Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса

348 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70891

⸱

8 мая 2026 г.

 ,  ,  , 
1Institut de Biologie Structurale, CEA, CNRS, Université Grenoble Alpes, 2Plant and Cell Physiology Lab (LPCV), Bioscience and Biotechnology Institute of Grenoble, Grenoble Alpes University - CNRS - INRAE - CEA, 3Integrated Structural Biology Grenoble (ISBG) CNRS, CEA, Université Grenoble Alpes

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предлагает эффективный рабочий процесс для микроскопии с помощью локализации одной молекулы изолированных ядер Arabidopsis с использованием оптимизированной изоляции, фиксации и маркировки для достижения надёжной наномасштабной визуализации хроматина и РНК-полимеразы II. Этот подход легко адаптируется к другим белкам, ассоциируемым с хроматином, или к модификациям гистонов для высокоразрешающей визуализации.

Аннотация

Хотя конфокальная флуоресцентная микроскопия дала ценные сведения об организации хроматина в ядрах растений, её дифракциально-ограниченное разрешение ограничивает изучение архитектуры хроматина, что стимулирует применение сверхразрешённых методов, таких как микроскопия локализации одной молекулы (SMLM). Среди этих подходов прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM) обеспечивает наномасштабное разрешение в отдельных клетках, обеспечивая точную визуализацию доменов хроматина, модификации гистонов и организацию ядер. Хотя такие методы всё чаще применяются в млекопитающих, их применение в биологии растений остаётся ограниченным, в основном из-за технических сложностей при подготовке образцов.

Здесь мы представляем упрощённый и воспроизводимый рабочий процесс для SMLM-визуализации ядер, выделенных из Arabidopsis thaliana. Этот протокол начинается с фиксации сеянцев для сохранения морфологии ядер, затем следует мягкое нарезывание тканей и центрифугирование для обогащения целостных ядер. Изолированные ядра затем маркируются фторофором в жидкой среде и иммобилизуются на низкоплавящих агарозных прокладках — стратегия, повышающая стабильность при длительном сеансе мономолекульной визуализации. Эти шаги в совокупности минимизируют фоновую флуоресценцию, улучшают согласованность маркировки и повышают воспроизводимость между биологическими репликатами.

Полученные препараты обеспечивают повышенную прозрачность для визуализации модификаций хроматина и ядерной архитектуры в растениях. Снижая технические барьеры для внедрения SMLM-визуализации в Arabidopsis, этот протокол предоставляет универсальный способ для изучения эпигенетической регуляции, организации хроматина и топологических вариаций ядра на наноуровне. Эта работа закладывает методологическую основу применения SMLM к растениям, преодолевая разрыв с биологией клеток млекопитающих и открывая новые возможности для изучения того, как ядерная архитектура влияет на регуляцию генома в ответ на факторы развития и окружающую среду в растительных системах.

Введение

Микроскопия давно является краеугольным камнем для изучения структуры хроматина и ядерной архитектуры, показывая, как ДНК и белки, связанные с гистонами, расположены в трёхмерном ядерном пространстве и влияют на регуляциюгенов 1,2. Традиционная флуоресцентная микроскопия дала ценные знания о крупномасштабных доменах хроматина, таких как хромосомные территории, хромоцентры и ядерныетела 3,4, возможные in situ, особенно в корневых тканяхрастений 3,5,6. Однако эти методы фундаментально ограничены дифракционным барьером света, что ограничивает пространственное разрешение примерно 200 нм по бокам и 500 нм пооси 7. Это ограничение скрывает наномасштабные детали сворачивания хроматина, паттернов модификации гистонов и транскрипционной компартментализации, лежащих в основе эпигенетической регуляции. Для преодоления этого барьера были разработаны методы микроскопии с высоким разрешением (SRM), такие как микроскопия структурированного освещения (SIM)8, стимулированное истощение излучения (STED)9,10 и микроскопия локализации одной молекулы (SMLM)11,12, достигающие разрешения от 100 нм до нескольких нм13.

Среди методов SRM SMLM — включая фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM)13 и прямую стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию (dSTORM) — предлагает исключительное пространственное разрешение в сочетании с молекулярнойспецифичностью 14. Обнаруживая положения отдельных флуорофоров со временем, SMLM воссоздаёт высокоточные наноизображения доменов хроматина, гистоновых отметок и ядерных структур в отдельныхклетках 15,16. Эта возможность преобразила исследования хроматина в системах млекопитающих, где SMLM применяется для визуализации кластеризации нуклеосом, уплотнения хроматина и паттернов модификации гистонов с беспрецедентнойдетализацией 15,16,17. В отличие от этого, применение SMLM к ядрам растений остаётся ограниченным, в основном из-за технических сложностей, связанных с свойствами тканей растений — таких как высокая автофлуоресценция, жёсткость клеточных стенок и наличие соединений, рассеивающих свет, таких как крахмал ихлорофилл-18. Кроме того, деликатность ядер при изоляции и маркировке требует оптимизированных рабочих процессов для поддержания структурной целостности и минимизации фоновых флуоресценций во время длительных сеансов визуализации.

Описанный здесь протокол был изначально разработан Элизабет Красик-Дайер и Селией Бару для микроскопии с стимулированным эмиссией (STED)19. Впоследствии он был оптимизирован и адаптирован для удовлетворения специфических требований STORM-визуализации с интеграцией знаний, полученных из опубликованных микробиологическихприложений 20, 21, 22. Общая цель — обеспечить упрощённый и воспроизводимый рабочий процесс для SMLM-визуализации изолированных ядер Arabidopsis thaliana. Интегрируя оптимальную фиксацию, мягкое механическое нарушение и флюорофорную маркировку в суспензии, этот метод сохраняет ядерную морфологию и эффективно удаляет цитоплазматические загрязнители, которые часто ухудшают качество визуализации. Иммобилизация размеченных ядер на агарозных площадках с низким уровнем плавления обеспечивает механическую стабильность при получении, позволяя проводить долгосрочную мономолекулярную визуализацию с наноточной точностью. По сравнению с ранее описанными протоколами SRM для ядер растений — особенно основанными на микроскопииSTED 19,23 — этот рабочий процесс использует фотопереключаемые флуорофоры (например, AF647, JF549) и снижает фоновую флуоресценцию благодаря этапам промывания, удаляющим хлорофилл и тканевые остатки, а также улучшает однородность маркировки за счёт добавления меченых молекул непосредственно к фиксированным и проницаемым ядрам. В результате это позволяет последовательно визуализировать модификации хроматина, ядерные компартменты и эпигенетические паттерны в отдельных ядрах. Снижая технические барьеры для внедрения SMLM в растениях, этот метод расширяет доступность наномасштабной визуализации и создаёт основу для изучения того, как организация хроматина и ядерная архитектура вносят вклад в регуляцию генов в ответ на факторы развития и окружающей среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о материалах и инструментах, используемых в данном протоколе, доступна в Таблице материалов. Если не указано иное, буферы очищаются на апирогенных фильтрах 0,2 мкм. Двойной дистиллированный ультра-чистый H2O (ddH2O) используется на протяжении всего протокола. Этапы центрифугирования выполняются в микротрубках объёмом 1,5 мл с использованием ротора с фиксированным углом.

1. Фиксация сеженцев и высвобождение ядер

  1. Поместите 6-колодную культивационную пластину на лёд под вытяжку, затем добавьте в каждую скважину примерно 4 мл раствора ледяной фиксации, приготовленного экспромтно под вытяжкой (4% (v/v) метанол-стабилизированный формальдегид, 0,1% тритон X-100 в 1× фосфатно-буферный физиологический раствор [PBS]).
  2. Используя чистые щипцы, удаляйте сеянцы (от 8 до 15 дней после прорастания), выращенные на твердых (0,8% агаре) полукрепких солях Murashige и Skoog Medium 2,2 г/л MS, 1% сахарозы (w/v), pH 5,7, как описано для сеянцев MS вссылке 24, и сразу же погрузите их в фиксационный раствор. Используйте одну скважину примерно для 20 сеянцев (для получения достаточного количества материала на образец требовалось 3 колодца).
  3. Поместите пластину в вакуумную камеру, заполненную льдом, и подайте вакуум при циклах давления от 0,2 бар до 0,8 бар в течение 15 минут, чтобы удалить захваченный воздух и обеспечить глубокое проникновение фиксатива в тканирастения. Медленно отпустите вакуум, перемешайте образец и затем примените вакуум ещё 15 минут.
  4. Под вытяжкой удалите фиксационный раствор пипеткой и промыйте каждую колодцу 3 раза в течение 10 минут при мягком перемешивании, используя 5 мл ледяного PBS.
  5. Удалите PBS и используйте щипцы, чтобы перенести фиксированную ткань в чашку Петри диаметром 120 мм × 120 мм. Добавьте к фиксированной всходу 50 мкл буфера изоляции ядер (NIB), подготовленного по описанию Красик-Дайера и Бару (45 мМ MgCl2, 20 мМ MOPS, 30 мМ цитрат натрия, 0,3% Тритон X-100). Отрегулировать pH 7 с помощью 1 N HCl)19. Чип с лезвием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клинки микротома оказались более эффективными, чем обычные лезвия для этой задачи.
  6. Соскребли нарезанную ткань к одному краю чашки Петри той же лезвием и добавьте 600 мкл NIB, обязательно смывая всю прилипшую ткань к лезвию.
  7. Перенесите тканевую суспензию в 2-мл гомогенизаторную трубку Dounce и проведите 5–10 раз меньшим пестиком, затем большим пестиком, пока он плавно не перемещается внутри трубки (обычно требуется 5–10 ударов).
  8. Отфильтруйте полученный гомогенизированный образец через сетчатый фильтр толщиной 30 мкм в микропробирку объёмом 1,5 мл.
  9. Центрифугуйте подвеску на 10 минут при давлении 800 × g , используя минимальную рампу для ускорения и торможения. Среди зелёного тканевого остатка видна маленькая белая гранула.
  10. Сбросьте супернатант и подвесите гранулу в 150 мкл NIB.
  11. Снова центрифугуйте на 10 минут при 800 × г и удалите супернатант. Если есть видимый зелёный мусор, помойте их во второй раз. Повторно суспензировать 50 мкл до 150 мкл NIB, исходя из размера гранулы.
  12. Сохраняйте полученную суспензию изолированных ядер при температуре 4 °C максимум 1 неделю перед проведением окрашивания. Однако рекомендуется действовать немедленно.

2. (Иммунно)окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих этапах протокол применяется к объему суспензии ядер объемом 50 мкл, что обычно соответствует 20 сеянкам. Если не указано, следующие шаги выполняются при комнатной температуре.

  1. Центрифугуйте раствор на 10 минут при 800 × г и сбросьте супернатант. Будьте осторожны, чтобы не трогать гранулы.
  2. Суспензировать ядра аккуратным пипетированием в 50 мкл блокирующего буфера (143 мМ NaCl, 4% BSA в PBS, хранится при 4 °C). Инкубировать 30 минут при лёгком перемешивании.
  3. Центрифугуйте раствор в течение 10 минут при 800 × г и сбросьте супернатант, не касаясь ядер.
  4. Ресуспензировать ядра аккуратным пипетированием в 50 мкл 1× PBS. Снова центрифугу на 10 минут при 800 × g. Отбросьте супернатант, как выше.
  5. Ресуспензировать ядра в 50 мкл раствора первичного антитела, приготовленного в буфере иммунного окрашивания, состоящего из 143 мМ NaCl, 1% BSA, 0,05% Tween 20 в PBS (антитела и рабочие разведения подробно описаны в Таблице материалов). Инкубировать образцы в течение 60 минут при лёгком перемешивании.
  6. Выполните 2 промывки (повторите шаги 2.3 и 2.4).
  7. Ресуспензировать ядра в 50 мкл козьего антитела AF647 с разбавлением1/200 26. Оберните трубки алюминиевой фольгой, чтобы защитить флуорофор от света. Инкубировать трубки в течение 60 минут при лёгком перемешивании.
  8. Выполните 2 промывки (повторите шаги 2.3 и 2.4).
  9. Повторно подвесьте гранулу в 50 мкл NIB. Подвеску храните в микротрубках объёмом 1,5 мл, обёрнутых алюминиевой фольгой. Маркировка стабильна в течение нескольких недель при 4 °C.

3. Посадка

  1. Для STORM-визуализации приготовьте раствор агарозы с низким уровнем плавления (LMA 1,5% w/v), растворив порошок в буфере B 1,25× состоящем из 50 мМ Tris pH 8, 10 мМ NaCl, 10% глюкозы. Приготовьте 1,25× раствор для бульона и храните при 4 °C.
  2. Нагрейте при 90 °C в течение 1 минуты, чтобы растворить порошок и получить прозрачный раствор. Охладите и поддерживайте расплавленный раствор LMA при 37 °C перед следующим шагом для предотвращения термической денатурации буфера глюкозооксидазы (GLOX) (приготовьте 10-кратный раствор, хранящийся при -20°C, состоящий из 100 мМ Tris pH 7,5, 25 мМ KCl, 1 мМ TCEP pH 7,0, 5 мг/мл глюкозооксидазы, 0,4 мг/мл каталазы, 50% глицерина v/v).
  3. После того как раствор LMA достигнет 37 °C, подготовьте буфер STORM, добавив 100 мМ меркаптоэтиламина (MEA) и GLOX в тёплый раствор LMA для достижения конечной концентрации 1×. Храните раствор MEA 1 M до месяца при 4 °C, но рекомендуется использовать свежеприготовленный раствор. Аккуратно перемешивайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для необязательной маркировки ДНК добавьте 1,5 нм (окончательная концентрация, 1 мМ раствора в DMSO) сопряжённого по JF549 Hoechst. Держите подвеску на 37 °C до использования.
  4. Аккуратно смешайте суспензию ядер с наноалмазами при разбавлении 1/1500. Инкубировать их вместе с образцом в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наноалмазы служат фидуциальными маркерами для коррекции дрейфа образца.
  5. Нанесите 10 мкл смеси на обработанный озоновым покрытием 1,5 часа (20 минут в системе ультрафиолетовой озоновой очистки) и подождите 3 минуты, чтобы ядра отложились на покрытии.
  6. Удалите лишнюю жидкость, подождите 2 минуты. Добавьте 10 мкл LMA, приготовленного на шаге 3.3, в накладку и немедленно накройте микроскопическим стеклом.
  7. Герметизируйте накладку силиконовым герметиком. Смешайте равные количества раствора A и B в небольшой чашке Петри с помощью наконечника микропипетки. Нанесите смесь по краям накладки, чтобы герметизировать образец. Силиконовый герметик затвердевает в течение 5 минут.
  8. После установки проводите визуализацию стекла без задержек, в конечном итоге в течение следующих 4–5 часов, чтобы избежать потери свойств монтажной площадки по поглощанию кислорода.

4. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры визуализации должны быть тщательно оптимизированы с учётом характера образца, фотофизических свойств флуорофоров и оптической конфигурации микроскопа. Крайне важно обеспечить высокое соотношение сигнал/шум для каждого флуорофора, минимизируя спектральное просачивание и перекрёстное возбуждение между флуоресцентными каналами. Образцы наблюдались с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащённого масляным иммерсионным объективом с высоким уровнем NA 100x, блоком для поддержания фокуса и белым светодиодом для яркополевой съёмки. Флуоресцентные метки AlexaFluor647 (AF647) возбуждались на 640 нм, а JF549-Hoechst — на 561 нм. Излучаемый свет фильтровался с помощью совместимого дихроического зеркала и полосного фильтра(ов), а затем изображения собирались с помощью научной камеры комплементарного металл-оксид-полупроводника (sCMOS).

  1. Установите слайд для сэмпла и найдите фокус. Активируйте модуль поддержания фокуса, если он есть в системе (настоятельно рекомендуется для длительных приобретений).
  2. Найдите и сосредоточьтесь на ядре. Лучше иметь один или несколько наноалмазов рядом с интересующим ядром, чтобы более эффективно корректировать дрейф во время реконструкции.
  3. (По желанию) Захватывайте дифракционно ограниченные снимки яркого поля и каждого люминесцентного канала при низкой мощности лазера.
  4. При двухцветной съёмке начинайте с получения более длинного волнового канала, а затем переходите на канал с более короткой длиной волны (то есть приобретите канал AF647 до JF549).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример параметров приобретения, использованных в этой работе:
    Канал A — маркировка эпитопа — AF647
    Время экспозиции: 20 мс
    Интенсивность лазера: 640 нм – 2,2 кВт/см²
    Режим возбуждения: HiLo27
    Канал B — маркировка ДНК — JF549-Hoechst
    Время экспозиции: 50 мс
    Интенсивность лазера: 561 нм - 1 кВт/см²
    Режим возбуждения: Эпинефрин
    Количество записанных изображений: 10 000–30 000 на канал, что гарантирует достаточно малую плотность флуорофоров на кадр для точной локализации по одной молекулы, а накопленное количество локализаций было эмпирически определено с помощью сверхразрешения QUantitative Image Rating and Reporting of Error Location (SQUIRREL)28, что также указывает на достаточное количество кадров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный выше протокол позволяет подготовить высококачественные ядра Arabidopsis thaliana , подходящие для SMLM. Было проведено несколько этапов оптимизации для улучшения ядерной целостности и снижения количества цитоплазматического и клеточного мусора, ухудшающего качество изображения. После каждого этапа оптимизации качество ядерных препаратов оценивалось с помощью конфокальной визуализации с помощью вращающегося диска Olympus IX81 перед переходом к сверхразрешающему получени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подготовка ядер Arabidopsis thaliana для одномолекулярной локализационной микроскопии (SMLM) требует нескольких критических этапов, которые сильно влияют на качество конечного образца. Как было описаноранее 19,35, тщательная и последовательная обработка тканей необходима для максимального восстановления целых ядер. Использование микротомных лезвий вместо стандартных бритвенных обеспечивает более чистую и равномерную фраг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Благодарим лабораторию Lavis и команду Open Chemistry в Janelia за щедрое предоставление красителей JF и JFX. Мы также благодарны Элизабет Красик-Дайер и Селии Бару за любезный обмен своим протоколом, а также Алин Пробст и Гильермо Орси за содержательные советы. Оптическая съёмка проводилась на платформе M4D центра Instruct-ERIC в Гренобле (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) в рамках Гренобельского партнёрства по структурной биологии, поддерживаемого французской инфраструктурой интегрированной структурной биологии (ANR-10-INBS-0005-02) и Гренобльским альянсом интегрированной структурной и клеточной биологии Labex, проектом аспирантуры Университета Гренобля в Альпах (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). Мы отмечаем Tip ten Brink за пакет AnalyzeFRC Python, разработанный на кафедре физики визуализации (ImPhys) факультета прикладных наук TU Delft.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibodyAbcamab5095Первичное анти-тело, используемое в разбавлении 1/200 в буфере для иммуногистахимии для визуализации активной формы полимеразы (Поликлональное анти-тело, выраженное в кролике)
Программное обеспечение для захватаAbbelightNEO LiveImaging v2.18
Белок сыворотки быкаSigma-AldrichA7906  
КаталазаSigma-AldrichC40
Сертифицированная низкотемпературная агарозаBio-Rad1613111
Крышки для стеклянных предметов толщиной 1,5H круглыеMarienfeld117640Ø: 24 мм
D-(+)-Глюкоза, безводная, 99%Thermo ScientificA16828-36 
Дихроичное зеркалоSemrockDi03-R405/488/561/635-t1Дихроичное зеркало для разделения возбуждения/испускания
Буферная соль Дюльбекко с фосфатом 10´biowestX0515 - 500 Работа в стерильных условиях
Одноразовые лезвия для микротомов Epredia UltraFisherScientific12191830Низкий профиль, однократное использование
Культурная тарелка Falcon с ячейками 6 колодцев с прозрачным плоским дном, обработанная TC, с крышкой Falcon353046
Развод формальдегида 37%Carl Roth7398Работать под вытяжной вытяжкой
ГлюкозооксидазаSigma-AldrichG2133
ГлицеринVWR24388.295
Коза анти-кролик IgG (H+L) Высоко-адсорбированный вторичный анти-тело, Alexa Fluor Plus 647Thermo ScientificA32733TRИспользуется в разбавлении 1/200 в качестве вторичного анти-тела, связанного с AF647
Решение Hoechst 33258Sigma-Aldrich94403Используется в разбавлении 1/500 для контрастирования ДНК, добавляется в агарозную подложку
Развод соляной кислотыChem-LabCL05.0311.1000 
JF549-HoechstLavis lab and Open Chemistry team (Janelia)JF549-HoechstИспользуется для контрастирования ДНК, добавляется в агарозную подложку с конечной концентрацией 1,5 нМ
Набор тканевых измельчителей для тканей KIMBLE DounceSigma-AldrichD8938Трубка 2 мл с обоими большими (0,0030-0,0050 дюйма) и мелкими (0,0005-0,0025 дюйма) щелевыми ступками
Лазерное устройствоOxxiusL6CcОснащено шестью лазерами: 405 нм - 100 мВт, 488 нм - 200 мВт, 532 нм - 500 мВт, 561 нм - 300 мВт, 640 нм - 500 мВт и 730 нм - 30 мВт
Гексагидрат хлорида магнияCarl RothHN03
Меркаптоэтиламин (MEA)Sigma-Aldrich30070
Натриевая соль МОПС 98%Fisher Scientific SAS352590010
Многополосный выпускной фильтрSemrockFF01-446/523/600/677Многополосная выпускная фильтрация для блокировки света, рассеянного лазером
НаноалмазыAdamas NanotechnologiesNDNV100nmHiWGA2mlЗапас 1 мг/мл
Цифровая CMOS-камера ORCA-FusionHamamatsuC14440-20UP 
Чашка Петри, 100/20 мм, PS, прозрачная, с вентиляционными отверстиями, стерильнаяGreiner Bio-One664161Используется для выращивания растений на среде 1/2 MS
Чашка Петри, квадратная, PS, прозрачная, 120/120/17 мм, стерильнаяGreiner Bio-One688161Используется при нарезке саженцев растений
pluriStrainer Mini клеточный фильтрpluriSelect43-10030-50Размер сетки 30 µm, подходит для 1,5 мл еппендорфовых пробирок
Хлорид калияSigma-AldrichP9333
Фильтр выпуска с одной полосойSemrockFF01-698/70Специальный выпускной фильтр для канала AF647
Фильтр выпуска с одной полосойChromaET600/50mСпециальный выпускной фильтр для канала JF549
Хлорид натрия (99,5%) Euromedex1112-A
Звездные замороженные слайды 76 x 26 ммKnittel VS112711FKB.01
Стерильный шприц-фильтрø 33 мм пористость 0,2 µm Luer Lock конусClearLine146560
Суперрезиновый системныйAbbelightSAFe360Olympus IX83, оснащенный объе

Ссылки

  1. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128 (4), 787-800 (2007).
  2. Rowley, M. J., Corces, V. G. Organizational principles of 3D genome architecture. Nat Rev Genet. 19 (12), 789-800 (2018).
  3. Fransz, P., de Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (22), 14584-14589 (2002).
  4. Tessadori, F., Chupeau, M. C., Chupeau, Y., Knip, M., Germann, S. Large-scale dissociation and sequential reassembly of pericentric heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells. J Cell Sci. 120 (7), 1200-1208 (2007).
  5. Caballero, L., Pasternak, T., Riyazuddin, R., Pérez-Pérez, J. M. Connecting high-resolution 3D chromatin maps with cell division and cell differentiation at the root apical meristem. Plant Cell Rep. 43 (10), 232 (2024).
  6. Pavlova, P., van Zanten, M., Snoek, B. L., de Jong, H., Fransz, P. 2D morphometric analysis of Arabidopsis thaliana nuclei reveals characteristic profiles of different cell types and accessions. Chromosome Res. 30 (1), 5-24 (2022).
  7. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  8. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  9. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett, OL. 19 (11), 780-782 (1994).
  10. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt Lett, OL. 24 (14), 954-956 (1999).
  11. Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative Single-Molecule Localization Microscopy. Annu Rev Biophys. 52, 139-160 (2023).
  12. Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).
  13. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  14. Heilemann, M., van de Linde, S., Schüttpelz, M., Kasper, R., Seefeldt, B. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  15. Ricci, M. A., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. P. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  16. Xu, J., Ma, H., Jin, J., Uttam, S., Fu, R. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  17. Nozaki, T., Imai, R., Tanbo, M., Nagashima, R., Tamura, S. Dynamic organization of chromatin domains revealed by super-resolution live-cell imaging. Molecular Cell. 67 (2), 282-293.e7 (2017).
  18. Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution microscopy in plant cell imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
  19. Kracik-Dyer, E., Baroux, C. 3D STED Imaging of isolated Arabidopsis thaliana nuclei. Methods Mol Biol. 2873, 263-280 (2025).
  20. Gaifas, L., et al. Combining live fluorescence imaging with in situ cryoelectron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 122 (19), e2425047122 (2025).
  21. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated time-lapse microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
  22. Vauclare, P., Wulffelé, J., Lacroix, F., Servant, P., Canfalonieri, F., et al. Stress-induced nucleoid remodeling in Deinococcus radiodurans is associated with major changes in Heat Unstable (HU) protein dynamics. Nucleic Acids Res. 52 (11), 6406-6423 (2024).
  23. Schubert, V. Super-resolution microscopy – Applications in plant cell research. Front Plant Sci. 8, 531 (2017).
  24. Carles, C. C., Ha, C. M., Jun, J. H., Fiume, E., Fletcher, J. C., Hennig, L., Köhler, C. Analyzing Shoot Apical Meristem Development. Plant Developmental Biology: Methods and Protocols. , 105-129 (2010).
  25. Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).
  26. Tse-Kang, S. Y., et al. Intestinal immunity in C. elegans is activated by pathogen effector-triggered aggregation of the guard protein TIR-1 on lysosome-related organelles. Immunity. 57 (10), 2280-2295.e6 (2024).
  27. Lim, D., Ford, T. N., Chu, K. K., Mertz, J. Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy. J Biomed Opt. 16 (1), 016014 (2011).
  28. Culley, S., et al. Quantitative mapping and minimization of super-resolution optical imaging artifacts. Nat Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
  29. Xue, M., et al. Single amino acid mutations in histone H3.3 illuminate the functional significance of H3K4 methylation in plants. Nat Commun. 16 (1), 4408 (2025).
  30. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plugin for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  33. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  34. Van Heel, M. Similarity measures between images. Ultramicroscopy. 21 (1), 95-100 (1987).
  35. Loureiro, J., et al. Isolation of plant nuclei for estimation of nuclear DNA content: Overview and best practices. Cytometry Part A. 99 (4), 318-327 (2021).
  36. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  37. Duncan, S., Olsson, T. S. G., Hartley, M., Dean, C., Rosa, S. A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12, 13 (2016).
  38. Gutzat, R., Mittelsten Scheid, O. Preparing chromatin and RNA from rare cell types with fluorescence-activated nuclear sorting (FANS). Methods Mol Biol. 2093, 95-105 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Организация хроматинамикроскопия сверхвысокого разрешенияdSTORM-визуализацияархитектура ядрамодификации хроматинафлуоресцентное мечениеизоляция ядерэпигенетическая регуляция
Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.