нормализации совместное сгибание shu-top с ^{shu-анти-боттом} и shu-анти-топ-с shu-боттом привело к 61,86- и 82,60-кратному увеличению флуоресценции DFHBI-1T соответственно (рисунки 2Di и 2Dii). В отличие от этого, отдельное складывание дало увеличение в 2,69 и 4,94 раза соответственно (рисунки 2Di и 2Dii). Хотя эти значения значительно ниже, чем при условиях совместного сгибания, они были выше, чем для шу-топа с шу-боттом или ^{шу-анти-топа} с shu-анти-боттом (1,04 и 1,16 соответственно).

В совокупности эти результаты показывают, что репортеры с дополнительными комплементарными последовательностями обладают большей способностью создавать базовые пары, чем те, у кого таких последовательностей нет. Этот эффект дополнительно усиливается при условии ко-сворачивания, которое способствует межмолекулярным взаимодействиям.

Рисунок 1: Прогнозируемые вторичные структуры верхней и нижней РНК и количественная оценка их межмолекулярного спарения оснований в кластерах in vitro РНК .(A–B) Примеры вторичных структур верхней (A) и нижней (B) сложившейся по отдельности, как предсказано РНКфолдом²⁵. При сгибании отдельно верх и низ не восстанавливают аптамер брокколи, и DFHBI-1T (серая звезда) производит минимальную флуоресценцию. (C) Пример вторичной структуры верхних и нижних РНК с основаниями, как предсказывается РНКк-кфолдом²⁵. Межмолекулярное спаривание оснований между двумя РНК воссоздаёт две руки^{брокколи 18}, что позволяет связываться с DFHBI-1T и приводит к сильной зелёной флуоресценции (зелёным звёздам). (D) Изображения DFHBI-1T отдельно (контроль только с красителями) и in vitro РНК-кластеров (маджента), образованных верхними и нижними РНК в присутствии DFHBI-1T (зелёный). (Ei, ii) Кластеры РНК in vitro (маджента), образующиеся верхними и нижними РНК при условиях ко-сворачивания (i) и отдельного сворачивания (ii) в присутствии DFHBI-1T (зелёный). Для панелей D и E РНК маркировались Cy5 так, что в среднем примерно треть РНК содержит один урацил с меткой Cy5, а оставшиеся две трети не имеют маркировки. Изображения представляют собой средние Z-проекции из 27 срезов, полученных с шагом 150 нм, с одинаковой экспозицией и мощностью лазера для каждого канала во всех условиях. Флуоресценция DFHBI-1T была нормализована до одинакового диапазона интенсивности в разных условиях. Полосы масштаба: 2 мкм. (F) Интенсивность DFHBI-1T была нормализована до количества РНК, измеренная флуоресценцией Cy5. Данные представлены в виде среднего ± SEM. P-значения для двухстороннего t-теста (**** против ко-фолдинга): 1,0 × 10⁻²² (только краситель), 2,3 × 10⁻²² (верх), 4,9 × 10⁻²³ (снизу) и 7,0 × 10⁻²³ (отдельное складывание). n = 30 областей для условия только красителя и 30–31 кластер РНК для всех остальных условий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Репрезентативные изображения и количественная оценка межмолекулярных пар оснований для репортеров SHU ^{и анти-носителей} SHU.