Пропентофиллин облегчает послеоперационную гипералгезию путем регуляции фосфорилирования ERK1/2 в астроцитах и микроглии спинного мозга

Краткое содержание

В данном исследовании изучается влияние пропентофиллина, вводимого интратекально, на ослабление разреза-индуцированной гипералгезии, а также связь этого эффекта с изменениями спинальных глиальных маркеров и фосфорилированием внеклеточной сигнал-регулируемой киназы 1 и 2 у крыс.

Аннотация

Спинальные астроциты, микроглия и внеклеточная сигнал-регулируемая киназа 1 и 2 (ERK1/2) участвуют в процессах обработки болевых сигналов. В данном исследовании изучалось, ослабляет ли предоперационное интратекальное введение пропентофиллина (PPF) острую инцизионную гипералгезию у крыс и связан ли этот эффект с маркерами спинальной глии и фосфорилированием ERK1/2. Шестьдесят шесть самцов крыс линии Sprague–Dawley были случайным образом распределены в группы: контрольную (blank), группу с инцизионной болью, группу физиологического раствора, группу диметилсульфоксида, группу PPF и группу U0126. Механическая и термическая гипералгезия оценивались на исходном уровне, а также через 2, 4, 8, 24 и 72 ч после разреза. Спинальные нейрональные и глиальные маркеры, p-ERK1/2 и воспалительные медиаторы оценивались методами вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции. Дополнительно проводились эксперименты на первичных спинальных астроцитах для изучения ERK1/2-зависимого высвобождения воспалительных медиаторов. Предоперационное интратекальное введение PPF ослабляло механическую и термическую гипералгезию на протяжении всего 72-часового периода наблюдения, в то время как U0126 ослаблял гипералгезию преимущественно в ранний послеоперационный период. Через 4 ч после разреза оба вида терапии были связаны со снижением экспрессии спинальных GFAP, Iba-1 и p-ERK1/2, а также со снижением иммунореактивности TNF-α и COX-2. В культивируемых астроцитах PPF снижал индуцированное LPS высвобождение воспалительных медиаторов, тогда как конститутивно активная ERK1/2 ослабляла этот эффект. Эти результаты подтверждают связь между антигипералгетическим действием PPF и модуляцией спинальных глиальных, ERK1/2-зависимых и воспалительных реакций после разреза.

Введение

Послеоперационная боль в области разреза, распространенный вид острой боли после хирургических процедур, обычно не длится более 7 дней, однако имеет сложные патологические механизмы, которые отличаются от механизмов воспалительной и нейропатической боли^1,2. При недостаточном контроле боли в области разреза в процессе ее развития она может привести к развитию синдрома хронической боли, а ее характер может измениться с боли при остром повреждении тканей на нейропатическую или смешанную боль³. Как правило, наиболее распространенным методом обезболивания после разреза является назначение анальгетиков, таких как опиоиды и нестероидные противовоспалительные препараты. Однако при их постоянном применении или использовании в высоких дозах могут возникнуть многочисленные побочные эффекты, что подчеркивает необходимость разработки более безопасных и эффективных стратегий анальгезии.

Надежные данные свидетельствуют о том, что пропентофиллин (PPF) облегчает гипералгезию при различных болевых процессах^4,5. Более того, анальгезирующий эффект PPF может быть частично достигнут путем ингибирования спинальной экспрессии митогенактивируемых протеинкиназ (MAPK), таких как p38 и c-Jun N-терминальные киназы (JNK)⁶. Хотя влияние PPF на пути p38 и JNK было установлено, его потенциальная модуляция пути внеклеточных сигнал-регулируемых киназ 1 и 2 (ERK1/2) — еще одного критического подсемейства MAPK, участвующего в передаче болевых сигналов, — остается неизученной при острой послеоперационной боли. Этот пробел в знаниях особенно важен, учитывая, что активация ERK1/2 демонстрирует иные временные и клеточные закономерности по сравнению с p38 и JNK, что указывает на потенциально уникальные терапевтические возможности.

Считалось, что глиальные клетки, включая астроциты, микроглию и олигодендроциты, изначально выполняют лишь функцию соединения и поддержки нервной ткани. Однако последние исследования показали, что астроциты и микроглия играют важную роль в регуляции синаптической пластичности и передаче болевых сигналов⁷. Будучи резидентными макрофагами головного и спинного мозга, клетки микроглии могут активироваться под воздействием нескольких внеклеточных стимулов на самых ранних этапах болевого процесса, после чего они пролиферируют и высвобождают большое количество воспалительных цитокинов, что усиливает проведение болевых сигналов от спинного мозга к мозгу^8,9. Одновременно с этим активированные астроциты могут усиливать высвобождение возбуждающего нейромедиатора глутамата и передавать информацию непосредственно сенсорным нейронам, улучшая межклеточную коммуникацию¹⁰.

Исследования показали, что активация астроцитов происходит на ранней стадии (в течение первых 24 ч) боли, вызванной разрезом, в то время как активация микроглии проявляется гораздо позже^11,12. Кроме того, одно исследование указало на то, что активированная микроглия оказывает ограниченное влияние на механическую гиперalгезию при боли, вызванной разрезом¹³. Эти результаты подчеркивают наличие актуальных вопросов о различных ролях астроцитов и микроглии при острой боли. Сообщалось, что пропентофиллин, модулирующий глию агент, облегчает гиперalгезию, регулируя активацию астроцитов и микроглии после хронического констриктивного повреждения нерва, острого повреждения нерва и острого повреждения тканей^4,5. Однако, насколько известно на данный момент, ни в одном исследовании не изучалось влияние PPF на активацию астроцитов или микроглии при острой боли, вызванной разрезом.

Внеклеточная сигнал-регулируемая киназа 1 и 2, основное подсемейство MAPK, активируемое ниже по каскаду от митоген-активируемой протеинкиназы 1 и 2 (MEK1/2), играет важную роль в ноцицептивной обработке и нейронной пластичности^14,15. Предыдущие исследования показали, что фосфо-ERK1/2 (p-ERK1/2) может индуцироваться в нейронах спинного мозга при ноцицептивной стимуляции, а также обнаруживаться в астроцитах и микроглии при воспалительной или нейропатической боли^16,17,18,19. Кроме того, сообщалось, что фармакологическое ингибирование сигналинга MEK1/2–ERK1/2 ослабляет механическую и термическую гипералгезию в нескольких моделях боли^{20,21,22,23,24,25}.

Однако клеточное распределение спинальных ERK1/2, в частности в астроцитах и микроглии, активируемых острым разрезом, а также их роль в боли, вызванной разрезом, остаются недостаточно определенными. Предыдущие исследования данной исследовательской группы указывают на то, что PPF облегчает острую инцизионную гипералгезию у крыс, снижая передачу сигналов JNK и p38 в спинном мозге, однако остается неясным, модулирует ли PPF также ERK1/2-зависимую сигнализацию в глиальных клетках спинного мозга при боли, вызванной разрезом. Таким образом, настоящее исследование следует рассматривать как расширение существующих концепций роли глии и MAPK в исследованиях боли, а не как полностью независимую механистическую парадигму. Его основное отличие от предыдущих работ заключается в специфическом фокусе на острой инцизионной боли, изучении ERK1/2 (а не p38/JNK) как интересующего компонента MAPK, а также в оценке раннего клеточного распределения p-ERK1/2 в спинном мозге в связи с применением PPF.

Данное исследование было направлено на изучение того, ослабляет ли предоперационное интратекальное введение PPF инцизионную гипералгезию на модели разреза подошвенной поверхности лапы крысы, и связан ли этот эффект с фосфорилированием ERK1/2 или изменениями в экспрессии спинальных нейрональных и глиальных маркеров, а также воспалительных медиаторов — фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и циклооксигеназы-2 (COX-2). В частности, данная работа отличается от предыдущих отчетов сочетанием поведенческой оценки с временным анализом методом вестерн-блоттинга, фармакологическим сравнением с ингибитором MEK1/2 U0126 и качественной иммунофлуоресцентной локализацией p-ERK1/2 в нейронах спинного мозга, астроцитах и микроглии в модели острой инцизионной боли. Хотя ее механизм основан на предыдущих данных, связывающих модуляцию глии и сигнализацию MAPK с болью, настоящая работа призвана предоставить дополнительные доказательства возможной роли спинальных глиальных ответов, связанных с ERK1/2, в ранней фазе инцизионной гипералгезии.

