Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса

Salim El-Khoury; Oleksandr Glushonkov; Cristel C. Carles; Jean-Philippe Kleman

doi:10.3791/70891

Method Article

Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса

DOI:

10.3791/70891

⸱

May 8th, 2026

Salim El-Khoury¹^,² , Oleksandr Glushonkov³ , Cristel C. Carles² , Jean-Philippe Kleman¹

¹Institut de Biologie Structurale, CEA, CNRS, Université Grenoble Alpes, ²Plant and Cell Physiology Lab (LPCV), Bioscience and Biotechnology Institute of Grenoble, Grenoble Alpes University - CNRS - INRAE - CEA, ³Integrated Structural Biology Grenoble (ISBG) CNRS, CEA, Université Grenoble Alpes

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предлагает эффективный рабочий процесс для микроскопии с помощью локализации одной молекулы изолированных ядер Arabidopsis с использованием оптимизированной изоляции, фиксации и маркировки для достижения надёжной наномасштабной визуализации хроматина и РНК-полимеразы II. Этот подход легко адаптируется к другим белкам, ассоциируемым с хроматином, или к модификациям гистонов для высокоразрешающей визуализации.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя конфокальная флуоресцентная микроскопия дала ценные сведения об организации хроматина в ядрах растений, её дифракциально-ограниченное разрешение ограничивает изучение архитектуры хроматина, что стимулирует применение сверхразрешённых методов, таких как микроскопия локализации одной молекулы (SMLM). Среди этих подходов прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM) обеспечивает наномасштабное разрешение в отдельных клетках, обеспечивая точную визуализацию доменов хроматина, модификации гистонов и организацию ядер. Хотя такие методы всё чаще применяются в млекопитающих, их применение в биологии растений остаётся ограниченным, в основном из-за технических сложностей при подготовке образцов.

Здесь мы представляем упрощённый и воспроизводимый рабочий процесс для SMLM-визуализации ядер, выделенных из Arabidopsis thaliana. Этот протокол начинается с фиксации сеянцев для сохранения морфологии ядер, затем следует мягкое нарезывание тканей и центрифугирование для обогащения целостных ядер. Изолированные ядра затем маркируются фторофором в жидкой среде и иммобилизуются на низкоплавящих агарозных прокладках — стратегия, повышающая стабильность при длительном сеансе мономолекульной визуализации. Эти шаги в совокупности минимизируют фоновую флуоресценцию, улучшают согласованность маркировки и повышают воспроизводимость между биологическими репликатами.

Полученные препараты обеспечивают повышенную прозрачность для визуализации модификаций хроматина и ядерной архитектуры в растениях. Снижая технические барьеры для внедрения SMLM-визуализации в Arabidopsis, этот протокол предоставляет универсальный способ для изучения эпигенетической регуляции, организации хроматина и топологических вариаций ядра на наноуровне. Эта работа закладывает методологическую основу применения SMLM к растениям, преодолевая разрыв с биологией клеток млекопитающих и открывая новые возможности для изучения того, как ядерная архитектура влияет на регуляцию генома в ответ на факторы развития и окружающую среду в растительных системах.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопия давно является краеугольным камнем для изучения структуры хроматина и ядерной архитектуры, показывая, как ДНК и белки, связанные с гистонами, расположены в трёхмерном ядерном пространстве и влияют на регуляцию^генов ^1,2. Традиционная флуоресцентная микроскопия дала ценные знания о крупномасштабных доменах хроматина, таких как хромосомные территории, хромоцентры и ядерные^тела ^3,4, возможные in situ, особенно в корневых тканях^{растений} ^3,5,6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о материалах и инструментах, используемых в данном протоколе, доступна в Таблице материалов. Если не указано иное, буферы очищаются на апирогенных фильтрах 0,2 мкм. Двойной дистиллированный ультра-чистый H₂O (ddH₂O) используется на протяжении всего протокола. Этапы центрифугирования выполняются в микротрубках объёмом 1,5 мл с использованием ротора с фиксированным углом.

