Защита бета-клеток островков от повреждений, вызванных перегрузкой железом, с помощью длинного некодирующего РНК гена, экспрессируемого матери

Краткое содержание

Перегрузка железом снижала экспрессию MEG3 в ткани поджелудочной железы. MEG3 может играть защитную роль против железо-индуцированного апоптоза β-клеток островков, потенциально с модуляцией пути NF-ĸB. Этот механизм может способствовать дисфункции островков у пациентов с β-TM и перегрузкой железа.

Аннотация

Пациенты с бета-талассемией мажор (β-TM) часто характеризуются нарушениями метаболизма глюкозы, и такие факторы, как перегрузка железом, хроническая анемия, гормональные дисбалансы, дисфункция печени и инсулинорезистентность, связанная с воспалением, считаются важными факторами, способствующими дисфункции островков поджелудочной железы. Длинные некодирующие рибонуклеиновые кислоты (lncRNAs) всё больше признаются за свои регуляторные роли в клеточном апоптозе и гомеостазе глюкозы. В данном исследовании изучается функция lncRNA, материнской экспрессируемой гена 3 (MEG3), при повреждении β-клеток островков, вызванных железом. Модель мыши с перегрузкой железа была индуцирована путём инъекции железа декстраном внутри брюшины. Осаждение железа и повреждение тканей в поджелудочной железе оценивались с помощью окрашивания прусского синего цвета и гематоксилина и эозина, а экспрессия MEG3 количественно оценивалась с помощью обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (RT-PCR). In vitro клетки MIN6 были трансфектированы с помощью малой интерферирующей РНК MEG3 для изучения апоптоза с помощью потоковой цитометрии, а активность сигнальных путей NF-каппа (ĸ)B оценивалась с помощью вестерн-блоттинга. Гистологическое окрашивание подтвердило значительное отложение железа и структурные повреждения в ткани поджелудочной железы у мышей с перегрузкой железом. RT-PCR анализ выявил заметное снижение экспрессии MEG3 в поджелудочной железе (p<0.05). In vitro снижение MEG3 значительно увеличило апоптоз клеток MIN6 по сравнению с контрольными группами. Вестерн-блот-анализ показал повышенный уровень NF-ĸB, что указывает на активацию сигнального пути NF-ĸB в клетках, заглушённых MEG3. Эти данные свидетельствуют о том, что снижение уровня MEG3 может усиливать апоптоз β-клеток островков через сигнализацию NF-ĸB при перегрузке железом. Ген MEG3 может играть защитную роль против железо-индуцированного апоптоза островков β клеток, потенциально с модуляцией пути NF-ĸB. Этот механизм может способствовать дисфункции островков у пациентов с β-TM и перегрузкой железа.

Введение

Бета-(β)-талассемии — это группа наследственных гематологических заболеваний, характеризующихся снижением или отсутствием выработки цепи β-глобина, что приводит к хронической анемии и неэффективному^{эритропоэзу 1}. У пациентов с трансфузионно-зависимой β-талассемией большой (β-TM) повторные переливания крови и гемолиз часто приводят к системной перегрузке железа, что может повреждать несколько органов и способствовать ряду эндокринных осложнений, включая нарушения глюкозного^{метаболизма 2}. Кроме того, хроническая анемия увеличивает нагрузку на поджелудочную железу, гормональные дисбалансы, влияющие на регуляцию глюкозы, нарушения функции печени, нарушающие метаболизм глюкозы, а инсулинорезистентность, вызванная воспалительными процессами, может способствовать гипергликемии у пациентов с β-TM. Таким образом, нарушения метаболизма глюкозы в β-TM имеют многофакторную^{природу 2,3}. Недавний мета-анализ показал, что распространённость нарушенной глюкозы натощак, нарушенной толерантности к глюкозе (IGT) и сахарного диабета (DM) у пациентов с β-TM составляла соответственно 17,21%, 12,46% и 6,54%, что указывает на рост нагрузки на глюкозно-метаболические нарушения в этой^{популяции3}.

Несмотря на растущую клиническую значимость, основные механизмы аномального метаболизма глюкозы в β-TM остаются плохо изученными. Предыдущие исследования показали, что хроническая перегрузка железом, главным образом из-за повторных переливаний и гемолиза, может приводить к чрезмерному отложению железа в поджелудочной железе, особенно в клетках островков β. Это накопление способствует образованию реактивных видов кислорода и усугубляет окислительный стресс, вызывая дисфункцию митохондрий, ухудшая синтез и секрецию инсулина, а в конечном итоге вызывая апоптоз β клеток и дефицит^{инсулина 4,6}. Кроме того, перегрузка железом может способствовать периферической инсулинорезистентности через воспаление, опосредованное окислительным стрессом, и вмешательство в инсулиновые сигнальные пути. Однако молекулярные пути, связывающие перегрузку железом с повреждением β-клеток и системной дисрегуляцией глюкозы, сложны и пока не полностью изучены. Длинные некодирующие рибонуклеиновые кислоты (lncRNAs) — класс транскриптов длиннее 200 нуклеотидов, не кодирующих белки — стали важными регуляторами в различных биологических процессах, включая гомеостаз глюкозы, секрецию инсулина и окислительные стрессовые^{реакции 7,8,9}. Известно, что клетки β поджелудочной железы экспрессируют более 1000 lncRNA, что указывает на их потенциальную регуляторную роль в поддержании эндокринной^{функции 10}.

Однако мало что известно о профилях экспрессии lncRNA и их функциональной роли в контексте повреждения β клеток, вызванного перегрузкой железом, особенно при β-TM. Недавние достижения показали, что LncRNA MEG3 (MEG3) способствует секреции инсулина и ингибирует апоптоз β-клеток^{поджелудочной железы 11}. Однако его влияние на β-клетки поджелудочной железы при перегрузке железом остаётся неясным. В других патологических контекстах было показано, что lncRNA взаимодействуют с ключевыми сигнальными путями, такими как NF-kappa (ĸ)B, JNK и Nrf2, которые также участвуют в повреждениях клеток, связанных с окислительным стрессом и перегрузкой^{железом} 12,13,14. В частности, NF-ĸB является центральным транскрипционным фактором, активируемым под окислительным стрессом, и участвует в апоптозе β-клеток при условиях перегрузки^{железом} 15,16,17. Таким образом, в данном исследовании изучается, что снижение уровня MEG3 может усиливать апоптоз островков β клеток посредством сигнализации NF-ĸB при условиях перегрузки железом. Эта работа может дать новые знания о молекулярных механизмах, лежащих в основе аномального метаболизма глюкозы в β-TM.

Протокол

Экспериментальные протоколы, использованные в настоящем исследовании, были утверждены Этическим комитетом Хайнаньской общей больницы (протокол No 2021-239). Руководство Национальных институтов здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных и Декларация Хельсинки строго соблюдались во всех экспериментальных процедурах. Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Модель животных и экспериментальный дизайн

В этом исследовании использовали тридцать шесть самцов мышей C57BL/6J (4 недели, примерно 20 г). Все мыши содержались в стандартных лабораторных условиях (20–25 °C, относительная влажность 50%–65%, цикл свет/тёмный 12 часов) с доступом к пище и воде ad libitum. После 7-дневного периода акклиматизации мышей случайным образом разделили на две группы (n=18 на группу): группу с перегрузкой железа (модельная группа), которая получала внутрибрюшинные инъекции декстрана железа (0,2 г/кг) дважды в неделю в течение 4 недель; и контрольная группа, получая эквивалентные объёмы нормального физиологического раствора через инъекцию внутрибрюшинного раствора. Через 4 недели мышей усыпили, а для последующего анализа изобрали ткани поджелудочной железы.

2. Измерение железа в сыворотке

Образцы крови были собраны из ретро-орбитального синуса под 1% пентобарбитальной анестезией во время диструса. После того как её оставили стоять при комнатной температуре в течение 1 часа, центрифугировали при 4 °C, 3 000 об/мин в течение 15 минут. Сыворотка отделялась и хранилась при -80 °C. Концентрации железа в сыворотке определялись с помощью колориметрического теста железа в соответствии с протоколом производителя.

3. Гистологический анализ

Образцы тканей поджелудочной железы погружались в 4% параформальдегид для фиксации, после чего перед подготовкой срезов был вложён парафин. Серийные срезы ткани толщиной от 4 до 5 мкм были получены и обработаны с помощью стандартных процедур депарафинизации и регидратации. Гистоморфологическое исследование было проведено с использованием окрашивания гематоксилином и эозином, а осаждение железа в тканях поджелудочной железы оценивалось с помощью прусского синего окрашивания по традиционным гистологическим протоколам.

4. Клеточная культура и мелкая интерферирующая трансфекция рибонуклеиновой кислоты

Клетки под β желудочной железы MIN6 MIN6 были культивированы в модифицированной среде Eagle Dulbecco с высоким содержанием глюкозы, дополненной сывороткой плода бычьей крупной рогатой скота 15%, пенициллином 100 мкг/мл, стрептомицином 100 мкг/мл, 10 мМ HEPES, пируватом натрия 50 мкм и 50 мкмоль/л β-меркаптоэтанолом. Все эксперименты проводились при слиянии клеток 80%. Каждый раз во время клеточной культуры берётся 6–8 мл культурной среды. Клетки поддерживались при 37 °C в увлажнённой атмосфере с концентрацией 5% CO₂. Для функциональных исследований клетки MIN6 в логарифмической фазе роста были трансфектированы с помощью специфических для lncRNA малых интерферирующих (si)РНК (нацеливаясь на выбранные lncRNA на основе результатов микрочипа; Группа ингибиторов) или отрицательную контрольную siRNA (группа Inhibitor NC) с использованием Lipofectamine 2000, согласно инструкции производителя. После культивирования в течение 24 часов клетки анализировались с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) или western blot для определения эффективности блокировки. Целевые последовательности этой siRNA были следующими: siMEG3: GCGUCUCUCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUCGUCGUTTACGUGACGUUCGGAGAATT. Каждый эксперимент проводился в трёх экземплярах и повторялся три раза.

5. Анализ цепной реакции с обратной транскрипцией полимеразы

Общая РНК была извлечена из образцов тканей поджелудочной железы и клеток MIN6 с использованием коммерчески доступного реагента для выделения РНК на основе фенолов согласно инструкциям производителя. Комплементарная ДНК была синтезирована с помощью комплекта обратной транскрипции при общем объёме реакции 20 мкл. После обратной транскрипции концентрация кДНК большинства образцов составляла примерно 1 мкг/мкл по количественному анализу образцов. Впоследствии 1 мкл кДНК-шаблона использовался для количественной амплификации ПЦР в реальном времени. qRT-PCR проводилась с использованием ПЦР-обнаружения на базе SYBR Green при следующих циклических условиях: 95 °C за 30 с, 90 °C 15 с, 60 °C 34 с и 68 °C 30 с. Относительные уровни экспрессии генов определялись с помощью метода сравнительного порогового цикла (метод ^2-ΔCT ). GAPDH использовался в качестве внутреннего референсного гена для нормализации данных ПЦР в реальном времени. Все экспериментальные процедуры выполнялись в соответствии с протоколами соответствующих производителей, и каждый эксперимент повторялся независимо как минимум три раза. Последовательности праймеров, использованные в этом исследовании, перечислены в Дополнительной таблице 1 и Таблице 2.

6. Анализ для подсчёта клеток 8

Способность к пролиферации клеток была определена с помощью анализа комплекта для подсчёта клеток 8 в соответствии с рекомендациями производителя. Кратко, клетки MIN6 были покрыты в культивных пластинах с 96 лунками с плотностью 5 x 10³ клеток на каждую скважину после трансфекции si-MEG3 или si-NC и поддерживались в течение 24 часов. В определённые временные моменты в каждую скважину вводилось 10 мкл реагента жизнеспособности клеток, а пластины инкубировали при 37 °C в течение 2 часов. Значения поглощения впоследствии измерялись на 450 нм с помощью микропластинного считывателя. Жизнеспособность клеток рассчитывалась в процентах относительно контрольной группы.

7. Обнаружение апоптоза с помощью потоковой цитометрии

Апоптотические изменения в клетках MIN6 были исследованы с помощью набора для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC/PI согласно инструкциям производителя. После 48 часов трансфекции сиРНК клетки были собраны, дважды промыты холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором и вновь суспендированы в буфере связывания. После этого клетки инкубировали с 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл йодида пропидия в течение 15 минут при комнатной температуре в тёмных условиях. Сразу после окрашивания образцы анализировались с помощью проточной цитометрии. Ранние и поздние популяции апоптотических клеток количественно оценивались с помощью программного обеспечения для анализа потоковой цитометрии. Доля апоптотических клеток была впоследствии рассчитана для межгрупповых сравнений. Каждый эксперимент проводился независимо три раза.

8. Вестерн-блот анализ

Эксперименты Western blot проводились согласно ранее опубликованным^{протоколам 18}. Клетки сначала переваривались с помощью трипсина, затем были собраны и лизированы на льду с помощью радиоиммунопреципитационного буфера лизиса. Концентрации белков были количественно измерены, и эквивалентные количества белка подвергались разделению на гелях электрофореза с 10% натрием додецилсульфатом-полиакриламидом перед передачей на мембраны с поливинилиденфторидом. После блокировки мембраны образцы инкубировали с первичными антителами против NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), каспазы-3 (1:1000) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (1:2000) при указанных коэффициентах разбавления, затем инкубировали вторичными антителами, связанными с пероксидазой хрена. Белковые сигналы были обнаружены с помощью системы хемилюминесценции и количественно измерены с помощью программного обеспечения ImageJ. GAPDH использовался в качестве контроля внутренней нагрузки, а уровни экспрессии белков экспрессировались в виде изменений складок относительно контрольной группы.

9. Статистический анализ

Данные были выражены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Сравнения между группами проводились с помощью теста Mann–Whitney^{U 19} с использованием статистического анализа. p-значение <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Оценка модели мышей с перегрузкой железом и измерение экспрессии гена 3 у матери в тканях поджелудочной железы

Для изучения роли MEG3 in vivo мы установили модель перегрузки железом у мышей с помощью внутрибрюшнической инъекции декстран железа. По сравнению с контрольной группой, уровень железа в сыворотке в группе Модель значительно повысился (p<0,05) (рисунок 1A). Гистологическое исследование выявило заметное осаждение железа в тканях поджелу...

Обсуждение

Аномальный метаболизм глюкозы — это распространённое и серьёзное осложнение у пациентов с β-TM, часто проявляющееся в виде ИГТ или ДМ. В этом исследовании мы обнаружили, что перегрузка железом приводит к повреждению поджелудочной железы и значительно снижает экспрессию lncRNA MEG3 в ткани поджелудочной железы, сопровождаясь увеличением апоптоза клеток β островков. Кроме того, снижение MEG3 в клетках MIN6 способствовало апоптозу β-клеток и было связано с активацией NF-ĸB, что указывает на...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1M Tris-HCL (pH=6.8)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	T1020
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
6×DNA Loading Buffer	TIANGEN	GH101-01
6×DNA Loading Buffer	TRANS	GH101-01
-80ºC refrigerator	BIOBASE	BDF-86V348
ABI 7500 real-time PCR system	Applied Biosystems, USA
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit	MULTI SCIENCES	AP101-100-kit
BCA Protein Assay Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd.	E-BC-K318-M
Biopulverizer	biospec
BSA	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A8020
C57BL/6J male mice	Gempharmatech Co,Jiangsu,China
CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit	KeyGEN BioTECH	KGA317
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
DMEM	KeyGEN BioTECH
Flow cytometry	ACEA Biosciences, USA	NovoCyte 2060R
Fluorescence PCR instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai
Glycine	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	G8200
High-capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Servicebio	GB23301	1/2000
HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Servicebio	GB23303	1/2000
Human LncRNA Array V5.0	Arraystar,Rockville, Maryland, USA
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
Microarray scanner	Agilent Technologies,California, USA
MIN6 cell	procell	KGM12800N
Mini-Bead-Beater-16	biospec
Mouse Anti-GAPDH	TransGen Biotech	HC301	1/2000
NanoDrop spectrophotometer	NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA	ND-2000
PAGE Pre-Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A1010
Primers	Generay Biotech,Anhui, China
PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser	CWBIO,Jiangsu, China
PVDF	Millipore	IPVH00010
Rabbit Anti Bax	proteintech	50599-2-ig	1/5000
Rabbit Anti Bcl-2	abcam	ab194583	1/1000
Rabbit Anti Caspase3	abcam	ab184787	1/2000
Rabbit Anti P65	abcam	ab32536	1/8000
Rabbit Anti p-P65	Affinity	af2006	1/1000
TB Green Premix Ex Taq II	TaKaRa, Japan
TRIzol	Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA
TRIzol reagent	CWBIO,Jiangsu, China
Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai	Chemi DocTM XRS+
Ultraviolet spectrophotometer	NanoPhotometer	NP80