По сравнению с традиционными послеоперационными анальгетиками, подходы, нацеленные на конкретные сигнальные пути, позволяют проверить определенный компонент сигналинга, однако могут обеспечивать лишь ограниченный по времени эффект и требовать инвазивного введения; ингибирование MEK1/2–ERK1/2 продемонстрировало антигиперальгетическое действие в нескольких экспериментальных моделях боли^{20,21,22,23,24,25}. PPF отличается от ингибиторов одного пути тем, что он модулирует глиальные ответы и связан с более чем одним процессом, опосредованным MAPK^4,5,6. Практическое применение метода по-прежнему ограничено дизайном доклинических исследований, предоперационным интратекальным введением, использованием только самцов крыс, а также отсутствием исследований зависимости «доза-эффект» и безопасности на более крупных хирургических моделях.

Протокол

Проведенные эксперименты были одобрены комитетом по этике Второй аффилированной больницы Ланьчжоуского университета, провинция Ганьсу, Китай (номер этического одобрения 2017-070). Все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Международной ассоциации по изучению боли²⁶. В исследовании было использовано в общей сложности 66 взрослых самцов крыс линии Sprague–Dawley весом 200–250 g, полученных из аккредитованного центра лабораторных животных. Для снижения потенциальной вариабельности, связанной с половыми гормональными влияниями, в данное исследование были включены только самцы. Все протоколы выполнялись в соответствии с рекомендациями Международной ассоциации по изучению боли²⁶, и были предприняты необходимые меры для минимизации страданий животных. Подробная информация о реагентах, расходных материалах, приборах и программном обеспечении, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

Животные

Крысы содержались парами до операции и по отдельности после разреза; корм и вода предоставлялись ad libitum. В помещении поддерживался 12-часовой цикл свет–тьма, температура воздуха составляла 24 °C ± 2 °C.

Интратекальное введение и модель инцизионной боли

Для интратекального введения растворов крыс анестезировали 1,5%–3% севофлураном (подаваемым через носовую маску) и помещали в брюшном положении с согнутым позвоночником. Шерсть в поясничной области выбривали, а кожу над межпозвоночным пространством L5–L6 дезинфицировали. Микрошприц вводили перкутанно в межпозвоночное пространство L5–L6. Об успешном проникновении в субарахноидальное пространство свидетельствовал внезапный вздрагивание или движение хвоста при продвижении иглы, что дополнительно подтверждалось появлением спинномозговой жидкости при осторожной аспирации. Если эти признаки не наблюдались, положение иглы корректировали перед инъекцией. Введение препарата осуществлялось только после выполнения обоих критериев подтверждения; животные с аномальными неврологическими признаками после инъекции исключались из исследования. Затем медленно вводили соответствующий раствор, после чего кожу снова очищали. Хирургическая процедура длилась примерно 3 min, и крысы обычно выходили из наркоза в течение 5–10 min.

Модель инцизионной боли у крыс была создана согласно ранее описанному методу²⁷. После проведения анестезии подошвенную поверхность задней лапы дезинфицировали 10% раствором повидон-йода. В коже подошвы выполняли продольный разрез длиной 1 cm, начиная примерно в 0.5 cm от пятки в направлении пальцев. Разрез проходил через кожу и фасцию. Подошвенную мышцу осторожно приподнимали офтальмологическим пинцетом и рассекали продольно, сохраняя общую целостность тканей. Затем мышцу возвращали на место, накладывали легкое давление для достижения гемостаза, и рану закрывали двумя матрасными швами с использованием нейлоновой нити 3-0. После закрытия раны место разреза повторно дезинфицировали. После операции крыс содержали индивидуально, обеспечивая восстановление в тихой, теплой среде, в защищенном от яркого света месте, со свободным доступом к корму и воде. За животными проводили послеоперационный мониторинг, и тех, кто не соответствовал заранее определенным критериям, незамедлительно исключали из исследования. Инфекцию раны определяли по следующим признакам: покраснение, отек и повышение локальной температуры вокруг раны, патологический желто-зеленый гнойный экссудат с неприятным запахом, замедленное заживление с сохранением зияния раны, некроз и увеличение площади поражения, а также системные признаки, включая повышенную температуру тела, вялость и отказ от пищи. Дополнительные критерии исключения включали: отсутствие восстановления после анестезии в течение 30 min, интраоперационное полное пересечение мышцы или нейроваскулярное повреждение, послеоперационное членовредительство, неудачное создание модели и неврологический дефицит, такой как паралич задних конечностей или невозможность опираться на лапу, не связанная с инцизионной болью. Крыс с инфекцией раны или расхождением краев раны исключали из исследования.

Поведенческие измерения

Механический порог отдергивания лапы (PWMT) и латентный период термического отдергивания лапы (PWTL) измерял исследователь, не знавший о распределении животных по группам. Тестирование проводилось в тихом помещении в одно и то же время суток после как минимум 10 min акклиматизации; параметры контейнера, тип пола (сетка или стекло), освещенность и интенсивность источника тепла оставались неизменными для всех групп. Для определения PWMT калиброванные нити фон Фрея (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g и 15.0 g) прижимали перпендикулярно к подошвенной поверхности рядом с раной до тех пор, пока нить не изгибалась примерно на 1–2 mm. Интервал между последовательными стимуляциями составлял 2 min; значение PWMT 50% определяли методом «вверх-вниз»²⁸. Для определения PWTL крыс помещали в индивидуальные прозрачные контейнеры на стеклянный пол, при этом источник инфракрасного излучения совмещали с подошвенной поверхностью рядом с раной. Для предотвращения повреждения тканей установили ограничение по времени (cut-off) в 30 s; интервал между последовательными воздействиями составлял 2 min, и регистрировали среднее значение трех измерений²⁹. Поднятие, встряхивание или вылизывание лапы считались положительной реакцией отдергивания; испытания, на которые повлияли уход за шерстью, движение или смещение относительно источника тепла, повторяли после повторной акклиматизации.

Вестерн-блот анализ

В установленное время крыс усыпляли путем перелома шейных позвонков, после чего быстро извлекали отделы L4–L6 поясничного отдела спинного мозга в буфер для лизиса RIPA (радиоиммунопреципитационного анализа), дополненный ингибитором протеаз в соотношении 100:1. Ткань гомогенизировали, выдерживали на льду в течение 20 min и центрифугировали при 15,000 × g в течение 20 min при 4 °C. Супернатант смешивали с 4× буфером для нанесения в соотношении 3:1, нагревали в кипящей воде в течение 5 min и хранили при −80 °C. Образцы белков (30 µg на дорожку) разделяли в 10% натрий-додецилсульфат-полиакриламидных гелях и переносили на поливинилиденфторидные мембраны с порами 0,45 или 0,22 µm. Успешность переноса проверяли по ожидаемой миграции предварительно окрашенного маркера молекулярной массы и отсутствию явных участков неравномерного или прерванного переноса. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком и 3% бычьим сывороточным альбумином в течение 2 h при комнатной температуре, затем инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами к NeuN (1:8,000), GFAP (1:4,000), Iba-1 (1:3,000), p-ERK1/2 (1:1,000), t-ERK1/2 (1:3,000) или GAPDH (1:2,000). После промывки в трис-солевом буфере, содержащем 0,05% Tween 20 (pH 7.4), мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:5,000), в течение 1 h при комнатной температуре. Сигналы визуализировали методом усиленной хемилюминесценции и регистрировали на пленке, используя одинаковый диапазон экспозиции для каждой мишени. Исследователь, не знавший о распределении по группам, анализировал плотность полос с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Изображения переводили в 8-битный градиент серого, к каждой полосе применяли идентичную прямоугольную область интереса, вычитали локальный фон из соседней пустой области и регистрировали интегральную плотность. Один и тот же размер области и процедура вычитания фона использовались для всех дорожек на одном блоте. Уровни NeuN, GFAP, Iba-1 и t-ERK1/2 нормировали по GAPDH; уровень p-ERK1/2 нормировали по t-ERK1/2; затем значения выражали относительно контрольной группы.

Иммунофлуоресценция

В установленные моменты времени крыс анестезировали 3% раствором пентобарбиталя натрия (1,5 mL/kg) и подвергли перфузии через сердце 300 mL предварительно охлажденного 0,01 mol/L фосфатно-солевого буфера (PBS; pH 7,4) с последующим введением 250 mL предварительно охлажденного 4% параформальдегида. Участок спинного мозга L4–L6 подвергали дофиксации в 4% параформальдегиде в течение 6 ч, криопротекции в течение ночи в 20%–30% растворе сахарозы в PBS при 4 °C и нарезали на срезы толщиной 10 µm при −22 °C. Срезы промывали в 0,01 mol/L PBS, блокировали в 10% сыворотке козы в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами против NeuN (1:100), GFAP (1:1 000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) или COX-2 (1:50). После трех промывок в PBS срезы инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с зеленым или красным флуорофором (1:400), в течение 1 ч при комнатной температуре, затем промывали в PBS еще три раза и заключали в антифейдинговый medium под покровное стекло. В каждую серию окрашивания включали срезы отрицательного контроля, обработанные без первичных антител. Снимки получал исследователь, не знавший принадлежности образцов, с помощью флуоресцентного микроскопа. Обзорные изображения с низким увеличением получали с использованием объектива 10×, тогда как изображения клеточной иммунореактивности и колокализации получали с использованием объективов 20× или 40× в соответствии с соответствующей панелью рисунка. Для сравнений в пределах одного рисунка и одной серии окрашивания увеличение объектива, интенсивность освещения, время экспозиции, усиление детектора, настройки камеры и параметры обработки изображений были фиксированы после оптимизации ниже уровня насыщения. Отдельные флуоресцентные каналы регистрировали последовательно для минимизации перекрытия каналов. Для каждого животного захватывали три неперекрывающихся поля в ипсилатеральном заднем роге. Интенсивность флуоресценции количественно определяли с помощью программного обеспечения для анализа изображений после 8-битного преобразования, вычитания фона с использованием бесклеточной области и применения идентичной области интереса и порога в каждой серии окрашивания; значения полей усредняли для получения одного значения на животное. Поля с переэкспозицией, складками ткани, разрывами, плохим фокусом или неравномерным фоном исключались и переснимались при тех же ненасыщающих настройках. Окрашивание считалось приемлемым, если архитектура ткани была неповрежденной, целевой сигнал превышал сигнал контроля без первичных антител и анализ не затрагивали значительные складки, разрывы или области насыщения.

In vitro эксперименты с первичными астроцитами спинного мозга

Первичные астроциты спинного мозга крыс культивировали в стандартных стерильных условиях в полной питательной среде при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂. Клетки использовали при достижении примерно 70%–80% конфлюэнтности, распределяя их по группам: контрольной, стимулированной LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 и группе с восстановлением функции ERK1/2. PPF и U0126 добавляли в концентрации 10 µM. Условия стимуляции LPS, обработки препаратами и сбора образцов были идентичны для параллельных лунок в каждом эксперименте. Для анализа селективности путей собирали лизаты клеток для проведения вестерн-блоттинга на p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, общий p38, p-JNK, общий JNK и соответствующий контроль загрузки. Супернатанты культур из параллельных лунок собирали, осветляли путем центрифугирования и анализировали на содержание TNF-α, PGE2 и IL-6 с помощью иммуноферментного анализа согласно инструкциям производителя. Денситометрия вестерн-блоттинга проводилась по тем же принципам анализа изображений, что описаны выше. Для экспериментов по восстановлению функции эндогенный ERK1/2 подавляли с помощью трансфекции siRNA, а перед началом обработки вводили экспрессионную конструкцию конститутивно активного ERK1/2 (CA-ERK1/2). Эффективность нокдауна и гиперэкспрессии подтверждали методом вестерн-блоттинга перед интерпретацией данных по цитокинам. Клетки, подвергнутые воздействию реагента для трансфекции без активной siRNA или конструкции, использовали в качестве процедурного контроля, где это было применимо.

Дизайн эксперимента

Разделение экспериментальных животных на подгруппы

Крысы были разделены на шесть групп с помощью метода таблицы случайных чисел; распределение по группам было завершено до начала поведенческого тестирования и сбора тканей. Шесть групп включали контрольную группу (n = 6), группу с инцизионной болью (IP) (n = 18), группу с физиологическим раствором (NS) (0,9% NS, 10 µL; n = 9), группу PPF (10 µg в 10 µL; n = 12), группу диметилсульфоксида (DMSO) (10% DMSO, 10 µL; n = 9) и группу U0126 (10 µg в 10 µL; n = 12). Крысы контрольной группы не подвергались ни подошвенному разрезу, ни интратекальному введению и служили необработанным контролем. Крысы в группе IP подверглись подошвенному разрезу без предварительного интратекального введения препаратов. Крысы в группах NS, PPF, DMSO и U0126 получали соответствующие препараты интратекально за 30 мин до подошвенного разреза. Группа NS служила контролем растворителя для PPF, в то время как группа DMSO служила контролем растворителя для U0126.

Дозы пропентофиллина и U0126

Пропентофиллин является модулятором глиальных клеток; доза 10 µg была выбрана на основании результатов предыдущих исследований данной научной группы, в которых эта доза облегчала острую гипералгезию. U0126 представляет собой неконкурентный по отношению к аденозинтрифосфату ингибитор MEK1/2, используемый для блокирования фосфорилирования ERK1/2. В различных моделях боли сообщалось об эффективности интратекальных доз в диапазоне 1–10 µg^30,31,32; в настоящем исследовании использовалась доза 10 µg. U0126 растворяли в 10% диметилсульфоксиде, в то время как PPF растворяли в 0,9% физиологическом растворе. Конечные концентрации составляли 1 µg/µL. Препараты и растворители готовили перед операцией, хранили при 4 °C и использовали в течение 12 h.

Влияние предоперационного интратекального введения пропентофиллина или U0126 на гипералгезию

За 24 ч до операции шесть крыс из каждой группы были случайным образом отобраны для поведенческих измерений; полученные значения PWMT и PWTL были приняты за базовый уровень. Интратекальные инъекции проводились за 30 мин до операции. Для оценки влияния предоперационного интратекального введения PPF и U0126 на механическую и термическую гипералгезию значения PWMT и PWTL оценивали через 2 ч, 4 ч, 8 ч, 24 ч и 72 ч после разреза.

Экспериментальный план оценки влияния предоперационного интратекального введения пропентофиллина или U0126 на экспрессию спинальных нейрональных и глиальных маркеров после выполнения разреза

Для определения подходящего момента времени после разреза для оценки эффекта лечения сначала был проведен предварительный анализ временного курса в группе IP. В частности, крыс в группе IP усыпляли через 2 ч, 4 ч, 24 ч и 72 ч после разреза, и уровни экспрессии клеточных маркеров NeuN, GFAP и Iba-1 в спинном мозге измеряли методом вестерн-блоттинга (n = 3 для каждой временной точки). На основании этого предварительного анализа первые 4 ч после разреза были выбраны в качестве окна раннего наблюдения, поскольку экспрессия NeuN достигла своего максимального уровня в точке 4 ч, а ранние молекулярные изменения были признаны наиболее значимыми для первоначального развития инцизионной гипералгезии. Тем не менее, временная точка 4 ч не предназначалась для репрезентации всех временных молекулярных изменений после разреза.

В этот выбранный момент времени крысы, которым вводили интратекальную инъекцию, были подвергнуты эвтаназии для проведения вестерн-блот-анализа различных клеточных маркеров (n = 3 на группу) и оценки морфологии различных типов клеток методом иммунофлуоресценции (n = 3 на группу). В контрольной группе (blank group) крыс забивали случайным образом для определения базовых уровней экспрессии различных клеточных маркеров (NeuN, GFAP и Iba-1) в спинном мозге с помощью вестерн-блоттинга (n = 3) и анализа морфологии различных клеток (нейронов, астроцитов и микроглии) методом иммунофлуоресценции (n = 3). Таким образом, контрольная группа служила базовым контролем без проведения разрезов и лечения.

Эффекты воздействия на спинальный p-ERK1/2 и воспалительные медиаторы

Для определения подходящего момента времени после разреза для оценки влияния лечения на экспрессию p-ERK1/2 и уровни воспалительных цитокинов сначала был проведен предварительный анализ временной динамики в группе IP. В частности, крысы в группе IP подвергались эвтаназии через 2 h, 4 h, 24 h и 72 h после разреза, и экспрессия спинального p-ERK1/2 измерялась методом вестерн-блоттинга (n = 3 на каждый временной интервал). На основании этого эксперимента по изучению временной динамики, а также момента времени, когда экспрессия NeuN после разреза была максимальной, интервал 4 h после разреза был выбран в качестве фиксированной временной точки для последующей оценки влияния предоперационного интратекального введения PPF или U0126 на экспрессию спинального p-ERK1/2 и воспалительные цитокины. Эта временная точка была выбрана как окно для раннего механистического наблюдения, а не как исчерпывающее представление всех временных изменений после разреза.

В этот выбранный временной точке крысы, которым была введена интратекальная инъекция, были подвергнуты эвтаназии для проведения вестерн-блот-анализа экспрессии p-ERK1/2 (n = 3 на группу) и иммунофлуоресцентной оценки воспалительных цитокинов (n = 3 на группу). В контрольной группе (blank group) крыс усыпляли случайным образом для определения базовых уровней экспрессии p-ERK1/2 в спинном мозге методом вестерн-блоттинга (n = 3) и уровней воспалительных цитокинов (TNF-α и COX-2) методом иммунофлуоресценции (n = 3). Таким образом, контрольная группа служила базовым контролем без проведения разрезов и лечения.

Клеточная локализация спинального p-ERK1/2 в нейронах, астроцитах и микроглии

Для дальнейшей оценки клеточного распределения спинального p-ERK1/2 после разреза через 4 ч после процедуры (n = 3) в группах Blank и IP было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Размер выборки был определен с учетом предыдущих исследований данной исследовательской группы и предварительных экспериментов. Поведенческие данные анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с повторными измерениями, где групповой фактор был межсубъектным, а временной — внутрисубъектным. Данные вестерн-блоттинга в динамике оценивали с помощью однофакторного ANOVA с последующим попарным сравнением с поправкой Бонферрони. Данные вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции в фиксированные моменты времени оценивали с помощью однофакторного ANOVA с запланированными сравнениями с поправкой Бонферрони; сравнения двух групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Нормальность распределения и гомогенность дисперсии оценивали с помощью тестов Шапиро–Уилка и Левена соответственно. Двусторонний pзначение p < Значение 0,05 считалось статистически значимым. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для статистического анализа, перечисленного в Таблица материаловДля in vitro в экспериментах с астроцитами единицей анализа считались эксперименты с независимыми культурами; денситометрия вестерн-блоттинга и концентрации цитокинов сравнивались с использованием однофакторного ANOVA с последующими запланированными сравнениями с поправкой Бонферрони или t-критерием Стьюдента t-критерий для заранее определенных сравнений двух групп, где это применимо.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Данные, подтверждающие результаты этого исследования, представлены в Дополнительном файле 1.

Результаты

Влияние разреза и предоперационного интратекального введения пропентофиллина или U0126 на гипералгезию после разреза

Механическая гипералгезия

За 24 ч до операции между шестью группами не было обнаружено значимых различий в PWMT (p > 0.05; Рисунок 1A,B). В группе IP PWMT снизился после разреза и оставался значимо ниже исходного уровня в период от 2 ч до 72 ч после разреза (p < 0.05 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 1A). В группах NS и DMSO значимых различий в PWMT между временными точками после разреза не наблюдалось (p > 0.05 по сравнению с группой IP; Рисунок 1B). В группе PPF PWMT был значимо выше, чем в группе IP, в период от 2 ч до 72 ч после разреза (p < 0.05 по сравнению с группой IP; Рисунок 1A), а через 72 ч после разреза он перестал значимо отличаться от исходного уровня (p > 0.05 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 1A). В группе U0126 PWMT были значимо выше, чем в группе IP, в течение первых 24 ч после разреза (p < 0.05 по сравнению с группой IP; Рисунок 1A), однако этот эффект не сохранился к 72 ч после разреза, когда PWMT оставался значимо ниже исходного уровня и больше не отличался значимо от показателей в группе IP (p < 0.05 по сравнению с исходным уровнем; p > 0.05 по сравнению с группой IP; Рисунок 1A).

Термическая гипералгезия

За 24 ч до операции значимых различий в PWTL между шестью группами не наблюдалось (p > 0.05; Рисунок 1C,D). В группе IP показатель PWTL снизился с 24.85 s ± 1.06 s до операции до 4.38 s ± 1.02 s через 4 ч после разреза, а затем частично увеличился до 18.37 s ± 1.38 s через 72 ч после разреза, однако оставался значимо ниже исходного уровня на протяжении всего периода наблюдения (p < 0.05 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 1C). В группах NS и DMSO значимых различий в PWTL между временными точками после разреза не выявлено (p > 0.05 по сравнению с группой IP; Рисунок 1D). В группе PPF показатель PWTL был значимо выше, чем в группе IP, на протяжении всего 72-часового периода наблюдения (p < 0.05 по сравнению с группой IP; Рисунок 1C), а через 72 ч после разреза он вернулся к уровню, который значимо не отличался от исходного (p > 0.05 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 1C). В группе U0126 показатель PWTL был значимо выше, чем в группе IP, в течение первых 24 ч после разреза (p < 0.05 по сравнению с группой IP; Рисунок 1C); этот эффект не сохранился через 72 ч после разреза, когда PWTL оставался значимо ниже исходного уровня и больше не отличался значимо от показателей группы IP (p < 0.05 по сравнению с исходным уровнем; p > 0.05 по сравнению с группой IP; Рисунок 1C).

Вестерн-блот анализ временных изменений экспрессии маркеров спинальных клеток и фосфорилирования внеклеточной сигнал-регулируемой киназы 1 и 2 после разреза

На ПВДФ-мембранах с помощью специфических антител было выявлено несколько полос с точными значениями молекулярных масс, включая NeuN (48 и 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) и GAPDH (36 kD). Полоса GAPDH использовалась в качестве контроля для NeuN, GFAP, Iba-1 и t-ERK1/2, а полоса t-ERK1/2 — в качестве контроля для p-ERK1/2.

Данные вестерн-блоттинга спинного мозга в группе IP показали повышение экспрессии белков в различной степени после разреза (Рисунок 2A). Экспрессия нейрон-специфического ядерного белка достигла максимального значения через 4 ч после разреза (p < 0.001 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 2A) и оставалась значительно повышенной через 72 ч после разреза (p < 0.001 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 2A). Уровни глиального фибриллярного кислого белка постепенно увеличивались в течение 72-часового периода наблюдения (p < 0.001 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 2A), при этом самый высокий уровень среди всех измеренных временных точек наблюдался через 72 ч. Аналогично, уровень Iba-1 также значительно повысился через 4 ч после разреза (p < 0.001 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 2A) и колебался в узком диапазоне. Примечательно, что данные вестерн-блоттинга спинного мозга в группе IP показали, что активация ERK1/2 увеличивалась только в течение первых 24 ч после разреза (p < 0.05 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 2B), но снизилась через 72 ч после разреза (p < 0.05 по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 2B), в то время как экспрессия t-ERK/2 не претерпела значимых изменений ни в одной временной точке.

Вестерн-блот анализ влияния предоперационного интратекального введения пропентофиллина или U0126 на экспрессию клеточных маркеров и фосфорилированной внеклеточной сигнал-регулируемой киназы 1 и 2 в спинном мозге

Данные вестерн-блоттинга показали, что экспрессия NeuN достигла своего максимального уровня через 4 ч после разреза, когда поведенческие показатели находились на самом низком пороге. Следовательно, влияние интратекального введения PPF и U0126 за 30 мин до операции на экспрессию клеточных маркеров и фосфорилирование ERK1/2 оценивали через 4 ч после разреза.

Данные вестерн-блоттинга показали, что по сравнению с контрольной группой экспрессия всех клеточных маркеров в спинном мозге в группе IP значительно увеличилась через 4 ч после разреза (p < 0.05 относительно исходного уровня; Рисунок 3). По сравнению с группой IP, предоперационное интратекальное введение PPF снижало экспрессию NeuN в спинном мозге (p < 0.05 относительно группы IP; Рисунок 3A), GFAP (p < 0.05 относительно группы IP; Рисунок 3B) и Iba-1 (p < 0.01 относительно группы IP; Рисунок 3C). По сравнению с группой IP, предоперационное интратекальное введение U0126 также снижало экспрессию NeuN в спинном мозге (p < 0.01 относительно группы IP; Рисунок 3D), GFAP (p < 0.05 относительно группы IP; Рисунок 3E) и Iba-1 (p < 0.01 относительно группы IP; Рисунок 3F). Однако при сравнении с контрольной группой экспрессия NeuN в группе PPF оставалась значительно выше исходного уровня (p < 0.01 относительно исходного уровня; Рисунок 3A), в то время как экспрессия NeuN в группе U0126 была значительно ниже, чем в контрольной группе (p < 0.01 относительно исходного уровня; Рисунок 3D). Что касается GFAP и Iba-1, в тексте теперь подчеркивается сравнение с группой IP, как показано на Рисунке 3. Предоперационное интратекальное введение NS и DMSO не оказало значимого влияния на экспрессию какого-либо из клеточных маркеров.

Данные вестерн-блоттинга показали, что экспрессия t-ERK1/2 в спинном мозге существенно не различалась между группами Blank, IP, NS и PPF через 4 ч после разреза (Рисунок 4A). Напротив, по сравнению с группой blank, экспрессия p-ERK1/2 была значительно повышена в группах IP и NS через 4 ч после разреза (p < 0.001 по сравнению с группой blank; Рисунок 4B). По сравнению с группой IP, предоперационное интратекальное введение PPF значительно снизило экспрессию p-ERK1/2 через 4 ч после разреза (p < 0.001 vs группа IP; Рисунок 4B). По сравнению с группой NS, экспрессия p-ERK1/2 в группе PPF также была значительно ниже (p < 0.01 vs группа NS; Рисунок 4B). Однако по сравнению с группой blank, экспрессия p-ERK1/2 в группе PPF оставалась значительно повышенной через 4 ч после разреза. Аналогично, экспрессия t-ERK1/2 в спинном мозге существенно не различалась между группами Blank, IP, DMSO и U0126 через 4 ч после разреза (Рисунок 4C). По сравнению с группой blank, экспрессия p-ERK1/2 была значительно повышена в группах IP и DMSO через 4 ч после разреза (p < 0.001 vs группа blank; Рисунок 4D). По сравнению с группой IP, предоперационное интратекальное введение U0126 значительно снизило экспрессию p-ERK1/2 (p < 0.001 vs группа IP; Рисунок 4D). По сравнению с группой DMSO, экспрессия p-ERK1/2 в группе U0126 также была значительно ниже (p < 0.001 по сравнению с группой DMSO; Рисунок 4D). Примечательно, что по сравнению с группой blank, экспрессия p-ERK1/2 в группе U0126 через 4 ч после разреза существенно не отличалась от экспрессии в группе blank. Предварительная обработка NS или DMSO не оказала значительного влияния на экспрессию p-ERK1/2 по сравнению с группой IP.

Иммунофлуоресцентное наблюдение за маркерами клеток спинного мозга и медиаторами воспаления

Результаты иммунофлуоресценции качественно показали более сильную иммунореактивность NeuN в ипсилатеральном заднем роге через 4 ч после разреза по сравнению с контралатеральной стороной (Рисунок 5). В контрольной группе на репрезентативных изображениях была показана базовая иммунореактивность NeuN, GFAP и Iba-1 в ипсилатеральном заднем роге спинного мозга (Рисунок 6A–C). В группе IP иммунореактивность NeuN была качественно сильнее, чем в контрольной группе (Рисунок 6D против Рисунок 6A), иммунореактивность GFAP также была сильнее (Рисунок 6E против Рисунок 6B), и иммунореактивность Iba-1 также повысилась (Рисунок 6F против Рисунок 6C). Одновременно с этим астроциты и микроглия в группе IP выглядели гипертрофированными, с увеличенными телами клеток и более толстыми, более сильно разветвленными отростками (Рисунок 6E,F).

В группе PPF репрезентативные изображения указывали на более слабую иммунореактивность NeuN по сравнению с группой IP (Рисунок 6G против Рисунка 6D), более слабую иммунореактивность GFAP (Рисунок 6H против Рисунка 6E) и более слабую иммунореактивность Iba-1 (Рисунок 6I против Рисунка 6F). В группе U0126 репрезентативные изображения аналогичным образом указывали на более слабую иммунореактивность NeuN по сравнению с группой IP (Рисунок 6J против Рисунка 6D), более слабую иммунореактивность GFAP (Рисунок 6K против Рисунка 6E) и более слабую иммунореактивность Iba-1 (Рисунок 6L против Рисунка 6F). В обеих группах, PPF и U0126, астроциты и микроглия выглядели менее гипертрофированными, с более мелкими телами клеток и меньшим количеством более тонких отростков (Рисунок 6H,I,K,L). Соответствующий анализ интенсивности флуоресценции NeuN, GFAP и Iba-1 согласовался с данными репрезентативных наблюдений иммунофлуоресценции (Рисунок 6M–O, соответственно).

Через 4 ч после разреза иммунореактивность TNF-α и COX-2, а также относительная интенсивность флуоресценции были повышены в ипсилатеральном заднем роге спинного мозга группы IP по сравнению с контрольной группой. Оба показателя были ниже после предоперационного интратекального введения PPF или U0126 (Рисунок 7A–C).

Клеточное распределение p-ERK1/2 в спинном мозге методом иммунофлуоресценции

Результаты иммунофлуоресцентного анализа показали, что в контрольной группе иммунореактивность p-ERK1/2 в спинном мозге была слабой и наблюдалась только в NeuN-положительных нейронах (Рисунок 8A–C). Напротив, через 4 ч после разреза иммунореактивность p-ERK1/2 заметно усилилась в заднем роге ипсилатерального спинного мозга и локализовалась не только в нейронах, но также в GFAP-положительных астроцитах и Iba-1-положительной микроглии (Рисунок 8D–I). Данный результат указывает на то, что разрез вызвал более широкое клеточное распределение p-ERK1/2: от исключительно нейронов в исходном состоянии до нейронов, астроцитов и микроглии после повреждения.

In vitro валидация ERK1/2-зависимого механизма в астроцитах спинного мозга

Чтобы дополнительно оценить, может ли PPF подавлять высвобождение медиаторов воспаления через ERK1/2-зависимую сигнализацию на клеточном уровне, первичные астроциты спинного мозга крысы стимулировали LPS и обрабатывали PPF или U0126 (10 µM). Вестерн-блот-анализ показал, что PPF снижал индуцированную LPS экспрессию p-ERK1/2, в то время как фосфорилирование p-p38 и p-JNK заметно не изменилось (Рисунок 9A), что подтверждает относительную селективность пути ERK1/2 в данных условиях. Параллельно с этим PPF снижал уровни TNF-α, PGE2 (конечного продукта активности COX-2) и IL-6 в супернатанте культуры по сравнению с группой Stim; U0126 оказывал аналогичные ингибирующие эффекты (Рисунок 9B).

Для проверки того, может ли персистентная активация ERK1/2 ослабить противовоспалительный эффект PPF, были проведены эксперименты по спасению (rescue experiments). Эндогенный ERK1/2 был нокаутирован с помощью siRNA, после чего была введена конструкция конститутивно активного ERK1/2 (CA-ERK1/2) (Рисунок 9C). В астроцитах, экспрессирующих CA-ERK1/2, PPF больше не снижал уровни TNF-α, PGE2 или IL-6 в той же степени (Рисунок 9D), что указывает на то, что подавление фосфорилирования ERK1/2 способствует противовоспалительному эффекту PPF в данной системе астроцитов in vitro.

В совокупности эти результаты in vitro обеспечивают механистическое подтверждение на клеточном уровне того, что PPF ослабляет высвобождение медиаторов воспаления через ERK1/2-зависимый механизм в астроцитах спинного мозга, дополняя данные наблюдений in vivo.

Рисунок 1: Влияние предоперационного интратекального введения PPF или U0126 на индуцированную разрезом механическую и термическую гипералгезию. (A) PWMT в контрольной группе, группе IP, группе PPF и группе U0126. (B) PWMT в группе IP и группе контроля с носителем. (C) PWTL в контрольной группе, группе IP, группе PPF и группе U0126. (D) PWTL в группе IP и группе контроля с носителем. Данные представлены как среднее ± SD (n = 6 крыс на группу); анализ проводился с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями (two-way repeated-measures ANOVA). ***p < 0.001 по сравнению с исходным уровнем; #p < 0.05, ##p < 0.01 и ###p < 0.001 по сравнению с группой IP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Временной ход экспрессии маркеров клеток спинного мозга и фосфорилирования ERK1/2 после разреза. (A) Количественный анализ и репрезентативные вестерн-блоты NeuN, GFAP и Iba-1 в группе IP от исходного уровня до 72 ч после разреза. (B) Количественный анализ и репрезентативные вестерн-блоты t-ERK1/2 и p-ERK1/2 за тот же период. Значения были нормализованы относительно контрольной группы (100%) и представлены как среднее ± SD (n = 3 крысы на временной точке). Общие различия анализировали с помощью однофакторного ANOVA с указанными попарными сравнениями. *p < 0.05, **p < 0.01 и ***p < 0.001 по сравнению с исходным уровнем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Влияние предоперационного интратекального введения PPF или U0126 на спинальные нейрональные и глиальные маркеры через 4 ч после разреза. (A–C) NeuN, GFAP и Iba-1 в контрольной группе (blank), группе IP, группе с физиологическим раствором и группе PPF. (D–F) NeuN, GFAP и Iba-1 в контрольной группе (blank), группе IP, группе с диметилсульфоксидом и группе U0126. Справа представлены репрезентативные вестерн-блоты. Значения были нормализованы относительно контрольной группы (100%) и представлены как среднее ± SD (n = 3 крысы на группу). *p < 0.05, **p < 0.01 и ***p < 0.001 по сравнению с контролем; #p < 0.05 и ##p < 0.01 по сравнению с IP; Δp < 0.05, ΔΔp < 0.01 и ΔΔΔp < 0.001 по сравнению с соответствующей группой плацебо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Влияние предоперационного интратекального введения PPF или U0126 на фосфорилирование ERK1/2 в спинном мозге через 4 ч после разреза. (A,B) Уровни t-ERK1/2 и p-ERK1/2 в группах blank, IP, нормального физраствора и PPF. (C,D) Уровни t-ERK1/2 и p-ERK1/2 в группах blank, IP, диметилсульфоксида и U0126. Справа представлены репрезентативные результаты вестерн-блоттинга. Значения были нормализованы относительно группы blank (100%) и представлены как среднее ± SD (n = 3 крысы на группу). **p < 0.01 и ***p < 0.001 по сравнению с группой blank; ###p < 0.001 по сравнению с группой IP; ΔΔp < 0.01 и ΔΔΔp < 0.001 по сравнению с соответствующей контрольной группой (vehicle). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Ипсилатеральная и контрлатеральная иммунореактивность NeuN в спинном мозге после разреза. Репрезентативный поперечный срез поясничного отдела спинного мозга из группы IP через 4 h после разреза демонстрирует окрашивание NeuN в контрлатеральном и ипсилатеральном задних рогах. Изображение является репрезентативным для n = 3 крыс и приведено для качественного анатомического сравнения. Масштабная линейка = 500 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Влияние PPF и U0126 на иммунореактивность нейронов и глии спинного мозга через 4 ч после разреза. (A–C) NeuN, GFAP и Iba-1 в контрольной группе. (D–F) Соответствующее окрашивание в группе IP. (G–I) Соответствующее окрашивание после обработки PPF. (J–L) Соответствующее окрашивание после обработки U0126. (M–O) Относительная интенсивность флуоресценции NeuN, GFAP и Iba-1 соответственно. Столбцы отображают среднее значение ± SD (n = 3 крысы на группу); *p < 0.05, **p < 0.01 и ***p < 0.001 для указанных сравнений. Масштабная линейка = 200 µm. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Иммунореактивность к TNF-α и COX-2 в спинном мозге после разреза и лечения. (A) Репрезентативные изображения TNF-α и COX-2 для групп blank, IP, PPF и U0126 через 4 ч после разреза. (B) Относительная интенсивность флуоресценции TNF-α. (C) Относительная интенсивность флуоресценции COX-2. Столбцы отображают mean ± SD (n = 3 крыс в группе); ***p < 0.001 для указанных сравнений. Масштабные отрезки = 200 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Рисунок 8: Клеточная локализация p-ERK1/2 в спинном мозге через 4 ч после разреза. (A–C) Ко-окрашивание p-ERK1/2 с NeuN, GFAP и Iba-1 соответственно в контрольной группе. (D–F) Соответствующее ко-окрашивание в группе IP; стрелками отмечены репрезентативные ко-локализованные клетки. Красным цветом обозначен p-ERK1/2, зеленым — клеточный маркер, желтым — ко-локализация. (G–I) Относительная интенсивность флуоресценции в NeuN-, GFAP- и Iba-1-положительных областях соответственно. Столбцы отображают среднее значение ± SD (n = 3 крысы на группу); **p < 0.01 и ***p < 0.001 для указанных сравнений. Масштабный отрезок = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: ERK1/2-зависимые противовоспалительные эффекты PPF в первичных астроцитах спинного мозга крысы. (A) Репрезентативные вестерн-блот-анализы, показывающие, что PPF снижал индуцированное LPS фосфорилирование p-ERK1/2 без явного влияния на p-p38 или p-JNK. (B) Концентрации TNF-α, PGE2 и IL-6 в супернатантах культур после обработки LPS, PPF или U0126. (C) Вестерн-блот-анализы, подтверждающие siRNA-опосредованный нокдаун ERK1/2 и экспрессию конститутивно активного ERK1/2 (CA-ERK1/2). (D) Концентрации TNF-α, PGE2 и IL-6 после экспрессии CA-ERK1/2 в присутствии или отсутствии PPF. Столбцы отображают среднее значение ± SD по результатам независимых экспериментов in vitro; ***p < 0.001 для указанных сравнений; ns — статистически не значимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Данные, подтверждающие результаты этого исследования.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Большинство пациентов после хирургического вмешательства страдают от острой боли, которая проявляется не только физически, но порой и психологически³³, однако детальные механизмы развития острой послеоперационной боли до сих пор изучены недостаточно. Сильный эффект анальгетиков сопровождается неизбежными побочными эффектами, что делает поиск более безопасных и эффективных обезболивающих средств критически важным. Данное исследование основывалось на ранее валидированной модели разреза у крыс для имитации острой послеоперационной боли, которая отличается простотой и доступностью в подготовке²⁷. В настоящем исследовании оценивались изменения спинальных нейрональных и глиальных маркеров, фосфорилирования ERK1/2 и воспалительных медиаторов после выполнения разреза, а также изучалось, связан ли антигипералгетический эффект предоперационного интратекального введения PPF с параллельными изменениями фосфорилирования спинального ERK1/2 и экспрессии воспалительных цитокинов.

После разреза у крыс в группе IP развилась выраженная механическая и термическая гипералгезия, в то время как предварительное введение препарата-носителя не оказало заметного влияния ни на поведенческие, ни на молекулярные показатели. Эти результаты подтверждают стабильность модели и указывают на то, что наблюдаемые эффекты в группах PPF и U0126 unlikely вряд ли были обусловлены самой процедурой инъекции или препаратом-носителем. Кроме того, хотя экспрессия NeuN увеличилась после разреза, это изменение следует интерпретировать с осторожностью — как изменение экспрессии нейронального маркера, а не как прямое доказательство нейрональной активации. В совокупности эти наблюдения создают основу для изучения глиальных ответов и ответов, связанных с ERK1/2, на ранних этапах развития послеоперационной боли.

Было показано, что глиальные клетки играют важную роль в формировании синапсов, передаче и интеграции синаптической информации, а также в регуляции синаптической пластичности. Иммунологические и провоспалительные функции глиальных клеток при обработке болевых сигналов, и особенно активированных астроцитов и микроглии спинного мозга, могут усиливать центральную сенситизацию, участвующую в опосреловании гипералгезии и послеоперационных поведенческих изменений^7,34. Маладаптивные неврологические изменения в спинном мозге могут привести к повышенной чувствительности к ноцицептивным или неноцицептивным стимулам. Обширные данные указывают на то, что активация астроцитов и микроглии спинного мозга участвует в развитии и поддержании гипералгезии в моделях повреждения спинномозговых нервов³⁵, боли, индуцированной тканевым активатором плазминогена¹⁶, послеоперационной боли при разрезах^11,12 и боли при раке костей^19,31. Таким образом, активация глии спинного мозга представляется общей чертой множества болевых состояний, и дальнейшее изучение её роли при боли после разрезов может расширить современное понимание механизмов послеоперационной боли.

Полученные результаты подтверждают мнение о том, что астроциты и микроглия спинного мозга участвуют в раннем нейровоспалительном ответе после разреза¹². Вместо идентичных временных паттернов, GFAP, Iba-1 и p-ERK1/2 продемонстрировали частично различные временные курсы, что позволяет предположить, что разные глиальные процессы могут способствовать различным фазам развития послеоперационной боли^31,35. Данные иммунофлуоресценции дополнительно подтвердили эту интерпретацию, выявив гипертрофические морфологические изменения в астроцитах и микроглии после разреза. В сочетании с повышением иммунореактивности TNF-α и COX-2 эти наблюдения согласуются с концепцией того, что воспалительная сигнализация, связанная с глией, способствует развитию острой инцизионной гипералгезии^7,36.

Пропентофиллин, производное метилксантина, изначально изучался как цереброваскулярный препарат благодаря его антиагрегантному действию и способности поддерживать долгосрочную память³⁷. Однако регуляторное воздействие PPF на глиальные клетки делает его потенциально ценным и в качестве анальгезирующего средства. Исследования показывают, что PPF может препятствовать активации микроглии, ингибируя расщепление внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата и снижая обратный захват внеклеточного аденозина^4,5. В исследовании in vitro PPF подавлял пролиферацию астроцитов, препятствуя активации сигнального пути мишени рапамицина у млекопитающих, индуцированного TNF-α⁶. Таким образом, именно регуляторный эффект PPF на глиальные клетки делает возможным его участие в модуляции болевых процессов.

Стойкий антигипералгезический эффект PPF в настоящем исследовании, наряду со снижением экспрессии GFAP и Iba-1, подтверждает интерпретацию, согласно которой модуляция глии является важным компонентом анальгетического действия PPF в данной модели. Предыдущие исследования также показали, что PPF может подавлять глиально-опосредованную воспалительную сигнализацию при болевых состояниях^5,31. Кроме того, параллельное снижение уровней TNF-α и COX-2 позволяет предположить, что PPF может ослаблять послеоперационную боль, частично подавляя связанные с глией воспалительные реакции. Однако, поскольку полученные данные носят ассоциативный, а не механистический характер, эти результаты следует интерпретировать как подтверждение участия глии, а не как доказательство прямого причинно-следственного пути.

Была доказана роль ERK1/2, пары важных внутриклеточных сигнал-регулируемых киназ, в развитии и поддержании различных болевых процессов (посредством модуляции нейронной возбудимости и синаптической пластичности в головном и спинном мозге)²¹. Например, исследование показало, что инъекции капсаицина или формалина вызывали краткосрочное и быстрое повышение уровня p-ERK1/2 в спинном мозге, однако активация ERK1/2 в спинном мозге сохранялась гораздо дольше после введения полного адъюванта Фрейнда или пчелиного яда (после короткого латентного периода)^38,39. Напротив, в другом исследовании активация ERK1/2 в спинном мозге, вызванная повреждением нерва, достигала пика крайне рано и сохранялась в течение некоторого времени, при этом гипералгезия развивалась после пика p-ERK1/2³⁵. Таким образом, фосфорилирование ERK1/2 может происходить на разных этапах различных болевых процессов, а повышенный уровень p-ERK1/2 в спинном мозге может иметь важное значение как для немедленной индукции, так и для долгосрочного генного ответа.

В настоящем исследовании индуцированное разрезом фосфорилирование ERK1/2 значительно увеличилось в первые 24 ч после разреза по сравнению с контрольной группой, а экспрессия p-ERK1/2 достигла пика через 4 ч после разреза (как было описано ранее)²⁴, что совпало с моментом максимальной экспрессии NeuN. Одновременно с этим, согласно результатам иммунофлуоресценции, индуцированное разрезом фосфорилирование ERK1/2 наблюдалось в нейронах, астроцитах и микроглии дорсального рога спинного мозга на ипсилатеральной стороне, что подтверждает мнение о том, что сигнальный путь ERK1/2 особенно значим для ранней фазы послеоперационной гипералгезии. Кроме того, предоперационное интратекальное введение U0126 снизило экспрессию спинальных глиальных маркеров, NeuN и p-ERK1/2 через 4 ч после разреза, а также облегчило механическую и термическую гипералгезию в ранний послеоперационный период, что позволяет предположить участие спинального p-ERK1/2 в ранней стадии острой гипералгезии после разреза. Однако, поскольку GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 и поведенческие показатели демонстрировали различные временные профили, данная механистическая интерпретация должна быть ограничена ранним послеоперационным этапом, представленным временной точкой 4 ч, и не может быть обобщена на весь послеоперационный период.

Кроме того, в настоящем исследовании предоперационное интратекальное введение PPF также снизило уровень фосфорилирования ERK1/2 через 4 ч после разреза, что позволяет предположить, что наблюдаемые изменения экспрессии NeuN, GFAP и Iba-1 в спинном мозге могут быть связаны, по крайней мере частично, с ERK1/2-зависимым сигнальным путем. Предоперационное интратекальное введение U0126 также привело к снижению иммунореактивности TNF-α и COX-2, что подтверждает возможную связь между фосфорилированием ERK1/2 и экспрессией медиаторов воспаления после разреза. Дополнительные эксперименты на астроцитах in vitro, представленные на Рисунке 9, предоставили подтверждение на клеточном уровне наличия ERK1/2-зависимого противовоспалительного компонента, так как постоянная активация ERK1/2 ослабляла способность PPF снижать высвобождение TNF-α, PGE2 и IL-6. Однако, поскольку эти эксперименты по восстановлению функции проводились на культивируемых астроцитах, а не в интактном спинном мозге, и поскольку восстановление функции in vivo или селективное воздействие на определенные типы клеток не проводилось, выводы in vivo следует интерпретировать как поддерживающие, а не как окончательное доказательство наличия причинно-следственного ERK1/2-зависимого механизма.

Для дальнейшего обсуждения возможных взаимосвязей между активацией глиальных клеток, экспрессией p-ERK1/2 и высвобождением воспалительных цитокинов были рассмотрены паттерны пространственной локализации, выявленные с помощью иммунофлуоресценции. После разреза через 4 ч в задних рогах спинного мозга наблюдалась коэкспрессия p-ERK1/2 с GFAP-положительными астроцитами и Iba-1-положительной микроглией. В сочетании с данными вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции, показавшими, что применение как PPF, так и U0126 было связано со снижением экспрессии p-ERK1/2, TNF-α и COX-2, эти данные позволяют предположить, что фосфорилирование ERK1/2 в глиальных клетках спинного мозга может быть задействовано в воспалительном ответе после разреза. Данные in vitro, полученные на первичных астроцитах, дополнительно подтверждают прямую клеточную связь между воздействием PPF, подавлением ERK1/2 и высвобождением медиаторов воспаления. Тем не менее, доказательства in vivo демонстрируют ассоциативную связь и параллельные изменения, связанные с лечением, в то время как клеточные эксперименты дополняют, но не заменяют причинно-следственную валидацию специфичности типов клеток in vivo. Поскольку анализ иммунофлуоресценции был основан на ограниченном количестве животных и полей зрения, эти наблюдения следует интерпретировать с осторожностью и в совокупности с результатами вестерн-блоттинга и исследованиями in vitro.

Ряд процедурных этапов оказывает непропорционально сильное влияние на воспроизводимость. Интратекальная инъекция требует как характерного отклика хвоста, так и подтверждения наличия спинномозговой жидкости; сопротивление при введении, отсутствие подтверждения или возникновение нового неврологического дефицита должны стать основанием для исключения животного из исследования, а не для повторного введения в то же место. Поведенческое тестирование чувствительно к акклиматизации, условиям содержания в клетке, расположению стимула и ожиданиям исследователя, поэтому крайне важны ослепление, фиксированные интервалы и постоянные условия окружающей среды. Время сбора тканей, равномерный перенос белков, инкубация антител и идентичные настройки микроскопии в рамках каждой серии окрашивания имеют не меньшее значение. К распространенным проблемам относятся вариативность порогов отдергивания из-за недостаточной акклиматизации, слабые или неравномерные полосы в вестерн-блоте вследствие неполного переноса или переэкспонирования, а также высокий фон флуоресценции из-за недостаточной промывки, избыточной концентрации антител или насыщенных настроек регистрации сигнала.

Протокол может быть модифицирован в зависимости от поставленного научного вопроса. При изучении поздних глиальных ответов может быть использован более широкий временной интервал, а при приоритете трансляционной применимости могут быть добавлены подбор доз или альтернативные пути введения. По сравнению с моделями воспалительной или нейропатической боли, модель разреза подошвы относительно быстрая и практичная, и она воспроизводит определенное послеоперационное повреждение²⁷. Сочетание поведенческого тестирования, вестерн-блоттинга и клеточной иммунофлуоресценции дает взаимодополняющую функциональную, молекулярную и пространственную информацию; однако такой подход более ресурсозатратен, чем анализ с одной конечной точкой, и сам по себе не устанавливает клеточно-специфическую причинно-следственную связь. Фармакологическое сравнение с U0126 усиливает интерпретацию сигнального пути, но остается менее специфичным, чем генетические манипуляции или манипуляции, селективные по типу клеток^{20,21,22,23,24,25}.

Перспективы дальнейшего применения включают тестирование обеих групп по полу, моделирование более обширных хирургических повреждений, использование клинически применимых путей введения препаратов, дополнительные временные точки послеоперационного наблюдения, а также вмешательства, направленные на конкретные популяции глиальных клеток. Данный рабочий процесс удобен для скрининга потенциальных анальгетиков или препаратов, модулирующих активность глии, так как модель разреза выполняется быстро, поведенческие конечные точки воспроизводимы, а молекулярные анализы основаны на стандартных лабораторных методах. Тем не менее, воспроизводимость результатов зависит от заранее определенных критериев исключения, слепого метода оценки результатов, единообразия получения изображений, а также полной отчетности по исходным данным и параметрам анализа.

Ограничения

Данное исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, модель разреза подошвенной поверхности лапы представляет собой относительно незначительную хирургическую травму и может не полностью отражать более масштабные хирургические вмешательства, такие как торакотомия или лапаротомия. Следовательно, при экстраполяции полученных результатов на другие формы послеоперационной боли следует соблюдать осторожность. Кроме того, в исследование были включены только самцы крыс Sprague–Dawley, что ограничивает возможность обобщения этих выводов для обоих полов. Учитывая известные половые различия в болевых реакциях, анальгетическом эффекте и паттернах активации глии, обосновано проведение дальнейших исследований с участием самок животных.

Основные молекулярные и гистологические наблюдения были сосредоточены на временной точке через 4 ч после разреза. Поскольку различные конечные показатели, включая GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 и поведенческие результаты, продемонстрировали разные временные профили после разреза, механистическая интерпретация полученных результатов должна быть ограничена главным образом ранним послеоперационным этапом. Кроме того, молекулярные эксперименты в данной работе были проведены с относительно ограниченным объемом выборки, что потенциально снижает статистическую достоверность этих наблюдений.

Внеклеточная сигнал-регулируемая киназа 1 и 2 оценивались совместно как p-ERK1/2; их индивидуальный вклад не изучался отдельно. Следовательно, в данном исследовании не удалось определить соответствующие роли ERK1 и ERK2 в процессах болевой чувствительности, вызванной разрезом. Кроме того, количественная оценка интенсивности флуоресценции основывалась на ограниченном количестве животных и полей обзора и не включала стереологический подсчет клеток или расчет формальных коэффициентов колокализации. Таким образом, данные наблюдения следует интерпретировать с осторожностью, совместно с результатами вестерн-блоттинга.

Наконец, несмотря на то что эксперименты по спасению астроцитов in vitro предоставили механистическое подтверждение регуляции воспалительных медиаторов через ERK1/2, вышележащие регуляторные события после разреза и нижележащие события в интактной ткани спинного мозга не были изучены детально. Система культурации in vitro также не может полностью воспроизвести взаимодействия между нейронами, астроцитами, микроглией и инфильтрирующими иммунными клетками в задних рогах спинного мозга. Соответственно, настоящее исследование подтверждает механизм, связанный с ERK1/2, но не устанавливает полную клеточно-специфическую причинно-следственную связь in vivo.

Заключение

Настоящее исследование демонстрирует, что вызванное разрезом повышение экспрессии NeuN, GFAP и Iba-1 в спинном мозге ослаблялось при предоперационном интратекальном введении PPF. Этот эффект сопровождался облегчением острой механической и термической гипералгезии, а также снижением фосфорилирования ERK1/2 и экспрессии TNF-α и COX-2 после разреза. Тем не менее, эти данные подтверждают (хотя и не предоставляют окончательного механистического доказательства) связь между антигипералгезическим эффектом PPF и снижением фосфорилирования ERK1/2 в глиальных клетках спинного мозга (в сочетании со снижением экспрессии воспалительных медиаторов). Антигипералгезический эффект PPF сохранялся на протяжении всего периода наблюдения после разреза, в то время как эффект ингибитора MEK1/2 U0126 был ограничен преимущественно ранним послеоперационным периодом. Эти результаты позволяют предположить, что сигнализация ERK1/2 может быть особенно значима на ранних стадиях развития послеоперационной боли. Более продолжительный эффект PPF указывает на то, что его механизм действия может включать дополнительные пути, помимо одного лишь ингибирования ERK1/2. Таким образом, PPF может представлять собой потенциальный вариант терапевтического вмешательства, а не биологическую мишень, для улучшения купирования острой послеоперационной боли.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,01 М фосфатно-солевой буфер (PBS)	Solarbio	P1020
1,0 М трис-HCl буфер (pH 6,8)	Solarbio	T1020
1,5 М Трис-HCl буфер (pH 8,8)	Solarbio	T1010
10% раствор додецилсульфата натрия (ДСН)	Solarbio	S1010
10× Стоковый раствор TBST	Solarbio	T1081
30%-й акриламид	Solarbio	A1010
4× буфер для нанесения белков	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Персульфат аммония	Solarbio	A1030
Автоматическая машина для производства чешуйчатого льда	Чаншу Сюэкэ	IMS-40
Бычий сывороточный альбумин (БСА)	Solarbio	A8020
Криостат CM150	Leica	CM150
Цифровой pH-метр	—	PHS-3C
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Solarbio	D8371
Электронные аналитические весы	Кэни	—
Реагент для усиленной хемилюминесценции (ECL)	Solarbio	PE0010
Видеоролик	Kodak	—
Флуоресцентный микроскоп DP71	Olympus	DP71
Среда для заливки крио срезов	Сакура	4583
Аппарат для гель-электрофореза	BIO-RAD	—
Глицерин	Solarbio	IG0910
Глицин	Solarbio	G8200
вторичные антитела козьи антимышиные Alexa Fluor 594	Proteintech	SA00013-3
вторичные антитела (козьи антимышиные), конъюгированные с пероксидазой хрена	ZSGB-BIO	ZB2305
вторичные антитела (коза анти-кролик), конъюгированные с Alexa Fluor 488	Proteintech	SA00013-2
вторичные антитела (козьи антикроличьи), конъюгированные с пероксидазой хрена	ZSGB-BIO	ZB2301
Сыворотка козы	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	Программное обеспечение GraphPad	5
Высокоскоростная центрифуга с охлаждением 3K15	Sigma	3K15
Горизонтальный орбитальный шейкер TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	Национальные институты здравоохранения	1.51j8
Метанол	Tianjin Guangfu	—
Первичные мышиные антитела к GAPDH крысы	Proteintech	60004-1-Ig
Первичные антитела мышиные к p-ERK1/2 крысы	CST	9101S
Na2HPO3	Тяньцзинь Бэйчэнь Фанчжэн	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Параформальдегид	Biosharp	BL539A
Микроскопические предметные стекла патологоанатомического качества	Шитай	—
Фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ)	Beyotime	ST506
Подошвенный тест 37370	УГО БАЗИЛЕ	37370
Поливинилиденфторидная мембрана	Solarbio	—
Пропентофиллин (PPF)	Taosu	T19812
Первичные антитела кролика к COX-2 крысы	Abcam	Ab179800
Первичные антитела к GFAP крысы (кроличьи)	Proteintech	16825-1-AP
Первичные антитела к Iba-1 крысы (кроличьи)	Proteintech	10904-1-AP
Первичные антитела кролика к крысиному NeuN	Abcam	Ab279297
Первичные антитела к крысиному t-ERK1/2, кроличьи	Proteintech	11257-1-AP
кроличьи антитела к крысиному TNF-α первичные антитела	Proteintech	29652-1-AP
Буфер для лизиса RIPA	Solarbio	R0010
SDS (додецилсульфат натрия)	Solarbio	S8010
Обезжиренное сухое молоко	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД)	Solarbio	T8090
Трис	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Низкотемпературный морозильник	Haier	—
Низкотемпературный морозильник	Sanyo	—
Система очистки воды до сверхчистого состояния	Heal Force	—
волокна фон Фрея	North Coast Medical	—