Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение мелких внеклеточных пузырьков из мышиных скелетных мышц и костного мозга с помощью хроматографии с исключением размера

207 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70894

⸱

23 июня 2026 г.

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает выделение малых внеклеточных пузырьков из мышиных скелетных мышц и костного мозга с помощью ферментативной пищеварения и хроматографии с исключением размера, что позволяет воспроизводимо воспроизводить фракции, обогащённые везикулами, из структурно сложных, малопродуктивных тканей для дальнейшего молекулярного анализа.

Аннотация

Малые внеклеточные везикулы (sEV) — это наноразмерные, липидно-связанные частицы, которые опосредуют межклеточный обмен через передачу белков, липидов и рибонуклеиновых кислот (РНК). Изоляция sEV из твёрдых тканей, таких как скелетная мышца (SkM) и костный мозг (BM), остаётся сложной из-за низкого выхода и загрязнения невезикулярными компонентами. Этот протокол описывает воспроизводимый рабочий процесс для выделения sEV от мышей SkM и BM. SkM ферментативно переваривается, тогда как BM обрабатывается напрямую и затем подвергается дифференциальной центрифугированию и хроматографии с исключением размера (SEC). Для SkM объём пустоты (~2,5 мл) отбрасывается, а последующие ~1,6 мл собираются как фракции, обогащённые EV, обычно подразделяемые на последовательные фракции по 400 мкл (F1–F4). Для BM отбрасывается объём пустоты 700 мкл, затем собирается доля с обогащением EV объемом ~850 мкл, которую можно разделить на последовательные доли по ~170 мкл (F1–F5) и объединить на основе обогащения маркеров EV. С помощью этого подхода sEV можно выделить из небольших объёмов тканей (примерно 500 мкл из одного квадрицепса и 150 мкл из объединённой бедренной и большеберцовой кости), обеспечивая ~108 частиц ·мл−1·мг−1 с диаметром частиц преимущественно <200 нм. Целостность и чистота везикул проверяются с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, анализа отслеживания наночастиц и вестерн-блотинга для канонических маркеров EV, с дополнительной характеристикой с помощью одночастичного интерферометрического обнаружения для количественной оценки субпопуляций везикул, определяемых тетраспанином. Этот метод позволяет воспроизводить высокочистые sEV из структурно сложных тканей с минимальным входным материалом, что позволяет проводить молекулярные и функциональные анализы тканевых пузырьков.

Введение

Малые внеклеточные везикулы (sEV) — это наноразмерные, липидно-связанные частицы, которые опосредуют межклеточные коммуникации через передачу белков, липидов и нуклеиновых кислот1. Они выделяются всеми типами клеток и присутствуют практически во всех биологических жидкостях, где выступают ключевыми носителями биоактивного груза, включая пептиды и микрорибонуклеиновые кислоты (РНК)2. Их груз селективно сортируется, что позволяет точно передавать определённыесигналы 3, а их везикулярная структура позволяет обходить типичные ограничения по градиенту и разбавлению свободно секретируемых факторов, доставляя концентрированные молекулярные полезные нагрузки на большиерасстояния 4. Хотя ЭВ из биожидкостей (например, плазмы, сыворотки и слюны) дают удобный обзор системной сигнализации, они представляют собой сильно смешанную популяцию, происходящую из многихтканей 5. Это затрудняет определение, какой орган производит конкретный биологический сигнал или как регулируется связь с электромобилями на уровне тканей. Поскольку циркулирующие электромобили объединены вместе, специфические для тканей изменения могут быть разбавлены или маскированы, что ограничивает возможность определить истинный источниксигналов 6.

Скелетная мышца (SkM) и костный мозг (BM) — это основные метаболически и функционально активные ткани с отличиемым клеточным составом и сигнальнымиролями 7,8. Обе ткани могут выпускать популяции EV, обогащённые уникальным, специфичным для ткани грузом; однако эти сигналы могут быть легко затенены в плазме EV из тканей с высоким оборотом, таких как иммунныеклетки 8,9. Прямая изоляция электромобилей от мышц или дефекции повышает чувствительность и позволяет выявлять тонкие, специфические для тканей адаптации, которые могут быть незаметны в кровообращении. Таким образом, тканевые EV предоставляют важную дополнительную информацию, показывая, когда конкретный орган выделяет EV, как долго эти сигналы сохраняются и какие адаптации являются острой, а какие — хронические. Несмотря на растущий интерес к электромобилям, большинство устоявшихся методов изоляции были разработаны для биофлюидов (например, плазмы и сыворотки) или систем культивирования клеток. В таких условиях электромобили могут быть получены с относительно высокой выходностью и минимальными структурными разрушениями. Однако выделение электромобилей напрямую от твёрдых тканей, таких как SkM и BM, представляет собой заметные технические сложности. Эти ткани структурно сложны и гетерогенны, требующие механических или ферментативных этапов диссоциации, которые могут вводить артефакты, включая высокий уровень растворимых белков, фрагменты органелл и невезикулярные наночастицы, что затрудняет получение высокочистых препаратов EV.

Ещё одной серьёзной проблемой при выделении EV из тканей является отсутствие стандартизированных рабочих процессов для определения и разделениядробей 10. Одна только дифференциальная центрифугирование часто приводит к коизоляции белковых агрегатов и больших пузырьков, тогда как методы на основе ультрацентрифугации, хотя и широко используемые, могут привести к агрегации, деформации и переменному восстановлению в зависимости от типа ротора и экспериментальных условий. Подходы с градиентом плотности повышают чистоту, но требуют много времени, низкой пропускной способности и их сложно стандартизировать влабораториях 11. Следовательно, в настоящее время не существует широко принятого, воспроизводимого метода, оптимизированного для выделения малых электромобилей из твёрдых тканей с высокой чистотой и стабильнойвыходностью 10.

Хроматография с исключением размера (SEC) стала перспективной альтернативой для изоляции EV, поскольку она разделяет частицы по размеру, не подвергая везикулы высоким центробежным силам. SEC обеспечивает эффективное отделение малых EV от растворимых белков и загрязнителей с низкой молекулярной массой, сохраняя при этом целостность везикул и биологическую функцию. Важно, что SEC позволяет чётко определить доли элюирования, что позволяет воспроизводимо идентифицировать обогащённые EV фракции и улучшать согласованность междуэкспериментами 12. Однако рабочие процессы SEC требуют тщательной оптимизации для образцов, полученных из тканей, особенно в отношении обработки тканей в верхнем сегменте, удаления мусора и сбора фракций. Для устранения этих ограничений мы разработали воспроизводимый и стандартизированный протокол для изоляции sEV из SkM и BM. Этот метод интегрирует контролируемое ферментное расщепление волокнистых тканей, дифференциальную центрифугу для удаления мусора и очистку на основе SEC для выделения пузырьков высокой чистоты. Рабочий процесс специально оптимизирован для минимизации загрязнения внутриклеточными компонентами, сохраняя целостность везикул и обеспечивая стабильное восстановление из тканей с низким уходом.

Этот протокол заполняет критический методологический пробел, предоставляя практичный и масштабируемый подход к выделению тканевых sEV с определённой фракционированностью и валидированной чистотой, достигаемый с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA), западного блотинга канонических маркеров EV, электронной микроскопии для морфологической оценки и одночастичного анализа EV с использованием захвата антител, интерферометрического размера и многоканального флуоресцентного визуализации. Особенно хорошо подходит для исследований, требующих тканино-специфического анализа EV, где везикулы, полученные из биожидкости, недостаточны для определения клеточного происхождения сигналов. Исследователям следует использовать этот метод, когда цель — получить высокочистые sEV из твёрдых тканей с минимальным загрязнением и сохранением целостности везикул. В отличие от этого, методы на основе ультрацентрифугирования могут быть предпочтительнее для применений с высокой выходностью, где чистота менее критична, и при выделении отдельных субпопуляций электромобилей могут выбираться подходы с градиентом плотности, несмотря на меньшую пропускную способность. Вместе этот протокол обеспечивает стандартизированную основу для выделения и характеристики тканевых sEV, позволяя проводить воспроизводимые молекулярные, биохимические и функциональные анализы в дальнейшем процессе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с животными были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Макгилла (DOUG10029) и проводились в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными.

1. Протокол изоляции sEV (SkM-sEV), полученный на основе SkM

  1. Сбор образцов и диссоциация тканей
    1. Сбор и сохранение тканей
      1. Сразу после удаления ткани SkM-ткани мгновенно замораживайте, погрузив её в предварительно охлаждённый метилбутан.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить предварительно охлаждённый метилбутан, поместите контейнер с метилбутаном в сухую ледяную ванну и постепенно добавляйте небольшие кусочки сухого льда прямо в жидкость. Дайте раствору остыть, температура обычно находится в диапазоне от −70°C до −80°C. Сохраняйте метилбутан в сухой ледяной ванне во время использования для поддержания температуры. Погружать ткань примерно на 3–4 секунды до полного заморозка, что подтверждается полным затвердеванием ткани и потерей гибкости.
      2. Перенесите ткань в криовиалы.
      3. Положите образцы на сухой лёд.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы при −80°C до дальнейшей обработки. Избегайте повторяющихся циклов заморозки и оттаивания. Быстрая заморозка эффективно сохраняет электромобили при правильной герметизации образцов. Обезвоживание или повреждение везикул может произойти, если ткани остаются открытыми или проходят несколько циклов замораживания–оттаивания 13.
    2. Диссоциация тканей
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы в шкафу для биобезопасности с использованием стерильных инструментов и перчаток, чтобы предотвратить загрязнение, которое может нарушить чистоту электромобилей.
      1. Взвешивание тканей
        1. Простерилизуйте пинцет 70% этанола и дайте ему высохнуть на воздухе.
        2. Переложите замороженную ткань на заранее взвешенную чашу для суспензированной культуры.
        3. Взвешивают ткань с помощью миллиграммовых весов (обычно ~80–120 мг на образец, в зависимости от возраста и пола мыши).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол валидирован для входных масс тканей в ~80–120 мг. Для образцов в этом диапазоне используйте объёмы реагентов, указанные в шагах 1.2.3.1, 1.3.1.3 и 1.3.2.1 без изменений. Для образцов вне этого диапазона масштабируйте все объёмы реагентов пропорционально массе ткани, сохраняя валидированное соотношение RPMI-1640, коллагеназы D и DNase I (1000:40:4 мкл на 100 мг ткани). Это соответствует примерно 10 мкл RPMI-1640, 0,4 мкл коллагеназы D (100 мг/мл запаса) и 0,04 мкл ДНКазы I (20 000 U/мл) на мг ткани. Поддерживайте эти пропорции, чтобы сохранить конечные концентрации ферментов в реакции. Эффективность пищеварения и выход электромобиля должны быть эмпирически подтверждены при работе значительно выше диапазона 80–120 мг.
        4. Верните образец в предварительно охлаждённую трубку и держите его на льду.
      2. Подготовьте ферменты
        1. Разморозить аликвоты коллагеназы D (запас 100 мг/мл) и DNase I (запас 20 000 U/mL) на льду (см. дополнительный файл 1, шаг 1.4 для подготовки ферментного запаса). Эти ферменты добавляются на шаге 1.3.2.1 для достижения окончательных концентраций в реакции 3,8 мг/мл коллагеназы D и 77 U/мл ДНКазы I. Итоговый объём пищеварения составляет 1,044 мл.
        2. Аккуратно смешивайте ДНКазу I инверсией. Не вихрьте.
      3. Подготовка тканей для пищеварения
        1. Добавьте 800 мкл RPMI-1640 в стерильную чашу для суспензионных культур, помещаемую на лёд.
        2. Перенесите ткань в блюдо.
        3. Разрежьте ткань на 6–8 кусочков примерно одинакового размера (2–3 мм с каждой стороны) с помощью стерильного одноразового скальпеля. Стабилизируйте ткань стерильными щипцами во время резки, чтобы обеспечить равномерную фрагментацию. Выполните этот шаг в течение 1 минуты на образец, чтобы поддерживать согласованность между образцами.
        4. Держите блюдо на льду на протяжении всего процесса, чтобы минимизировать повреждение.
    3. Перенос тканей и ферментативное пищеварение
      1. Перенос тканей
        1. Обрезать конец стерильного наконечника пипетки P1000 стерильным лезвием для создания отверстия диаметром 2–3 мм, достаточного для свободного прохождения фрагментов ткани, образованных на шаге 1.2.3.3.
          ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте коммерчески доступные широкоствольные (широкоотверстие) наконечники пипеток объемом 1 мл, которые обеспечивают стандартизированное отверстие (обычно ~2–3 мм внутреннего диаметра) и устраняют вариативность, связанную с ручной обрезкой.
