Генерация и дифференцировка обонятельных эпителиальных органоидов человека из взрослых стволовых клеток

Краткое содержание

Этот протокол описывает устоявшийся подход к выделению обонятельных прогениторных клеток из взрослой человеческой верхней раковинной ткани с целью получения обонятельных эпителиальных органоидов. Также подробно описывается стратегия химической индукции для дифференцировки этих органоидов в зрелые обонятельные сенсорные нейроны, что позволяет моделировать обонятельный нейрогенез человека.

Аннотация

Обонятельный эпителий человека обладает выдающейся нейрогенной возможностью, поддерживаемой постоянной популяцией базальных стволовых клеток; Однако создание динамической модели in vitro , которая точно повторяет этот регенеративный процесс, оказалось сложным. Здесь мы представляем устоявшийся протокол получения обонятельных органоидов из прогениторных клеток, выделенных из верхней носовой ткани взрослого человека. Эти органоиды сохраняют ствол, что подтверждается экспрессией SOX2, и демонстрируют пространственно организованную дифференцировку, характеризующуюся равномерной экспрессией незрелого нейронального маркера GAP43 и периферической локализацией зрелого обонятельного маркера сенсорных нейронов OMP. Последующая целенаправленная дифференцировка с помощью LY411575 ингибитора Notch, активатора Wnt CHIR-99021 и ретиноевой кислоты сгенерировала маркерно-положительные обонятельные сенсорные нейронные клетки, которые совместно экспрессировали OMP и нейрональный маркер Tuj1 (класс III β-тубулин). Эта модель, основанная на человеке, обходит ограничения мышиных систем и предоставляет надежную in vitro платформу для изучения обонятельного нейрогенеза, ассоциированной с COVID-19 аносмии и других обонятельных нейродегенеративных заболеваний.

Введение

Обонятельная система человека поддерживает непрерывный нейрогенез,1 процесс, который в основном управляется базальными стволовыми клетками обонятельного эпителия, а именно горизонтальными базальными клетками (HBC) и шаровидными базальными клетками (GBC). ^2,3 GBC конститутивно дифференцируются на обонятельные сенсорные нейроны (OSN), тогда как HBC остаются спокойными до активации при травме. ^4,5 Обонятельное восприятие начинается, когда молекулы запаха связываются с рецепторами на ресничках OSN, запуская каскад сигнальной трансдукции, который передаёт информацию обонятельной лампе и коре. ⁶ Развитие и поддержание этой сенсорной функции регулируются обонятельным эпителием.

Обонятельная дисфункция, вызванная физическими, химическими или биологическими нарушениями, часто проходит спонтанно. ⁷ Тем не менее, он затрагивает от 1,5% до 25% населения^{мира 8} и может быть вызван различными этиологиями, включая травмы,9 инфекции,10 и нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Альцгеймера и ^{Паркинсона 11}; в таких случаях спонтанное восстановление часто бывает неполным или отсутствующим. Современные терапевтические подходы, такие как обонятельная тренировка и введение кортикостероидов, демонстрируют ограниченную эффективность. ^12,13 Этот терапевтический разрыв возникает из-за неполного понимания механизмов, управляющих выживаемостью и регенерацией обонятельного нейроэпителия после травмы, что усугубляется недостаточностью существующих in vitro моделей для изучения обонятельной биологии человека.

В последние годы разработка различных моделей человеческих органоидов создала новые технологические платформы для изучения человеческих заболеваний. ¹⁴ органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток (AdSC), также называемых тканевыми стволовыми клетками, были успешно получены для различных тканей, полученных из эндодермы, включая желудок, печень, поджелудочную железу, лёгкие и мочевой пузырь. 15,16,17,18,19 В отличие от этого, установление обонятельных эпителиальных органоидов человека из обонятельного плакода, полученного из эктодермы, остаётся технически сложным. Основной практической проблемой является сложность постоянного получения жизнеспособной обонятельной эпителиальной ткани из верхней раковинной раковины человека. Расположение и объём обонятельной области значительно различаются у разных людей и подвержены выраженной возрастной дегенерации. Непреднамеренное скопление респираторного, а не обонятельного эпителия нарушает результаты культуры. Для решения этой проблемы мы усовершенствовали протокол 2021 года Рена и др., которые успешно культивировали кластеры клеток из обонятельной слизистой ^{человека,20} для надёжного генерации обонятельных эпителиальных органоидов человека. Наш подход генерирует обонятельные эпителиальные органоиды человека с трёхмерной, иерархически организованной архитектурой и поддерживает их дифференциацию в обонятельные сенсорные нейроны. Эта модель предоставляет ценную экспериментальную платформу для изучения механизмов, определяющих судьбу обонятельных эпителиальных стволовых клеток, а также для скрининга потенциальных терапевтических агентов при обонятельных заболеваниях.

Кратко говоря, основная цель этого метода — создать стандартизированный рабочий процесс для генерации и дифференцирования обонятельных эпителиальных органоидов человека от взрослых предшественников. Обоснование такого подхода заключается в устранении критического разрыва, возникающего из-за отсутствия физиологически значимых in vitro моделей обонятельной системы человека. По сравнению с традиционными двумерными (2D) монослойными культурами или мышиными моделями, эта трёхмерная (3D) система обладает явным преимуществом в том, что она точно воспроизводит сложную пространственную организацию и специфичный для человека генетический контекст обонятельной слизисты. Чтобы исследователи могли рассмотреть этот протокол, важно понимать, что точная изоляция жизнеспособного обонятельного эпителия от верхней раковины человека, при этом избегая загрязнения респираторным эпителием, является исключительно сложной и сильно зависит от возраста пациента и индивидуальных анатомических особенностей. Следовательно, этот протокол особенно подходит для исследователей, имеющих постоянный доступ к клиническим образцам человека и стремящихся моделировать обонятельный нейрогенез человека, вирусно-индуцированную аносмию или обонятельные дефициты, связанные с нейродегенеративными заболеваниями.

Протокол

Это исследование было проведено с одобрения Институционального наблюдательного совета (IRB) Западнокитайской больницы Сычуаньского университета (Одобрение No 2024 (31)). Письменное информированное согласие было получено от всех участвующих пациентов до сбора тканей и публикации данных. Образцы верхней носовой раковины были получены у пациентов, проходивших эндоскопическую операцию на основании черепа или операцию на решёчатой пазухе из-за ринореи спинномозговой жидкости.

1. Обработка и транспортировка образцов тканей

1. Сразу после сбора образцы тканей поместите в предварительно охлаждённую стерильную транспортную среду, состоящую из базальной среды DMEM/F12/HEPES, дополненной 10% плодовой бычьей сывороткой и 5% раствором пенициллина–стрептомицина, и транспортируйте их в лабораторию при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка помогает поддерживать жизнеспособность клеток, а смесь антибиотиков предотвращает возможное микробное загрязнение во время транспортировки. Держите время транспортировки менее 2 часов, чтобы сохранить жизнеспособность клетки.

2. Предварительная обработка тканей (выполняется на льду)

1. Переместите образец в предварительно охлаждённую стерильную миску для культуры, удалите транспортную среду и промыйте ткань модифицированным буфером PBS, содержащим 5% раствора пенициллина–стрептомицина. Промывайте так: добавьте 5 мл предварительно охлаждённого раствора для мытья, аккуратно постукуйте по салфетке 5–7 раз, затем полностью впитывайте жидкость. Повторите этот цикл промывания три раза, чтобы удалить кровяные клетки и тканевые остатки.
2. Используя стерильные микроножницы, измельчите ткань на фрагменты размером примерно 1–2^{мм 3}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе поддерживайте увлажнение тканей, закрепляйте её тупыми щипцами и минимизируйте время обрезания для сохранения жизнеспособности клеток.

3. Ферментативное пищеварение

1. Переместите механически диссоциированную ткань в центрифугную трубку объемом 15 мл и добавьте 3 мл предварительно подогретого (37 °C) буфера для переваривания соединений (содержащего 0,125% трипсина и 10 U/мл ДНКазы I), поддерживая соотношение объема фермента к ткани 3:1. Инкубировать трубку в водяной бане при температуре 37 °C с мягким перемешиванием в течение 20 минут. Проверяйте образец каждые 5 минут, чтобы отслеживать ход пищеварения и предотвратить сгустение тканей.
2. Остановите пищеварение, добавив равный объём раствора для прекращения беременности, базальную среду DMEM/F12/HEPES, дополненную сывороткой из 10% плода бычьей крупной рогатой скрынки. Аккуратно пипетируйте смесь вверх и вниз 10 раз, чтобы обеспечить полное смешивание и эффективный контакт между ферментами и ингибирующими компонентами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: α1-антитрипсин, присутствующий в сыворотке, эффективно нейтрализует активность трипсина.

4. Подготовка суспензии с одной ячейкой

1. Поставьте сито для ячейки 40 мкм поверх трубки центрифугы объемом 50 мл. С помощью обрезанного наконечника пипетки объёмом 1 мл перенесите переваренную ткань и жидкость из 15-мл пробирки на сито. Аккуратно прокрутите материал на фильтре наконечником пипетки для облегчения прохождения, затем промывайте сито дополнительным 1–2 мл раствора для завершения. После того как вся жидкость прошла через сито, переведите фильтрат из трубки объёмом 50 мл в новую центрифугную трубку на 15 мл.
2. Центрифугуйте подвеску при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C. Обратите внимание на отдельную клеточную гранулу внизу трубки и аккуратно аспирируйте супернатант, оставляя примерно 100 мкл, чтобы не нарушить или не потерять гранулу.

5. Создание трёхмерной системы культуры

1. Без повторного суспензия клеточной гранулы в культурной среде напрямую соедините её с Matrigel с помощью предварительно охлаждённого, низкосвязанного наконечника пипетки для достижения точной плотности 10 000 клеток/мкл. Раздайте 40 мкл этой смеси клетки–Матригель в каждую яме пластины на 24 лунки и по 20 мкл в каждую конфокальную чашу с стеклянным дном. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 30 минут, чтобы Matrigel могла полимеризироваться и образовать трёхмерный каркас.
2. После затвердевания Matrigel аккуратно добавляйте 500 мкл безсывороточной обонятельной среды для культуры нейрональных стволовых клеток вдоль стенки колодца, чтобы избежать нарушения геля. Сохраняйте культуры в увлажнённом инкубаторе при 37 °C с 5% CO₂, заменяя среду каждые 3 дня свежей предварительно подогретой средой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда обонятельной культуры нейрональных стволовых клеток состоит из DMEM/F12/HEPES, дополненных следующими компонентами: R-спондин 1 (200 нг/мл), Ноггин (100 нг/мл), Wnt3a (50 нг/мл), EGF (50 нг/мл), Y-27632 (10 мкм), первичный антимикробный агент (100 мкг/мл), добавка N2 (1%), добавка B27 (2%) и L-глутамин (1%).

6. Пассирование и дифференциация

1. Предварительно охлаждайте раствор для восстановления органоидов на льду в течение 10 минут перед использованием; Аспирируйте культурную среду из скважин, затем добавьте 1 мл ледяного раствора восстановления в каждую скважину. Наклоните пластину под углом 45°, аккуратно аспирируйте и раздайте раствор 5–7 раз, чтобы вывести органоиды из матрици базальной мембраны и перенести полученную суспензию в центрифугную трубку на 15 мл. Инкубировать трубку на льде в течение 3–5 минут, затем центрифугировать при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C и аккуратно удалить супернатант, оставив примерно 100 мкл жидкости, чтобы предотвратить потерю гранулы.
2. Добавьте 1 мл органоидного диссоциационного реагента непосредственно в клеточную гранулу и инкубируете трубку при 37 °C с мягким встряхиванием при 220 об/мин в течение 5 минут. Немедленно прекратите переваривание, добавив равный объём раствора Стоп, и аккуратно пипетируйте смесь вверх и вниз 5 раз для обеспечения однородности. Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C для сбора диссоциированных клеток.
3. Повторно суспензировать клеточную гранулу в Matrigel при объёме 40 мкл на колодец для пластин с 24 лунками или 20 мкл на скважину для чашек с конфокальными культурами; Тщательно перемешайте с помощью предварительно охлаждённого, низко связывающего наконечника пипетки, чтобы обеспечить равномерное подвешение. После посева в соответствующие тарелки или тарелки инкубировать конструкции при 37 °C в течение 30 минут, чтобы обеспечить полимеризацию матригеля и формирование трёхмерных строительных лесов. Затем аккуратно добавьте 500 мкл специализированной среды для сфероидной культуры без сыворотки для обонятельных нервных стволовых клеток вдоль стенок колодца, чтобы не нарушать гель. Поддерживайте культуры в инкубаторе при 37 °C при 5% CO₂ и 95% относительной влажности.
4. Примерно через 7 дней после перехода, после того как новое поколение обонятельных эпителиальных органоидов преобразовается в сфероиды, аспирируете расширяющую среду из конфокальных антенн стеклянного дна и заменяйте её дифференциационной средой. Заменяйте дифференциационную среду на свежую, предварительно подогревшуюся каждые 3 дня. Морфологически отличающиеся обонятельные нейроны обычно становятся заметны при микроскопии примерно через 7 дней после дифференцировки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда дифференцировки состоит из DMEM/F12/HEPES, дополненных R-Spondin 1 (200 нг/мл), Noggin (100 нг/мл), Wnt3a (50 нг/мл), EGF (50 нг/мл), Y-27632 (10 мкм), LY411575 (5 мкм), CHIR99021 (3 мкМ), ретиноевой кислоты (RA, 1 мкМ), первичным антимикробным агентом (100 мкг/мл), добавками N2 (1%), добавками B27 (2%) и L-глутамином (1%).