1. Фиксация сеженцев и высвобождение ядер

Поместите 6-колодную культивационную пластину на лёд под вытяжку, затем добавьте в каждую скважину....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный выше протокол позволяет подготовить высококачественные ядра Arabidopsis thaliana , подходящие для SMLM. Было проведено несколько этапов оптимизации для улучшения ядерной целостности и снижения количества цитоплазматического и клеточного мусора, ухудшающего качество изображения. После каждого этапа оптимизации качество ядерных препаратов оценивалось с помощью конфокальной визуализации с помощью вращающегося диска Olympus IX81 перед переходом к сверхразрешающему получени.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подготовка ядер Arabidopsis thaliana для одномолекулярной локализационной микроскопии (SMLM) требует нескольких критических этапов, которые сильно влияют на качество конечного образца. Как было описано^{ранее 19,35}, тщательная и последовательная обработка тканей необходима для максимального восстановления целых ядер. Использование микротомных лезвий вместо стандартных бритвенных обеспечивает более чистую и равномерную фраг.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим лабораторию Lavis и команду Open Chemistry в Janelia за щедрое предоставление красителей JF и JFX. Мы также благодарны Элизабет Красик-Дайер и Селии Бару за любезный обмен своим протоколом, а также Алин Пробст и Гильермо Орси за содержательные советы. Оптическая съёмка проводилась на платформе M4D центра Instruct-ERIC в Гренобле (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) в рамках Гренобельского партнёрства по структурной биологии, поддерживаемого французской инфраструктурой интегрированной структурной биологии (ANR-10-INBS-0005-02) и Гренобльским альянсом интегрированной структурной и клеточной биологии Labex, проектом аспирантуры ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Антитело РНК-полимераза II CTD повторяет YSPTSPS (фосфо S2)	Abcam	ab5095	Первичное антитело, используемое при разбавлении 1/200 в буфере иммунного окрашивания для визуализации активной формы полимеразы (поликлональное антитело, выращённое у кролика)
Программное обеспечение для приобретения	Аббелайт	NEO LiveImaging v2.18
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	A7906
Каталазе	Сигма-Олдрич	C40
Сертифицированная агароза с низким уровнем плавления	Био-Рад	1613111
Толщина накладных слоев 1,5 часа круга	Мариенфельд	117640	&Osлэш;: 24 мм
D-(+)-Глюкоза, безводная, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Дихроическое зеркало	Семрок	Di03-R405/488/561/635-t1	Дихроическое зеркало для разделения возбуждения/излучения
Дульбекко с фосфатным буферным физиологическим раствором 10 и остро;	biowest	X0515 - 500	Работа в стерильных условиях
Одноразовые микротомные лезвия Epredia Ultra	FisherScientific	12191830	Низкопрофильный, одноразовый
Пластина для культивирования клеток Falcon с 6 скверлинами с прозрачным плоским дном TC, обработанная с крышкой	Falcon	353046
Раствор формальдегидов 37%	Карл Рот	7398	Работа под вытяжкой
Глюкозооксидаза	Сигма-Олдрич	G2133
Глицерин	VWR	24388.295
Козий антикроличий IgG (H+L) — высокоадсорбируемое вторичное антитело, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Используется при 1/200 как вторичный антител, связанный с AF647
Решение Hoechst 33258	Сигма-Олдрич	94403	Используется при 1/500 для контрокрашивания ДНК, добавляется в агарозную подушечку
Раствор соляной кислоты	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Лаборатория Лависа и команда открытой химии (Джанелия)	JF549-Hoechst	Используется для контрокрашивания ДНК, добавляется в агарозную подушечку при конечной концентрации 1,5 нМ
KIMBLE Dounce набор для молотки для салфеток	Сигма-Олдрич	D8938	Трубка объёмом 2 мл с большими (0,0030-0,0050 дюйма) и малыми (0,0005-0,0025 дюйма) просветными пестиками
Лазерный блок	Оксиус	L6Cc	Оснащён шестью лазерами: 405 нм - 100 мВт, 488 нм - 200 мВт, 532 нм - 500 мВт, 561 нм - 300 мВт, 640 нм - 500 мВт и 730 нм - 30 мВт
Гексагидрат хлорида магния	Карл Рот	HN03
Меркаптоэтиламин (MEA)	Сигма-Олдрич	30070
MOPS натриевая соль 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Многодиапазонный эмиссионный фильтр	Семрок	FF01-446/523/600/677	Многополосная эмиссионная фильтрация для блокировки лазерного рассеяния света
Наноалмазы	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Заводское содержание 1 мг/мл
Цифровая CMOS-камера ORCA-Fusion	Хамамацу	C14440-20UP
Чашка Петри, 100/20 мм, PS, прозрачная, с вентиляционными отверстиями, стерильная	Greiner Bio-One	664161	Использовался для выращивания растений на полу-МС среде
Чашка Петри, квадратная, PS, прозрачная, 120/120/17 мм, стерильная	Greiner Bio-One	688161	Используется при нарезке сеянцев растений
pluriStrainer Mini cell strainer	pluriSelect	43-10030-50	Размер сетки 30 и микро; m, подходящий для трубки Эппендорфа объемом 1,5 мл
Хлорид калия	Сигма-Олдрич	P9333
Однополосный эмиссионный фильтр	Семрок	FF01-698/70	Специфический эмиссионный фильтр для канала AF647
Однополосный эмиссионный фильтр	Хрома	ET600/50м	Специфический эмиссионный фильтр для канала JF549
Хлорид натрия (99,5%)	Euromedex	1112-A
Слайды Star-Frost размером 76 x 26 мм	Книттель	VS112711FKB.01
Стерильный фильтр для шприца и ослэш; пористость 33 мм 0,2 и микро; Конус замка Люр	ClearLine	146560
Система сверхразрешения	Аббелайт	SAFe360	Olympus IX83 оснащён 100x масляным погружательным объективом NA1.5
Биомоль три-натрия цитрат 2H2O Gen-Apex	Prolabo	PRO-33615.268
Класс молекулярной биологии Tris Base	Promega	H5135
Трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорид (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Твинсил Спид	Picodent	13001002	Силиконовый герметик
Система очистки ультрафиолетового озона духовка UVOCS	UVOCS Inc.	T10X10	20 минут экспозиции для очистки скользящего покрытия и nbsp;
Вакуумный насос	Вакуум	VP 100C
Центрифуга Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific		Ротор TX-400 75003629. Центрифугирование проводилось с помощью трубок Эппендорфа.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles