Зелёные наночастицы CuO/ZnO: уменьшение транслокации и накопленияAFB 1 в кукурузе

Краткое содержание

В этом исследовании изучалась эффективность гибридных наночастиц CuO/ZnO с зелёным синтезом в уменьшении накопления и транслокации афлатоксина_B1 (_{AFB 1}) в кукурузе, показав, что лечение в дозе 125 мг/кг значительно снижает уровень_{AFB 1} и минимизирует риски воздействия пищи на человека и животных.

Аннотация

Афлатоксин B₁ (_{AFB 1}) — это мощный канцероген, вырабатываемый видами рода Aspergillus , который загрязняет кукурузные культуры, создавая серьёзные риски для здоровья людей и животных из-за пищевого воздействия. Традиционное послеуборочное управление и химические вмешательства часто дорогостоящие или неэффективные для предотвращения перемещения почвенных токсинов в растение во время роста. Основная цель этого протокола заключалась в оценке гибридных наночастиц (НП), синтезированных зелёным синтезом меди/оксида цинка (CuO/ZnO) как устойчивого доуборки почвы. Целью исследования было выяснить, могут ли эти NPs эффективно ингибировать транслокацию и накопление_{AFB 1} в тканях кукурузы, тем самым снижая накопление токсинов в съедобных зернах. Используя рандомизированный комплексный блок на двух различных участках поля, кукуруза была выращена в почве, инокуляционной спорами_{AFB 1} или Aspergillus flavus , и обработана различными концентрациями NP (0–125 мг/кг). Протокол использовал зелёный синтез с субстратом Pleurotus ostreatus для обеспечения экологичности. Ткани растений анализировались на различных физиологических стадиях с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) для измерения уровней_{AFB 1} и оценки рисков для человека и скота. Обработка 125 мг/кг зелёных гибридных NPs значительно снизи<ла концентрацию AFB₁ на всех стадиях роста. На территории кампуса уровень_{AFB 1} был снижен на 68% на вегетативной стадии, на 82% при цветении и на 76% при созревании по сравнению с положительным контролем. Ключевым является то, что уровень зерновых_{AFB 1} снизился до 6,91 ppb, что значительно снизило предполагаемую суточную норму для людей. Однако требуются дальнейшие исследования для оценки потенциальных остатков наночастиц и долгосрочной токсичности. Этот метод демонстрирует, что зеленые гибридные NP CuO/ZnO действуют как эффективный биоремедиационный агент, предотвращая транспортировку токсинов в съедобные части растения. Этот подход предлагает масштабируемую, экологически безопасную стратегию для повышения продовольственной безопасности и снижения воздействия_{AFB 1} в регионах, подверженных афлатоксинам.

Введение

Афлатоксины, особенно афлатоксин_B1 (_{AFB 1}), являются одними из самых значимых микотоксинов из-за их распространённости, токсичности и влияния на человека. Они образуются определёнными грибами, преимущественно представителями видов Aspergillus ^1,2,3. _{AFB 1} связан с гепатоцеллюлярным раком и является самым опасным из всех афлатоксинов⁴. Эти мощные канцерогены заражают различные сельскохозяйственные культуры, включая кукурузу (Zea mays L.), вызывая серьёзные проблемы с безопасностью^{пищевых продуктов 5,6}. Наличие_{AFB 1} в кукурузе не только влияет на урожайность и качество урожая, но и представляет серьёзную угрозу здоровью людей и животных из-за пищевого^{воздействия 7,8}.

В настоящее время управление афлатоксином преимущественно опирается на послеуборочные стратегии, такие как правильная сушка, сортировка повреждённых ядерен, химические обработки (например, аммиак или озон), облучение и герметическое хранение для предотвращения роста грибков во время хранения⁹. Стратегии включают хорошее управление культурами, биоконтроль (например, известь) и улучшенные хранилища¹⁰. Также были испытаны физические и химические методы, такие как микроволновый, ультрафиолет (УФ), импульсный свет, электролизованная вода, холодная плазма, озон, электронный луч и гамма-облучение^. Однако эти методы после сбора часто дорогостоящие, энергозатратные или непрактичные для широкого применения, и они не предотвращают транслокацию афлатоксина внутри растения во время роста.

Используемые подходы до сбора урожая включают агрономические методы, такие как устойчивые сорта, своевременная посадка, орошение для снижения засушливого стресса и биоконтроль с использованием афлатоксинных штаммов A. flavus (например, Aflasafe), которые конкурентно исключают токсигенные штаммы, но требуют повторного применения и могут не полностью решать почвенную^{транслокацию} 11,12,13 . Эти методы часто сталкиваются с ограничениями: послеуборочные вмешательства не могут обратить вспять уже существующее загрязнение, влечут за собой высокие затраты на инфраструктуру сортировки/хранения в условиях с ограниченными ресурсами, рискуют потерей питательных веществ или остатками от химикатов, а эффективность биоконтроля варьируется в зависимости от^{экологических условий 14}.

В отличие от этого, гибридные наночастицы CuO-ZnO, синтезированные зелёным синтезом, предлагают новую стратегию пополнения почвы перед уборкой. В отличие от традиционных химических NP, зелёный синтез с использованием растительных экстрактов (например, грибного субстрата) позволяет избежать токсичных растворителей, снижает затраты и повышает биосовместимость, делая их экологически^{устойчивыми 15,16}. Гибридизация CuO-ZnO синергетически усиливает противогрибковую активность, генерируя реактивные кислородные формы (ROS), нарушая грибковые мембраны и обеспечивая высокую площадь поверхности для адсорбции_{AFB 1}, тем самым препятствуя поглощению и транслокации в съедобные части растений, такие как зерна. Это отличается от существующих стратегий тем, что позволяет проводить раннее вмешательство на границе почвы и растения, достигая снижения до 80-99%_{AFB 1} при низких дозах (например, 125 мг/кг), без ущерба урожайности и оставления вредных остатков¹⁷. Ключевые преимущества включают экологическую чистоту по сравнению с химическими фунгицидами, превосходящую эффективность по сравнению с однометаллическими NPs или биоконтроль в условиях переменных полевых условий, а также потенциал масштабируемой интеграции в сельскохозяйственные практики в регионах, склонных к афлатоксину, таких как Африка к югу от Сахары.

Металлические оксидные NP, в частности оксид цинка (ZnO) и оксид меди (CuO), привлекли внимание среди этих материалов благодаря своим противогрибковым свойствам и способности поглощать^{токсины 18,19}. Например, сообщалось, что Cu NP способны создавать ROS, что может наносить вред бактериальным и грибным биологическим^{макромолекулам 20}. Также в другом эксперименте было показано, что грибные штаммы имеют заметный сдвиг с явной тенденцией к увеличению порядка при обработке CuO NP на основе хитозана, что привело к наибольшему эффекту^{упорядочения 21}. Зелёный синтез NPs привлёк внимание как более безопасная и устойчивая альтернатива традиционным химическим методам, минимизируя токсичные побочные продукты и воздействие на окружающую^{среду 15,22}.

Гибридизация NP CuO и ZnO сочетает полезные свойства обоих металлов, что потенциально повышает их эффективность в разложении или адсорбции_{AFB 1}^23,24. В настоящее время эти зелено синтезированные NPs в основном используются для контроля образования ФП в грибных штаммах в экспериментах in vitro; например, Шейк и Авад изучали влияние AgNPs, AuNP и их смеси на рост и накопление афлатоксина_B1 афлатоксина B1 афлатоксинного штамма A. flavus ²⁵. Однако концентрация, необходимая для контроля роста A. flavus, неизвестна. Таким образом, существует критическая необходимость оценивать зеленые гибриды CuO-ZnO в условиях, значимых для полевых условий, на предмет их влияния на транслокацию_{AFB 1} из почвенных источников в ткани кукурузы по сравнению с традиционными NP. Таким образом, целью этого исследования было определить влияние различных концентраций зелёных гибридных NP CuO/ZnO на концентрацию_{AFB 1}/A. flavus в тканях растений кукурузы и оценить риск AFB₁ в кукурузе после обработки кукурузы зелёными гибридными NP CuO/ZnO. Исследовательские гипотезы должны были предоставить механистическую основу для наблюдаемой эффективности зелено синтезированных гибридных NP CuO-ZnO. В данном исследовании проверяются следующие измеримые гипотезы: 1) Гипотеза противогрибкового ингибирования, согласно которой гибридные NPs значительно снижают споруляцию A. flavus и последующую де-ново производство_{AFB 1} в почве по сравнению с однометаллическими NP, что определяется по снижению грибковой нагрузки и уровня токсинов на участке Молелване. 2) Гипотеза адсорбции-транслокации: при наличии уже существующих токсинов (на территории кампуса) NPs должны были продемонстрировать высокую аффинность связывания с_{AFB 1}, значительно снижая скорость транслокации токсинов из почвы в корневую систему кукурузы. 3) Гипотеза биосовместимости (фитотоксичности): согласно которой зелено синтезированные гибридные NP должны приводить к снижению остаточного накопления металла и снижению маркеров окислительного стресса в тканях кукурузы по сравнению с обычными химическими эталонами, тем самым повышая биобезопасность сельскохозяйственных культур.

Протокол

Экспериментальные площадки
Испытания проводились на двух площадках, расположенных на расстоянии 7 км друг от друга; Участки были вакцинированы различными методами лечения. В первом испытании на исследовательской ферме Молелвейн, Северо-Западный университет (NWU) (25.810°S, 25.630°E, 1276 м) в Северо-Западной провинции Южной Африки, был создан сетчатый комплекс с тенью 40%. Почва с красным песчаным суглинком была классифицирована как форма Хаттона и содержала 75% песка, 4% ила и 21%^{глины 25}%. Второй эксперимент был проведён на комплексе сетки кампуса NWU Mafikeng (25. 8278°S, 25. 6079°E, 1276 м). Почвы на втором участке имели песчаный суглинок с 82% песка, 3% ила, содержание глины 15%, ранее классифицировались как Arcadia^{form 25}. Зелёные гибридные NP CuO/ZnO были синтезированы в лаборатории кафедры химии Школы физико-химических наук факультета естественных и сельскохозяйственных наук NWU в Южной Африке.

Синтез зелёных гибридных NP CuO/ZnO
Десять (10) г сушёного субстрата из отработанного гриба Pleurotus ostreatus (SMS) были добавлены к 100 мл деионизированной воды, нагреты при 70 °C и перемешивались 2 часа²⁶ часов. Затем смесь охлаждалась до комнатной температуры, фильтровалась, и 30 мл фильтрата добавляли в раствор, содержащий 2,5 г медного ацетата и 2 г цинкового ацетата в 30 мл дистиллированной воды. pH этого раствора был скорректирован до 8 с помощью гидроксида натрия (NaOH), нагреван до 80 °C в течение 2 часа, центрифугирован после реакции, сушился ночью в духовке и кальцинировал при 650 °C в течение 2^{ч 26}. Синтезированные NP были охарактеризованы и подтверждены как зелёные гибридные NP CuO/ZnO.

Отбор проб и анализ почвы
Образцы почвы были собраны на Университетской ферме в Молелвейн и на испытательном полигоне кампуса на глубинах 0–15 см и 15–30 см. Впоследствии их классифицировали и исследовали по физическим и химическим свойствам, как это было описано^{в 27} статьях.

Экспериментальная конструкция
В исследовании использовался факториальный эксперимент, организованный в рандомизированном полном блочном дизайне (RCBD) с тремя репликами. Для оценки эффективности гибридных NP CuO-ZnO с зелёным синтезом в различных сценариях загрязнения были установлены два независимых режима воздействия на отдельных участках: Участок 1 (кампус Северо-Западного университета) представлял собой экзогенную модель загрязнения, где почва была спайкирована экстракцией_{AFB 1} со скоростью 160 ppb/kg для оценки возможностей NPs прямой адсорбции и экранирования от транслокации. Участок 2 (исследовательская ферма Молелвейн): представлял биологическую модель инфекции, в которой почву инокуляли спорами A. flavus в концентрации 160 спор/кг для изучения противогрибкового воздействия NPs на производство de novo микотоксинов и последующее поглощение растениями. Порошкообразные NP взвешивались и равномерно смешивались с 1 кг почвы в пластиковом пакете для посадки после инокуляции (споры_{AFB 1} или A. flavus ). Каждое лечение проводилось отдельно, а руки дезинфицировали между процедурами. Затем в каждый горшок изначально сажали четыре семена кукурузы (верхний диаметр 9 см, нижний диаметр 6,5 см). Чтобы сохранить три здоровых саженца в горшке, их обрезали через неделю после появления. В соответствии с рекомендациями по оптимальному производству кукурузы, полученными на основе анализа почвы, почва была удобрена. Горшки были размещены на расстоянии между и внутри рядов 0,75 м × 0,3 м, всего получилось 216 горшков. Почва в горшках поливалась до 60% полевой вместимости после посева семян. Образцы почвы и растений были собраны на трёх этапах развития: V10 (развитие), R1 (цветение) и R6 (зрелость). Образцы затем доставлялись в лабораторию в холодильнике, наполненном льдом, и хранили при -20 °C для дальнейших исследований. Для хранения и глубокой заморозки оставшихся образцов растений на концентрации_{AFB 1} и других анализов использовались коричневые бумажные пакеты. Оставшиеся образцы растений для концентраций_{AFB 1} и другие анализы хранились в коричневых бумажных пакетах и замораживались глубоко до анализа.

Анализ афлатоксинов кукурузы
Компоненты для развития кукурузы (корень, стебель, лист и зерно) на различных стадиях роста собирались в стерильные пластиковые пакеты, тщательно маркировались и транспортировались в лабораторию. Для сохранения целостности данных о росте и обеспечения независимых наблюдений на каждом этапе развития был внедрён протокол деструктивной выборки. Для устранения перекрёстного загрязнения между концентрациями наночастиц и типами инокуляции инструменты и перчатки очищались 70% этанолом и промывались деионизированной водой между каждой группой обработки. В ступке с пестиком 10 г растительного материала и 1 г хлорида натрия (NaCl) измельчались в течение 10 минут в 25 мл 80% метанола и 20% дистиллированной воды. Для зерна кукурузы и сердечника кукурузы 25 г молотого образца и 2,5 г NaCl смешивались с 100 мл 80% метанола:20 дистиллированной воды на высокой скорости в течение 10 минут. Затем гомогенизированный экстракт фильтровали через стеклянный микрофибровый фильтр, после чего промывали 20 мл 20% Tween-2 в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS). Афлатоксины извлекались из колонки иммунной аффинности после элюции со скоростью потока одной капли в секунду, а супернатант (цитоплазма) собирался в янтарный флакон. Затем_{AFB 1} и другие афлатоксины измерялись по методу жидкой^{хроматографии 28} , который включал дериватизацию афлатоксинов раствором офтальдиальдегида и ввод дериватизированных соединений в систему высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Система HPLC была оснащена флуоресцентным детектором Jasco FP-920, настроенным на возбуждение 362 нм и излучение 425 нм. _{AFB 1} имел физиологическую структуру для обнаружения на длине волны возбуждения 362 нм. Использовалась колонна Хихрома (4,6 мм × 150 мм) с частицами 5 мкм, а реактор дериватизации представлял собой программу ячейки KOBRA с частотой 100 мкА. Разделение хроматографических пиков проводилось в колонне Хихрома, к которой была установлена предколонна аналогичной стационарной фазы. Инерцсил ODS-3 и ODS-3 V использовались соответственно в качестве защитных и аналитических патронов, а инжектор состоял из автопромплера с реодиновым клапаном. Подвижная фаза состояла из воды: метанола (65:35, в/в), бромида калия (119 мг) и 4 М азотной кислоты (350 мкл) на литр, и перекачивалась при расходе 1,0 мл/мин в изократической программе. Обнаружение афлатоксина считалось положительным для каждого пика при времени удержания, аналогичном стандарту, и на высоте, в пять раз выше базового^{шума 29}.

Были рассчитаны пределы обнаружения (LOD), предел количественной оценки (LOQ) и процент (%) восстановления для подтверждения аналитического подхода HPLC с использованием уравнений 1, 2 и 3 соответственно. LOD — это самая низкая концентрация афлатоксина, которую можно надёжно отличить от фоновых шумов, тогда как LOQ — самая низкая концентрация афлатоксина, которую можно количественно измерить с приемлемой точностью и^{точностью 30}. _{AFB 1} и его метаболиты были извлечены путём добавления 10 мкл общего количества стандартов афлатоксина (AFB₁, AFB₂, AFG₁ и AFG₂) к отрицательным контрольным образцам кукурузы в тройном экземпляре. Образцы затем извлекались с помощью ВЭЖХ с использованием вышеупомянутых процедур.

LOD = X + 3s 1

LOQ = X + 10s 2

3

Таким образом: «X» — средняя концентрация укреплённых пробелов образца, а «s» — стандартное отклонение образца.

Оценка воздействия AFB1
Средние уровни афлатоксинов в рационе кукурузы, суточное потребление кукурузы и средний вес тела (дети, взрослые, крупный рогатый скот, молочные коровы и цыплята) использовались для расчета предполагаемого дневного потребления (EDI). EDI для средних афлатоксинов рассчитывался по уравнению 2 и выражался в (нг/кг массы тела/сутки); для расчёта индекса опасности (HI) значения EDI были преобразованы в нг/кг массы тела/день (1 ppb/kg/день = 1 000 нг/кг массы тела/день) для соответствия единицам TD5032³¹.

4

Оценка и характеристика рисков
Индекс опасности (HI) рассчитывался путём деления EDI на TD50 и умножения на коэффициент безопасности 50 000. Медианная токсичная доза (TD) 50 — это необходимая доза (нг/кг/масса тела/день) для возникновения опухолей у 50% исследуемых животных, у которых не развились бы опухоли при нулевой^{дозе 31,32}.

Анализ данных
Анализ дисперсии был проведён на собранных данных о росте и урожайности с использованием процедуры RCBD в SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США). Были проведены многочисленные сравнения средних значений наименьших квадратов с использованием теста Тьюки на честно значимую разницу (HSD)³³.

Результаты

Концентрация афлатоксина в компонентах роста
Результаты показали, что концентрации афлатоксина в компонентах роста и в зерне кукурузы, обработанном зелёным синтезированными NPs CuO/ZnO, что указывает на наличие всех основных типов афлатоксинов (AFG₂, AFG₁, AFB₂ и AFB₁). Калибровочные кривые, используемые для расчёта концентраций афлатоксина, показали хорошую линейность между различными афлат...

Обсуждение

Успех этого протокола в снижении транслокации и накопления_{AFB 1} в кукурузе зависит от нескольких критически важных этапов, обеспечивающих как биологическую эффективность, так и аналитическую^{надёжность 16,27}. Результаты показывают, что 125 мг/кг зелено синтезированных гибридных NP CuO-ZnO значительно снижали концентрацию_{AFB 1} в обеих экспериментальных моделях, хотя и с помощью потенциально различных

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Медь(II) ацетат [Cu(CO2CH3)2]	Sigma-Aldrich Pty, Сент-Луис, Миссури, США	10,53,753	Тёмно-сине-зелёный кристаллический твёрдый материал (98% чистоты)
Стеклянный микрофибровый фильтр и bbsp;	Sigma-Aldrich Pty, Сент-Луис, Миссури, США	1703965	Боросиликатное стекло
Система высокопроизводительной жидкостной хроматографии (HPLC)	Симадзу	20H2	Для разделения и количественной оценки аналитов
Этанол класса HPLC	Sigma-Aldrich Pty, Сент-Луис, Миссури, США	34923	Бесцветный растворитель высокой чистоты ( & ge; 99 %)
Метанол класса HPLC	Merck KGaA, Дармштадт, Германия	322415	Бесцветный растворитель высокой чистоты ( & ge; 99 %)
Столбец иммунной аффинности	Симадзу	KJ524	Для селективной очистки целевых аналитов
Семена кукурузы PAN 5R-590R	NWK	Н/Д	Маленькие, твёрдые зерна с белым колуором
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)	Merck KGaA, Дармштадт, Германия	3526580	Изотонический буферный раствор
Пластиковые пакеты	Эко-Агро Энтерпрайз (Pty) Ltd	Н/Д	Перфорированный
Очищенные AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 и AF — всего на месте	Trilogy Analytical Laboratory, Inc (Воссбринк Драйв, Вашингтон, США)	TAS-M12DA1-10	Белое до бело-белое кристаллическое твердое тело
Хлорид натрия (NaCl)	Sigma-Aldrich Pty, Сент-Луис, Миссури, США	Н/Д	Белое кристаллическое твердое тело
Цинковый ацетат [Zn(CH3COO2)2H2O]	Химикаты VWR	2331 210 2	Белокристаллическое твердое вещество (99 % чистоты)