(A) Изображения DFHBI-1T отдельно (контроль только с красителями) и in vitro кластеров РНК (маджента), образованных РНК shu-топ, shu-боттом, ^{shu-анти-топ} и ^{shu анти-боттом} в присутствии DFHBI-1T (зелёный). РНК были маркированы Cy5 так, что в среднем при in vitro транскрипции было включено три урацила UTP-Cy5. Изображения представляют собой средние Z-проекции из 27 срезов, полученных с шагом 150 нм, с одинаковой экспозицией и мощностью лазера для каждого канала во всех условиях. Флуоресценция DFHBI-1T была нормализована до одинакового диапазона интенсивности в разных условиях. Шкалы: 2 мкм. (B) Интенсивность DFHBI-1T была нормализована до количества РНК, измеренная флуоресценцией Cy5. Данные представлены как средние ± SEM. n.s., не значимые. P-значения для двуххвостого t-теста (против только красителя): 3,1 × 10⁻³ (**; shu-top), 1,7 × 10⁻¹ (н.с.; шу-боттом), 2,9 × 10⁻³⁵ (***; SHU анти-топ), и 2.2 × 10⁻² (; Shu Anti-Bottom). n = 30 областей для условия только красителя и 30–32 кластера РНК для всех остальных условий. (Ci, ii) Изображения кластеров РНК in vitro (маджента), образованных путём смешивания shu-top с shu-боттом, shu^anti-top с shu^anti-bottom, shu-top с shu^anti-bottom, и shu^anti-top с shu-боттом в присутствии DFHBI-1T (зелёного) при ко-фолдинге (i) и отдельном складке ( ii) условия. Изображения представляют собой средние Z-проекции из 27 срезов, полученных с шагом 150 нм, с одинаковой экспозицией и мощностью лазера для каждого канала во всех условиях. Для низкого диапазона флуоресценция DFHBI-1T была нормализована до того же диапазона интенсивности, что и рисунки 1D–Eii и рисунок 2A. Для высокого диапазона флуоресценция DFHBI-1T была нормализована до более высокого, но стабильного диапазона интенсивности во всех условиях панелей Ci и Cii. Шкалы: 2 мкм. (Di, ii) Интенсивность DFHBI-1T была нормализована сначала до интенсивности РНК, а затем до отрицательных контрольных показателей, определяемых как средний нормализованный сигнал DFHBI-1T только от каждой РНК. Данные представлены как средние ± SEM. n.s., не значимые. (i) P-значения для двуххвостого t-теста (**** против shu-top + shu-bottom): 1,1 × 10⁻³¹ (^{shu анти-топ} + shu^{анти-боттом}), 1,1 × 10⁻²² (shu-топ + ^{shu анти-боттом}) и 4,3 × 10⁻²⁷ (shu^{анти-топ} + shu-bottom). (ii) P-значения для двуххвостого t-теста (против shu-top + shu-bottom): 2,2 × 10⁻¹ (n.s.; shu анти-верх + shu анти-низ), 1,9 × 10⁻9 (; shu-top + shu^anti-bottom), и 1.3 × 10⁻¹⁵ (; Шу^{анти-верх} + шу-боттом). n = 29–32 РНК-кластера для всех условий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Название	Последовательности (5′-3′)
Промоутер T7	TAATACGACTCACTATAG
Верх	GGATGGAGACGGGGGGGGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGCGGAT
дно	GGATCCGCATCTGTCGAGTAG AGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTGTGGGC TCCATCATCC
Топ-7 нападающий	TAATACGACTCACTATAG GGATGGAGAGGGGGTCG
Верхний реверс	ATCCGCATCATCTGGACCC
нижняя часть T7 вперёд	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCTCTGTCGA
нижняя сторона	GGATGGGGGCACACT
Передние праймеры содержат перевес последовательности промоторов T7 (выделен жирным), за которым следуют последовательности, направленные на 5′-конец РНК.

