Этот метод изучает, как стареющие кожные фибробласты влияют на здоровых людей. Старение вызывается через воздействие UVB, и кондиционированная среда применяется к нормальным фибробластам. Он помогает оценить биоактивные соединения, направленные на изменённую коммуникацию между клетками при старении кожи.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Новая комбинация антиоксидантов для восстановления здоровой межклеточной коммуникации in vitro с использованием кондиционированной среды из стареющих клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Старение кожи — это многофакторный процесс, вызванный изменениями на молекулярном и клеточном уровнях, также известные как признаки старения. Одно из этих изменений — изменённая межклеточная коммуникация, что способствует дисфункции тканей кожи и структурному повреждению. Здесь представлена модель in vitro , имитирующая эти особенности старения кожи путём инкубации здоровых фибробластов с кондиционированной средой из стареющих фибробластов. Во-первых, UVB-облучённые фибробласты могут быть проанализированы на изменения экспрессии генов, связанных с фотовозрастом. Во-вторых, кондиционированная среда из стареющих фибробластов, индуцированных UVB, может быть взята и перенесена здоровым фибробластам, что приводит к снижению уровня белков внеклеточного матрикса и повышению экспрессии провоспалительных цитокинов генов. Эти изменения компенсируются использованием новой комбинации антиоксидантов (витамин C + идебенон). Эти результаты показывают, что модель in vitro может использоваться для оценки эффективности новых соединений на особенностях старения дермальных клеток кожи, а также для отбора соединений, способных модулировать регенеративные и омоложающие клеточные процессы кожи.
Введение
Старение кожи — это естественный процесс снижения функций и свойств кожи, включая потерю жёсткости и эластичности, а также усиленное провисение. Это ускоряется внешними факторами, такими как воздействие ультрафиолетового (УФ) и загрязнение, которые повреждают клетки и вызывают изменения намолекулярном уровне 1. Эти изменения хорошо охарактеризованы недавними исследованиями и выявлены как признаки старения, включая геномную нестабильность, утрату теломер, эпигенетические изменения, потерю протеостаза, дефектную макроаутофагию, дерегулированное чувство питательных веществ, дисфункцию митохондрий, клеточное старение, истощение стволовых клеток, изменённую межклеточную коммуникацию, хроническое воспаление идисбиоз 2. Эти особенности объясняют, как субклеточное повреждение приводит к дисфункции тканей, тем самым способствуя процессу старения. Интересно, что эти изменения действуют не самостоятельно, а формируют взаимозависимую сетевую подпись. Первичные повреждения, такие как геномные повреждения или эпигенетические изменения, накапливаются и в конечном итоге вызывают клеточное старение. В случае кожи это в основном вызвано УФ-повреждением, при этом фотостарение является основным фактором признаков старениякожи 3. Стареющие клетки демонстрируют повышенное выработку провоспалительных цитокинов, матриксных металлопротеиназ и факторов роста, которые также известны как секреторный фенотип, ассоциированный с старением (SASP) и включают IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA или IL1A, а такжедругие 4,5,6. Эти секретируемые факторы не только влияют на структурные свойства кожи, такие как дермальный внеклеточный матрикс, но и нарушают функцию окружающих клеток. Это включает высвобождение цитокинов, стимулирующих активацию меланоцитов, вызывающих возрастную гиперпигментацию кожи (например, фактор стволовых клеток или IL18) или других вредных белков, изменяющих функцию окружающих здоровых фибробластов, нарушая их функцию и способствуя усилению стареющего фенотипа 7,8,9,10,11. В результате хроническое воспаление и изменённая межклеточная коммуникация являются ключевыми факторами вредоносного состояния, которое приводит эти молекулярные изменения к визуальным признакам старения кожи, таким как морщины, обвисение, возрастные пятна или потеря упругости.
Конкретные белки, способствующие вредному воздействию SASP, можно изучать с помощью известных методов, таких как ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), Luminex, количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR) или Western Blot идругие 5,12. Однако этот подход полезен для идентификации конкретных белков с индивидуальной точки зрения и характеристики конкретного механизма действия, но не учитывает влияние полного SASP на соседние клетки. Здесь предлагается протокол in vitro для изучения эффекта SASP, вырабатываемого стареющими дермическими фибробластами, индуцированными UVB, на здоровые соседние фибробласти, имитируя изменённую межклеточную коммуникационную черту старения. Как уже отмечалось, УФ является основным двигателем старения клеток в коже. Таким образом, УФ-повреждение выбирается в качестве источника повреждения вместо репликационного или онкогенно-индуцированного старения, чтобы построить текущую модель3. Для этого используется среда, содержащая факторы, выделяемые стареющими фибробластами (условной средой), а маркеры функции клеток количественно определяются в здоровых фибробластах, инкубированных этой средой. Согласно этому протоколу, после переноса кондиционированной среды из стареющих в здоровые клетки, UVB-индуцированные стареющие фибробласти собираются для количественной оценки молекулярных особенностей, таких как гены, участвующие в провоспалительном и паракринном сигнале. Во-вторых, здоровые фибробласты, обработанные условной средой стареющих фибробластов, собираются для характеристики эффекта SASP на соседние клетки, количественно оценивая гены, участвующие во внеклеточном матриксе, факторы роста и активации фибробластов. Таким образом, влияние интересующих соединений (COI) анализируется как сначала в стареющих фибробластах, так и затем в здоровых фибробластах, обработанных кондиционированной средой. Что касается этих соединений, предыдущие исследования показали, что антиоксиданты эффективны в защите и коррекции признаков старения, вызванного фотостарением. В результате комбинация двух антиоксидантов (витамина C и идебенона) используется для отмены некоторых изменений, вызванных УФБ, как в стареющих клетках, так и в здоровых клетках, инкубированных с кондиционированной средой стареющихклеток 13,14,15
В целом, этот протокол предназначен для изучения влияния SASP на клетки кожи и выявления новых молекул/вмешательств, которые восстанавливают изменённую межклеточную коммуникацию, тем самым подходящие для регенеративных и биостимулирующих продуктов в эстетической медицине и регенеративной дерматологии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Человеческие дермальные фибробласты, использованные в данном исследовании, были получены у коммерческого поставщика сотовой линии. Поскольку не использовались первичные человеческие образцы, данные пациентов или эксперименты in vivo , для этого исследования не требовалось одобрение Институционального наблюдательного совета (IRB) и информированное согласие.
1. Индукция старения в дермальных фибробластах с помощью UVB
- Пластинчатые человеческие дермальные фибробласты плотностью 6 ×10 4 клеток на одну скважину в пластине из 6 лунок с использованием модифицированной среды Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненной 10% сывороткой плода бычьего скота (FBS).
- Через 24 часа удалите клеточную культурную среду и замените её 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) на каждую скважину.
- Облучить клетки ультрафиолетовым светом при 25 мДж/см².
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта энергия была оптимизирована для устройства для ультрафиолетового облучения, используемого в данном протоколе (см. Таблицу материалов), чтобы вызвать достаточное повреждение для запуска старения, при этом избегая чрезмерных повреждений, которые могут привести к апоптозу. При использовании других устройств корректируйте энергию облучения соответственно.
ВНИМАНИЕ: УФБ-излучение опасно. Используйте соответствующее защитное оборудование и экранирование, чтобы избежать воздействия. - Удалите PBS и добавьте 2 мл свежей клеточной культуры в каждую колодцу.
- Через 72 часа удалите клеточную культурную среду, добавьте 1 мл PBS в каждую скважину и повторите UVB-облучение, как описано в шаге 1.3.
- Через 72 часа удалите клеточную культурную среду и добавьте 0,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА на колодцу. Инкубировать 1–2 минуты при 37 °C, затем собирать клетки с помощью 1,5 мл свежей среды для клеточной культуры.
- Клетки с плотностью 8 × 104 клеток на каждую скважину в пластине с 6 лунками с использованием среды для клеточной культуры (DMEM с добавлением 10% FBS). После этого этапа индуцируется клеточное старение.
2. Обработка стареющих клеток интересующими соединениями
- Через 24 часа удалите клеточную культурную среду и добавьте 2 мл среды с интересующими соединениями.
- После дополнительных 24 часов разместите отдельную партию человеческих дермальных фибробластов (как описано в шаге 1.1) в пластины с 6 колодцами. Эти клетки будут служить здоровыми дермальные фибробласты для переноса кондиционированной среды.
3. Обусловленный перенос среды от стареющих клеток к здоровым клеткам
- Через 48 часов после соединенной обработки стареющих клеток и через 24 часа после нанесения здоровых фибробластов собирайте 2 мл кондиционированной среды на одну скважину из стареющих клеток и переносите его в здоровые фибробласти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите культурную среду из здоровых фибробластов непосредственно перед добавлением кондиционированной среды, чтобы обеспечить эффективный перенос. - Добавьте 1 мл PBS в стареющие клетки и берите их с помощью трипсина, как описано в шаге 1.6. Используйте эти клетки для анализа стареющих или воспалительных маркеров с помощью набора ELISA или qPCR.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы могут храниться при −80 °C, если последующие анализы не проводятся немедленно. - Инкубировать здоровые фибробласты, получающие кондиционированную среду при 37 °C с 5% CO₂ в течение 24 часов.
4. Сбор здоровых клеток для анализа активации фибробластов с помощью экспрессионного анализа генов
- После 24-часовой инкубации с кондиционированной средой собирайте здоровые фибробласты с использованием трипсина, как описано в шаге 1.6. Проанализируйте экспрессию генов внеклеточного матрикса с помощью qPCR.
- Проведите qPCR-анализ.
- Извлекайте РНК из клеточных гранул согласно инструкциям производителя (набор для экстракции РНК).
- Проведите обратную транскрипцию 200 нг РНК согласно инструкциям производителя (комплект обратной транскрипции).
- Амплифицировать cДНК в соответствии с инструкциями производителя (мастер-микс qPCR). Провести qPCR при следующих условиях: 95 °C в течение 30 секунд, затем 40 циклов по 95 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 30 секунд. Используемые праймеры приведены в таблице 1.
| Джин | Прямая последовательность | Обратная последовательность |
| CDKN2A | 5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3' | 5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3' |
| CDKN1A | 5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3' | 5'-CCAGGACTGCAGGCTCTCT-3' |
| SCF | 5'-AATCCTCTCGTCAAAACTGAAGG-3' | 5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3' |
| ИЛ-18 | 5'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3' | 5'-GTTTTTTGCGAGAGGAAGCG-3' |
| ELN | 5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3' | 5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3' |
| FBN1 | 5'-GGTGAATGTACAAACACAGTCAGCAG-3' | 5'-ATAGGAACAGAGCACAGCTTGTTGA-3' |
| ИЛ-6 | 5'-AGCCCTGAAAGGAGACATGTA-3' | 5'-TCTGCCAGTGCCTCTCTTTGGC-3' |
| IL-8 | 5'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAAGGT-3' | 5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCT-3' |
| CTGF | 5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGTGTGT-3' | 5'-TGTCTTCCAGTCGGGGGCAGCTA-3 |
| IGF1 | 5'-CAGAGCAGATAGAGCCTGCG-3' | 5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3' |
Таблица 1: Список праймеров, используемых для qPCR-анализов. Для каждого праймера приведены прямые и обратные последовательности, соответствующие изученным и количественно оценённым генам.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Настоящий протокол описывает метод моделирования изменённой межклеточной коммуникации, характерной для старения in vitro. На рисунке 1 представлена графическая схема, иллюстрирующея основные этапы протокола, включая индукцию старения, количественную оценку маркеров и анализ изменённой межклеточной коммуникации в клетках кожи in vitro.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Понимание процесса старения на молекулярном уровне является ключом к разработке новых подходов и вмешательств, которые задерживают возрастные признаки и продлевают продолжительность жизни и функциональность клеток и тканей. Определение и идентификация признаков старения сыграли ключевую роль в создании научной основы для разработки этих вмешательств 2,16. Среди признанных признаков старения изменённая межклеточная коммуникация пр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы работали в Mesoestetic Pharma Group, S.L.
Благодарности
Авторы выражают благодарность соавторам за помощь и советы в этом проекте.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-well plates | Fisher Scientific | 10578911 | Многоячеистые пластинки для культуры клеток для использования во время анализа (индукция старения и обработка соединением) |
| Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (устройство для UVB-облучения) | Vilber Lourmat | VL-6111-1090-1 | Устройство, используемое для создания повреждений путем UVB-облучения и, следовательно, для индукции старения |
| Модифицированная среда Дульбекко (DMEM) | Merck Life science | D6046-500ML | Стандартная среда для культуры клеток дермальных фибробластов |
| Фетальный бычий сывороточный (FBS) | Fisher Scientific | 17593595 | Питательная добавка, используемая в качестве источника факторов роста, гормонов, белков и необходимых микроэлементов для роста клеток |
| ELISA-комплект для H3K27me3 | Epigentek | P-3014T-096 | Специфический иммуноанализ для обнаружения эпигенетической модификации H3K27me3 в биологических образцах |
| Человеческие дермальные фибробласты | Promocell | C-12302 | Основная клетка кожи в дерме и регулятор фотостарения кожи |
| Фосфатно-буферный раствор (PBS) | Merck Life science | D8537-500ML | Буферный раствор, имитирующий физиологическую среду. Используется для промывания клеток без вызывания стресса или снижения жизнеспособности клеток |
| PrimeScript RT reagent kit (комплект для обратной транскрипции) | Takara Bio | RR037A | Комплект для получения комплементарной ДНК из РНК, выделенной из клеток. 2-й шаг для qPCR-анализа после очистки РНК. |
| TB Green Premix Ex Taq (qPCR мастер-микс) | Takara Bio | RR420A | Комплект для проведения полимеразной цепной реакции из комплементарной ДНК для количественного определения уровней экспрессии генов. 3-й шаг для qPCR-анализа после обратной транскрипции. |
| Комплект для выделения общей РНК (комплект для извлечения РНК) | Norgen | 17200 | Комплект для получения РНК из собранных клеток. 1-й шаг для qPCR-анализа после сбора клеток. |
| Trypsin/EDTA 0,05% | Merck Life science | T2601-100ML | Раствор фермента, используемый на этапах сбора/пассажа для отсоединения клеток от пластинок культуры клеток |
Ссылки
- Chaudhary, M., Khan, A., Gupta, M. Skin ageing: Pathophysiology and current market treatment approaches. Curr Aging Sci. 13 (1), 22-30 (2020).
- López-Otín, C., et al. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
- Razzaghi, Z., Ahmadzadeh, A. Examination of the biological effects of sunlight on the skin: a review. J Lasers Med Sci. 16, e52 (2025).
- He, R., et al. Hallmarks of the aging skin microenvironment: components and mechanisms. J Cell Physiol. 240 (11), e70111 (2025).
- Karras, A., et al. Measuring the senescence-associated secretory phenotype. Biomedicines. 13 (9), 2451 (2025).
- Chin, T., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
- Yuan, X. H., Jin, Z. H. Paracrine regulation of melanogenesis. Br J Dermatol. 178 (3), 632-639 (2018).
- Fullard, N., et al. Cell senescence-independent changes of human skin fibroblasts with age. Cells. 13 (8), 662 (2024).
- Hachiya, A., et al. The paracrine role of stem cell factor/c-kit signaling in the activation of human melanocytes in ultraviolet-B-induced pigmentation. J Invest Dermatol. 116 (4), 578-586 (2001).
- Kovacs, D., et al. Role of fibroblast-derived growth factors in regulating hyperpigmentation of solar lentigo. Br J Dermatol. 163 (5), 1020-1027 (2010).
- Kim, M., et al. Ultraviolet-irradiated endothelial cells secrete stem cell factor and induce epidermal pigmentation. Sci Rep. 8 (1), 4235 (2018).
- Lee, Y. H., et al. Identification of senescence rejuvenation mechanism of Magnolia officinalis extract including honokiol as a core ingredient. Aging. 17 (2), 497-523 (2025).
- Pandel, R., Poljšak, B., Godic, A., Dahmane, R. Skin photoaging and the role of antioxidants in its prevention. ISRN Dermatol. 2013, 1-11 (2013).
- McDaniel, D. H., et al. Clinical efficacy assessment in photodamaged skin of 0.5% and 1.0% idebenone. J Cosmet Dermatol. 4 (3), 167-173 (2005).
- Farris, P. K. Topical vitamin C: a useful agent for treating photoaging and other dermatologic conditions. Dermatol Surg. 31 (7 Pt 2), 814-817 (2005).
- López-Otín, C., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Sjerobabski-Masnec, I., Situm, M. Skin aging. Acta Clin Croat. 49 (4), 515-518 (2010).
- Ganguly, B., Hota, M., Pradhan, J. Skin aging: implications of UV radiation, reactive oxygen species and natural antioxidants. Skin Aging. , (2022).
- Ito, T., et al. Regulation of cellular senescence by polycomb chromatin modifiers through distinct DNA damage- and histone methylation-dependent pathways. Cell Rep. 22 (13), 3480-3492 (2018).
- Sen, P., Shah, P. P., Nativio, R., Berger, S. L. Epigenetic mechanisms of longevity and aging. Cell. 166 (4), 822-839 (2016).
- Cencioni, C., et al. Aging Triggers H3K27 Trimethylation Hoarding in the Chromatin of Nothobranchius furzeri Skeletal Muscle. Cells. 8 (10), 1269 (2019).
- Ma, Z., et al. Epigenetic drift of H3K27me3 in aging links glycolysis to healthy longevity in Drosophila. eLife. 7, e35368 (2018).
- Martinez-Gutierrez, A., et al. Hyaluronic and Succinic Acid: new biostimulating combination to counteract dermal and subcutaneous aging. Int J Mol Sci. 26 (15), 7548 (2025).
- Park, S., et al. Senotherapeutic potential of araliadiol in senescent human dermal fibroblasts: an in vitro study using three senescence models. Pharmaceutics. 17 (12), 1560 (2025).
- Waldera Lupa, D. M., et al. Characterization of skin aging–associated secreted proteins (SAASP) produced by dermal fibroblasts isolated from intrinsically aged human skin. J Invest Dermatol. 135 (8), 1954-1968 (2015).
- Boismal, F., et al. Proteomic and secretomic comparison of young and aged dermal fibroblasts highlights cytoskeleton as a key component during aging. Aging. 16 (16), 11776-11795 (2024).
- Abdul Ghani, N. I., et al. Effect of different collection times of dermal fibroblast conditioned medium (DFCM) on in vitro re-epithelialisation process. Biomedicines. 10 (12), 3203 (2022).
- Chowdhury, S. R., Aminuddin, B. S., Ruszymah, B. H. I. Effect of supplementation of dermal fibroblasts conditioned medium on expansion of keratinocytes through enhancing attachment. Indian J Exp Biol. 50 (5), 332-339 (2012).
- Ohgo, S., et al. Senescent dermal fibroblasts enhance stem cell migration through CCL2/CCR2 axis. Exp Dermatol. 24 (7), 552-554 (2015).
- Malaquin, N., et al. Senescent fibroblasts enhance early skin carcinogenic events via a paracrine MMP-PAR-1 axis. PLoS One. 8 (5), e63607 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