        2. Переместите фрагменты ткани и среду RPMI-1640 в заранее маркированные трубки объёмом 1,5 мл с помощью пипетки P1000 с модифицированным наконечником. Выполните 2–3 последовательных аспирации для извлечения остаточных фрагментов и среды. Визуально осмотрите чашу и кончик пипетки после переноса и используйте стерильные щипцы для переноса оставшихся фрагментов, чтобы убедиться, что не осталось видимой ткани.
        3. Добавьте 200 мкл RPMI-1640 в каждую лампу.
      2. Ферментативное пищеварение
        1. Добавьте в каждую трубку 40 мкл коллагеназного D запаса (100 мг/мл) и 4 мкл запаса DNase I (20 000 U/mL) из аликвотов, размораженных на льду. Это даёт окончательные концентрации в реакции 3,8 мг/мл коллагеназы D и 77 U/мл ДНКазы I. Для образцов за пределами диапазона тканей 80–120 мг регулируйте объем ферментов пропорционально, как описано в ПРИМЕЧАНИИ после шага 1.2.1.3.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Эти объёмы калибруются для масс тканей в пределах типичного диапазона 80–120 мг. Для масс тканей за пределами этого диапазона масштабируйте все объёмы реагентов пропорционально, как описано в ПРИМЕЧАНИИ после шага 1.2.1.3 (0,4 мкл коллагеназы D и 0,04 мкл ДНКазы I на мг ткани), что сохраняет одинаковые конечные концентрации ферментов в реакции независимо от массы ткани.
        2. Добавляйте ферменты во все образцы одновременно при обработке нескольких образцов.
        3. Держите трубки на льду во время добавления ферментов.
        4. Аккуратно переверните трубки для смешивания. Не вихрьте.
        5. Инкубировать трубки при 37°C в течение 30 минут на нутирующем миксере (24 об/мин, угол наклона 20°; см. таблицу материалов). Убедитесь, что перемешивание равномерно во время инкубации.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Переварить каждый образец в общем объёме 1,044 мл (1000 мкл RPMI-1640, 40 мкл коллагеназы D и 4 мкл ДНКазы I на образец; эквивалентно соотношению ~25:1 буфер-коллагенази).
    4. Удаление мусора
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инициируйте уравновесление столбца SEC в начале первой центрифугирования (шаг 1.4.1.1). Столбец SEC требует 20–25 минут для промыва и уравновешения. Начало уравновешения на этом этапе гарантирует, что столбец готов к загрузке образца сразу после завершения этапа фильтрации (шаг 1.4.3).
      1. Первая центрифуга
        1. Центрифугуйте образцы при 300 × г в течение 10 минут при 4°C, чтобы спелить непереваренный мусор, целые клетки и оставшиеся фрагменты ткани.
        2. Аккуратно перенесите супернатант в новые стерильные микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл, не нарушая гранулу.
      2. Вторая центрифуга
        1. Центрифугуйте образцы при 2 000 × г в течение 15 минут при 4°C, чтобы отпустить крупные мусоры, мёртвые клетки, апоптотические тела и большие везикулы.
        2. Аккуратно перенесите супернатант в новые стерильные микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл, не нарушая гранулу.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая центрифуга является необязательной и должна включаться при дополнительном удалении мусора. Выполните этот шаг, если наднатант выглядит заметно мутным или содержит остаточные частицы после первой центрифугации. Этот этап также рекомендуется, если предыдущие препараты показали загрязнение внутриклеточными маркерами (например, кальнексином или BiP) в фракциях SEC, обогащённых EV, или наличие невезикулярных частиц при трансмиссионной электронной микроскопии. Необходимость этого этапа должна быть подтверждена при первоначальной оптимизации протокола для каждого типа ткани.
      3. Фильтрация
        1. Предварительно увлажняйте стерильные 30 мкм клеточные фильтры путём промывания с помощью RPMI-1640 для уравновесения мембраны и минимизации потерь образца. Отбросьте ополаскивание.
        2. Фильтруйте каждый образец через предварительно увлажнённое 30-мкм клеточное сито в стерильные микроцентрифугные трубки с низким содержанием белка объемом 1,5 мл, чтобы удалить оставшийся клеточный мусор и крупные частицы до SEC.
        3. Позволить образцам пройти через фильтр под действием гравитации.
        4. Оставьте 10–15 минут на образец для фильтрации.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрация завершена, когда над мембраной фильтра не остаётся видимой жидкости, а объём фильтрата в трубке стабилизируется. Если фильтрация медленнее или замирает, это может указывать на засорку из-за остаточного мусора; В таких случаях рассмотрите повторение этапа уточнения или уменьшение нагрузки на выборку.
        5. Соберите 550–600 мкл фильтрованного супернатанта для последующего загрузки на колонку SEC. Для согласованности между образцами нормализуйте объём нагрузки до 500 мкл на столбец (см. шаг 2.2.1), независимо от общего объёма восстановления.
  2. Хроматография с исключением размера (SEC)
    1. Столбец Equilibrate SEC
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг во время центрифугации, если возможно.
      1. Промить колонку SEC 17 мл 1× PBS (0,22 мкм с фильтрацией).
      2. Позволить всему объёму пройти через колонку под действием силы тяжести при ожидаемом расходе 0,75 мл/мин (всего 20–25 минут для объёма промыва 17 мл). Более высокие или медленные расходы могут указывать на неправильное уравновесение или засорку столбцов.
      3. Поддерживайте колонку и PBS при комнатной температуре (RT, 21°C ± 2°C) во время уравновешения, чтобы обеспечить стабильный расход и оптимальную работу колонны.
      4. Подготовьте микроцентрифугные трубки с низким содержанием белка объёмом 1,5 мл для сбора всех фракций.
      5. При необходимости подготовьте дополнительную трубку для сбора объёма пустоты.
    2. Загрузка и элюция образцов
      1. Загрузите 500 мкл фильтрованного супернатанта на колонку SEC.
      2. Дайте образцу полностью войти в смолу. Конечная точка достигается, когда жидкий мениск достигает поверхности слоя смолы, при этом над смолой не остаётся видимой жидкости, а смола остаётся видимо влажной.
      3. Не позволяйте менискусу опускаться ниже поверхности смолы или не высыхать колонна, так как это приводит к попаданию воздуха в слой смолы и нарушающему еволюцию. Когда жидкий мениск достигает поверхности смолы (как определено в шаге 2.2.2), немедленно переходите к шагу 2.2.4 без промедления.
      4. Сразу добавьте 2 мл PBS для начала элюции.
      5. Соберите объём пустоты (~2,5 мл).
      6. Отбросьте объём пустоты или оставьте его как дробь без электромобиля.
      7. Начните собирать фракцию, обогащённую EV, сразу после того, как объём пустоты 2,5 мл будет элюирован.
      8. Собирайте в общей сложности 1,6 мл элуата, обогащённого EV, после объёма пустоты, либо в виде одной непрерывной фракции в одной трубке, либо в виде последовательных фракций, которые затем объединяются.
      9. В качестве альтернативы собирайте последовательные доли по 0,4 мл для оптимизации чистоты относительно выхода. Меньшие объёмы фракций рекомендуются при повышенной чистоте (например, для протеомных анализов или чувствительных последующих применений), тогда как крупные фракции могут использоваться для максимизации общего выхода электромобильных электромобилей.
      10. Оценить дроби для обогащения EV с помощью методов характеристики (например, Western blot для маркеров и загрязнителей EV, а также NTA) и объединить фракции, обогащённые EV, как определено в разделе характеристики.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте непрерывный поток колонки. Когда одна часть заканчивается, добавьте PBS, чтобы поддерживать постоянную жидкость над слоем смолы и предотвратить иссасывание колонны. Используйте трубки с низким содержанием белка и без нуклеазы для сбора.
    3. Концентрация
      1. Концентрируйте образцы электромобилей с использованием центробежных фильтров (отсечение молекулярной массы 100 кДа [MWCO]) для последующих приложений (например, секвенирование РНК, протеомика или вестерн-блот).
      2. Перед использованием предварительно промывайте фильтры PBS.
      3. Центрифугуйте образцы при температуре 4 000 × г при 4°C, проверяя каждые 2–3 минуты до достижения желаемого конечного объёма (обычно 50–100 мкл). Используйте более низкие конечные объёмы (например, ~50 мкл) для приложений, требующих более высокой концентрации и больших объёмов (например, ~100 мкл), когда предпочтительно максимизировать восстановление.
        ВНИМАНИЕ: Избегайте избыточной концентрации, прекращая центрифугирование после достижения целевого объёма.
      4. Восстанавливайте ретентате с помощью аккуратной пипетки.
      5. При необходимости фиксировать объемы образцов до и после концентрации для оценки восстановления. NTA может использоваться для оценки концентрации частиц до и после концентрации, если это возможно.
    4. Хранение
      1. Обогащённые EV фракции храните на льду или при 4°C для немедленных анализов (например, NTA и трансмиссионная электронная микроскопия [TEM]) и обработывайте в течение 24 часов для TEM и в течение 48 часов для NTA.
      2. Aliquot EV отдаёт образцы в трубки с низким содержанием белка для хранения.
      3. Храните образцы при −80°C для длительного использования.
      4. Избегайте повторяющихся циклов заморозки и оттаивания.

2. Протокол изоляции sEV (BM-sEV), основанный на BM

  1. Сбор образцов и диссоциация тканей
    1. Сбор и сохранение тканей
      1. Не ломайте кости сразу после удаления, так как это укрепляет костный мозг и усложняет извлечение методом с проклётной трубкой. Вместо этого костей храните на льду или при 4°C в короткие периоды обработки перед обработкой или заморозкой, как описано в шаге 3.1.1.4 (размещение на сухом льду до хранения −80°C).
      2. Удалите окружающие мышцы и соединительные ткани с рассечений костей.
      3. Перенесите кости в криовиалы.
      4. Положите образцы на сухой лёд.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы при −80°C до дальнейшей обработки.
    2. Обработка BM
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы в шкафу для биобезопасности с использованием стерильных инструментов и перчаток, чтобы предотвратить загрязнение, которое может нарушить чистоту электромобилей.
      1. Перед добавлением любого материала предварительно взвесьте и маркируйте трубки центрифуг объемом 1,5 мл. Рассчитайте массу BM, сравнивая веса трубок до и после извлечения.
      2. Подготовьте систему с пробоевой трубкой, вставив ПЦР-трубку объёмом 0,2 мл (целую крышку) в центрифугную трубку объёмом 1,5 мл с плотной посадкой. Проколите нижнюю часть трубки объёмом 0,2 мл один раз стерильной иглой 16 G, держащей перпендикулярно основанию, чтобы получить однородную перфорацию диаметром ~1,6 мм. Подготовьте по одной установке на каждую ногу для каждой мыши.
      3. Поместите ногу, очищенную от всех мышц и окружающих тканей, в стерильную чашку Петри.
      4. Разделите бедренную кость и большеберцовую кость, разрезав суставное пространство.
      5. Отрежьте оба конца бедренной кости и большеберцовой кости, чтобы открыть красный костный мозг. Поместите кости в проколённую ПЦР-трубку, расположенную внутри трубки объёмом 1,5 мл, и запечатайте сборку парапленкой, чтобы обеспечить надёжную установку во время центрифугирования.
      6. Центрифугуйте образцы в течение 10 секунд в настольной микроцентрифуге при температуре примерно 8 000 × г, то есть максимально близкая достижимая настройка используемого прибора, при комнатной температуре.
      7. Проверяйте успешное извлечение костного мозга по трём критериям: (i) кости выглядят заметно белыми без остаточного красного костного мозга, (ii) пуля в нижней трубке тёмно-красная и компактная, обычно заполняя конический кончик трубки объёмом 1,5 мл, и (iii) измеренная масса костного мозга (шаг 3.1.2.9) находится в ожидаемом диапазоне ~15–30 мг на мышь.
      8. Переместить или перерезать кости и повторить короткое вращение, если видимый красный мозг остаётся внутри кости.
      9. Взвесьте пробирки ещё раз, чтобы определить массу извлеченного костного мозга (обычно ~15–30 мг на образец, в зависимости от возраста, пола и эффективности экстракции мыши).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол валидирован для получения костного мозга в размере ~15–30 мг на образец. Поскольку объем ресуспензии RPMI-1640 остаётся постоянным на уровне 250 мкл независимо от массы костного мозга (шаг 3.1.2.10), выход EV нормализуется до измеренной начальной массы костного мозга при дальнейшем анализе (частицы·мЛ−1·мг−1 ткани). Для образцов значительно ниже 15 мг собирайте костный мозг от сопоставленных мышей (того же возраста, пола и костей) перед ресуспензией, чтобы сохранить достаточный вход для дальнейшей характеристики. Для образцов значительно выше 30 мг либо разделите костный мозг на две отдельные ресуспензии по 250 мкл каждая, либо масштабируйте объем RPMI-1640 пропорционально (~12,5 мкл на мг костного мозга), чтобы предотвратить неполную ресуспензию; В любом случае при анализе применяйте одинаковую нормировку по массе.
      10. Добавьте 250 мкл RPMI-1640 в каждую лампу. Поддерживайте постоянный объём по образцам независимо от массы костного мозга, чтобы нормализовать выход EV до начальной массы костного мозга. Держите образцы на льду.
      11. Повторно подвесьте костный мозг, аккуратно протягивая пипеткой вверх и вниз 10–15 раз с помощью пипетки P1000, пока суспензия не станет визуально однородной, без видимых комков или целостных фрагментов ткани. Избегайте насильственного пипетирования или образования пузырьков, которые могут нарушить целостность пузырьков.
  2. Удаление мусора
    1. Первая центрифуга
      1. Центрифугуйте образцы при 300 × г в течение 10 минут при 4°C, чтобы спелить непереваренный мусор, целые клетки и оставшиеся фрагменты ткани.
      2. Аккуратно перенесите супернатант в новые стерильные микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл, не нарушая гранулу.
    2. Вторая центрифуга
      1. Центрифугуйте образцы при 2 000 × г в течение 15 минут при 4°C, чтобы удалить крупный мусор.
      2. Аккуратно перенесите супернатант в новые стерильные микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл, не нарушая гранулу.
    3. Третья центрифуга
      1. Центрифугуйте образцы при 10 000 × г в течение 30 минут при 4°C, чтобы удалить апоптотические тела и крупные везикулы.
      2. Аккуратно перенесите супернатант в новые стерильные микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл, не нарушая гранулу.
      3. Обеспечьте получение конечного объёма в 200 мкл супернатаната.
  3. Хроматография с исключением размера (SEC)
    1. Подготовка колонны
      1. Уравновесить столбец SEC, промывая 6 мл с 1× PBS (0,22 мкм фильтруем).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Объём уравновешения зависит от столбца и должен соответствовать типу столбцов, указанному в Таблице материалов. Для этого столбца требуется объём уравновешения 6 мл, что отличается от столбца, используемого для SkM-образцов.
      2. Пусть весь объём пройдёт под действием силы тяжести.
      3. Поддерживайте колонку и PBS на RT во время уравновешения, чтобы обеспечить оптимальный расход и работу колонны.
    2. Загрузка и элюция образцов
      1. Загрузите 150 мкл фильтрованного супернатанта на колонку SEC.
      2. Дайте образцу полностью войти в смолу. Конечная точка достигается, когда жидкий менискус достигает поверхности слоя смолы, и над ней не остаётся видимой жидкости, пока смола остаётся влажной (как описано в шаге 2.2.2).
      3. Не позволяйте менискусу опускаться ниже поверхности смолы или колонке высыхать (см. конечную точку, определенную в шаге 3.3.2.2), так как это погружает воздух в слой смолы и нарушает элиминацию. Когда жидкий мениск достигнет поверхности смолы, немедленно переходите к шагу 3.3.2.4 без промедления.
      4. Немедленно добавьте 550 мкл PBS для начала элюции.
      5. Собирайте объём пустоты (700 мкл).
      6. Отбросьте объём пустоты или оставьте его как дробь без электромобиля.
      7. Начинайте сбор фракции, обогащённой EV, сразу после того, как объем пустоты 700 мкл будет элюирован.
      8. Соберите 850 мкл элюата, обогащённого ЭВ, после объёма пустоты в 700 мкл.
      9. Альтернативно, собирайте последовательные фракции примерно по 170 мкл для оптимизации чистоты по сравнению с выходом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости более высокой чистоты (например, для протеомных анализов или чувствительных последующих применений) рекомендуется меньшие объёмы фракций, тогда как для максимизации общего выхода электромобиля могут использоваться крупные порции.
      10. Оценивайте фракции для маркеров EV и пулируйте фракции, обогащённые EV, по мере необходимости.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте непрерывный поток колонки. Когда одна часть заканчивается, добавьте PBS, чтобы поддерживать постоянную жидкость над слоем смолы и предотвратить иссасывание колонны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для оценки эффективности этого протокола для выделения тканевых sEV представлены репрезентативные результаты из образцов SkM и BM. Успешная изоляция определялась (i) обогащением канонических маркеров EV (TSG101, CD63, CD81 и CD9) в ранних фракциях SEC, (ii) минимальным обнаружением внутриклеточных загрязнителей (например, Calnexin и BiP), (iii) унимодальным распределением размеров частиц с большинством частиц <200 нм), (iv) визуализацией целых, мембранно связанных везикул с помощью TEM, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает надёжный и воспроизводимый подход к выделению препаратов, обогащённых sEV, непосредственно из SkM и BM — двух малопродуктивных и сильно гетерогенных тканей. Хотя изоляция EV хорошо зарекомендована для биожидкостей и систем культуры клеток, стандартизированные методы для тканевых EV остаются ограниченными из-за трудностей, связанных с диссоциацией тканей, загрязнением внутриклеточным материалом и изменчивостью выхода. Здесь мы описываем критические шаги, стратегии ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

Благодарим Дженни Янг, Дариуша Журвека и Владимира Ерко за техническую помощь и полезные обсуждения. Мы благодарны платформе Центра прикладной наномедицины, особенно Надиму Тавилу и Лауре Монтермини, за поддержку в области характеристики внеклеточных везикул и сбора данных. Мы также благодарим сотрудников ветеринарного центра, Гайлен Гадури и Тару Томсон, за помощь в обращении с мышами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1.5 мл центрифужная пробиркаSarstedt72.690.300Общая микроцентрифужная пробирка, используемая в протоколе
1.5 мл пробирка с низкой связывающей способностью белкаSarstedt72.706.600Используется для обработки ЭВ, сбора фракций СЭК и хранения
0.2 мл ПЦР-пробиркаFisher Scientific14-222-262Используется для настройки извлечения костного мозга с проколом
Игла 16 GBD305197Используется для прокалывания 0.2 мл ПЦР-пробирки
30 мкм клеточный фильтрMiltenyi Biotec130-098-458Используется для фильтрации образцов скелетных мышц
70% этанолSigma-Aldrich1.11727Используется для стерилизации пинцетов
Шафа биобезопасностиНДНДИспользуется для обработки тканей в стерильной среде
Инструмент для резки костейFisher Scientific10-001-976Используется для разделения бедра и голени и экспозиции костного мозга
Бычий сывороточный альбумин (БСА)BioShopALB001Используется для блокирования и разбавления антител в вест-блот
Дихлорид кальция (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302Используется для приготовления буфера HEPES
Медь с угольным покрытием, 200-ячеечная сеткаSigma-Aldrich930342Используется для подготовки образцов для ЭМ
Центрифугальный фильтр, 100 кДа MWCOMilliporeSigmaUFC810096Используется для концентрации ЭВ
Коллагеназ DRoche11088858001Используется для ферментативного расщепления скелетных мышц
КриовиальSarstedt72.690.300Используется для хранения тканей и костей
Деионизированная вода (ультрачистая)НДНДИспользуется для приготовления буфера и шагов промывания для ЭМ
DNase IRoche11284932001Используется для ферментативного расщепления скелетных мышц
Сухой ледНДНДИспользуется для охлаждения образцов и транспортировки
Повышенный субстрат для хемилюминесценцииBiorad1705061Используется для обнаружения в вест-блот
Фильтрующий блок, 0.22 мкмSarstedt83.3941.501Используется для фильтрации PBS, если применимо
Пинцеты / пинцетMilliporeSigmaF3892Используется для работы с тканями
ГлутаральдегидНДНДИспользуется для фиксации в ЭМ
ГлицинНДНДИспользуется в шагах промывания сетки для ЭМ
Растворы солей Хэнка (HBSS)Gibco14175-095Используется для приготовления стабильного раствора DNase I
HEPESBioShopHEP001.500Используется для приготовления буфера HEPES-NaOH
Стравадин, конъюгированный с пероксидазой редисковицыThermo FisherS911Используется для обнаружения в вест-блот
Система имэджинг для хемилюминесценцииBiorad12003153Используется для визуализации мембран в вест-блот
KClBioShopPOC308Используется для приготовления буфера HEPES
Хлорид магния (MgCl2)BioShopMAG510.500Используется для приготовления буфера HEPES
2-МетилбутанThermo Fisher78-78-4Используется для быстрой заморозки скелетных мышц
Миллиграммовый весMilliporeSigmaZ741359Используется для взвешивания тканей и костного мозга
NaClBioShopSOD004.1Используется для приготовления буфера HEPES
Прибор для анализа наночастицMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 используется для размерного анализа и подсчета частиц
NaOHBioShopSHY500.500Используется для корректировки pH
Нитроцеллюлозная мембранаBioRad1704271Используется для переноса в вест-блот
Миксер-вибраторLabnetS0500Используется во время ферментативного расщепления
Пипетка P1000MilliporeSigmaFA10006M-1EAИспользуется для переноса тканей
Наконечник для пипеты, 1 млSarstedt70.3050.275Наконечник отрезан, чтобы расширить отверстие для переноса фрагментов ткани
Фосфатно-буферный раствор солей (PBS)WisentINC 811.012-FLИспользуется в протоколе; также используется для эквилибрирования и элюции СЭК
Ингибитор фосфатазыMilliporeSigma4906845001Используется для приготовления лизата в вест-блот
Чаша ПетриMilliporeSigmaCLS3511

Ссылки

  1. Whitham, M., et al. Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise. Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).
  2. Kumar, M. A., et al. Extracellular vesicles as tools and targets in therapy for diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 27 (2024).
  3. Fonseka, P., Mathivanan, S. Extracellular vesicles biogenesis, cargo sorting and implications in disease conditions. Cells. 12 (2), (2023).
  4. Taraboletti, G., et al. Bioavailability of VEGF in tumor-shed vesicles depends on vesicle burst induced by acidic pH. Neoplasia. 8 (2), 96-103 (2006).
  5. Dakup, P. P., et al. Challenges and opportunities in state-of-the-art proteomics analysis for biomarker development from plasma extracellular vesicles. Proteomics. , (2025).
  6. Li, Y., et al. EV-origin: Enumerating the tissue-cellular origin of circulating extracellular vesicles using exLR profile. Comput Struct Biotechnol J. 18, 2851-2859 (2020).
  7. Shero, J. A., Lindholm, M. E., Sandri, M., Stanford, K. I. Skeletal muscle as a mediator of interorgan crosstalk during exercise: Implications for aging and obesity. Circ Res. 136 (11), 1407-1432 (2025).
  8. Vanhie, J. J., et al. The role of exercise- and high-fat diet-induced bone marrow extracellular vesicles in stress hematopoiesis. Front Physiol. 13, 1054463 (2022).
  9. Pinto, A. C., et al. Exploiting the therapeutic potential of contracting skeletal muscle-released extracellular vesicles in cancer: Current insights and future directions. J Mol Med (Berl). 102 (5), 617-628 (2024).
  10. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  11. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835 (2023).
  12. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145 (2021).
  13. Ahmadian, S., et al. Different storage and freezing protocols for extracellular vesicles: A systematic review. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 453 (2024).
  14. Watanabe, S., et al. Skeletal muscle releases extracellular vesicles with distinct protein and microRNA signatures that function in the muscle microenvironment. PNAS Nexus. 1 (4), pgac173 (2022).
  15. Magalhaes-Gama, F., et al. Exploring cell-derived extracellular vesicles in peripheral blood and bone marrow of B-cell acute lymphoblastic leukemia pediatric patients: Proof-of-concept study. Front Immunol. 15, 1421036 (2024).
  16. Potter, D. R., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles attenuate pulmonary vascular permeability and lung injury induced by hemorrhagic shock and trauma. J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 245-256 (2018).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Org Biomol Chem. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Kim, T., Hong, J. W., Lee, L. P. Efficient methods of isolation and purification of extracellular vesicles. Nano Converg. 12 (1), 45 (2025).
  19. Bracht, J. W. P., et al. Choice of size-exclusion chromatography column affects recovery, purity, and miRNA cargo analysis of extracellular vesicles from human plasma. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (3), 497-508 (2024).
  20. Mo, W., et al. Extracellular vesicle-mediated bidirectional communication between the liver and other organs: Mechanistic exploration and prospects for clinical applications. J Nanobiotechnology. 23 (1), 190 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение мелких внеклеточных пузырьков из мышиных скелетных мышц и костного мозга с помощью хроматографии с исключением размера
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.