Таблица 1: Последовательности промотора T7, сплит-репортеров брокколи и праймеров, используемых для амплификации шаблонов ДНК для транскрипции T7. Перечисленные праймеры использовались для создания шаблонов ДНК для in vitro транскрипции верхней и нижней РНК, которые впоследствии были применены в анализах кластеризации РНК, описанных в этом исследовании.

Название	Последовательности (5′-3′)
шу-топ	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTATTCATATTCATATCTTACTCAAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGGGGGGCCAGGATCATTCATCATGGCAAGAGACGGTCGGGGGGGTCCAGATGGCGGA TAAAAAACATACCAAACATGAAGGTTAATTTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATT AGTTATTTCGATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAAAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
шу-боттом	GCTTACTAAGAAGCCCCCAGTATTATTCATATTATTCATATTACTACTCAAAAAAAGGATCCCCCATCAT TGTCGAGTAGAGTGGGCTCTTGCCATGTGTGTGTGTGGGGGGCACATACTCTGGG ATCCTGTCGAGTGGTGGGCTCCATCCAAAAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAGCAGTATCATTAGTTATTTCGATTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTTTTTATTATTTAGAGCAACGTAGTTAAGTTGTTAA AAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
Shuanti-top	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTATTGGTTTTTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAAC TAATGATACTGCTCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTTTGGGTGTGTTTTTTTTTTTGGA TGATGGAGACGGGGGGGGGGGGGGCCAGGATCATTCATCATGGCAAGAGACGGGGGGGGGGGGGGCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATATGAAATACTGGGGCTCTTAGTAAGC
Shu Anti-Bottom	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTATTGGTTTTTTTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCHATGTTGCTAATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTTTTTGTGTGTGTTTTT GGATCCGCATCTGTCGAGTGGAGTGGGCTCTTGCCATGTGTGTGTGGGTGTGTGGCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTGGGGGCTCCATCATCCTTTTTTTGAGTTAA GATATGAAATATGAAATACTGGGGGGCTCTTTAGTAAGC
shu-top или shu-bottom-T7 вперёд	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
Шу-топ или шу-боттом-Реверс	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
shuanti-top или shu anti-bottom-T7 вперёд	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
Shuанти-верх или shuанти-низ-Реверс	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
Передние праймеры содержат перевес последовательности промоторов T7 (выделен жирным), за которым следуют последовательности, направленные на 5′-конец РНК. Между промоутером T7 и shu-top, shu-bottom или shu-bottom или shuанти-топ и shu анти-боттом были включены один-два дополнительных G. Это связано с тем, что наличие G в позициях +2 и +3 может значительно увеличить выход транскрипции— 19. Однако эти дополнительные G могут потенциально повлиять на интерпретацию пар оснований в проектируемых конструкциях. См. примечание в шаге 1.1.

Таблица 2: Последовательности шу-топ, шу-боттом, шу^{анти-топ}, шу анти-боттом и праймеры, используемые для амплификации шаблонов ДНК для транскрипции T7. Перечисленные праймеры использовались для создания шаблонов ДНК для in vitro ^{транскрипции} анти-РНК shu и shu, несущих верхний и нижний репортеры, которые впоследствии использовались в тестах кластеризации РНК, описанных в этом исследовании.

Discussion

В этом исследовании разделенная система Broccoli^{aptamer 18} была адаптирована для прямой визуализации и количественной оценки межмолекулярных пар оснований в условиях кластеризации in vitro РНК. Этот подход позволяет оценивать межмолекулярное спаривание основ в различных условиях in vitro и дополняет биохимические анализы, такие как эксперименты с вытягиванием РНК с использованием сшивателей с парами^{оснований} 15,16,17 и гель-электрофорез ^4,6,7. В отличие от этих биохимических методов, которые не обладают пространственным разрешением для различия пар основ внутри РНК-кластеров от происходящего вне них, этот подход позволяет напрямую визуализировать эти взаимодействия внутри кластеров. В частности, он позволяет отслеживать пару базовых веществ между верхними и нижними РНК, или РНК, несущими эти репортеры, при определённых условиях кластеризации РНК. Кроме того, он обеспечивает количественное считывание в реальном времени о паре баз между репортерными РНК без необходимости сшивания или экстракции РНК, минимизируя потери образца и несовместимость буферов.

С помощью флуоресцентной микроскопии межмолекулярное спаривание основ между разделёнными последовательностями аптамеров брокколи было количественно измерено с помощью сигнала DFHBI-1T, что продемонстрировало совместимость DFHBI-1T с протоколом кластеризации РНК in vitro . Степень межмолекулярного парирования основ варьировалась в зависимости от условий сворачивания РНК, как это наблюдалось при условиях кофолдинга и раздельного сворачивания (рисунок 1F и рисунок 2Di–2Dii). Эти результаты свидетельствуют о том, что условия сворачивания РНК критически влияют на межмолекулярные взаимодействия РНК и должны тщательно учитываться при интерпретации экспериментальных результатов.

Этот анализ также предоставляет платформу для оценки того, улучшают ли последовательности, окружающие верхний и нижний репортеры, межмолекулярное спаривание оснований, как это продемонстрировано с помощью shu. Флуоресценция DFHBI-1T была выше для shu-top с ^{shu anti-bottom} и shu^anti-top с shu-bottom, чем для shu-top с shu-bottom или shu ^anti-top с shu^anti-bottom, что указывает на межмолекулярные взаимодействия с участием shu и ^{shu анти} дополнительно усилить сигнал Брокколи. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что сигнал флуоресценции DFHBI-1T, полученный только в результате кофолдинга верхнего и нижнего репортеров, не является верхней границей анализа.

Флуоресценция DFHBI-1T, измеренная в этих экспериментах, охватывала широкий динамический диапазон — от увеличения в 1,04 раза (shu-top с shu-bottom при отдельном складывании) до 82,60-кратного увеличения (^{shu анти-топ} с shu-bottom при условиях совместного сгибания). Этот динамический диапазон позволяет обнаруживать различия в межмолекулярных взаимодействиях РНК между РНК, несущими эти репортеры.

Несколько этапов этого протокола критически важны для успешного обнаружения межмолекулярного спарения оснований РНК между расщеплёнными верхними и нижними РНК брокколи в кластерах РНК. Свежие аликвоты PEG 8000 следует использовать для надежной индукции кластеризации РНК, а повторяющиеся циклы замораживания–оттаивания минимизировать из-за нестабильности реагента. DFHBI-1T следует ликвидировать и хранить при −20 °C для сохранения флуоресцентных свойств. Продукты транскрипции in vitro следует анализировать на денатурирующем РНК-геле перед кластеризацией для подтверждения правильного размера транскрипта. Кроме того, крайне важно поддерживать условия без РНаз, включая чистую рабочую среду и камеру визуализации, поскольку капли РНК инкубируются при комнатной температуре в течение длительного времени перед проведением визуализации.

Одно из ограничений этого анализа заключается в том, что DFHBI-1T конкретно сообщает о межмолекулярном спаривании оснований, опосредованных верхними и нижними последовательностями. Другие события межмолекулярного парирования оснований, происходящие в разных областях РНК, не могут быть обнаружены. Кроме того, структура брокколи, образованная парой оснований верхней и нижней нити, термодинамически^{стабильна 26} и может не полностью отражать слабые или временные взаимодействия, такие как те, что образуются рассеянными, поверхностно открытыми основаниями, как это наблюдается в мРНК-кластерах зародышевых гранул Drosophila ⁴.

Кроме того, межмолекулярные взаимодействия РНК–РНК могут быть промискуитетными и неспецифичными, а последовательности, окружающие верхний и нижний репортеры, могут влиять на флуоресценцию DFHBI-1T. Эти фланговые области могут напрямую взаимодействовать с репортерными последовательностями, подавляя образование брокколи или изменяя структуру РНК, тем самым влияя на взаимодействие между РНК, несущими репортёры. Соответственно, анализ отражает совокупные эффекты структуры РНК, сверху и нижней пары оснований, взаимодействий между флангирующими последовательностями и взаимодействиями между флангирующими последовательностями и репортерами.

Этот анализ предоставляет возможности для будущих исследований. Например, изменение последовательностей РНК по бокам репортеров, введение РНК-геликазов или шаперонов, или изменение соляных условий может влиять на межмолекулярное спаривание оснований в РНК-кластерах. Такие эффекты можно оценить, измеряя сигнал DFHBI-1T при условиях кофолдинга и раздельного сгибания. Учитывая, что аналогичные РНК-аптамеры использовались в клетках, бактериях и^{дрожжах} 26,27,28,29,30, этот подход может быть распространён на целлюло-системы или модельные организмы для изучения межмолекулярных пар оснований в мРНК-кластерах.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	Миллипор Сигма	M1028	Используется для приготовления 10 раз; Буфер для разворачивания РНК.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Используется для приготовления 10 раз; Буфер для разворачивания РНК.
50% PEG 8000	NEB	M0204S	Компонент комплекта T4 РНК-лигазы; используется как реагент для молекулярного скопления для индукции кластеризации РНК.
Абсолютный этанол, 200 доказательств	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Используется для подготовки буфера промывания РНК.
Кислотный фенол: хлороформ, pH 4,5 (с IAA, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific	AM9722	Используется для очистки РНК.
Аминоаллил-UTP-Cy5	Jena Bioscience	NU-821-CY5	Используется для маркировки РНК во время транскрипции in vitro.
Камерное крышное стекло	Термо Фишер Сайентифик	155409PK	Камера визуализации реакций РНК-кластеризации.
Хлороформ	Thermo Fisher Scientific	C298-500	Используется для очистки РНК.
DFHBI-1T	Луцерна	410	Используется как флуорофор для обнаружения аптамера РНК брокколи.
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345	Безводные; по молекулярной биологии; использовался для подготовки DFHBI-1T.
Чистая и чистая ДНК Набор концентраторов	Зимо	D4014	Используется для очистки продуктов ДНК перед транскрипцией T7.
Набор для экстракции ДНК-геля	NEB	T1020L	Используется для экстракции геля.
Сухая ванна	Benchmark Scientific	BSH1001	Используется для нагрева образцов РНК в микроцентрифугных пробирках.
FIJI/ImageJ	NIH (Национальные институты здравоохранения)	Н/Д	Открытое программное обеспечение для анализа изображений; используется для количественной оценки интенсивности флуоресценции и анализа ROI.
Гель-электрофорезная система	Термо Фишер Сайентифик	B2-BP	Используется для проведения электрофореза ДНК-геля.
Гель-загрузочный краситель, фиолетовый (6 и раз;)	NEB	B7024S	Используется как загрузочный краситель для электрофореза ДНК-геля.
Микроскоп мгновенного структурированного освещения	VisiTech international	VT-iSIM	Конфокальный микроскоп, способный визуализировать флуоресценцию GFP и Cy5.
Изопропанол	Thermo Fisher Scientific	327272500	Используется для очистки РНК.
Транскрипционный набор MEGAscript T7	Thermo Fisher Scientific	AM1334	Используется для транскрипции in vitro T7. В комплект входят нуклеотидные растворы (АТФ, КТФ, ГТФ, УТФ) и ДНКаза.
Микроцентрифугальные трубки	Genesee Scientific	22-284	Трубка 1,5 мл; используется для хранения ДНК-шаблонов для in vitro транскрипции, продуктов РНК и аликвотов спермина и DFHBI-1T.
Мини-центрифуга	Benchmark Scientific	Z763845	Используется для кратковременной центрифугации.
Спектрофотометр Nanodrop One	Термо Фишер Сайентифик	13-400-518	Микрообъёмный спектрофотометр для измерения концентрации и качества ДНК и РНК.
Вода без нуклеазы	Thermo Fisher Scientific	AM9937	Используется для ресуспензии РНК-гранул, приготовления РНК-промыва и буферов для сворачивания, а также для разведения спермина и DFHBI-1T.
Онлайн-калькулятор молярной массы	Биолаборатории Новой Англии (NEB)	Н/Д	Онлайн-инструмент для расчёта массы РНК из молярного количества (например, pmol).
Полипропиленовые ПЦР-трубки	Корнинг	3745	200 и мю; ПЦР-трубки L, используемые для ПЦР, транскрипции in vitro и реакций РНК-кластеризации
Базовый блок питания PowerPac	Био-радиация	1645050	Используется для проведения электрофореза ДНК-геля.
Термоцикл Proflex ПЦР	Термо Фишер Сайентифик	44-840-73	Используется для ПЦР, транскрипции in vitro и нагревающих образцов РНК в ПЦР-пробирках.
Q5 High-Fidelity 2 и раза; Мастер-микс	NEB	M0492S	Используется как 2× Мастер-микс высокого качества.
Рефрижераторный центрифуга	Эппендорф	5424R	Используется для очистки РНК и гранулирования.
Раствор для дезактивации RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9782	Используется для очистки лабораторных столов и поверхностей, чтобы минимизировать загрязнение РНазой.
Спермин  Тетрагидрохлорид	Сигма-Олдрич	S1141-1G	Используется для индуцирования кластеризации РНК.
База Трис	Миллипор Сигма	T1503-1KG	Используется для подготовки буфера Tris (pH 7.0).
Ультрачистая агароза	Thermo Fisher Scientific	16500500	Используется для электрофореза ДНК-геля.