7. Иммунофлуоресценция

1. Аспирируйте посевную среду и аккуратно промой образцы один раз 500 мкл PBS. Удалите PBS, затем добавьте 500 мкл 4% параформальдегида и зафиксируйте образцы при комнатной температуре на 15 минут. Аспирировать и отбросить фиксатив; затем фиксированные образцы промывайте PBS (3 x 500 мкл) и храните при 4 °C до 48 часов.
2. Аспирировать PBS и добавить 500 мкл раствора проницаемости (0,2% Triton X-100 в PBS), инкубировать 15 минут при комнатной температуре, затем аспирировать и сбрасывать раствор. Промывайте образцы с помощью 0,02% PBST (0,02% Triton X-100 в PBS; 3 x 500 мкл).
3. Добавьте 500 мкл блокирующего раствора (3% BSA в PBS) и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
4. Аспирировать блокирующий раствор и заменить его 500 мкл раствора первичного антитела, приготовленного путём разбавления соответствующего первичного антитела (например, анти-GAP43 при 1:160, анти-ОМП при 1:50 или анти-SOX2 при 1:50) в блокирующем растворе, и инкубировать ночью при 4 °C. На следующий день аспирируйте первичный раствор антител и промывайте образцы с помощью 0,02% PBST (3 x 500 мкл).
5. Добавьте 500 мкл вторичного раствора антител, содержащего конъюгированное с Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 555, разведённое 1:500 в блокирующем растворе, и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа. Аспирируйте вторичный раствор антител и проведите дополнительные промывки с 0,02% PBST (3 x 500 мкл).
6. Добавьте 500 мкл рабочего раствора DAPI (DAPI разбавленный в PBS) и инкубировать в темноте в течение 10 минут, чтобы окрашить ядра. Аспирируйте раствор DAPI и промывайте образцы с 0,02% PBST (3 x 500 мкл). Окрашиваемые образцы храните при 4 °C до 48 часов перед снимком.

8. Конфокальная микроскопия

1. Проведите конфокальную микроскопию с использованием оси Z размером 1 мкм для органоидов диаметром ≤100 мкм и 0,5 мкм для органоидов больше 100 мкм. Получайте изображения в многоканальном последовательном режиме, сканируя в следующем порядке: DAPI, FITC, TRITC и Cy5. Импортируйте приобретённые файлы последовательности изображений Z-стека в программное обеспечение для 3D-рендеринга (например, Imaris). Используйте функцию рендеринга 3D-объема для создания полной трёхмерной модели органоида. Наблюдайте эту реконструированную модель, чтобы визуализировать пространственное распределение конкретных клеточных маркеров (например, SOX2, GAP43 и OMP) и качественно подтвердить иерархическую архитектуру и статус дифференцировки нейронов обонятельных эпителиальных органоидов как конечной конечной точки.

Результаты

Выделение обонятельной эпителиальной ткани и культура первичных обонятельных эпителиальных органоидов
Для создания системы культуры обонятельных эпителиальных органоидов мы выделили обонятельный эпителий из верхней раковинной ткани человека и внедрили его в трёхмерную матрицу матригеля (рисунок 1). Опираясь на определённые условия культуры, описанные Реном и соавторами, мы проверили и тонко настроили концентрации ключевых факторов роста —...

Обсуждение

Органоиды представляют собой уникальную модель in vitro, поскольку их самоорганизующаяся трёхмерная архитектура близко повторяет архитектуру коренных человеческих тканей и в некоторых случаях может быть гистологически неотличимой от реальных органов. ¹⁴ Поэтому создание человеческих органоидных моделей критически важно для изучения человеческих заболеваний. Здесь мы представляем протокол создания системы культуры органоидов из первичных обонятельных эпите...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP antibody	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 antibody	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Supplement	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-glutamine supplement)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (basement membrane matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Supplement	Gibco	17502048	1%
Organoid Dissociation Reagent	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid Recovery Solution	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primary antimicrobial agent)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
Recombinant Human EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Recombinant Human Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinoic acid	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM