Методическая статья

Идентификация модифицированных гистонов в качестве связывающих субстратов члена семейства Спиндлин человека 4 (SPIN4) с помощью пептидных массивов и нативного вытягивания нуклеосом

DOI:

10.3791/70934

⸱

27 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетические варианты у человека с членом семейства Спиндлин 4 (SPIN4) недавно были выявлены у пациентов с избыточным ростом костей — новым расстройством развития. Представлен протокол и новые результаты, описывающие биохимическую идентификацию модифицированных гистонов в контексте нуклеосом как субстратов, связывающих SPIN4.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Член семейства 4 человеческих спиндлинов (SPIN4) только что стал новым регулятором роста костей. Варианты потери функции в SPIN4 были выявлены у пациенток с синдромом пре- и после родового избыточного роста, который наследует X-сцепленную доминантную форму. SPIN4 содержит три тандемных повтора доменов Тюдоров, каждый из которых образует отдельную ароматическую клетку. Эти домены Тюдоров считаются эпигенетическими читающими доменами для метилированного аргинина и лизиновых остатков гистонов на основе гомологии последовательностей. Однако точные субстраты связывания SPIN4 остаются неясными. Человеческий SPIN4, как в дикой, так и в болезненосных мутантных формах, был успешно получен с помощью системы экспрессии насекомых клеток. С помощью массива пептидов с модификацией гистонов были определены различия в связывании между диким типом и мутантным SPIN4. Функциональные валидации дополнительно показали, что SPIN4 является подлинным считывателем метилирования гистона H3 лизин-4 (H3K4me), что подтверждается биохимическим понижением натыльным мононуклеосом. Этот интегрированный подход способствует быстрой идентификации белков эпигенетических считывателей для связывания.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Член семейства Спиндлин 4 (SPIN4) является эпигенетическим чтецом и недавно был вовлечён в синдром избыточного роста, представляя созвездие до- и послеродового избыточного ростаи высокого роста 1,2. Мыши Spin4 Knockout (KO) повторили точный человеческий фенотип, подтверждая причинность. На сегодняшний день SPIN4 — единственный идентифицированный эксклюзивный эпигенетический считыватель, который негативно регулирует рост костей. Однако биохимические свойства SPIN4, который является важным эпигенетическим считывателем роста, не были охарактеризованы, что оставляет критический пробел в знаниях в понимании фундаментальных заболеваний механизмов этого нового расстройства развития. SPIN4 содержит три тандемных повтора доменов Тюдора, которые обычно считаются метилированными доменами аргинина или лизин-гистона-читателябелков 3. Вариант missense SPIN4D82H недавно был выявлен у пациентки с пренатальной и послеродовой синдромом перероста костей. Эта мутация затрагивает первый тюдоровский домен SPIN4; однако соответствующие связывающие субстраты этих доменов Тюдоров остаются неясными, что ограничивает функциональную диссекция SPIN4-зависимой регуляции хроматина и экспрессии генов в процессе развития костей.

Идентификация новых гистон-связывающих субстратов доменов читающих белков не зависит от единого стандартизированного подхода. Посттрансляционные модификации (ПТМ) гистонов в основном происходят на хвостах гистонов, которые выступают наружу из ядра нуклеосом. Распознавание ПТМ на хвостах гистонов доменами читающих белков очень варьирующее и часто требует многовалентных электростатических взаимодействий с участием нуклеосомной ДНК, линкерной ДНК и/или других гистоновых доменов для совместной стабилизации взаимодействия читателя-мишень4. В настоящее время PTM пептидов гистонового хвоста были изготовлены в виде микрочипов и коммерциализированы несколькимипоставщиками 5. Хотя скрининг PTM на основе пептида хвоста гистонов на наличие связывающих мишень с белковыми доменами считывателя является высокой пропускной способностью, при отсутствии нуклеосом, он часто даёт ложноположительные результаты. Кроме того, экспериментальные условия для таких скринингов сильно эмпирически обоснованы и варьируются от белка к белку, что делает их технически сложными для изучения. Синтетический нуклеосомный скрининг или pulldown PTM обеспечивает гораздо более надёжный показатель, но он гораздо дороже и с низкой пропускной способностью, поскольку восстановление нуклеосом с переменными комбинациями PTM по своей сути сложно.

Этот протокол описывает быстрый подход к выявлению гистонных ПТМ в нуклеосомах как связывающих мишеней SPIN4. Рекомбинантный SPIN4 был восстановлен и отфильтрован на коммерческом массиве гистонов PTM пептидов для выявления потенциальных целей связывания. Впоследствии из живых клеток были получены нативные мононуклеосомы, содержащие различные эндогенные гистонные ПТМ. SPIN4 pulldown мононуклеосом позволил провести таргетную валидацию гистонов PTM на основе антител после первоначального скрининга. Эта интегрированная биохимическая стратегия демонстрирует принципиальный подход к эффективному обнаружению мишень с точки зрения времени и затрат стоимости и может быть легко применена для выявления связывающих субстратов других плохо охарактеризованных эпигенетических читающих белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры с участием HEK293FT клеток проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по биобезопасности (IBC) Университета Содружества Вирджинии.

1. Очистка рекомбинантного человеческого SPIN4

  1. Клонировать полноразмерный дикой SPIN4 или SPIN4D82H с N-концевой эпитопной меткой 1× FLAG в бакуловирусныйвектор 6,7.
  2. Подготовьте бакуловирус, трансфектируя клетки Sf9 бакуловирусными векторами, собирайте вирусы при разрыве клеток, аликвотируйте и храните вирус при −80°C 6,7.
  3. В колбу Эрленмайера объёмом 500 мл добавьте среду роста 100 мл, 1,5 × 10 клетокпо 8 Sf9 и 1 мл бакуловируса P1.
  4. Инкубировать культуру при 27,5 °C в орбитальном шейкере-инкубаторе на 125 об/мин в течение 72 часов в темноте.
  5. Очистить FLAG-SPIN4 с помощью геля аффинности FLAG в буфере лизиса BC150, содержащем ингибиторы протеаз, и элюировать белок с помощью пептида 1× FLAG при концентрации 0,1 мг/мл.
  6. Для полного удаления пептида 1× FLAG диализируют элюированный FLAG-SPIN4 с буфером хранения белка BC150 при температуре 4 °C в следующем порядке:
    1. Первый диализ: 1 л, 1 час.
    2. Второй диализ: 2 л, ночью.
    3. Третий диализ: 1 л, 1 час.
  7. Концентрируйте диализованный белок до нужного объёма (для SPIN4 — от 600 мкл до 150 мкл).
  8. Определите концентрацию белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA) и соответственно рассчитайте молярную концентрацию.
  9. Количество сирого белка, извлеченного на каждом этапе очистки, и соответствующие оценочные выходы приведены в Дополнительной таблице 1. Очистка проводилась из 250 мл культуры Sf9 с использованием 400 мкл гелевой суспензии с аффинностью против FLAG.
  10. Разведите концентрированный SPIN4 на 10× в буфере хранения белка BC150 (дополнительная таблица 2). Загрузите 1, 2, 5, 10 и 20 мкл на гель 15% SDS–PAGE и визуализируйте с помощью синей окрашивания Coomassie (рисунок 1A).
  11. Количественно определите интенсивность полосы с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы определить относительную интенсивность сигнала между полосами, загруженными равными объемами.
  12. Разделите отношение интенсивности на молекулярную массу каждого белка, чтобы получить молярное отношение.
  13. Используйте это молярное соотношение для коррекции молярной концентрации, оцененной в шаге 1.8.
  14. Аликвот очищенный белок, мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при −80 °C. Для краткосрочного использования храните при 4 °C на ночь перед следующим экспериментом.

2. Массив гистоновых пептидов

  1. Подготовьте буфер блокировки пептидного массива, растворив 5 г бычьей сыворотки альбумина (BSA) в буфере хранения белков BC150 до конечного объёма 100 мл.
  2. Опционально обведите зону реакции на пептидном массиве с помощью гидрофобного маркера для минимизации расхода реагентов.
  3. Положите несколько листов фильтровой бумаги в чашку Петри диаметром 15 см и смочите их водой.
  4. Разместите пептидные массивы на увлажнённой фильтрующей бумаге.
  5. Аккуратно добавьте блокирующий буфер объемом 300 мкл, чтобы полностью покрыть каждую область массива.
  6. Накройте чашку Петри и инкубуйте при комнатной температуре 1–3 часа.
  7. Подготовьте FLAG-SPIN4 в блокирующем буфере до конечной концентрации 1 мкм.
  8. Подготовьте 1× пептид FLAG в блокирующем буфере до конечной концентрации 1 мкм.
  9. Чтобы улучшить соотношение сигнал/шум и уменьшить нежелательный фон, выполните следующие шаги в холодной комнате. Переместите заблокированные массивы (вместе с чашкой Петри) в холодную комнату перед добавлением белков.
  10. Удалите лишний блокирующий буфер из массивов.
  11. Аккуратно добавляйте желаемый белок FLAG-SPIN4 или пептид FLAG в качестве контроля на каждый блок.
  12. Накройте чашку Петри и инкубуйте на ночь в холодной комнате.
  13. Добавьте примерно 50 мл буфера для промывания пептидного массива в вестерн-блот и отнесите в холодную комнату.
  14. Сбросьте белковый раствор и немедленно перенесите массивы в буфер для промывки, реакционной стороной вверх.
  15. Промывайте массивы пять раз следующим образом: первые два раза по 1 минуте каждая, остальные три — по 5 минут каждая.
  16. Промыйте массивы буфером, блокирующим пептидный массив, чтобы удалить остатки моющего средства, затем верните их в чашку Петри.
  17. Приготовьте раствор антитела против FLAG в разбавлении 1:2000 и добавьте 300 мкл на блок.
  18. Инкубировать при комнатной температуре 1 час.
  19. Повторяйте шаги 2.14–2.16, чтобы промыть массивы.
  20. Приготовьте противомышиный IgG (вторичный антител) с HRP-конъюгированным козьим раствором в разбавлении 1:6000 и добавьте 300 мкл на блок.
  21. Инкубировать при комнатной температуре 1 час.
  22. Повторяйте шаги 2.14–2.16, чтобы промыть массивы.
  23. Поместите массивы внутрь прозрачного листового защитного слоя.
  24. Добавьте примерно 1 мл усиленного хемилюминесцентного субстрата (ECL), обеспечивая равномерное покрытие поверхности реакции.
  25. Удалять пузырьки воздуха и захватывать хемилюминесцентные и яркополевые изображения с помощью соответствующей системы визуализации (например, цифровых камер или авторадиографических пленок) (рисунок 1B).
  26. Анализируйте интенсивность сигнала согласно программному обеспечению для пептидного массива и сопутствующих онлайн-инструментов (рисунок 2A–C).

3. Крупномасштабное выражение FLAG-SPIN4 для вытяжного анализа

  1. В колбу Эрленмейера объёмом 500 мл добавьте среду ESF921 объёмом 125 мл, 1,8 × 10клеток 8 Sf9 и 1,2 мл бакуловирус P1, экспрессирующий FLAG-SPIN4 или FLAG-SPIN4D82H.
  2. Инкубировать при 27,5 °C в орбитальном шейкерном инкубаторе (125 об/мин) в течение 72 часа.
  3. Аликота культура описывается следующим образом:
    1. 4 мл посева в 15 мл трубки для титрации.
    2. 30 мл посева в четыре трубки по 50 мл.
  4. Центрифугуйте трубки при 600 × г в течение 15 минут и сбросьте супернатант.
  5. Заморозьте гранулы в жидком азоте и храните при −80 °C до использования.

4. Титрование соотношения шарика к лизату для FLAG-SPIN4 и FLAG-SPIN4D82H

  1. Добавьте 1 мл лизисного буфера BC150 к каждой из гранул Sf9 из 5 мл культуры Sf9, описанной в разделе 3, шаг 3.1.
  2. Соникуйте лизаты для полного нарушения: 30% амплитуда, 5 с включённым/5 секунд отключения, общее время соникации 15 с.
  3. Центрифугировать при 20 000 × г, 4 °C в течение 10 минут и перенести супернатант в свежие трубки по 1,5 мл.
  4. Подготовьте гелевой суспензия с анти-FLAG на 20 мкл для каждой реакции вытяжения (60 мкл на 3 титрации)
  5. Промыйте бусины с помощью буфера лизиса BC150:
    1. Добавьте 1 мл буфера лизиса BC150 и кратковременно создайте вихрь.
    2. Центрифуга при 3 000 × г в течение 1 минуты.
    3. Аспирируйте и отвергайте супернатант.
  6. Суспензировать шарики в лизисном буфере BC150 объёмом 40 мкл на каждую 1 реакцию вытяжения (120 мкл на 3 титрации).
  7. Объедините лизат в трубках объемом 1,5 мл с буфером лизиса BC150 и суспензией в бусинках (дополнительная таблица 3)
  8. Инкубировать трубки на вращающем трубке, установленном на 15 об/мин при 4 °C в течение 1,5 часа.
  9. Центрифугите при 3 000 × г в течение 1 минуты и аспирируйте супернатант.
  10. Промой бусины три раза следующим образом:
    1. Суспензировать шарики в буфере лизиса и вихрь объемом 500 мкл BC150 на короткое время.
    2. Центрифуга при 3 000 × г в течение 1 минуты.
    3. Аспирировать супернатант.
  11. Суспензируйте бусины в буфере 20 мкл 1× Laemmli и инкубуйте при 95 °C в течение 5 минут.
  12. Центрифуга при 3 000 × г в течение 1 минуты.
  13. Запустите супернатант на геле SDS–PAGE 15% и покрасьте в цвет Coomassie blue для оценки выхода белка.
  14. На основе данных выберите соотношение лизата к шарикам, которое насыщает сайты связывания антител на шариках. В экспериментах ≥300 мкл лизата на 20 мкл шариков было достаточно для достижения полной способности связывания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: «Насыщение сайтов связывания антител» определяется как точка, при которой увеличение объёма лизата больше не приводит к лучшему восстановлению целевого белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При той же молярности SPIN4D82H демонстрирует меньшую связывающую аффинность с гелем аффинности FLAG, чем дикий аналог.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном экспериментальном режиме 1 мл лизата был получен из 6 миллионов клеток Sf9 (рассчитано как 1,5 × 106 клеток/мл × 4 мл), что указывает на то, что SPIN4, экспрессируемый из ~6 миллионов клеток Sf9, достаточно для насыщения 20 мкл гелевой суспензии с аффинитетом против FLAG.

5. Крупномасштабная подготовка геля FLAG-SPIN4 в качестве приманки

  1. Для каждого тестируемого белка возьмите две гранулы из культур объемом 30 мл. Каждую гранулу повторно суспензировать в буфере лизис-буфера BC150 на 6 мл, перенесите в центрифугную трубку на 15 мл и отрегулировать общий объём до 13 мл с помощью буфера BC150.
  2. Соникуйте каждый образец на льду с амплитудой 100%, с 15 секундами включённым/30 секундами отрыва, что в сумме составляет 2 минуты.
  3. Пересадите лизаты в предварительно охлаждённые высокоскоростные центрифугные трубки и центрифугу при 20 000 × г, 4 °C в течение 15 минут.
  4. Добавьте 200 × (количество образцов + 1) × 1,1 мкл гелевой суспензии против аффинности FLAG в центрифугную трубку объемом 1,5 мл.
  5. Промыйте бусины >5 колонок (CV) буфера лизиса BC150 один раз.
  6. Ресуспензировать шарики в 400 × (количество образцов + 1) × 1,1 мкл буфера лизиса BC150.
  7. Перенесите супернатанты, полученные в Шаге 4, на 15 мл центрифугных трубок.
  8. Добавьте 500 мкл подвески Step 5.7 beed в каждую трубку.
  9. В одну трубку добавьте 3 мл буфера лизиса BC150 и 60 мкл пептида 1× FLAG (100 мМ) в качестве отрицательного контроля.
  10. Инкубировать образцы на ротаторе трубки, установленной на 120 об/мин при 4 °C в течение 1,5 часа.
  11. Центрифугуйте при 2 000 × г в течение 5 минут и выбросьте супернатант.
  12. Суспензируйте шарики в нужном объёме супернатанта и перенесите в трубки объёмом 1,5 мл.
  13. Центрифугуйте при 3 000 × г в течение 1 минуты и аспирируйте супернатант.
  14. Промыйте бусины пять раз с буфером BC150 следующим образом:
    1. Подвесьте шарики в буфере лизиса объемом 1 мл BC150.
    2. Для четвёртой и пятой промывки размещайте образцы на вращательном трубке, установленную на 20 об/мин при 4 °C на 10 минут.
    3. Центрифугуйте при 3 000 × г в течение 1 минуты и аспирируйте супернатант.
  15. Подвесьте шарики в буфере лизиса BC150 объемом 200 мкл.
  16. Возьмите 9 мкл буферной суспензии и проанализируйте содержание белка на 15% SDS–PAGE, после чего следите синевая окрашивание Coomassie.
  17. Поскольку входные данные белка превышают способность связываться с шариками, количество белка, связанного с одним объёмом шарика, должно быть одинаковым для разных образцов. Полу-количественно определите интенсивность полосы с помощью цифрового анализа изображений и корректируйте количество шариков для последующих реакций.

6. Подготовка мононуклеосом из HEK293FT клеток

  1. Выращивать HEK293FT клетки в контейнерах для тканевой культуры диаметром 15 см до примерно 90% совпадения с использованием 10% сыворотки плода (FBS) в DMEM-среде при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с содержанием 5%CO2 .
  2. Ранние проходные HEK293FT клетки получаются коммерчески и подтверждаются с помощью профилирования STR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна тарелка диаметром 15 см даёт ~27 миллионов клеток, что достаточно для 1–2 реакций вытяжения. Для шести реакций (включая отрицательные контрольные) приготовьте как минимум три тарелки диаметром 15 см. Если посттрансляционная модификация гистонов (PTM) редкая или нестабильная, соответственно увеличивайте количество клеток от 2 до 10× соответственно.
  3. (По желанию) В зависимости от интересующей модификации гистона добавьте соответствующие ингибиторы PTM (дополнительная таблица 2) в культурную среду и инкубировать в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть опущен, если присутствует большое количество гистонных ПТМ.
  4. Когда клетки достигают почти 100% слияния, собирайте их следующим образом:
    1. Аспирируйте культурную среду.
    2. Аккуратно промывайте клетки ледяной PBS 10 мл, затем аспирируйте.
    3. Добавьте 5 мл ледяного PBS.
    4. Соскребли клетки на льду и перенесите в трубку объёмом 50 мл (все тарелки можно комбинировать).
    5. Центрифуга при 13 000 × г, 4 °C в течение 10 минут.
    6. Отбросьте супернатант.
  5. (По желанию) Либо действуйте немедленно, либо заморозите клеточную гранулу для последующего использования:
    1. Оцените объём гранул.
    2. Ресуспензировать в 9× объёме гранул буфера G, чтобы достичь конечной концентрации глицерина 20%.
    3. Быстро заморозьте в жидком азоте и храните при −80 °C.
  6. Если вы продолжаете с замороженной гранулы, разморозьте гранулу на льду, центрифугите при 1 300 × g, 4 °C в течение 5 минут и сбросьте супернатант.
  7. Ресуспензировать (свежую или размораженную) гранулу в 10× объёме гранул буфера TMSD (40 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 5 мМMgCl 2, 250 мМ сахарозы, 1 мМ DTT), содержащего ингибиторы протеаз, с помощью серологической пипетки.
  8. Подготовьте 10% NP-40 в буфере TMSD свежим образом и добавьте 0,11× общий объём реакции для достижения конечной концентрации NP-40 ~1%.
  9. Инкубировать подвеску на ротаторе с трубкой, установленной на 120 об/мин при 4 °C в течение 5 минут.
  10. Смешайте 10 мкл суспензии с 10 мкл трипан-синего и наблюдайте под микроскопом для наблюдения за ядерным окрашиванием. Убедитесь, что ядра полностью изолированы от цитозоля (рисунок 3A).
  11. Когда примерно 95% ядер трипан-сине-положительные, переходите к следующему этапу. Для HEK293FT клеток обычно достаточно 1% инкубации NP-40 в течение 5 минут. Для других типов клеток проверьте и отрегулируйте время инкубации.
  12. Центрифугуйте при 1 300 × g, 4 °C в течение 5 минут и выбросьте супернатант.
  13. Повторно суспензируйте гранулу в 10× объёме буфера TMSD.
  14. Повторите шаги 6.12–6.13 пять раз, чтобы полностью удалить остаточный NP-40.
  15. Суспензируйте гранулу в 5× объёме буфера B.
  16. Добавьте 1 единицу микрококковой нуклеазы (MNase) на 10 000 ядер и инкубировать в водяной бане при температуре 37 °C. Время от времени перемешивайте трубку во время инкубации, чтобы ядра равномерно восстановились
  17. В указанные временные точки (0,5, 1 и 2,5 ч) отведите 50 мкл реакции в трубки по 1,5 мл, немедленно добавьте 1 мкл 0,5 м ЭДТА-На (pH 8,0) и создайте вихрь.
  18. Извлекайте ДНК из каждой временной точки, следуя следующей процедуре:
    1. Добавьте 80 мкл H₂O, 30 мкл 10% SDS и 20 мкл 5 млн NaCl; Вихрь.
    2. Добавьте 200 мкл фенол/хлороформа; Вихрь тщательно.
    3. Центрифуга при 20 000 × г, RT, 3 минуты.
    4. Аккуратно перенесите супернатант в новую трубку объёмом 1,5 мл.
    5. Добавьте 1 мл 100% этанола и 20 мкл 3 м ацетата натрия (pH 5,2); Вихрь.
    6. Центрифуга при 20 000 × г, RT, 5 минут.
    7. Удалите супернатант, добавьте 1 мл 70% этанола.
    8. Центрифуга при 20 000 × г, RT, 1 минута.
    9. Снимите супернатант и высушите гранулы при 55 °C с открытой крышкой в течение 10 минут.
    10. Подвесьте гранулу в буфере 50 мкл TE.
  19. Проведите образцы на 1% агарозном геле TBE для подтверждения размера мононуклеосомной ДНК (147 п.п.) (Рисунок 3B).
  20. (По желанию) Эффективность пищеварения микрококковой нуклеазы (MNase) варьируется в зависимости от типа клеток, при необходимости для полного удаления полинуклеосом, может добавляться дополнительную MNазу в ходе реакции. Например, если образцы 1 и 2 часа выглядят похоже, добавляйте больше MNase через 3 часа.
  21. Когда наблюдается преобладающая полоса ~147 bp или когда дополнительная MNase/расширенная инкубация больше не изменяет размер фрагмента, реакцию останавливают, добавляя 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) к конечной концентрации 2 мМ.
  22. Центрифуга при 1 300 × г, 4 °C в течение 5 минут. Собери супернатант (S1).
  23. Суспензируйте гранулу в 10× объёме гранулы буфера TE + ингибиторов протеазы и инкубуйте образец на ротаторе, установленном на 20 об/мин при 4 °C минимум 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность экстракции мононуклеосом варьируется в зависимости от типов клеток. Для эффективного извлечения нуклеосом может использоваться NaCl с объемом 0-300 мМ.
  24. Центрифуга при 1 300 × г, 4 °C в течение 5 минут. Собрать супернатант (S2).
  25. Перенесите по 50 мкл S1 и S2 на отдельные трубки по 1,5 мл.
  26. Проанализировать все фракции с помощью электрофореза агарозным гелем (шаги 6.17–6.18) для оценки распределения размеров ДНК и эффективности экстракции. Большинство мононуклеосом находятся в фракции S2 (рисунок 3C).
  27. Перенесите S2 в высокоскоростные центрифугные трубки и вращите при 20 000 × г, 4 °C, в течение 10 минут, чтобы удалить нерастворимый материал.
  28. Соберите супернатант и диализуйте буфер лизиса BC150 (без ингибиторов):
    1. Первый диализ: 1 л, 1 час.
    2. Второй диализ: 2 л, ночью.
  29. После диализа снова центрифугуйте при 20 000 × г, 4 °C, в течение 10 минут, чтобы удалить остатки нерастворимого мусора.
  30. Собери последний супернатант.
  31. Смешайте 5 мкл супернатанта с 35 мкл буфера BC150 и 10 мкл 5× Леммли, нагрейте при 95 °C в течение 5 минут и загрузите 1, 2, 5, 10 и 20 мкл на гель SDS–PAGE 15%.
  32. Загрузка 1, 2 и 5 мкл 0,1 мг/мл BSA в буфере Леммли в качестве ориентира для оценки выхода.
  33. Покрасьте в цвет Кумасси синим и оцените урожайность нуклеосом полуколичественно с помощью программного обеспечения для анализа изображений (рисунок 3D).

7. Модифицированный нуклеосомный пуллдаун

  1. Подготовьте буфер блокировки 2× шариков, растворив 1 г BSA в лизисном буфере BC150 до конечного объёма 10 мл, затем вооружите вихрь до полного растворения.
  2. Перенесите шарики FLAG-SPIN4-WT и FLAG-SPIN4D82H , содержащие эквивалентные молярные количества белка (из раздела 5, шаги 5.16–5.17) в отдельные трубки по 1,5 мл.
  3. Добавьте равный объём отрицательных контрольных шариков (из раздела 5, шаг 10) к образцу FLAG-SPIN4-WT.
  4. Отрегулировать общий объём всех образцов бусина с помощью буфера лизиса BC150.
  5. Добавьте равный объём буфера для блокировки шариков 2× в каждую трубку с бусинами и буфер BC150.
  6. Инкубировать образцы на ротаторе трубки, установленной на 20 об/мин при 4 °C ночью (O/N).
  7. Разморозить соответствующее количество 1× нуклеосомы, извлеченной из HEK293FT клеток на льду. Требуемый объём зависит от желаемого молярного отношения нуклеосомы к SPIN4. Для начальной оптимизации используйте молярное отношение нуклеосомы к SPIN4 1:1.
  8. Тщательно смешайте 1× нуклеосому с равным объёмом 2× буфером для блокировки шариков.
  9. Смешайте смесь из Шага 7.8 с заранее заблокированными шариками в трубке на 15 мл.
  10. Инкубировать смесь на ротаторе трубки, установленной на 20 об/мин при 4 °C в течение 4 часов или ночью.
  11. Центрифугу при 3 000 × г, 4 °C в течение 3 минут.
  12. Аккуратно отбросьте супернатант.
  13. Подвесьте шарики в буфере лизис объёмом 1 мл BC150 и перенесите в трубки объёмом 1,5 мл.
  14. Промой бусины три раза следующим образом:
    1. Центрифугу при 3 000 × г, 1 минуту, и аспирировать супернатант.
    2. Подвесьте шарики в буфере лизиса объемом 1 мл BC150.
    3. Иногда перемешивайте трубку, чтобы бусины равномерно подвешивались во время стирки.
  15. Промой бусины ещё два раза следующим образом:
    1. Центрифугу при 3 000 × г, 1 минуту, и аспирируйте супернатант.
    2. Суспензировать шарики в буфере лизиса BC150 объемом 1 мл.
    3. Вращайте при 20 об/мин, при 4 °C, в течение 10 минут.
  16. После промывки подвесите бусины в 9 колонках (CV) буфера лизиса BC150.
  17. Возьмите по 160 мкл с каждого образца, смешайте с буфером 40 мкл 5× Laemmli и нагрейте при 95 °C в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется пептидная элюция белок-нуклеосомного комплекса с флагом, что даёт более чистые результаты с меньшим фоном.
  18. Центрифугу при 3 000 × г, комнатной температуры, в течение 5 минут.
  19. Загрузите 5 мкл супернатанта на гель SDS–PAGE с 15% и проведите серебряное окрашивание (рисунок 4A).
  20. Загрузите ещё 5 мкл супернатанта на 15% гель SDS–PAGE, перенесите на мембрану PVDF и проведите соответствующие первичные и вторичные антитела, специфичные для целевых гистонных ПТМ (рисунок 4B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения связывающих субстратов человеческого SPIN4 были восстановлены дикий тип SPIN4 и мутант, полученный пациентом с синдромом перероста, с помощью системы экспрессии клеток насекомых Sf9. В частности, это мутация аспарагиновой кислоты (D) в гистидин (H) в остатке 82 (D82H), которая находится в первом домене Тюдора SPIN4, что указывает на её роль в регуляции связывания субстрата SPIN4. Для экспрессии белка в клетках Sf9 использовался бакуловирусный вектор, кодирующей один FLAG-мет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Был представлен эффективный по времени и экономии метод биохимического определения специфических гистонных ПТМ в качестве мишеней плохо охарактеризованного белка, а также оценки того, как его мутация, связанная с болезнью, влияет на связывание мишени. Преимущество этого метода в том, что он не требует дорогостоящей или трудоёмкой реконструкции синтетических нуклеосом. Этот подход использовал удобство коммерциализированных гистонных PTM-пептидных массив при этом гарантируя, что SPIN4 явля...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят всех бывших и нынешних членов лаборатории Yu and Jee за техническую поддержку. J.-R.Y. был поддержан премией NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. ДА. Джей получил поддержку от Детской национальной больницы и Детского исследовательского института.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 млСарштедт72.690.001Общие эксперименты
Тарелка для культуры тканей диаметром 15 смСарштедт83.3903.300Общие эксперименты
Конические центрифугные трубки объёмом 15 млСарштедт62.554.101Общие эксперименты
Конические центрифугные трубки объёмом 50 млСарштедт62.548.004Общие эксперименты
500 мл колбы ЭрленмайераStellar ScientificCT229809Культура клеток Sf9
Amersham ImageQuant 800 CCD-имиджерЦитиваIMQ800ПЗЗ-система визуализации
Гель аффинитета против FLAG M2Сигма-ОлдричA2220Биохимический pulldown
Антитела к анти-FLAG M2Сигма-ОлдричF1804Вестерн блот
АпротининMedChemExpressHY-P0017Ингибитор протеазы
Анализ массивов SofrwareАктивный мотивhttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipАнализ данных пептидных массив MODified
ASI Agarose LEAlkali ScientificA7700ДНК-гель
Экспрессионная система бакуловируса Bac-to-BacThermo Scientific10359016Экспрессия бакуловируса
Бензамидин гидрохлоридMedChemExpressHY-W018781Ингибитор протеазы
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Сигма-ОлдричA9647Стандарт количественной оценки белков
Бромофенол БлюThermo ScientificA18469.08Буфер Ламмели
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Scientific20278Protien gel окрашивание
Дитиотрейтол (DTT)Sigma-Aldrich D5545Буфер лизиса
EDTAИсследовательские продукты RPIE58100Буфер лизиса
Субстрат с усиленной хемилюминесценцией (ECL)ЦитиваRPN2232Вестерн блот
ESF 921 Среда для культуры клеток насекомыхСистемы экспрессии96-001Культура клеток Sf9
Этанол (200 proof)Spectrum ChemicalET107Осадки ДНК
Система визуализации EVOS M5000ИнвитрогенM5000Общая визуализация
Пептид FLAGMedChemExpressHY-P7006Пуллдаун элюция
ГлицеринSigma-Aldrich G77893Буфер хранения
Антитела H3K4me1  Активный мотив39300Вестерн блот
Антитела H3K4me2  Клеточная сигнализация9725TВестерн блот
Антитела к H3K4me3  Клеточная сигнализация9751TВестерн блот
HEK293FT ячейкиThermo ScientificR70007Фибробластклеточная линия человека эмбриональной почки
HEPESSigma-Aldrich H3375Буфер лизиса
ImageJНациональные институты здравоохраненияhttps://imagej.net/ij/download.html  Программа для обработки изображений на базе Java
Лейпептин гемисульфатMedChemExpressHY-18234AИнгибитор протеазы
Микрококковая нуклеаза (MNase)NEB M0247SЭндонуклеаза для пищеварения хроматина
Модель 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Соникация
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ гистоновый пептидный массивАктивный мотив13005Анализ связывания белков
Пепстатин АMedChemExpressHY-P0018Ингибитор протеазы
Пероксидаза IgG Fraction Monoclonal Goat Anti-Mouse IgG, специфичный для легких цепейJackson ImmunoResearch115-035-174Вестерн блот
pFastBac1-Flag-SPIN4Thermo Scientific10360014Вектор экспрессии бакуловируса
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82HThermo Scientific10360014Вектор экспрессии бакуловируса
Фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1)Сигма-ОлдричP2069Очистка ДНК
Белковый анализ Pierce Rapid Gold BCAThermo ScientificPIA53226Квантификация белков
Набор для окраски Pierce SilverThermo Scientific24612Обнаружение белков
Ингибитор протеазы PMSFThermo Scientific36978Ингибитор протеазы
Полиакриламидный гельИзготовлено внутри компанииН/ДПротеиновый гель
Клетки насекомых Sf9ATCCCRL-1711Линия насекомых для экспрессии бакуловирусов
Диализное устройство Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCOThermo Scientific69572Белковый диализ
Ацетат натрияСигма-ОлдричS8750Осадки ДНК
Хлорид натрия Fischer BP358-1Общие буферы
Додецилсульфат натрия (SDS)Sigma-Aldrich L3771Общие буферы
Трипан Синий раствор (0,4%)Thermo Scientific15250061Окрашивание ядер

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
  2. Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation. Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).
  3. Lu, R., Wang, G. G. Tudor: a versatile family of histone methylation readers. Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).
  4. Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).
  5. Mauser, R., Jeltsch, A. Application of modified histone peptide arrays in chromatin research. Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).
  6. Hsu, C. I., et al. Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1. Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).
  7. Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system. STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).
  8. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).
  9. Fuhrmann, J., Thompson, P. R. Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation. ACS Chem Biol. 11, 654(2015).
  10. Zhao, F., et al. Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1. J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).
  11. Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).
  12. Greschik, H., et al. The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development. Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

Похожие статьи