Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Пропентофиллин облегчает послеоперационную гипералгезию путем регуляции фосфорилирования ERK1/2 в астроцитах и микроглии спинного мозга

36 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70927

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании изучается влияние пропентофиллина, вводимого интратекально, на ослабление разреза-индуцированной гипералгезии, а также связь этого эффекта с изменениями спинальных глиальных маркеров и фосфорилированием внеклеточной сигнал-регулируемой киназы 1 и 2 у крыс.

Аннотация

Спинальные астроциты, микроглия и внеклеточная сигнал-регулируемая киназа 1 и 2 (ERK1/2) участвуют в процессах обработки болевых сигналов. В данном исследовании изучалось, ослабляет ли предоперационное интратекальное введение пропентофиллина (PPF) острую инцизионную гипералгезию у крыс и связан ли этот эффект с маркерами спинальной глии и фосфорилированием ERK1/2. Шестьдесят шесть самцов крыс линии Sprague–Dawley были случайным образом распределены в группы: контрольную (blank), группу с инцизионной болью, группу физиологического раствора, группу диметилсульфоксида, группу PPF и группу U0126. Механическая и термическая гипералгезия оценивались на исходном уровне, а также через 2, 4, 8, 24 и 72 ч после разреза. Спинальные нейрональные и глиальные маркеры, p-ERK1/2 и воспалительные медиаторы оценивались методами вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции. Дополнительно проводились эксперименты на первичных спинальных астроцитах для изучения ERK1/2-зависимого высвобождения воспалительных медиаторов. Предоперационное интратекальное введение PPF ослабляло механическую и термическую гипералгезию на протяжении всего 72-часового периода наблюдения, в то время как U0126 ослаблял гипералгезию преимущественно в ранний послеоперационный период. Через 4 ч после разреза оба вида терапии были связаны со снижением экспрессии спинальных GFAP, Iba-1 и p-ERK1/2, а также со снижением иммунореактивности TNF-α и COX-2. В культивируемых астроцитах PPF снижал индуцированное LPS высвобождение воспалительных медиаторов, тогда как конститутивно активная ERK1/2 ослабляла этот эффект. Эти результаты подтверждают связь между антигипералгетическим действием PPF и модуляцией спинальных глиальных, ERK1/2-зависимых и воспалительных реакций после разреза.

Введение

Послеоперационная боль в области разреза, распространенный вид острой боли после хирургических процедур, обычно не длится более 7 дней, однако имеет сложные патологические механизмы, которые отличаются от механизмов воспалительной и нейропатической боли1,2. При недостаточном контроле боли в области разреза в процессе ее развития она может привести к развитию синдрома хронической боли, а ее характер может измениться с боли при остром повреждении тканей на нейропатическую или смешанную боль3. Как правило, наиболее распространенным методом обезболивания после разреза является назначение анальгетиков, таких как опиоиды и нестероидные противовоспалительные препараты. Однако при их постоянном применении или использовании в высоких дозах могут возникнуть многочисленные побочные эффекты, что подчеркивает необходимость разработки более безопасных и эффективных стратегий анальгезии.

Надежные данные свидетельствуют о том, что пропентофиллин (PPF) облегчает гипералгезию при различных болевых процессах4,5. Более того, анальгезирующий эффект PPF может быть частично достигнут путем ингибирования спинальной экспрессии митогенактивируемых протеинкиназ (MAPK), таких как p38 и c-Jun N-терминальные киназы (JNK)6. Хотя влияние PPF на пути p38 и JNK было установлено, его потенциальная модуляция пути внеклеточных сигнал-регулируемых киназ 1 и 2 (ERK1/2) — еще одного критического подсемейства MAPK, участвующего в передаче болевых сигналов, — остается неизученной при острой послеоперационной боли. Этот пробел в знаниях особенно важен, учитывая, что активация ERK1/2 демонстрирует иные временные и клеточные закономерности по сравнению с p38 и JNK, что указывает на потенциально уникальные терапевтические возможности.

Считалось, что глиальные клетки, включая астроциты, микроглию и олигодендроциты, изначально выполняют лишь функцию соединения и поддержки нервной ткани. Однако последние исследования показали, что астроциты и микроглия играют важную роль в регуляции синаптической пластичности и передаче болевых сигналов7. Будучи резидентными макрофагами головного и спинного мозга, клетки микроглии могут активироваться под воздействием нескольких внеклеточных стимулов на самых ранних этапах болевого процесса, после чего они пролиферируют и высвобождают большое количество воспалительных цитокинов, что усиливает проведение болевых сигналов от спинного мозга к мозгу8,9. Одновременно с этим активированные астроциты могут усиливать высвобождение возбуждающего нейромедиатора глутамата и передавать информацию непосредственно сенсорным нейронам, улучшая межклеточную коммуникацию10.

Исследования показали, что активация астроцитов происходит на ранней стадии (в течение первых 24 ч) боли, вызванной разрезом, в то время как активация микроглии проявляется гораздо позже11,12. Кроме того, одно исследование указало на то, что активированная микроглия оказывает ограниченное влияние на механическую гиперalгезию при боли, вызванной разрезом13. Эти результаты подчеркивают наличие актуальных вопросов о различных ролях астроцитов и микроглии при острой боли. Сообщалось, что пропентофиллин, модулирующий глию агент, облегчает гиперalгезию, регулируя активацию астроцитов и микроглии после хронического констриктивного повреждения нерва, острого повреждения нерва и острого повреждения тканей4,5. Однако, насколько известно на данный момент, ни в одном исследовании не изучалось влияние PPF на активацию астроцитов или микроглии при острой боли, вызванной разрезом.

Внеклеточная сигнал-регулируемая киназа 1 и 2, основное подсемейство MAPK, активируемое ниже по каскаду от митоген-активируемой протеинкиназы 1 и 2 (MEK1/2), играет важную роль в ноцицептивной обработке и нейронной пластичности14,15. Предыдущие исследования показали, что фосфо-ERK1/2 (p-ERK1/2) может индуцироваться в нейронах спинного мозга при ноцицептивной стимуляции, а также обнаруживаться в астроцитах и микроглии при воспалительной или нейропатической боли16,17,18,19. Кроме того, сообщалось, что фармакологическое ингибирование сигналинга MEK1/2–ERK1/2 ослабляет механическую и термическую гипералгезию в нескольких моделях боли20,21,22,23,24,25.

Однако клеточное распределение спинальных ERK1/2, в частности в астроцитах и микроглии, активируемых острым разрезом, а также их роль в боли, вызванной разрезом, остаются недостаточно определенными. Предыдущие исследования данной исследовательской группы указывают на то, что PPF облегчает острую инцизионную гипералгезию у крыс, снижая передачу сигналов JNK и p38 в спинном мозге, однако остается неясным, модулирует ли PPF также ERK1/2-зависимую сигнализацию в глиальных клетках спинного мозга при боли, вызванной разрезом. Таким образом, настоящее исследование следует рассматривать как расширение существующих концепций роли глии и MAPK в исследованиях боли, а не как полностью независимую механистическую парадигму. Его основное отличие от предыдущих работ заключается в специфическом фокусе на острой инцизионной боли, изучении ERK1/2 (а не p38/JNK) как интересующего компонента MAPK, а также в оценке раннего клеточного распределения p-ERK1/2 в спинном мозге в связи с применением PPF.

Данное исследование было направлено на изучение того, ослабляет ли предоперационное интратекальное введение PPF инцизионную гипералгезию на модели разреза подошвенной поверхности лапы крысы, и связан ли этот эффект с фосфорилированием ERK1/2 или изменениями в экспрессии спинальных нейрональных и глиальных маркеров, а также воспалительных медиаторов — фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и циклооксигеназы-2 (COX-2). В частности, данная работа отличается от предыдущих отчетов сочетанием поведенческой оценки с временным анализом методом вестерн-блоттинга, фармакологическим сравнением с ингибитором MEK1/2 U0126 и качественной иммунофлуоресцентной локализацией p-ERK1/2 в нейронах спинного мозга, астроцитах и микроглии в модели острой инцизионной боли. Хотя ее механизм основан на предыдущих данных, связывающих модуляцию глии и сигнализацию MAPK с болью, настоящая работа призвана предоставить дополнительные доказательства возможной роли спинальных глиальных ответов, связанных с ERK1/2, в ранней фазе инцизионной гипералгезии.

По сравнению с традиционными послеоперационными анальгетиками, подходы, нацеленные на конкретные сигнальные пути, позволяют проверить определенный компонент сигналинга, однако могут обеспечивать лишь ограниченный по времени эффект и требовать инвазивного введения; ингибирование MEK1/2–ERK1/2 продемонстрировало антигиперальгетическое действие в нескольких экспериментальных моделях боли20,21,22,23,24,25. PPF отличается от ингибиторов одного пути тем, что он модулирует глиальные ответы и связан с более чем одним процессом, опосредованным MAPK4,5,6. Практическое применение метода по-прежнему ограничено дизайном доклинических исследований, предоперационным интратекальным введением, использованием только самцов крыс, а также отсутствием исследований зависимости «доза-эффект» и безопасности на более крупных хирургических моделях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Проведенные эксперименты были одобрены комитетом по этике Второй аффилированной больницы Ланьчжоуского университета, провинция Ганьсу, Китай (номер этического одобрения 2017-070). Все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Международной ассоциации по изучению боли26. В исследовании было использовано в общей сложности 66 взрослых самцов крыс линии Sprague–Dawley весом 200–250 g, полученных из аккредитованного центра лабораторных животных. Для снижения потенциальной вариабельности, связанной с половыми гормональными влияниями, в данное исследование были включены только самцы. Все протоколы выполнялись в соответствии с рекомендациями Международной ассоциации по изучению боли26, и были предприняты необходимые меры для минимизации страданий животных. Подробная информация о реагентах, расходных материалах, приборах и программном обеспечении, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

Животные

Крысы содержались парами до операции и по отдельности после разреза; корм и вода предоставлялись ad libitum. В помещении поддерживался 12-часовой цикл свет–тьма, температура воздуха составляла 24 °C ± 2 °C.

Интратекальное введение и модель инцизионной боли

Для интратекального введения растворов крыс анестезировали 1,5%–3% севофлураном (подаваемым через носовую маску) и помещали в брюшном положении с согнутым позвоночником. Шерсть в поясничной области выбривали, а кожу над межпозвоночным пространством L5–L6 дезинфицировали. Микрошприц вводили перкутанно в межпозвоночное пространство L5–L6. Об успешном проникновении в субарахноидальное пространство свидетельствовал внезапный вздрагивание или движение хвоста при продвижении иглы, что дополнительно подтверждалось появлением спинномозговой жидкости при осторожной аспирации. Если эти признаки не наблюдались, положение иглы корректировали перед инъекцией. Введение препарата осуществлялось только после выполнения обоих критериев подтверждения; животные с аномальными неврологическими признаками после инъекции исключались из исследования. Затем медленно вводили соответствующий раствор, после чего кожу снова очищали. Хирургическая процедура длилась примерно 3 min, и крысы обычно выходили из наркоза в течение 5–10 min.

Модель инцизионной боли у крыс была создана согласно ранее описанному методу27. После проведения анестезии подошвенную поверхность задней лапы дезинфицировали 10% раствором повидон-йода. В коже подошвы выполняли продольный разрез длиной 1 cm, начиная примерно в 0.5 cm от пятки в направлении пальцев. Разрез проходил через кожу и фасцию. Подошвенную мышцу осторожно приподнимали офтальмологическим пинцетом и рассекали продольно, сохраняя общую целостность тканей. Затем мышцу возвращали на место, накладывали легкое давление для достижения гемостаза, и рану закрывали двумя матрасными швами с использованием нейлоновой нити 3-0. После закрытия раны место разреза повторно дезинфицировали. После операции крыс содержали индивидуально, обеспечивая восстановление в тихой, теплой среде, в защищенном от яркого света месте, со свободным доступом к корму и воде. За животными проводили послеоперационный мониторинг, и тех, кто не соответствовал заранее определенным критериям, незамедлительно исключали из исследования. Инфекцию раны определяли по следующим признакам: покраснение, отек и повышение локальной температуры вокруг раны, патологический желто-зеленый гнойный экссудат с неприятным запахом, замедленное заживление с сохранением зияния раны, некроз и увеличение площади поражения, а также системные признаки, включая повышенную температуру тела, вялость и отказ от пищи. Дополнительные критерии исключения включали: отсутствие восстановления после анестезии в течение 30 min, интраоперационное полное пересечение мышцы или нейроваскулярное повреждение, послеоперационное членовредительство, неудачное создание модели и неврологический дефицит, такой как паралич задних конечностей или невозможность опираться на лапу, не связанная с инцизионной болью. Крыс с инфекцией раны или расхождением краев раны исключали из исследования.

Поведенческие измерения

Механический порог отдергивания лапы (PWMT) и латентный период термического отдергивания лапы (PWTL) измерял исследователь, не знавший о распределении животных по группам. Тестирование проводилось в тихом помещении в одно и то же время суток после как минимум 10 min акклиматизации; параметры контейнера, тип пола (сетка или стекло), освещенность и интенсивность источника тепла оставались неизменными для всех групп. Для определения PWMT калиброванные нити фон Фрея (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g и 15.0 g) прижимали перпендикулярно к подошвенной поверхности рядом с раной до тех пор, пока нить не изгибалась примерно на 1–2 mm. Интервал между последовательными стимуляциями составлял 2 min; значение PWMT 50% определяли методом «вверх-вниз»28. Для определения PWTL крыс помещали в индивидуальные прозрачные контейнеры на стеклянный пол, при этом источник инфракрасного излучения совмещали с подошвенной поверхностью рядом с раной. Для предотвращения повреждения тканей установили ограничение по времени (cut-off) в 30 s; интервал между последовательными воздействиями составлял 2 min, и регистрировали среднее значение трех измерений29. Поднятие, встряхивание или вылизывание лапы считались положительной реакцией отдергивания; испытания, на которые повлияли уход за шерстью, движение или смещение относительно источника тепла, повторяли после повторной акклиматизации.

Вестерн-блот анализ

В установленное время крыс усыпляли путем перелома шейных позвонков, после чего быстро извлекали отделы L4–L6 поясничного отдела спинного мозга в буфер для лизиса RIPA (радиоиммунопреципитационного анализа), дополненный ингибитором протеаз в соотношении 100:1. Ткань гомогенизировали, выдерживали на льду в течение 20 min и центрифугировали при 15,000 × g в течение 20 min при 4 °C. Супернатант смешивали с 4× буфером для нанесения в соотношении 3:1, нагревали в кипящей воде в течение 5 min и хранили при −80 °C. Образцы белков (30 µg на дорожку) разделяли в 10% натрий-додецилсульфат-полиакриламидных гелях и переносили на поливинилиденфторидные мембраны с порами 0,45 или 0,22 µm. Успешность переноса проверяли по ожидаемой миграции предварительно окрашенного маркера молекулярной массы и отсутствию явных участков неравномерного или прерванного переноса. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком и 3% бычьим сывороточным альбумином в течение 2 h при комнатной температуре, затем инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами к NeuN (1:8,000), GFAP (1:4,000), Iba-1 (1:3,000), p-ERK1/2 (1:1,000), t-ERK1/2 (1:3,000) или GAPDH (1:2,000). После промывки в трис-солевом буфере, содержащем 0,05% Tween 20 (pH 7.4), мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:5,000), в течение 1 h при комнатной температуре. Сигналы визуализировали методом усиленной хемилюминесценции и регистрировали на пленке, используя одинаковый диапазон экспозиции для каждой мишени. Исследователь, не знавший о распределении по группам, анализировал плотность полос с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Изображения переводили в 8-битный градиент серого, к каждой полосе применяли идентичную прямоугольную область интереса, вычитали локальный фон из соседней пустой области и регистрировали интегральную плотность. Один и тот же размер области и процедура вычитания фона использовались для всех дорожек на одном блоте. Уровни NeuN, GFAP, Iba-1 и t-ERK1/2 нормировали по GAPDH; уровень p-ERK1/2 нормировали по t-ERK1/2; затем значения выражали относительно контрольной группы.

Иммунофлуоресценция

В установленные моменты времени крыс анестезировали 3% раствором пентобарбиталя натрия (1,5 mL/kg) и подвергли перфузии через сердце 300 mL предварительно охлажденного 0,01 mol/L фосфатно-солевого буфера (PBS; pH 7,4) с последующим введением 250 mL предварительно охлажденного 4% параформальдегида. Участок спинного мозга L4–L6 подвергали дофиксации в 4% параформальдегиде в течение 6 ч, криопротекции в течение ночи в 20%–30% растворе сахарозы в PBS при 4 °C и нарезали на срезы толщиной 10 µm при −22 °C. Срезы промывали в 0,01 mol/L PBS, блокировали в 10% сыворотке козы в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами против NeuN (1:100), GFAP (1:1 000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) или COX-2 (1:50). После трех промывок в PBS срезы инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с зеленым или красным флуорофором (1:400), в течение 1 ч при комнатной температуре, затем промывали в PBS еще три раза и заключали в антифейдинговый medium под покровное стекло. В каждую серию окрашивания включали срезы отрицательного контроля, обработанные без первичных антител. Снимки получал исследователь, не знавший принадлежности образцов, с помощью флуоресцентного микроскопа. Обзорные изображения с низким увеличением получали с использованием объектива 10×, тогда как изображения клеточной иммунореактивности и колокализации получали с использованием объективов 20× или 40× в соответствии с соответствующей панелью рисунка. Для сравнений в пределах одного рисунка и одной серии окрашивания увеличение объектива, интенсивность освещения, время экспозиции, усиление детектора, настройки камеры и параметры обработки изображений были фиксированы после оптимизации ниже уровня насыщения. Отдельные флуоресцентные каналы регистрировали последовательно для минимизации перекрытия каналов. Для каждого животного захватывали три неперекрывающихся поля в ипсилатеральном заднем роге. Интенсивность флуоресценции количественно определяли с помощью программного обеспечения для анализа изображений после 8-битного преобразования, вычитания фона с использованием бесклеточной области и применения идентичной области интереса и порога в каждой серии окрашивания; значения полей усредняли для получения одного значения на животное. Поля с переэкспозицией, складками ткани, разрывами, плохим фокусом или неравномерным фоном исключались и переснимались при тех же ненасыщающих настройках. Окрашивание считалось приемлемым, если архитектура ткани была неповрежденной, целевой сигнал превышал сигнал контроля без первичных антител и анализ не затрагивали значительные складки, разрывы или области насыщения.

In vitro эксперименты с первичными астроцитами спинного мозга

Первичные астроциты спинного мозга крыс культивировали в стандартных стерильных условиях в полной питательной среде при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Клетки использовали при достижении примерно 70%–80% конфлюэнтности, распределяя их по группам: контрольной, стимулированной LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 и группе с восстановлением функции ERK1/2. PPF и U0126 добавляли в концентрации 10 µM. Условия стимуляции LPS, обработки препаратами и сбора образцов были идентичны для параллельных лунок в каждом эксперименте. Для анализа селективности путей собирали лизаты клеток для проведения вестерн-блоттинга на p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, общий p38, p-JNK, общий JNK и соответствующий контроль загрузки. Супернатанты культур из параллельных лунок собирали, осветляли путем центрифугирования и анализировали на содержание TNF-α, PGE2 и IL-6 с помощью иммуноферментного анализа согласно инструкциям производителя. Денситометрия вестерн-блоттинга проводилась по тем же принципам анализа изображений, что описаны выше. Для экспериментов по восстановлению функции эндогенный ERK1/2 подавляли с помощью трансфекции siRNA, а перед началом обработки вводили экспрессионную конструкцию конститутивно активного ERK1/2 (CA-ERK1/2). Эффективность нокдауна и гиперэкспрессии подтверждали методом вестерн-блоттинга перед интерпретацией данных по цитокинам. Клетки, подвергнутые воздействию реагента для трансфекции без активной siRNA или конструкции, использовали в качестве процедурного контроля, где это было применимо.

Дизайн эксперимента

Разделение экспериментальных животных на подгруппы

Крысы были разделены на шесть групп с помощью метода таблицы случайных чисел; распределение по группам было завершено до начала поведенческого тестирования и сбора тканей. Шесть групп включали контрольную группу (n = 6), группу с инцизионной болью (IP) (n = 18), группу с физиологическим раствором (NS) (0,9% NS, 10 µL; n = 9), группу PPF (10 µg в 10 µL; n = 12), группу диметилсульфоксида (DMSO) (10% DMSO, 10 µL; n = 9) и группу U0126 (10 µg в 10 µL; n = 12). Крысы контрольной группы не подвергались ни подошвенному разрезу, ни интратекальному введению и служили необработанным контролем. Крысы в группе IP подверглись подошвенному разрезу без предварительного интратекального введения препаратов. Крысы в группах NS, PPF, DMSO и U0126 получали соответствующие препараты интратекально за 30 мин до подошвенного разреза. Группа NS служила контролем растворителя для PPF, в то время как группа DMSO служила контролем растворителя для U0126.

Дозы пропентофиллина и U0126

Пропентофиллин является модулятором глиальных клеток; доза 10 µg была выбрана на основании результатов предыдущих исследований данной научной группы, в которых эта доза облегчала острую гипералгезию. U0126 представляет собой неконкурентный по отношению к аденозинтрифосфату ингибитор MEK1/2, используемый для блокирования фосфорилирования ERK1/2. В различных моделях боли сообщалось об эффективности интратекальных доз в диапазоне 1–10 µg30,31,32; в настоящем исследовании использовалась доза 10 µg. U0126 растворяли в 10% диметилсульфоксиде, в то время как PPF растворяли в 0,9% физиологическом растворе. Конечные концентрации составляли 1 µg/µL. Препараты и растворители готовили перед операцией, хранили при 4 °C и использовали в течение 12 h.

Влияние предоперационного интратекального введения пропентофиллина или U0126 на гипералгезию

За 24 ч до операции шесть крыс из каждой группы были случайным образом отобраны для поведенческих измерений; полученные значения PWMT и PWTL были приняты за базовый уровень. Интратекальные инъекции проводились за 30 мин до операции. Для оценки влияния предоперационного интратекального введения PPF и U0126 на механическую и термическую гипералгезию значения PWMT и PWTL оценивали через 2 ч, 4 ч, 8 ч, 24 ч и 72 ч после разреза.

Экспериментальный план оценки влияния предоперационного интратекального введения пропентофиллина или U0126 на экспрессию спинальных нейрональных и глиальных маркеров после выполнения разреза

Для определения подходящего момента времени после разреза для оценки эффекта лечения сначала был проведен предварительный анализ временного курса в группе IP. В частности, крыс в группе IP усыпляли через 2 ч, 4 ч, 24 ч и 72 ч после разреза, и уровни экспрессии клеточных маркеров NeuN, GFAP и Iba-1 в спинном мозге измеряли методом вестерн-блоттинга (n = 3 для каждой временной точки). На основании этого предварительного анализа первые 4 ч после разреза были выбраны в качестве окна раннего наблюдения, поскольку экспрессия NeuN достигла своего максимального уровня в точке 4 ч, а ранние молекулярные изменения были признаны наиболее значимыми для первоначального развития инцизионной гипералгезии. Тем не менее, временная точка 4 ч не предназначалась для репрезентации всех временных молекулярных изменений после разреза.

В этот выбранный момент времени крысы, которым вводили интратекальную инъекцию, были подвергнуты эвтаназии для проведения вестерн-блот-анализа различных клеточных маркеров (n = 3 на группу) и оценки морфологии различных типов клеток методом иммунофлуоресценции (n = 3 на группу). В контрольной группе (blank group) крыс забивали случайным образом для определения базовых уровней экспрессии различных клеточных маркеров (NeuN, GFAP и Iba-1) в спинном мозге с помощью вестерн-блоттинга (n = 3) и анализа морфологии различных клеток (нейронов, астроцитов и микроглии) методом иммунофлуоресценции (n = 3). Таким образом, контрольная группа служила базовым контролем без проведения разрезов и лечения.

Эффекты воздействия на спинальный p-ERK1/2 и воспалительные медиаторы

Для определения подходящего момента времени после разреза для оценки влияния лечения на экспрессию p-ERK1/2 и уровни воспалительных цитокинов сначала был проведен предварительный анализ временной динамики в группе IP. В частности, крысы в группе IP подвергались эвтаназии через 2 h, 4 h, 24 h и 72 h после разреза, и экспрессия спинального p-ERK1/2 измерялась методом вестерн-блоттинга (n = 3 на каждый временной интервал). На основании этого эксперимента по изучению временной динамики, а также момента времени, когда экспрессия NeuN после разреза была максимальной, интервал 4 h после разреза был выбран в качестве фиксированной временной точки для последующей оценки влияния предоперационного интратекального введения PPF или U0126 на экспрессию спинального p-ERK1/2 и воспалительные цитокины. Эта временная точка была выбрана как окно для раннего механистического наблюдения, а не как исчерпывающее представление всех временных изменений после разреза.

В этот выбранный временной точке крысы, которым была введена интратекальная инъекция, были подвергнуты эвтаназии для проведения вестерн-блот-анализа экспрессии p-ERK1/2 (n = 3 на группу) и иммунофлуоресцентной оценки воспалительных цитокинов (n = 3 на группу). В контрольной группе (blank group) крыс усыпляли случайным образом для определения базовых уровней экспрессии p-ERK1/2 в спинном мозге методом вестерн-блоттинга (n = 3) и уровней воспалительных цитокинов (TNF-α и COX-2) методом иммунофлуоресценции (n = 3). Таким образом, контрольная группа служила базовым контролем без проведения разрезов и лечения.

Клеточная локализация спинального p-ERK1/2 в нейронах, астроцитах и микроглии

Для дальнейшей оценки клеточного распределения спинального p-ERK1/2 после разреза через 4 ч после процедуры (n = 3) в группах Blank и IP было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Размер выборки был определен с учетом предыдущих исследований данной исследовательской группы и предварительных экспериментов. Поведенческие данные анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с повторными измерениями, где групповой фактор был межсубъектным, а временной — внутрисубъектным. Данные вестерн-блоттинга в динамике оценивали с помощью однофакторного ANOVA с последующим попарным сравнением с поправкой Бонферрони. Данные вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции в фиксированные моменты времени оценивали с помощью однофакторного ANOVA с запланированными сравнениями с поправкой Бонферрони; сравнения двух групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Нормальность распределения и гомогенность дисперсии оценивали с помощью тестов Шапиро–Уилка и Левена соответственно. Двусторонний pзначение p < Значение 0,05 считалось статистически значимым. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для статистического анализа, перечисленного в Таблица материаловДля in vitro в экспериментах с астроцитами единицей анализа считались эксперименты с независимыми культурами; денситометрия вестерн-блоттинга и концентрации цитокинов сравнивались с использованием однофакторного ANOVA с последующими запланированными сравнениями с поправкой Бонферрони или t-критерием Стьюдента t-критерий для заранее определенных сравнений двух групп, где это применимо.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Данные, подтверждающие результаты этого исследования, представлены в Дополнительном файле 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Влияние разреза и предоперационного интратекального введения пропентофиллина или U0126 на гипералгезию после разреза

Механическая гипералгезия

Значимых различий в PWMT между шестью группами за 24 ч до операции не наблюдалось (p > 0.05; Рисунок 1A,B). В группе IP значение PWMT снизилось после разреза и оставалось значимо ниже исходного уровня в период от 2 ч до 72 ч после разреза (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Большинство пациентов после хирургического вмешательства страдают от острой боли, которая проявляется не только физически, но порой и психологически33, однако детальные механизмы развития острой послеоперационной боли до сих пор изучены недостаточно. Сильный эффект анальгетиков сопровождается неизбежными побочными эффектами, что делает поиск более безопасных и эффективных обезболивающих средств критически важным. Данное исследование основывалось на ранее валидированной модели разреза у крыс для им...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии личного, финансового, коммерческого или академического конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Хайцзяо Чжоу и Мин Вана за техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,01 М фосфатно-солевой буфер (PBS)SolarbioP1020
1,0 М трис-HCl буфер (pH 6,8)SolarbioT1020
1,5 М Трис-HCl буфер (pH 8,8)SolarbioT1010
10% раствор додецилсульфата натрия (ДСН)SolarbioS1010
10× Стоковый раствор TBSTSolarbioT1081
30%-й акриламидSolarbioA1010
4× буфер для нанесения белковSolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
Персульфат аммонияSolarbioA1030
Автоматическая машина для производства чешуйчатого льдаЧаншу СюэкэIMS-40
Бычий сывороточный альбумин (БСА)SolarbioA8020
Криостат CM150LeicaCM150
Цифровой pH-метр—PHS-3C
Диметилсульфоксид (ДМСО)SolarbioD8371
Электронные аналитические весыКэни—
Реагент для усиленной хемилюминесценции (ECL)SolarbioPE0010
ВидеороликKodak—
Флуоресцентный микроскоп DP71OlympusDP71
Среда для заливки крио срезовСакура4583
Аппарат для гель-электрофорезаBIO-RAD—
ГлицеринSolarbioIG0910
ГлицинSolarbioG8200
вторичные антитела козьи антимышиные Alexa Fluor 594ProteintechSA00013-3
вторичные антитела (козьи антимышиные), конъюгированные с пероксидазой хренаZSGB-BIOZB2305
вторичные антитела (коза анти-кролик), конъюгированные с Alexa Fluor 488ProteintechSA00013-2
вторичные антитела (козьи антикроличьи), конъюгированные с пероксидазой хренаZSGB-BIOZB2301
Сыворотка козыSolarbioSL038
GraphPad PrismПрограммное обеспечение GraphPad5
Высокоскоростная центрифуга с охлаждением 3K15Sigma3K15
Горизонтальный орбитальный шейкер TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJНациональные институты здравоохранения1.51j8
МетанолTianjin Guangfu—
Первичные мышиные антитела к GAPDH крысыProteintech60004-1-Ig
Первичные антитела мышиные к p-ERK1/2 крысыCST9101S
Na2HPO3Тяньцзинь Бэйчэнь Фанчжэн—
NaH2PO3Tianjin Damao—
ПараформальдегидBiosharpBL539A
Микроскопические предметные стекла патологоанатомического качестваШитай—
Фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ)BeyotimeST506
Подошвенный тест 37370УГО БАЗИЛЕ37370
Поливинилиденфторидная мембранаSolarbio—
Пропентофиллин (PPF)TaosuT19812
Первичные антитела кролика к COX-2 крысыAbcamAb179800
Первичные антитела к GFAP крысы (кроличьи)Proteintech16825-1-AP
Первичные антитела к Iba-1 крысы (кроличьи)Proteintech10904-1-AP
Первичные антитела кролика к крысиному NeuNAbcamAb279297
Первичные антитела к крысиному t-ERK1/2, кроличьиProteintech11257-1-AP
кроличьи антитела к крысиному TNF-α первичные антителаProteintech29652-1-AP
Буфер для лизиса RIPASolarbioR0010
SDS (додецилсульфат натрия)SolarbioS8010
Обезжиренное сухое молокоSolarbioD8340
SPSSIBM22
Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД)SolarbioT8090
ТрисSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
Низкотемпературный морозильникHaier—
Низкотемпературный морозильникSanyo—
Система очистки воды до сверхчистого состоянияHeal Force—
волокна фон ФреяNorth Coast Medical—

Ссылки

  1. Bateman C. Pain management—the global sound of silence. S Afr Med J. 2015;105:621-3.
  2. Pogatzki-Zahn EM, Segelcke D, Schug SA. Postoperative pain—from mechanisms to treatment. Pain Rep. 2017;2:e588.
  3. Kaiser U, Kopkow C, Deckert S, Neustadt K, Jacobi L, Cameron P, et al. Validation and application of a core set of patient-relevant outcome domains to assess the effectiveness of multimodal pain therapy (VAPAIN): a study protocol. BMJ Open. 2015;5:e008146.
  4. Tawfik VL, Nutile-McMenemy N, Lacroix-Fralish ML, DeLeo JA. Efficacy of propentofylline, a glial modulating agent, on existing mechanical allodynia following peripheral nerve injury. Brain Behav Immun. 2007;21:238-46.
  5. Wu F, Li H, Sun J, Li X, Jiang W, Huang Y, et al. Inhibition of GAP-43 by propentofylline in a rat model of neuropathic pain. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6:1516-22.
  6. Norsted Gregory E, Codeluppi S, Gregory JA, Steinauer J, Svensson CI. Pentoxifylline and propentofylline prevent proliferation and activation of the mammalian target of rapamycin and mitogen-activated protein kinase in cultured spinal astrocytes. J Neurosci Res. 2013;91:300-12.
  7. Ji RR, Chamessian A, Zhang YQ. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 2016;354:572-7.
  8. Grace PM, Hutchinson MR, Maier SF, Watkins LR. Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol. 2014;14:217-31.
  9. Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy? Pain. 2013;154 Suppl 1:S10-28.
  10. Chen G, Park CK, Xie RG, Ji RR. Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice. Brain. 2014;137:2193-209.
  11. Liu Y, Hou B, Zhang W, Wang D, Wang H, Yu G, et al. The activation of spinal astrocytes contributes to preoperative anxiety-induced persistent postoperative pain in a rat model of incisional pain. Eur J Pain. 2015;19(5):733-40.
  12. Obata H, Eisenach JC, Hussain H, Bynum T, Vincler M. Spinal glial activation contributes to postoperative mechanical hypersensitivity in the rat. J Pain. 2006;7:816-22.
  13. Masaki E, Mizuta K, Ohtani N, Kido K. Early postoperative nociceptive threshold and production of brain-derived neurotrophic factor induced by plantar incision are not influenced by minocycline in a rat: role of spinal microglia. Neurosignals. 2016;24:15-24.
  14. Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. 2011;75:50-83.
  15. Roskoski R Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66:105-43.
  16. Berta T, Liu YC, Xu ZZ, Ji RR. Tissue plasminogen activator contributes to morphine tolerance and induces mechanical allodynia via astrocytic IL-1β and ERK signaling in the spinal cord of mice. Neuroscience. 2013;247:376-85.
  17. Bi RY, Meng Z, Zhang P, Wang XD, Ding YQ, Gan YH, et al. Involvement of trigeminal ganglionic Nav1.7 in hyperalgesia of inflamed temporomandibular joint is dependent on ERK1/2 phosphorylation of glial cells in rats. Eur J Pain. 2013;17(7):983-94.
  18. Mikuzuki L, Saito H, Katagiri A, Okada S, Kubo A, Suzuki T, et al. Phenotypic change in trigeminal ganglion neurons associated with satellite cell activation via extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is involved in lingual neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2017;46:2190-202.
  19. Song Z, Xie W, Chen S, Strong JA, Print MS, Wang JI, et al. STAT1 as a downstream mediator of ERK signaling contributes to bone cancer pain by regulating MHC II expression in spinal microglia. Brain Behav Immun. 2017;60:161-73.
  20. Duncia JV, Santella JB III, Higley CA, Pitts WJ, Wityak J, Frietze WE, et al. MEK inhibitors: the chemistry and biological activity of U0126, its analogs, and cyclization products. Bioorg Med Chem Lett. 1998;8:2839-44.
  21. Ji RR, Gereau RW IV, Malcangio M, Strichartz GR. MAP kinase and pain. Brain Res Rev. 2009;60:135-48.
  22. Li F, Zhang H, Ma X, Zhang X, Wang Y, Zhang J, et al. Annexin A10 contributes to chronic constrictive injury-induced pain through activating ERK1/2 signalling in rats. Int J Neurosci. 2018;128(2):125-32.
  23. Qiu Q, Chai S, Jiang Z, Zhang Y, Liu X, Li M, et al. Propofol produces preventive analgesia via GluN2B-containing NMDA receptor ERK1/2 signaling pathway in a rat model of inflammatory pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917737462.
  24. van den Heuvel I, Reichl S, Segelcke D, Zahn PK, Pogatzki-Zahn EM. Selective prevention of mechanical hyperalgesia after incision by spinal ERK1/2 inhibition. Eur J Pain. 2015;19(2):225-35.
  25. Zhang YB, Guo Y, Li H, Wang LN. Gabapentin effects on PKC-ERK1/2 signaling in the spinal cord of rats with formalin-induced visceral inflammatory pain. PLoS One. 2015;10:e0141142.
  26. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 1983;16:109-10.
  27. Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 1996;64:493-9.
  28. Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1980;20:441-62.
  29. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988;32:77-88.
  30. Hao J, Chen H, Madigan MC, Coote JH, Zhang Y, Xu XJ, et al. Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia. Neuroscience. 2008;152:1067-75.
  31. Wang LN, Yao M, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, et al. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in the rat spinal cord. Mol Pain. 2011;7:48.
  32. Yang F, Sun W, Yang Y, Wang Y, Li CL, Fu H, et al. SDF1-CXCR4 signaling contributes to persistent pain and hypersensitivity via regulating excitability of primary nociceptive neurons: involvement of ERK-dependent Nav1.8 up-regulation. J Neuroinflammation. 2015;12:219.
  33. Apfelbaum JL, Chen C, Mehta SS, Gan TJ. Postoperative pain experience: results from a national survey suggest postoperative pain continues to be undertreated. Anesth Analg. 2003;97:534-40.
  34. Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10:895-926.
  35. Zhuang ZY, Gerner P, Woolf CJ, Ji RR. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model. Pain. 2005;114:149-59.
  36. Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 2005;6:521-32.
  37. Bath PM, Bath-Hextall FJ. Pentoxifylline, propentofylline and pentifylline for acute ischemic stroke. Cochrane Database Syst Rev. 2004;3:CD000162.
  38. Cui XY, Chen Y, Chen J, Ma ZL, Zhao YL, Li YQ, et al. Differential activation of p38 and extracellular signal-regulated kinase in spinal cord in a model of bee venom-induced inflammation and hyperalgesia. Mol Pain. 2008;4:17.
  39. Ji RR. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. J Neurosci. 2002;22:478-85.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Микроглия спинного мозгалечение пропентофиллиноммеханическая гипералгезиятермическая гипералгезиявестерн-блоттингиммунофлуоресцентный анализмедиаторы воспаления
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.