Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса

Summary

Этот протокол предлагает эффективный рабочий процесс для микроскопии с помощью локализации одной молекулы изолированных ядер Arabidopsis с использованием оптимизированной изоляции, фиксации и маркировки для достижения надёжной наномасштабной визуализации хроматина и РНК-полимеразы II. Этот подход легко адаптируется к другим белкам, ассоциируемым с хроматином, или к модификациям гистонов для высокоразрешающей визуализации.

Abstract

Хотя конфокальная флуоресцентная микроскопия дала ценные сведения об организации хроматина в ядрах растений, её дифракциально-ограниченное разрешение ограничивает изучение архитектуры хроматина, что стимулирует применение сверхразрешённых методов, таких как микроскопия локализации одной молекулы (SMLM). Среди этих подходов прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM) обеспечивает наномасштабное разрешение в отдельных клетках, обеспечивая точную визуализацию доменов хроматина, модификации гистонов и организацию ядер. Хотя такие методы всё чаще применяются в млекопитающих, их применение в биологии растений остаётся ограниченным, в основном из-за технических сложностей при подготовке образцов.

Здесь мы представляем упрощённый и воспроизводимый рабочий процесс для SMLM-визуализации ядер, выделенных из Arabidopsis thaliana. Этот протокол начинается с фиксации сеянцев для сохранения морфологии ядер, затем следует мягкое нарезывание тканей и центрифугирование для обогащения целостных ядер. Изолированные ядра затем маркируются фторофором в жидкой среде и иммобилизуются на низкоплавящих агарозных прокладках — стратегия, повышающая стабильность при длительном сеансе мономолекульной визуализации. Эти шаги в совокупности минимизируют фоновую флуоресценцию, улучшают согласованность маркировки и повышают воспроизводимость между биологическими репликатами.

Полученные препараты обеспечивают повышенную прозрачность для визуализации модификаций хроматина и ядерной архитектуры в растениях. Снижая технические барьеры для внедрения SMLM-визуализации в Arabidopsis, этот протокол предоставляет универсальный способ для изучения эпигенетической регуляции, организации хроматина и топологических вариаций ядра на наноуровне. Эта работа закладывает методологическую основу применения SMLM к растениям, преодолевая разрыв с биологией клеток млекопитающих и открывая новые возможности для изучения того, как ядерная архитектура влияет на регуляцию генома в ответ на факторы развития и окружающую среду в растительных системах.

Introduction

Микроскопия давно является краеугольным камнем для изучения структуры хроматина и ядерной архитектуры, показывая, как ДНК и белки, связанные с гистонами, расположены в трёхмерном ядерном пространстве и влияют на регуляцию^{генов 1,2}. Традиционная флуоресцентная микроскопия дала ценные знания о крупномасштабных доменах хроматина, таких как хромосомные территории, хромоцентры и ядерные^{тела 3,4}, возможные in situ, особенно в корневых тканях^{растений 3,5,6}. Однако эти методы фундаментально ограничены дифракционным барьером света, что ограничивает пространственное разрешение примерно 200 нм по бокам и 500 нм по^{оси 7}. Это ограничение скрывает наномасштабные детали сворачивания хроматина, паттернов модификации гистонов и транскрипционной компартментализации, лежащих в основе эпигенетической регуляции. Для преодоления этого барьера были разработаны методы микроскопии с высоким разрешением (SRM), такие как микроскопия структурированного освещения (SIM)⁸, стимулированное истощение излучения (STED)^9,10 и микроскопия локализации одной молекулы (SMLM^)11,12, достигающие разрешения от 100 нм до нескольких нм¹³.

Среди методов SRM SMLM — включая фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM)¹³ и прямую стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию (dSTORM) — предлагает исключительное пространственное разрешение в сочетании с молекулярной^{специфичностью 14}. Обнаруживая положения отдельных флуорофоров со временем, SMLM воссоздаёт высокоточные наноизображения доменов хроматина, гистоновых отметок и ядерных структур в отдельных^{клетках 15,16}. Эта возможность преобразила исследования хроматина в системах млекопитающих, где SMLM применяется для визуализации кластеризации нуклеосом, уплотнения хроматина и паттернов модификации гистонов с беспрецедентной^{детализацией} 15,16,17. В отличие от этого, применение SMLM к ядрам растений остаётся ограниченным, в основном из-за технических сложностей, связанных с свойствами тканей растений — таких как высокая автофлуоресценция, жёсткость клеточных стенок и наличие соединений, рассеивающих свет, таких как крахмал и^{хлорофилл-18}. Кроме того, деликатность ядер при изоляции и маркировке требует оптимизированных рабочих процессов для поддержания структурной целостности и минимизации фоновых флуоресценций во время длительных сеансов визуализации.

Описанный здесь протокол был изначально разработан Элизабет Красик-Дайер и Селией Бару для микроскопии с стимулированным эмиссией (STED)¹⁹. Впоследствии он был оптимизирован и адаптирован для удовлетворения специфических требований STORM-визуализации с интеграцией знаний, полученных из опубликованных микробиологических^{приложений 20, 21, 22}. Общая цель — обеспечить упрощённый и воспроизводимый рабочий процесс для SMLM-визуализации изолированных ядер Arabidopsis thaliana. Интегрируя оптимальную фиксацию, мягкое механическое нарушение и флюорофорную маркировку в суспензии, этот метод сохраняет ядерную морфологию и эффективно удаляет цитоплазматические загрязнители, которые часто ухудшают качество визуализации. Иммобилизация размеченных ядер на агарозных площадках с низким уровнем плавления обеспечивает механическую стабильность при получении, позволяя проводить долгосрочную мономолекулярную визуализацию с наноточной точностью. По сравнению с ранее описанными протоколами SRM для ядер растений — особенно основанными на микроскопии^{STED 19,23} — этот рабочий процесс использует фотопереключаемые флуорофоры (например, AF647, JF549) и снижает фоновую флуоресценцию благодаря этапам промывания, удаляющим хлорофилл и тканевые остатки, а также улучшает однородность маркировки за счёт добавления меченых молекул непосредственно к фиксированным и проницаемым ядрам. В результате это позволяет последовательно визуализировать модификации хроматина, ядерные компартменты и эпигенетические паттерны в отдельных ядрах. Снижая технические барьеры для внедрения SMLM в растениях, этот метод расширяет доступность наномасштабной визуализации и создаёт основу для изучения того, как организация хроматина и ядерная архитектура вносят вклад в регуляцию генов в ответ на факторы развития и окружающей среды.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о материалах и инструментах, используемых в данном протоколе, доступна в Таблице материалов. Если не указано иное, буферы очищаются на апирогенных фильтрах 0,2 мкм. Двойной дистиллированный ультра-чистый H₂O (ddH₂O) используется на протяжении всего протокола. Этапы центрифугирования выполняются в микротрубках объёмом 1,5 мл с использованием ротора с фиксированным углом.

1. Фиксация сеженцев и высвобождение ядер

1. Поместите 6-колодную культивационную пластину на лёд под вытяжку, затем добавьте в каждую скважину примерно 4 мл раствора ледяной фиксации, приготовленного экспромтно под вытяжкой (4% (v/v) метанол-стабилизированный формальдегид, 0,1% тритон X-100 в 1× фосфатно-буферный физиологический раствор [PBS]).
2. Используя чистые щипцы, удаляйте сеянцы (от 8 до 15 дней после прорастания), выращенные на твердых (0,8% агаре) полукрепких солях Murashige и Skoog Medium 2,2 г/л MS, 1% сахарозы (w/v), pH 5,7, как описано для сеянцев MS в^{ссылке 24}, и сразу же погрузите их в фиксационный раствор. Используйте одну скважину примерно для 20 сеянцев (для получения достаточного количества материала на образец требовалось 3 колодца).
3. Поместите пластину в вакуумную камеру, заполненную льдом, и подайте вакуум при циклах давления от 0,2 бар до 0,8 бар в течение 15 минут, чтобы удалить захваченный воздух и обеспечить глубокое проникновение фиксатива в ткани^{растения.} Медленно отпустите вакуум, перемешайте образец и затем примените вакуум ещё 15 минут.
4. Под вытяжкой удалите фиксационный раствор пипеткой и промыйте каждую колодцу 3 раза в течение 10 минут при мягком перемешивании, используя 5 мл ледяного PBS.
5. Удалите PBS и используйте щипцы, чтобы перенести фиксированную ткань в чашку Петри диаметром 120 мм × 120 мм. Добавьте к фиксированной всходу 50 мкл буфера изоляции ядер (NIB), подготовленного по описанию Красик-Дайера и Бару (45 мМ MgCl₂, 20 мМ MOPS, 30 мМ цитрат натрия, 0,3% Тритон X-100). Отрегулировать pH 7 с помощью 1 N HCl)¹⁹. Чип с лезвием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клинки микротома оказались более эффективными, чем обычные лезвия для этой задачи.
6. Соскребли нарезанную ткань к одному краю чашки Петри той же лезвием и добавьте 600 мкл NIB, обязательно смывая всю прилипшую ткань к лезвию.
7. Перенесите тканевую суспензию в 2-мл гомогенизаторную трубку Dounce и проведите 5–10 раз меньшим пестиком, затем большим пестиком, пока он плавно не перемещается внутри трубки (обычно требуется 5–10 ударов).
8. Отфильтруйте полученный гомогенизированный образец через сетчатый фильтр толщиной 30 мкм в микропробирку объёмом 1,5 мл.
9. Центрифугуйте подвеску на 10 минут при давлении 800 × g , используя минимальную рампу для ускорения и торможения. Среди зелёного тканевого остатка видна маленькая белая гранула.
10. Сбросьте супернатант и подвесите гранулу в 150 мкл NIB.
11. Снова центрифугуйте на 10 минут при 800 × г и удалите супернатант. Если есть видимый зелёный мусор, помойте их во второй раз. Повторно суспензировать 50 мкл до 150 мкл NIB, исходя из размера гранулы.
12. Сохраняйте полученную суспензию изолированных ядер при температуре 4 °C максимум 1 неделю перед проведением окрашивания. Однако рекомендуется действовать немедленно.

2. (Иммунно)окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих этапах протокол применяется к объему суспензии ядер объемом 50 мкл, что обычно соответствует 20 сеянкам. Если не указано, следующие шаги выполняются при комнатной температуре.

1. Центрифугуйте раствор на 10 минут при 800 × г и сбросьте супернатант. Будьте осторожны, чтобы не трогать гранулы.
2. Суспензировать ядра аккуратным пипетированием в 50 мкл блокирующего буфера (143 мМ NaCl, 4% BSA в PBS, хранится при 4 °C). Инкубировать 30 минут при лёгком перемешивании.
3. Центрифугуйте раствор в течение 10 минут при 800 × г и сбросьте супернатант, не касаясь ядер.
4. Ресуспензировать ядра аккуратным пипетированием в 50 мкл 1× PBS. Снова центрифугу на 10 минут при 800 × g. Отбросьте супернатант, как выше.
5. Ресуспензировать ядра в 50 мкл раствора первичного антитела, приготовленного в буфере иммунного окрашивания, состоящего из 143 мМ NaCl, 1% BSA, 0,05% Tween 20 в PBS (антитела и рабочие разведения подробно описаны в Таблице материалов). Инкубировать образцы в течение 60 минут при лёгком перемешивании.
6. Выполните 2 промывки (повторите шаги 2.3 и 2.4).
7. Ресуспензировать ядра в 50 мкл козьего антитела AF647 с разбавлением^{1/200 26}. Оберните трубки алюминиевой фольгой, чтобы защитить флуорофор от света. Инкубировать трубки в течение 60 минут при лёгком перемешивании.
8. Выполните 2 промывки (повторите шаги 2.3 и 2.4).
9. Повторно подвесьте гранулу в 50 мкл NIB. Подвеску храните в микротрубках объёмом 1,5 мл, обёрнутых алюминиевой фольгой. Маркировка стабильна в течение нескольких недель при 4 °C.

3. Посадка

1. Для STORM-визуализации приготовьте раствор агарозы с низким уровнем плавления (LMA 1,5% w/v), растворив порошок в буфере B 1,25× состоящем из 50 мМ Tris pH 8, 10 мМ NaCl, 10% глюкозы. Приготовьте 1,25× раствор для бульона и храните при 4 °C.
2. Нагрейте при 90 °C в течение 1 минуты, чтобы растворить порошок и получить прозрачный раствор. Охладите и поддерживайте расплавленный раствор LMA при 37 °C перед следующим шагом для предотвращения термической денатурации буфера глюкозооксидазы (GLOX) (приготовьте 10-кратный раствор, хранящийся при -20°C, состоящий из 100 мМ Tris pH 7,5, 25 мМ KCl, 1 мМ TCEP pH 7,0, 5 мг/мл глюкозооксидазы, 0,4 мг/мл каталазы, 50% глицерина v/v).
3. После того как раствор LMA достигнет 37 °C, подготовьте буфер STORM, добавив 100 мМ меркаптоэтиламина (MEA) и GLOX в тёплый раствор LMA для достижения конечной концентрации 1×. Храните раствор MEA 1 M до месяца при 4 °C, но рекомендуется использовать свежеприготовленный раствор. Аккуратно перемешивайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для необязательной маркировки ДНК добавьте 1,5 нм (окончательная концентрация, 1 мМ раствора в DMSO) сопряжённого по JF549 Hoechst. Держите подвеску на 37 °C до использования.
4. Аккуратно смешайте суспензию ядер с наноалмазами при разбавлении 1/1500. Инкубировать их вместе с образцом в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наноалмазы служат фидуциальными маркерами для коррекции дрейфа образца.
5. Нанесите 10 мкл смеси на обработанный озоновым покрытием 1,5 часа (20 минут в системе ультрафиолетовой озоновой очистки) и подождите 3 минуты, чтобы ядра отложились на покрытии.
6. Удалите лишнюю жидкость, подождите 2 минуты. Добавьте 10 мкл LMA, приготовленного на шаге 3.3, в накладку и немедленно накройте микроскопическим стеклом.
7. Герметизируйте накладку силиконовым герметиком. Смешайте равные количества раствора A и B в небольшой чашке Петри с помощью наконечника микропипетки. Нанесите смесь по краям накладки, чтобы герметизировать образец. Силиконовый герметик затвердевает в течение 5 минут.
8. После установки проводите визуализацию стекла без задержек, в конечном итоге в течение следующих 4–5 часов, чтобы избежать потери свойств монтажной площадки по поглощанию кислорода.

4. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры визуализации должны быть тщательно оптимизированы с учётом характера образца, фотофизических свойств флуорофоров и оптической конфигурации микроскопа. Крайне важно обеспечить высокое соотношение сигнал/шум для каждого флуорофора, минимизируя спектральное просачивание и перекрёстное возбуждение между флуоресцентными каналами. Образцы наблюдались с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащённого масляным иммерсионным объективом с высоким уровнем NA 100x, блоком для поддержания фокуса и белым светодиодом для яркополевой съёмки. Флуоресцентные метки AlexaFluor647 (AF647) возбуждались на 640 нм, а JF549-Hoechst — на 561 нм. Излучаемый свет фильтровался с помощью совместимого дихроического зеркала и полосного фильтра(ов), а затем изображения собирались с помощью научной камеры комплементарного металл-оксид-полупроводника (sCMOS).

1. Установите слайд для сэмпла и найдите фокус. Активируйте модуль поддержания фокуса, если он есть в системе (настоятельно рекомендуется для длительных приобретений).
2. Найдите и сосредоточьтесь на ядре. Лучше иметь один или несколько наноалмазов рядом с интересующим ядром, чтобы более эффективно корректировать дрейф во время реконструкции.
3. (По желанию) Захватывайте дифракционно ограниченные снимки яркого поля и каждого люминесцентного канала при низкой мощности лазера.
4. При двухцветной съёмке начинайте с получения более длинного волнового канала, а затем переходите на канал с более короткой длиной волны (то есть приобретите канал AF647 до JF549).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пример параметров приобретения, использованных в этой работе:
   Канал A — маркировка эпитопа — AF647
   Время экспозиции: 20 мс
   Интенсивность лазера: 640 нм – 2,2 кВт/^см²
   Режим возбуждения: HiLo²⁷
   Канал B — маркировка ДНК — JF549-Hoechst
   Время экспозиции: 50 мс
   Интенсивность лазера: 561 нм - 1 кВт/^см²
   Режим возбуждения: Эпинефрин
   Количество записанных изображений: 10 000–30 000 на канал, что гарантирует достаточно малую плотность флуорофоров на кадр для точной локализации по одной молекулы, а накопленное количество локализаций было эмпирически определено с помощью сверхразрешения QUantitative Image Rating and Reporting of Error Location (SQUIRREL)²⁸, что также указывает на достаточное количество кадров.

Results

Описанный выше протокол позволяет подготовить высококачественные ядра Arabidopsis thaliana , подходящие для SMLM. Было проведено несколько этапов оптимизации для улучшения ядерной целостности и снижения количества цитоплазматического и клеточного мусора, ухудшающего качество изображения. После каждого этапа оптимизации качество ядерных препаратов оценивалось с помощью конфокальной визуализации с помощью вращающегося диска Olympus IX81 перед переходом к сверхразрешающему получению.

Discussion

Подготовка ядер Arabidopsis thaliana для одномолекулярной локализационной микроскопии (SMLM) требует нескольких критических этапов, которые сильно влияют на качество конечного образца. Как было описано^{ранее 19,35}, тщательная и последовательная обработка тканей необходима для максимального восстановления целых ядер. Использование микротомных лезвий вместо стандартных бритвенных обеспечивает более чистую и равномерную фраг...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Первичное антитело, используемое в иммуногистахимической буферной смеси в разведении 1/200 для визуализации активной формы полимеразы (поликлональное антитело, выработанное у кролика)
Программное обеспечение для регистрации	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Белок сыворотки быка	Sigma-Aldrich	A7906
Каталаза	Sigma-Aldrich	C40
Сертифицированная агар-агар с низкой температурой плавления	Bio-Rad	1613111
Покрытые стеклом толщиной 1.5H круглые предметные стёкла	Marienfeld	117640	Ø: 24 мм
D-(+)-Глюкоза, безводная, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Дихроическое зеркало	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Дихроическое зеркало для разделения возбуждения/эмиссии
Фосфатный буфер Дульбекко 10´	biowest	X0515 - 500	Работа в стерильных условиях
Одноразовые лезвия для микротомов Epredia Ultra	FisherScientific	12191830	Низкий профиль, одноразовые
Культуральный блок Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell с крышкой	Falcon	353046
Формальдегидный раствор 37%	Carl Roth	7398	Работа под вытяжной вытяжкой
Глюкозооксидаза	Sigma-Aldrich	G2133
Глицерил	VWR	24388.295
Коза анти-кролика IgG (H+L) сильно перекрестно-адсорбированный вторичный антиген, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Используется в разведении 1/200 как вторичное антиген, связанное с AF647
Раствор Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	94403	Используется в разведении 1/500 для контрастирования ДНК, добавляется к агар-агар пакету
Раствор соляной кислоты	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Используется для контрастирования ДНК, добавляется к агар-агар пакету с конечной концентрацией 1.5 нМ
Набор для измельчения ткани JFMBLE Dounce	Sigma-Aldrich	D8938	2 мл трубки с обоими большими (0.0030-0.0050 дюйма) и малым (0.0005-0.0025 дюйма) промежутками пестиков
Лазерный блок	Oxxius	L6Cc	Оснащен шестью лазерами: 405 нм - 100 мВт, 488 нм - 200 мВт, 532 нм - 500 мВт, 561 нм - 300 мВт, 640 нм - 500 мВт и 730 нм - 30 мВт
Гексагидрат хлорида магния	Carl Roth	HN03
Меркаптоэтиламин (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
Натриевая соль MOPS 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Многополосный фильтр излучения	Semrock	FF01-446/523/600/677	Многополосная фильтрация излучения для блокирования света, рассеянного лазером
Наноалмазы	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Запас 1 мг/мл
Цифровая CMOS-камера ORCA-Fusion	Hamamatsu	C14440-20UP
Петри чаша, 100/20 мм, PS, прозрачная, с вентиляцией, стерильная	Greiner Bio-One	664161	Используется для выращивания растений на 1/2 среды MS
Петри чаша, квадратная, PS, прозрачная, 120/120/17 мм, стерильная	Greiner Bio-One	688161	Используется при резке саженцев растений
Плоскостная пленка pluriStrainer Mini	pluriSelect	43-10030-50	Размер сетки 30 µm, подходит для 1.5 мл пробирки Eppendorf
Хлорид калия	Sigma-Aldrich	P9333
Однополосный фильтр излучения	Semrock	FF01-698/70	Специальный фильтр излучения для канала AF647
Однополосный фильтр излучения	Chroma	ET600/50m	Специальный фильтр излучения для канала JF549
Хлорид натрия (99,5%)	Euromedex	1112-A
Слайды Star-Frost 76 x 26 мм	Knittel	VS112711FKB.01
Стерильный фильтр для шприцаø 33 мм пористость 0.2 µm Luer Lock конус	ClearLine	146560
Система сверхвысокого разрешения	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83, оснащенный масляным объективом 100x NA1.5
Тринатрийцитрат 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO