Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культивирование микрососудистых эндотелиальных клеток мозга мыши

165 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70909

⸱

17 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол для выделения и первичной культуры микроваскулярных эндотелиальных клеток мозга (BMEC) из неонатальной мышиной ткани с целью создания надёжной in vitro модели для изучения функции гематоэнцефалического барьера в физиологических и патологических условиях.

Аннотация

Микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга (БМЭК) являются основным клеточным компонентом гематоэнцефалического барьера (БББ) и играют ключевую роль в регулировании молекулярного транспорта и поддержании гомеостаза центральной нервной системы. Надёжные in vitro модели эндотелия мозга необходимы для изучения физиологии и дисфункции BBB при неврологических и системных заболеваниях. Описан воспроизводимый протокол выделения и первичного посева БМЭК из коры головного мозга у мышей новорождённых. Метод включает рассечение корковой ткани, механическую и ферментативную диссоциацию, удаление миелиновых остатков с помощью градиента плотности бычьей сыворотки (BSA) и обогащение эндотелиальных клеток с помощью иммунного отбора на основе CD31. Изолированные клетки затем культивируются на пластинах, покрытых коллагеном, и характеризуются морфологической оценкой, иммунофлуоресценционным обнаружением эндотелиальных маркеров, анализами формирования ангиогенных трубок и измерениями трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) для оценки свойств барьера. Этот протокол обеспечивает надёжный подход к получению первичных культур BMEC, подходящих для изучения биологии BBB, эндотелиальной сигнализации и нейроваскулярных взаимодействий при физиологических и патологических условиях.

Введение

Гематоэнцефалический барьер (БББ) — это высокоспециализированная структура, которая строго регулирует обмен веществами между центральной нервной системой (ЦНС) и системнымкровообращением 1. BBB в основном формируется микрососудистыми эндотелиальными клетками мозга, соединёнными плотными соединениями. Эти эндотелиальные клетки функционируют внутри многоклеточной системы, известной как нейроваскулярная единица (NVU), которая также включает астроциты, перициты, нейроны, глиальные клетки и базальнуюмембрану 2. Среди этих компонентов центральную роль играют микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга (BMEC), формируя непрерывный слой с плотными соединениями, тысячами селективных транспортерных систем, ограниченной везикулярной транспортировкой и ограничивая инфильтрацию иммунных клеток за счёт низкой экспрессии спаянных молекул, ограничивающих проход растворённых веществ и клеток в паренхимумозга 3,4.

Помимо роли физического и селективного барьера, BMEC активно участвуют в ключевых процессах, включая нейроваскулярную сигнализацию, регуляцию кровотока в мозге, локальные иммунные ответы и, в частности, церебральныйангиогенез 5. Последний процесс играет ключевую роль в эмбриональном развитии, но также реактивируется при патологических состояниях, таких как инсульт, ишемия или воспаление. BMEC реагируют на проангиогенные сигналы, такие как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста плаценты (PLGF), координируя формирование и созревание новых сосудов 6,7. Таким образом, эндотелиальная дисфункция мозга серьёзно нарушает целостность BBB и гомеостаз мозга.

Изучение BMEC in vitro позволяет моделировать как физиологию BBB, так и механизмы, регулирующие ангиогенез мозга. Однако изоляция этих клеток из ткани мозга представляет собой значительные технические сложности из-за сложности нервной ткани, большого количества миелина и необходимости получения культур с высокой чистотой эндотелия. Хотя имеются бессмертные клеточные линии, они имеют значительные ограничения с точки зрения фенотипической и функциональнойрепрезентативности 8.

В этом контексте протоколы первичной культуры BMEC на неонатальных мышиных моделях представляют собой мощный экспериментальный инструмент, поскольку сохраняют многие морфологические, молекулярные и функциональные характеристики эндотелия мозга in vivo . Однако несколько устоявшихся протоколов изоляции мышиного BMEC основаны на механической диссоциации в сочетании с градиентами плотности (декстран или Перколл), что часто приводит к переменному эндотелиальному обогащению и остаточному загрязнению перицитами, астроцитами и миелиновымобломком 9. Очистка на основе антибиотиков с использованием пуромицина улучшает чистоту эндотелиума (до ~95%), но может вызвать клеточный стресс из-за подавления синтеза белка и потенциального влияния на эндотелиальныйфенотип 10. Альтернативно, подходы на основе флуоресцентно-активированного сортировки клеток (FACS) обеспечивают высокоочищенные популяции, но требуют специализированного оборудования и обширной обработки, что может снизить жизнеспособность имасштабируемость 11. Более современные неонатальные протоколы избегают градиентов плотности и сокращают количество этапов центрифугирования, повышая урожайность и ограничиваязагрязнение 12.

Опираясь на этот фон, в работе описывается оптимизированный протокол изоляции и культивирования эндотелиальных клеток из микрососудистого мозга мышей новорождённых. Этот метод сочетает точную анатомическую диссекцию, эффективное ферментное пищеварение, удаление миелина с помощью градиента бычьей сыворотки альбумина (BSA) и обогащение с помощью иммуноселекции магнитными микросферами, конъюгированными с маркером CD31. Протокол позволяет получать жизнеспособные, воспроизводимые и обогащённые первичные культуры, подходящие для изучения церебрального ангиогенеза, нейроваскулярного взаимодействия, эндотелиальной сигнализации и дисфункции BBB как в физиологических, так и в патологических условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Комитет по биоэтике и биобезопасности Университета Био-Био одобрил этот проект (грант Fondecyt 1240925). Работа с животными проводилась в соответствии с основными принципами трёх «Р» при использовании экспериментальныхживотных 13 и в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованных Национальными институтами здоровья СоединённыхШтатов 14. Животных содержали в соответствующих условиях в биотериуме Университета Био-Био в стандартных условиях содержания (12 часов цикл свет/темнота, контролируемая температура 22 ± 2 °C, с импровизированным доступом к корму и воде).

Для получения клеток использовались беременные мыши дикого типа (WT) (C57BL/6) в возрасте от 4 до 6 месяцев. После родов щенки оставались с матерью до 5-го дня после родов (P5). В этот момент потомство было глубоко анестезиировано изофлураном до потери рефлексов перед эвтаназией. Гипотермия использовалась исключительно как дополнение для минимизации движений и сразу же сопровождалась обезглавливанием. Все процедуры проводились в соответствии с Руководящими принципами Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) по эвтаназии животных (2020)15 и международными правилами по уходу и использованию лабораторных животных (NIH)14. Кора головного мозга была выделена и использована для разработки этого экспериментального протокола (см. Шаг 3 протокола). Таблица материалов содержит материалы и антитела, используемые в этом протоколе.

1. Подготовка эндотелиальной культурной среды

  1. Для приготовления 500 мл культурной среды для эндотелиальных клеток мышиного мозга в стерильной ёмкости смешайте 250 мл DMEM с добавлением 10% плодовой сыворотки (FBS), 250 мл эндотелиальной среды для культуры с добавлением 10% FBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культурная среда обеспечивает важные эндотелиальные факторы роста и поддерживает пролиферацию клеток. Если указанный продукт (см. таблицу материалов) недоступен, в DMEM + FBS можно добавить эквивалентные добавки для эндотелиальных клеток (например, ЭКГС, гидрокортизон и L-глутамин) для достижения аналогичных условийроста 16.
  2. Стерильно фильтруйте всю среду (10% FBS) через фильтр 0,22 мкм для обеспечения стерильности.
  3. Храните подготовленную среду при 4 °C до использования. Готовьте свежую среду каждые 2–4 недели для поддержания активности факторов роста.

2. Покрытие посевных пластин

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения присоединения клеток и поддержания эндотелиального фенотипа посевающие пластины должны быть предварительно покрыты коллагеном типа I. Шаги этого процесса следующие:

  1. Подготовьте раствор предварительного покрытия, смешивая коллаген типа I (0,1 мг/мл), M уксусной кислоты для растворения коллагена и стерильную базальную среду для достижения общего объёма 15 мл. Аккуратно перемешивайте, пока коллаген полностью не растворится, и при необходимости регулируйте pH 4.0 . Стерильно фильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм и храните на льду до использования для сохранения стабильности коллагена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген типа I имитирует базальную мембрану, поддерживает прикрепление эндотелиальных клеток и помогает поддерживать фенотип клеток.
  2. Гомогенизировать раствор в стерильных условиях. Нанесите раствор равномерно, чтобы покрыть всю поверхность посевных тарелок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используется только объём, необходимый для покрытия поверхности.
  3. Инкубировать пластины при 37 °C ночью (12–16 часов), чтобы коллаген правильно адсорбирался. Перед посевом клетки удалите лишний раствор покрытия и промыйте пластины 2 раза стерильным 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (1x PBS, pH 7,4), чтобы удалить остаточную кислоту и несвязанный коллаген.

3. Выделение смешанной клеточной культуры мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол основан на предыдущих отчетах 9,17, направленных на изоляцию BMEC от коры мозга у мышей P5.

  1. Принесите в жертву пять щенков P5 с глубокой анестезией с изофлураном; использовать гипотермию только в качестве дополнительного эффекта, после чего происходит отрубление шейного отдела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого этапа все процедуры должны выполняться в биологическом защитном шкафе с ламинарным потоком.
  2. Соберите мозги (рисунок 1A) и поместите его в стерильный холодный PBS (1x) в конической трубке объёмом 50 мл, пока весь мозг не будет обработан.
  3. Отдельте мозговые каналы, аккуратно прокатывая каждый мозг по стерилизованной нитроцеллюлозной мембране. Перенесите мозг на пластину диаметром 100 мм с холодным PBS (1 раз). С помощью стерильного скальпеля удаляют ствол мозга, мозжечок, таламус и обонятельную луковицу (рисунок 1B,C).
  4. Соберите полученные мозговые коры без мозговых выделений и храните их в холодном PBS (1 раз). Немедленно перенесите всю кору мозга в коническую трубку объёмом 50 мл, содержащую 5 мл PBS 1x на льду (рисунок 1D).
  5. Механически диссоциировать ткань стерильными ножницами, затем использовать пипетку объёмом 1 мл, пока не останутся детали и подвеска не станет однородной (см. рисунок 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик пипетки можно обрезать для снижения механического напряжения во время тритурации. Диссоциация тканей достигается контролируемым всасыванием и мягкой пипеткой, а более широкое отверстие кончика минимизирует сдвиговые силы и механический лизис клеток, тем самым сохраняя жизнеспособность клетки.
  6. Соберите все ткани и поместите их в трубки по 15 мл.
  7. Для переваривания ткани переместите образец в стерильную коническую трубку объёмом 15 мл с 2 мл раствора коллагеназы (2 мг/мл в DMEM) и инкубируют 2 часа при 37 °C на орбитальном шейкере при скорости 180 об/мин.
  8. После переваривания добавьте 5 мл DMEM с дополнением 10% FBS в суспензию и центрифугу при 3 000 × г в течение 10 минут (см. рисунок 1F). Отбросьте супернатант.
  9. Для удаления миелина реуспензуйте гранулу в 4 мл 20% BSA в PBS (w/v) и центрифугуйте при 3 000 × г в течение 20 минут (рисунок 1G). После центрифугирования аккуратно удалите верхний молочный слой, содержащий миелин, с помощью пипетки Пастера и выбросьте оставшиеся наверхние вещества (рисунок 1H).
  10. Суспензируйте гранулу в 2 мл DMEM с 10% FBS, затем снова центрифугуйте при 3 000 × г в течение 10 минут. Сбросьте супернатант, затем аккуратно подвесьте финальную гранулу в 1 мл DMEM с 10% FBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе конечная ресуспензия содержит гетерогенную популяцию клеток, полученных из мозга, возникающую в результате диссоциации тканей. Эта смесь может включать клетки мозга, микроваскулярные эндотелиальные клетки, астроциты, перициты и другие нейронные клетки. Для выборочного обогащения BMEC требуются последующие этапы очистки и культуры.
  11. Перед нанесением изолированных клеток удалите раствор покрытия с подготовленных посевных пластин (см. шаг 2.3) и промывайте каждую колодцу стерильным PBS (1 раз).
  12. Посейте восстановленные подвешенные клетки (шаг 3.10) на покрытые тарелки (рекомендуемо: тарелки диаметром 60 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно вся клеткавая суспензия, полученная при одной изоляции, распределяется на одну или две покрытые чашками, каждая из которых содержит 5 мл эндотелиальной среды роста.
  13. Сохранять культуры в эндотелиальной клеточной среде при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Заменяйте среду каждые 2–3 дня. Когда культуры достигают слияния 90–100%, проводите иммуноселекция с использованием шариков, покрытых CD31, для обогащения эндотелиальных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После выделения и первоначального установления культуры процедура обычно даёт примерно 5 × 1010 6 клеток на препарат, которые прилипают к пластинам, покрытым коллагеном, и развивают характерную морфологию булыжника эндотелиальных монослоёв.

4. Выделение микроваскулярных эндотелиальных клеток мозга (BMEC) с помощью магнитных шариков CD31

  1. Подготовка и отделение клеток
    1. Когда культуры достигнут 90–100% слияния, промывайте клетки 3 раза PBS (1 раз), чтобы удалить остаточную среду.
    2. Добавьте 1 мл трипсина (0,5% 1x) в пластину и инкубируемые 3–5 минут при 37 °C, чтобы отделить клетки.
    3. Нейтрализуйте трипсин, добавив 1 мл эндотелиального посевного материала с 10% FBS. Перенесите суспензию ячейки (~2 мл) в стерильную микроцентрифугную трубку и центрифугу при 220 × г на 10 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант.
  2. Подготовка магнитных шариков CD31
    1. Поместите 8 мкл магнитных шариков CD31 в новую трубку на 15 мл. Промыйте шарики 1 мл раствора Хэнка 1%, аккуратно подвешивая их, перемещая трубку.
    2. Поместите трубку на магнит на 2 минуты, чтобы осадить шарики. Аккуратно снимите супернатант, не трогая бусины. Повторите этот шаг стирки три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда работайте рядом с магнитом, чтобы не потерять шарики, и выполняйте этот этап в стерильных условиях, чтобы предотвратить загрязнение первичной клеточной культуры.
  3. Инкубация клеток с помощью бусинок
    1. Ресуспензировать клеточную гранулу в 1 мл раствора Хэнка 1%, содержащего FBS (чтобы уменьшить неспецифическое связывание).
    2. Переместить клетки в трубку с предварительно промытыми бусинами с помощью пипетки объемом 1000 мкл. Инкубировать смесь на льду с лёгким встряхиванием в течение 20 минут.
  4. Магнитное разделение эндотелиальных клеток
    1. Поместите трубку на магнит на 3 минуты, чтобы осадить эндотелиальные клетки, связанные с бусинками.
    2. Аккуратно снимите супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно очистить два изолированных типа клеток — одну эндотелиальную клетку (см. шаг 4.5) и смесь различных типов клеток мозга. На данный момент доступны два варианта.
      1. Удалять и отбрасывать супернатант (то есть смесь клеток мозга), оставляя трубку на магните. Промыйте клетки с бусинкой (то есть CD31+ клетки) 2 мл раствора Хэнка и повторите это три раза.
      2. Используйте супернатант, содержащий клеточный мусор, чтобы создать новую культуру с неотображёнными клетками (например, фибробласты, астроциты, микроглии, нейроны, перициты и другие).
  5. Культивирование очищенных BMEC
    1. Суспензировать эндотелиальные клетки, связанные с бусинкой, в 7 мл полной эндотелиальной среды (10% FBS).
    2. Посейте клетки на пластине диаметром 60 мм, предварительно покрытую коллагеном, на ночь (см. раздел 2). Инкубировать в стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальный фенотип сохраняется до пассажа (p) 3 при описанных условиях культуры. Для поддержания свойств, связанных с гематоэнцефалическим барьером, рекомендуется проводить экспериментальные анализы с использованием ранних проходов (p0–p3).

5. Характеристика клеток

  1. Микроскопическое наблюдение клеток, захваченных бусинами
    ПРИМЕЧАНИЕ: При условиях культуры, описанных в этом протоколе, первичные BMEC обычно могут поддерживаться до трёх пассажей (p3 ), сохраняя их характерную эндотелиальную морфологию и фенотип. В зависимости от плотности посева и скорости роста, культуры обычно поддерживаются примерно в течение 2–3 недель in vitro , прежде чем произойдут значительные фенотипические изменения.
    1. После иммуноселекции с помощью магнитных шариков CD31 наблюдайте прикреплённые клетки под фазово-контрастным микроскопом (рисунок 2A).
      1. Ищите CD31-положительные эндотелиальные клетки с типичной морфологией булыжника и образующими однородные монослои в течение 5–7 дней.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во время иммуноселекции магнитные шарики, покрытые CD31, специфически связываются с эндотелиальными клетками, тем самым обогащая эндотелиальную популяцию. После процесса отбора бусины (примерно 4,5 мкм в диаметре) всё ещё могут быть обнаружены в связи с эндотелиальными клетками или внутренне поглощаются ими в ранних проходах. Обычно они уменьшаются при последующих промывках и поддержании культуры и не мешают жизнеспособности BMEC или росту клеток (рисунок 2B).
      2. Используйте однородную морфологию и отсутствие удлинённых или астроцитоподобных клеток для оценки чистоты эндотелиальной популяции.
  2. Иммунофлуоресценция для CD31 и GLUT1
    1. Семена 2 × 103 BMEC на покрытых коллагеном покрытых покрытиями и культивировании до достижения слияния 80–90%.
    2. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 10 минут при комнатной температуре (22–25 °C) и промывайте с помощью PBS.
    3. Пермеабилизуйте с Triton X-100 0,1% в течение 5 минут и блокируйте неспецифическое связывание 5% BSA на 30 минут.
    4. Инкубировать ночь при 4 °C с первичными антителами против CD31 и GLUT1 (транспортер глюкозы, специфичный для эндотелия мозга).
    5. Промывайтесь с PBS и инкубируемые в течение 1 часа с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами.
    6. Контрокрашивание ядра с помощью 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и крепление накладок с помощью антифейдного монтажного материала.
    7. Визуализируйте это под флуоресценцией или конфокальным микроскопом. Ищите CD31, локализованный на границах клеток (рисунок 3A), тогда как GLUT1 показывает распределение цитоплазматических и мембран, подтверждающее эндотелиальную идентичность и фенотип эндотелия мозга (рисунок 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные изображения из независимых изоляций BMEC демонстрируют типичную морфологию и маркерную экспрессию культивированных BMEC. Наличие белков с плотным соединением, таких как клаудин-5, также может использоваться для характеристики эндотелия мозга. Для дальнейшей оценки чистоты эндотелиальных культур можно провести дополнительное иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием отрицательных маркеров для других типов нейроклеток. Например, для обнаружения астроцитов может использоваться глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), а ионизированная кальциально-связывающая адаптер молекулы 1 (Iba1) — для идентификации микроглиальных клеток. Отсутствие окрашивания этих маркеров подтверждает отсутствие загрязнения со стороны этих неэндотелиальных клеток (рисунок 3C,D).
  3. Анализ образования трубок
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки проявляют проангиогенную способность в анализахMatrigel 18, и эндотелиальная идентичность может быть подтверждена с помощью этого теста.
    1. Предварительное покрытие пластины с 96 лунками Matrigel и дайте ей полимеризироваться в течение 30 минут при 37 °C.
    2. Семя 1 × 104 BMEC на скважину в 100 мкл полной эндотелиальной среды (10% FBS). Инкубировать при 37 °C и отслеживать образование трубки в течение 4–8 часов с помощью микроскопа с фазовым контрастом (рисунок 4A).
    3. Количественно определите общую длину трубки, количество соединений и сеток с помощью ImageJ (плагин Angiogenesis Analyzer)19. (Рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Способность BMEC формировать взаимосвязанные трубчатые структуры подтверждает их ангиогенный потенциал и эндотелиальную функциональность.
  4. Измерение трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки мозга должны образовывать плотный барьер, так как они являются ключевым компонентомBBB 20. Необходимо подтвердить способность эндотелия создавать электрический барьер.
    1. Сеять 20 000 BMEC на коллагеновыми вставками Transwell (размер пор 0,4 мкм) в верхнем компартменте и культивировать до их слияния.
    2. Измерьте TEER с помощью эпителиального вольтомметра для оценки целостности монослойного слоя. Записывайте значения TEER ежедневно до стабилизации; увеличение сопротивления указывает на формирование плотных межклеточных соединений, характерных для функциональных эндотелиальных барьеров (рисунок 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки невыбранной смеси клеток, включая астроциты, могут использоваться для создания системы кокультуры. Такая конфигурация требует тщательной оптимизации соотношения клеток между верхними (BMEC) и нижними (не выбранными смесями клеток), что должно быть стандартизировано в каждой лаборатории. Эта конфигурация кокультуры была адаптирована из ранее описанных моделейBBB 21.
    3. Посеять невыбранную клеточную смесь (шаг 4.4.2.2) в нижнюю яме культивирующей пластины и BMEC на верхней стороне мембраны вставки Transwell.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Был включён репрезентативный эксперимент с сопоставлением условий монокультуры и кокультуры для оценки герметичности барьера с помощью измерений TEER (рисунок 4C).

6. Расширение и обслуживание очищенных BMEC

  1. Условия культуры
    1. Поддерживайте очищенные BMEC в полной эндотелиальной культурной среде (10% FBS) при 37 °C в увлажнённом инкубаторе (влажность 95%) с 5% CO₂. Меняйте посевную среду каждые 2–3 дня, чтобы обеспечить свежие питательные вещества и поддерживать жизнеспособность клеток.
  2. Мониторинг роста и морфологии клеток
    1. Ежедневно наблюдайте культуры под фазово-контрастным микроскопом для отслеживания прикрепления, роста и морфологии клеток. Обратите внимание на характерную морфологию булыжника BMEC, которые образуют слияющийся монослой в течение 5–7 дней.
  3. Субкультурирование и переход
    1. Когда культуры достигают слияния 80–90%, клетки отделяют с помощью 0,05–0,1% трипсина в течение 3–5 минут при 37 °C.
    2. Нейтрализуйте трипсин равным объёмом полной среды, центрифугуйте при 220 × г в течение 10 минут при 4 °C и снова суспензуйте гранулу в свежей эндотелиальной среде.
    3. Засеять клетки на пластины, покрытые коллагеном, с нужной плотностью для дальнейшего расширения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте пассажи BMEC 3–5 для поддержания эндотелиального фенотипа и функциональной целостности.
  4. Опциональное криосохранение
    1. Для длительного хранения ресуспензируйте BMEC в замороженной среде (10% DMSO в полной эндотелиальной среде). Постепенно замораживайте до –80 °C в морозильнике с контролируемой скоростью, затем переведите в жидкий азот для длительного хранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный здесь протокол позволяет выделить и культивировать первичные BMEC у неонатальных мышей (P5). Эти клетки являются основным клеточным компонентом BBB и, следовательно, являются ценным экспериментальным инструментом для изучения физиологии и патофизиологии цереброваскулярной системы. Успешное выделение и культура микроваскулярных эндотелиальных клеток мозга (BMEC) были продемонстрированы с помощью морфологических, фенотипических и функциональных оценок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изоляция BMEC является инструментальным инструментом для изучения механизмов, регулирующих физиологию BBB и её дисфункции при различных патологиях центральной нервной системы (ЦНС) 4,9, включая инсульт. В отличие от увековеченных клеточных линий, первичные культуры BMEC сохраняют ключевые фенотипические и функциональные особенности эндотелия мозга, включая экспрессию плотно связанных белков и ангиогенную способность, характерную ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Части этой рукописи были написаны с помощью ChatGPT от OpenAI (версия GPT-4, июль 2025 года) для повышения ясности, языка и согласованности. Авторы критически просматривали, редактировали и одобряли весь контент с помощью ИИ. Инструменты ИИ не использовались для анализа данных, интерпретации результатов или генерации научных выводов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность исследователям из GRIVAS Health и NEUROVAS за их ценный вклад. Это исследование было профинансировано Fondecyt Regular 1240295.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
60 мм культуральные пластинкиCorning430166
96-лунковые культуральные пластинкиCorning41122107
Уксусная кислотаSigma-AldrichA6283
Антибиотик-антимикотический (по желанию)Gibco15240062
Анти-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Анти-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Анти-GLUT1Abcamab1157301:200
Анти-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Анти-мышиный IgG Alexa Fluor (594 краситель)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Анти-кроличий IgG Alexa Fluor  (488 краситель)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Автоматические и серологические пипеты Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Базальная среда (для раствора коллагена)Gibco (DMEM)11965092
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichA9647
Коллагеназа типа IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µг/мл
DMEM (высокоглюкозный)Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV Complete MediumMerck MilliporeSCME004Среда для роста эндотелиальных клеток
Трубки Falcon (15 & 50 мл)Corning®352096 / 352070
Фетальный бычий сывороточный (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
Флуоресцентный микроскопMoticBA410
Перчатки, маски, лабораторные расходные материалыРазличные поставщики—
Гепарин (100 Е/мл)Sigma-AldrichH3393
Инвертированный микроскопOlympus CKX41
Магнитный сепараторEasySep  NC9284020
Орбитальный шакерователь (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ПарафинBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
Холодильный центрифугHITACHICT5RE
СкальпельFine Science ToolsРазличные
Ножницы и тонкие пинцетыFine Science ToolsРазличные
Стерильная нитроцеллюлозная мембранаBIO-RAD1620094
Коллаген I типаCorning 30394

Ссылки

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
  3. Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
  4. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
  5. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
  6. Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
  7. Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
  8. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
  10. Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
  11. Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
  12. Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
  13. Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
  14. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
  15. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
  16. Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  17. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
  18. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  19. Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
  20. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
  21. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
  22. Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
  24. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
  25. Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
  26. Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
  27. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
  28. Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
  29. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
  30. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Нейронаукивыпуск 233выпуск 233В этом месяце в JoVEвыпускэндотелиальные клетки мозгапервичная культурагематоэнцефалический барьерангиогенез в мозге

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.