Аконитин вызывает повреждение миокарда у крыс, связанное с активацией сигнального пути JNK1/2

Краткое содержание

В этом исследовании изучалась потенциальная роль сигнализации JNK1/2 при повреждении миокарда, вызванном аконитином, у крыс. Повышенное фосфорилирование JNK1/2 было связано с повреждением миокарда, а фармакологическое торможение пути JNK частично облегчало повреждение миокарда, что указывает на то, что сигнализация JNK может участвовать в кардиотоксичности, вызванной аконитином.

Аннотация

Острое отравление аконитином (Acon) может привести к аритмии и повреждению миокарда; однако основные механизмы остаются неясными. В этом исследовании изучался механизм повреждения миокарда, вызванного острым отравлением Acon. Модель острого отравления Acon у крыс (n = 51) была установлена путём внутрижелудочного введения. Для фиксации изменений сердечного ритма использовались электрокардиографические методы. Для оценки патологического повреждения миокарда и отложения коллагена проводились окрашивания гематоксилином и эозином (HE), а также массонова. Уровни экспрессии сердечных ферментов и белков в венозной крови были выявлены с помощью ферментно-связанных иммуносорбентных тестов (ELISA). Связь структуры и активности между Acon и JNK исследовалась с помощью молекулярного стыковки. Уровни экспрессии фосфорилированных белков c-Jun N-терминальной киназы 1/2 (JNK1/2) были обнаружены методом вестерн-блоттинга. В этом исследовании у крыс наблюдались желудочковые аритмии после внутрижелудочного введения Acon. Ткань миокарда проявила неорганизованное расположение волокон и клеток миокарда, сопровождаемое аномальным отложением коллагена. Результаты молекулярного стыковки показали возможные взаимодействия между Acon и JNK1/2. Тем временем уровень экспрессии сердечных ферментов и белков, а также фосфорилированного JNK1/2, был значительно повышен. Дальнейшие исследования показали, что лечение ингибитором JNK частично SP600125 обратить обратное повреждение миокарда, вызванное Acon, у крыс. Эти результаты указывают на то, что фосфорилирование JNK1/2 участвует в развитии повреждения миокарда, вызванного острым отравлением аконитином. Результаты показывают, что активация сигнального пути JNK1/2 способствует повреждению миокарда, вызванному аконитином, а ингибирование пути JNK1/2 может облегчить повреждение миокарда, вызванное острой интоксикацией аконитином.

Введение

Акон — это натуральный экстракт алкалоидного дитерпена из растения Aconitum семейства ранункулцевых. Он обладает противовоспалительной ^1,2, обезболивающей, противоопухолевой и противоревматическим, иммунным метаболизмом и стимуляцией^{кровообращения 3,4,5}. Однако неправильное или чрезмерное использование препаратов, содержащих Acon, может привести к тяжелым отравлениям. Симптомы, вызванные отравлением аконитином, включают сердечные^{симптомы 6},^{неврологические симптомы 7} и желудочно-кишечные^{симптомы 8}. В последние годы по всему миру часто поступают сообщения о случаях, связанных с отравлением аконитом или^{смертью 9,10,11}. Отравление аконом в основном проявляется в сердечно-сосудистой системе, нервной и пищеварительной системах. Среди них основной причиной смерти от отравления является кардиотоксичность. Повреждение сердца, вызванное Эйконом, очень серьёзно; В частности, кратковременное начало синдрома затрудняет своевременное проведение клинического лечения. Обычно острое отравление Acon вызывает тошноту, диарею, головокружение, боль в груди, одышку и другие первые симптомы в течение нескольких часов⁸. В настоящее время детальный механизм повреждения миокарда, вызванного острым отравлением Acon, остаётся неясным, и нет клинически эффективных препаратов, способных эффективно облегчить повреждение миокарда, вызванное отравлением Acon^{. 12,13}.

Повреждения при остром отравлении Аконом, которые могут позволить исследовать механизм повреждения миокарда, могут стать значимым способом для исследования, зависящего от времени. Такая модель может иметь потенциал для будущего лечения пациентов с острыми заболеваниями Acon и предотвратить раннее развитие синдрома. Исследования предполагали роль сигнального пути n-терминальной киназы c-Jun (JNK) в иммунном ответе на яды. Сигнальный путь JNK является одним из митоген-активированных протеинкиназных (MAPK) сигнальных путей. Семейство JNK включает три гена (JNK1/MAPK8, JNK2/MAPK9 и JNK3/MAPK10). JNK1 и JNK2 могут экспрессироваться в большинстве тканей, включая сердце, тогда как JNK3 в основном обнаруживается в^мозге14 и в основном связан с окислительным стрессом и воспалительным ответом^{клеток 15}. Исследования показали, что сигнальный путь, опосредованный JNK, играет важную роль в ишемии/реперфузионном повреждении мозга и^{миокарда 16,17}. Введение C66 облегчает воспаление миокарда с высоким содержанием жиров, вызванное диетой, подавляя активацию JNK в сердцах^{мышей 18}. Хлорогеновая кислота облегчает повреждение кардиомиоцитов, вызванное TNF-α, ингибируя сигнализацию^{JNK 19}. Пиноценбрин облегчает повреждение миокарда и воспалительный ответ, вызванный LPS, ингибируя сигнальный путь p38/JNK MAPK, а также облегчает сердечную дисфункцию и аритмию²⁰. Эти исследования показывают, что изменения в сигнальной передаче JNK, преимущественно JNK1/2, тесно связаны с повреждением миокарда. В то же время JNK также является целью Acon на низших направлениях для ряда мероприятий. Одно исследование показало, что высокие дозы воздействия Acon могут опосредовать путь активации фермента JNK, вызывая токсичность развития эмбрионов данио-рерио, такие как укорочённая длина тела, изогнутая форма тела и дефекты развития^{мозга 21}. Это исследование предполагает, что Acon может активировать сигнальный путь JNK. Однако роль сигнального пути JNK в повреждении миокарда, вызванном острым отравлением аконитином, остаётся неясной.

В этом исследовании была установлена модель острого отравления миокарда Acon с помощью различных внутрижелудочных доз и временных интервалов. Кроме того, мы исследовали влияние Acon на уровень фосфорилирования JNK1/2 в миокарде и активацию сигнального пути JNK в этой модели. Изучение роли фосфорилирования JNK1/2 при повреждении миокарда у крыс, вызванных острым отравлением Acon, даёт теоретическую основу для изучения повреждения миокарда, вызванного острым отравлением Acon.

Протокол

Проект и план реализации экспериментов были утверждены Комитетом по экспериментам на животных Куньминского медицинского университета для утверждения (номер одобрения: Kmmu20220652) 06/2022. Все экспериментальные планы были реализованы в соответствии с «Руководством по экспериментам на животных Куньминского медицинского университета». Список всех материалов, использованных в этом исследовании, приведён в Таблице материалов.

ВНИМАНИЕ: Из-за высокой токсичности Acon все процедуры подготовки и введения проводились в соответствии с институциональными нормами безопасности лабораторий. Сотрудники, работавшие с Acon, носили соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные халаты и маски, а процедуры подготовки Acon выполнялись с соблюдением соответствующих мер предосторожности для минимизации риска заражения. Животных тщательно контролировали во время и после введения Acon на предмет признаков тяжёлой токсичности и страданий, а при необходимости применялись гуманные методы лечения для минимизации страданий. Биологические отходы и материалы, загрязнённые Acon, утилизировались в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.

Обращение с животными

Взрослые самцы крыс породы Sprague-Dawley (SD) (2 месяца, вес 230 г) были выращены в здании экспериментальных животных SPF, в центре экспериментальных животных Медицинского университета Куньмина. Условия кормления всех SD крыс были обработаны в соответствии с требованиями к кормлению крыс SPF. Их адаптивно воспитывали в течение недели, а перед экспериментом они голодали 12 часов. Acon растворялся в буфере ацетата (Acet) с концентрацией 0,05 м, а крысы SD были разделены на 4 группы по принципу случайного контроля: группа 1 (Acon-1 mg) вводилась 1 мг/кг Acon по гаважу; Группа 2 (Acon-2 мг) вводилась 2 мг/кг Acon внутрижелудочно; Группа 3 (Acet), введена 2 мл 0,05 М ацетата с буфером внутрижелудочно; и Группа 4 (контроль, лечение не применяется). Образцы были собраны через 1, 3 и 6 часов после внутрижелудочного введения. Всего было изучено 36 крыс, по 3 на группу по 1, 3 и 6 ч. В каждый определённый момент времени впервые проводились записи ЭКГ. Впоследствии крысы были анестезиированы, а образцы крови взяты для биохимического анализа сыворотки. После сбора крови крыс приносили в жертву, а сердечную ткань быстро удаляли. Части ткани миокарда фиксировались для гистологического анализа (окрашивание по HE и Masson), а оставшиеся ткани хранили для анализа экспрессии белков методом Western Blotting. В экспериментах с активаторами и ингибиторами JNK1/2 крысы SD будут разделены на 5 групп по принципу случайного контроля: модельная группа получила 2 мг/кг внутрижелудочного введения Acon, а ингибиторная группа — внутрибрюшническую инъекцию 6 мг/кг^{SP600125 22} сначала, а затем 2 мг/кг Acon через 2 часа — через 2 часа. Группе агонистов сначала ввели внутрибрюшинную инъекцию 0,1 мг/кг анизомицина (Anis^)23,24, а через 2 часа — 2 мг/кг Акона. Группе DMSO была введена внутрибрюшническая инъекция 2 мл смеси раствора с корастворителем с DMSO объемом 0,8%. Контрольная группа не получила никакого лечения. Всего было изучено 15 крыс. Все результаты окрашивания анализировались вслепую, чтобы минимизировать наблюдательную смещённость. В экспериментальный период крысы постоянно контролировались на предмет выживаемости и признаков тяжёлой токсичности после введения аконитина. Смертность фиксировалась в каждой назначенной точке времени наблюдения (1 ч, 3 и 6 ч). Смерть определялась как полное прекращение дыхания и сердечного ритма. Животные, проявлявшие тяжёлое страдание, включая стойкую дышку, потерю рефлекса выпрямления, неспособность передвигаться или умирающие, считались достигшими гуманной точки и были немедленно усыплены под глубокой анестезией для минимизации страданий. Количество смертей для каждой группы крыс (Таблица 1–4).

Электрокардиограмма крыс (ЭКГ)

Крысы в каждой группе подвергались отслеживанию ЭКГ. Конкретный метод был следующим: после анестезии путём внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия в дозе 30 мг/кг. Крысы были закреплены в положении на спине на консоли для экспериментов с животными. Компьютер был подключён к биологической системе приема и анализа сигнала BL-420N, а вилка провода ЭКГ была вставлена в трёхканальный входной порт системы BL-420N. Штифты вставлялись подкожно во внутреннюю сторону правой передней конечности, правой задней конечности и левой задней конечности крыс. Штифты замачивались и стерилизовывали в 75% спирте перед операцией, при этом следили за тем, чтобы не вставлять их в мышцы. Зажимы электродов провода ЭКГ затем были подключены к контактам каждой конечности. Были включены переключатель питания и системное программное обеспечение биологической системы приема и анализа сигналов BL-420N. Для передачи сигнала был выбран канал 3, и тип сигнала был установлен как rat ECG. Параметры были установлены следующим образом: частота дискретизации — 1 кГц; дальность — 2,0 мВ; временная постоянная (высокочастотная фильтрация), 200 мс (0,80 Гц); низкочастотная фильтрация — 100 Гц; скорость сканирования — 200,0 мс/див; и 50 Гц фильтр выреза был отключён. Была зафиксирована ЭКГ Lead II, и наблюдались изменения в ЭКГ. После стабилизации ЭКГ проводились мониторинг и запись в течение 3 минут, а данные сохранялись группами для последующего анализа. После записи ЭКГ клипсы и штифты для электродов были сняты, а крысы возвращались в клетки. Крыс содержали в тепле, а их дыхание контролировалось до полного восстановления после анестезии, чтобы предотвратить смерть, связанную с удушением. Исходные записи ЭКГ проводились в первый день до начала лечения. На второй день крысам вводили Acon через внутрижелудочный гавадж, а затем записи ЭКГ проводились через 1, 3 и 6 часов после применения той же процедуры.

Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) и массонским окрашиванием

Сердца были разрезаны в горизонтальной плоскости короткой оси, а сердечная ткань с верхушки сердца у крыс с SD была собрана и закреплена в 4% полиформальдегиде при комнатной температуре в течение 24 часов. Фиксированные ткани были обезвожены, очищены в ксилоле и погружены в парафиновый воск. Затем срезы толщиной 4 мкм окрашивались HE и Masson по стандартной процедуре. При окрашивании гематоксилином проводилось 2 минуты, затем образцы замачивались в тёплой воде на 1 минуту, после чего эозин окрашивались 30 секунд. При окрашивании Массона окрашивайте раствором гематоксилина железа Вейгерта в течение 5 минут, затем раствором Массона синего 3–5 минут, и наконец анилин-синим раствором 1–2 минуты. Слайды наблюдались под обычным оптическим микроскопом. Для каждого участка случайным образом выбирались пять неперекрывающихся микроскопических полей с одинаковым увеличением, избегая крупных сосудов и очевидных артефактов. Доля объема коллагена (CVF) была рассчитана с помощью ImageJ согласно уравнению (1):

(1)

Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA)

После записи ЭКГ крысам анестезиировали пентобарбиталом натрия, а затем была проведена промежуточная лапаротомия для сбора венозной крови. Образцы крови были взяты путём прокола нижней полой вены с помощью одноразовой венозной иглой для сбора крови. Кровь была инкубирована при 4 °C ночью, а супернатант был собран после центрифугирования при 1000 × г в течение 20 минут. Концентрации CK-MB, AST, LDH, cTn-1 и h-FABP были определены с помощью теста ELISA. ELISA проводилась в соответствии с инструкциями производителя. Значения оптической плотности (OD) каждой ямы определялись на 450 нм с помощью считывателя микропластин.

Вестерн-блоттинг-анализ

Общий белок извлекался из сердечных тканей с помощью набора для экстракции белка. Для определения концентрации белка использовался тест BCA. Общий объем белка (объём образца тестируемого белка составлял 10 мкл) отделялся с помощью электрофореза гель с помощью 10% натрия додецилсульфат-полиакриламида и передался на мембрану PVDF, блокируя в 5% обезжиренном молоке на 30 минут. Впоследствии мембрана была инкубирована ночью с первичными антителами JNK1/2 (1:500), p-JNK1/2 (1:1000) и GAPDH (1:4000). На следующий день все мембраны были промыты PBST три раза, а затем инкубированы соответствующим вторичным антителом (1:5000) в течение 1 часа. Наконец, для обнаружения сигналов использовались усиленные химилюминесцентные реагенты; раствор для проявления равномерно наносили по капле на мембранные полоски PVDF и давали инкубировать в течение 10 секунд, после чего следовали экспозиция, проявление и визуализация. Интенсивность вестерн-блот-полосы измерялась с помощью программного обеспечения ImageJ.

Валидация молекулярного стыковки

SDF 3D-молекулярная структура аконитина была скачана из базы данных PubChem, а структура SDF преобразована в mol2-структуру с помощью программного обеспечения OpenBabel. Самые высокоразрешённые и самые длинные структуры белков PDB JNK1 и JNK2 были скачаны из баз данных Uniprot и Protein Data Bank. Гидрогенизация, удаление лигандов и полное добавление водорода проводились на макромолекулярных белках, тогда как полное добавление водорода и электронная нагрузка — на малых молекулярных соединениях, а также устанавливались торсионные связи. Эксперименты по молекулярному стыкованному соединению проводились с помощью AutoDock Vina, где аффинности связывания ≤ -7,0 ккал/моль были определены как признак сильных взаимодействий лиганд-белок. PyMol использовался для визуализации 3D-структуры стыковочного комплекса, а Discovery Studio — для визуализации 2D-структуры стыковочного комплекса.

Статистический анализ

Все эксперименты повторялись три раза независимо друг от друга. GraphPad Prism 8 использовался для статистического анализа и построения графиков всех данных. Все данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Тест t-Student использовался для сравнения двух групп. Для сравнения нескольких групп в одну и ту же точку времени или анализов по течению времени внутри одной группы использовался односторонний ANOVA. p < 0,05 считался статистически^{значимым 25}.

Результаты

Результаты ЭКГ у крыс после гаважа Acon

Предыдущие исследования показали, что токсические эффекты аконитина проявляются на ранней стадии, обычно в течение нескольких часов после введения^26,27. Поэтому, чтобы зафиксировать раннее появление и прогрессирование острой кардиотоксичности в этом временном окне, мы выбрали три временных точки: 1, 3 часа и 6 часов для экспериментов. Результаты электрокардиограммы показали, что после 1, 3 и 6 часов действия Acon аритмий в контрольной и группе Acet не наблюдалось, а изменения ЭКГ были незаметны. Крысы из группы Acon-1mg имели преждевременные желудочковые сокращения и преждевременную желудочковую бигеминию соответственно, преждевременную желудочковую тройку, короткий разрыв желудочковой тахикардии, мономорфную желудочковую тахикардию, двунаправленную желудочковую тахикардию и одну или несколько желудочковых аритмий. Крысы из группы Acon-2 mg развили преждевременные желудочковые сокращения, одну или несколько желудочковых аритмий, включая преждевременную желудочковую бигеминию, короткую разрывную желудочковую тахикардию и двустороннюю желудочковую тахикардию (рисунок 1, дополнительные рисунки 1–2). Acon способствует патологическому повреждению миокарда и увеличивает окрашивание коллагена в тканях миокарда крыс.

Ткань миокарда была оценена с помощью окрашивания HE. Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой и группой ацета, после 1, 3 и 6 часов лечения Acon, ткань миокарда у крыс с SD в группе Acon-1 mg демонстрировала частичный разрыв мышечных волокон миокарда, неорганизованное расположение клеток миокарда, расширение миокарда, отек возникает в миокардном интерстиции. Большинство клеток миокарда опухли, ядра глубоко окрашены и конденсированы, большое количество клеток миокарда подвергается дегенерации, а в цитоплазме волокна миокарда образуются круглые вакуоли (указано стрелками). Полосатые мышечные волокна в ткани миокарда у крыс с SD в группе Acon-2 мг были неясны или исчезли; Расположение мышечных пучков было рыхлым и беспорядочным, межмышечные пространства расширялись, большое количество ядер клеток было глубоко окрашено, ядерный пикноз, межклеточный отёк и клетки миокарда были опухшими и дегенерированными. Цитоплазма волокон миокарда показала круглые вакуоли (показаны стрелками) (рисунок 2A, дополнительный рисунок 3A, дополнительный рисунок 4A).

Для оценки отложения коллагена в ткани миокарда проводилось окрашивание по методу Массона. В контрольной и ацетной группах кардиомиоциты демонстрировали нормальную морфологию с минимальным отложением коллагена в миокардном интерстиции. В группе Acon-1 мг наблюдалось небольшое увеличение количества синего окрашения коллагена в некоторых интерстициальных областях. В группе Acon-2 мг более обширные синие окрашенные области были диффузно распределены по ткани миокарда, сопровождаясь дезорганизованным расположением миофиламентов и нарушением нормальной структуры миокарда. Степень окрашивания коллагена в группе Acon-2 мг была выше, чем в группе Acon-1 mg. Количественный анализ показал, что доля объема коллагена (CVF) значительно увеличилась как в группах Acon-1 mg, так и Acon-2 mg по сравнению с группами Контрольной и Acet (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05). Примечательно, что значение CVF достигло наивысшего уровня в группе Acon-2 мг через 6 часов после внутрижелудочного введения (рисунок 2B, дополнительный рисунок 3B, дополнительный рисунок 4B). Учитывая короткий период наблюдения (1–6 часов), эти результаты, скорее всего, отражают острые интерстициальные изменения, такие как отёки или изменения в окрашивании коллагена, а не установленный фиброз миокарда. Кроме того, после лечения Acon-1 мг или Acon-2 мг не было заметно значимой разницы в массе сердца между группами на 1, 3 и 6 чах (Таблица 5).

Acon способствует развитию сердечных ферментов и белка в венозной крови крыс

Для оценки повреждения миокарда, вызванного Acon, мы измерили уровень маркеров сердечных повреждений в сыворотке, включая CK-MB, AST, LDH, cTn-I и h-FABP. В сравнении с контрольной и ацетной группами, группы Acon-1 мг и Acon-2 мг показали значительно повышенные уровни CK-MB, AST, LDH, cTn-I и h-FABP через 1, 3 и 6 часов (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05). Более того, в то же время увеличение этих маркеров было более заметным в группе Acon-2 mg, чем в группе Acon-1 mg (p < 0,05) (рисунок 3).

Результаты молекулярного стыковки

Для дальнейшего изучения влияния Acon на сигнальный путь повреждения миокарда у крыс мы использовали молекулярное докирование для выявления белков, связанных с Acon. Результаты стыковки показали, что Acon может стабильно связываться с активными карманами как JNK1, так и JNK2 через несколько нековалентных взаимодействий. В JNK1 аконитин образовал две традиционные водородные связи с ALA267 и SER299, с расстояниями связей 2,0 Å и 2,1 Å соответственно, что указывает на сильные направленные взаимодействия, способствующие закреплению лигандов. Кроме того, наблюдались обширные взаимодействия ван-дер-Ваальса между аконитином и окружающими остатками, что способствовало тесной пространственной комплементарности внутри кармана связывания. Гидрофобные взаимодействия, включая взаимодействия алкил/π-алкил с ILE304, дополнительно стабилизировали лиганд в гидрофобной микросреде. Также были выявлены углеродно-водородные связи, формирующие кооперативную сеть взаимодействия, поддерживающую связывание лигандов (рисунок 4A–C). В JNK2 аконитин образует одну обычную водородную связь с LEU302 (2,1 Å), выступая ключевым анкорным взаимодействием. Подобно JNK1, взаимодействия ван дер Ваальса, гидрофобные взаимодействия и углеродно-водородные связи вместе способствовали стабилизации лиганд-белкового комплекса (рисунок 4D–F). Результаты стыковки для исследуемых соединений представлены в виде баллов связывания (ккал/моль) и приведены в таблице 6. В целом, водородные связи обеспечивали специфичность и закрепление, гидрофобные взаимодействия усилили вложение и аффинность связывания лигандов, а взаимодействия ван-дер-Ваальса способствовали общей стабильности комплекса. Эти данные показывают, что аконитин может образовывать стабильные комплексы как с JNK1, так и с JNK2, что подтверждает его потенциал как таргетирующего агента.

Acon повышает уровень фосфорилирования JNK

Для дальнейшего изучения влияния Acon на сигнальный путь JNK в ткани миокарда экспрессия фосфорилирования JNK1/2 была оценена методом Western blotting. В сравнении с группами Контрольной и Ацетной группами, группы Acon-1 мг и Acon-2 мг показали значительно повышенные уровни p-JNK1/2 (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05). Кроме того, уровень фосфорилирования JNK1/2 был значительно выше в группе Acon-2 mg, чем в группе Acon-1 mg (p < 0,05) (рисунок 5A). В группе Acon-2 мг сравнения между разными временными точками показали, что уровни p-JNK1/2 значительно повышались через 1, 3 и 6 часов, при этом самый высокий уровень наблюдался на 6 чах (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05) (рисунок 5B). На основе этих результатов для последующих экспериментов была выбрана группа Acon-2 mg на 6 часах.

Ингибитор JNK облегчает патологические повреждения миокарда и окрашивание коллагена в ткани миокарда крыс

Для дальнейшей оценки регуляторной роли сигнального пути JNK уровни экспрессии p-JNK1 и p-JNK2 в ткани миокарда были оценены методом вестерн-блоттинга. По сравнению с группами контрольной группы и группы DMSO, группа Acon показала значительно повышенный уровень экспрессии p-JNK1 и p-JNK2 (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05). По сравнению с группой Acon, группа Acon+SP600125 показала значительное снижение уровней p-JNK1 и p-JNK2 (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05). В отличие от этого, по сравнению с группой Acon+SP600125, группа Acon + Anis показала значительно повышенный уровень экспрессии p-JNK1 и p-JNK2 (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05) (рисунок 6).

Влияние Аниса и SP600125 на повреждение миокарда было дополнительно изучено. Результаты окрашивания HE показали, что по сравнению с группой Acon интерстициальный отёк ткани миокарда в группе Acon+SP600125 был уменьшен, отёк некоторых кардиомиоцитов исчез, а цитоплазма клетки была равномерной. Мышечное пространство заполнено, межмышечное пространство становится тоньше, некоторые волокна миокарда расположены плотно и упорядоченно, небольшое количество ядер клеток глубоко окрашено, а цитоплазма волокон миокарда показывает маленькие круглые вакуоли, и патологическое повреждение миокарда облегчается. В сравнении с группой Acon+SP600125 группа Acon + Anis имела сломанные волокна миокарда, расширенные мышечные промежутки, свободно и беспорядочно расположенные волокна миокарда, опухшие и дегенерированные клетки миокарда, ядерный хроматин был глубоко окрашен, и возник межклеточный отёк (рисунок 7A).

Массоновское окрашивание проводилось для оценки окрашивания коллагена в ткани миокарда. В группе Acon+SP600125 в миокардном интерстиции наблюдались умеренно окрашенные синим пятнами. По сравнению с группой Acon, доля объема коллагена (CVF) в группе Acon+SP600125 была значительно снижена, что свидетельствует об ослаблении интерстициальных изменений, вызванных аконитином. В отличие от этого, в группе Acon + Anis в миокардиальной интерстиции наблюдались более обширные участки с синим окрашением коллагена по сравнению с группой Acon+SP600125, что сопровождалось значительным увеличением CVF (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05) (рисунок 7B). Кроме того, существенной разницы в массе сердца между группами не было выявлено (Таблица 5). Учитывая короткий период наблюдения (1–6 ч), эти изменения чаще отражают острые интерстициальные изменения, такие как отёки или изменения в окрашивании коллагена, а не устоявшийся фиброз миокарда. Эти результаты свидетельствуют о том, что SP600125 облегчает повреждение миокарда, вызванное аконитином, тогда как анизомицин ещё больше усугубляет повреждение миокарда в этих экспериментальных условиях.

Ингибитор JNK снижает экспрессию сердечных ферментов и белоков сердца в сыворотке крыс

Результаты ELISA показали, что по сравнению с группой Acon экспрессия CK-MB, AST и LDH была значительно снижена в группе Acon + SP600125, тогда как экспрессия CK-MB, AST и LDH увеличилась после действия Anis (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05). Кроме того, по сравнению с группой Acon, экспрессия cTn-I и h-FABP была значительно снижена в группе Acon + SP600125 (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05). По сравнению с группой Acon + SP600125, экспрессия cTn-I и h-FABP была значительно увеличена в группе Acon + Anis (n = 3 крысы на группу, односторонний ANOVA, p < 0,05) (рисунок 8A–8B).

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Все исходные данные, использованные в этом исследовании, доступны в дополнительных файлах, приложенных к рукописи.

Рисунок 1: Электрокардиограмма, иллюстрация аритмии у крыс (после 6 часов действия Acon). Сверху вниз — контрольная группа, группа ацета, группа Acon-1 мг и группа Acon-2 мг. Типы аритмий при Acon-1mg-A-гаваже и Acon-2 мг-A-гаваге (в порядке возникновения аритмий сверху вниз): Acon-1mg-A-гаваджа: преждевременные желудочковые сокращения; преждевременная желудочковая бигеминия; двунаправленная желудочковая тахикардия. Акон-2 мг-А-гаваж: преждевременные сокращения желудочков; преждевременная желудочковая бигеминия; короткий всплеск желудочковай тахикардии. Сокращения; B-gavage = До Acon gavage; A-gavage = После Acon gavage. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Повреждение миокарда и окрашивание коллагена в ткани миокарда крыс, отмеченные окрашиванием HE и Массона. (A) Патологические изменения в ткани миокарда крыс были выявлены с помощью окрашивания HE (жёлтая стрелка указывает на круглые вакуоли, образованные повреждёнными кардиомиоцитами); шкала = 100 мкм. (B) Окрашивание коллагена в ткани миокарда крыс было обнаружено с помощью окрашивания Массона; масштаб = 50 мкм. Среднее ± SD, n = 3. Все P-значения рассчитывались с помощью независимого одностороннего анализа дисперсии. *p < 0.05, **p < 0.01. 40x и 400x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Уровни CK-MB, AST, LDH, cTn-I и h-FABP в сыворотке крыс указывали на повреждение миокарда. (A–F). Уровни CK-MB, AST, LDH, cTn-I и h-FABP измерялись с помощью наборов ELISA. Среднее ±SD, n = 3. Все p-значения рассчитывались с помощью независимого одностороннего анализа дисперсии. *p < 0.05, **p < 0.01. Сокращения; CK-MB = креатинова киназа-MB; AST = аспартатаминотрансфераза; LDH = лактатдегидрогеназа; cTn-I = сердечный тропонин I; h-FABP = белок, связывающий жирные кислоты сердечного типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Результаты молекулярного стыковки Acon с путём JNK. (A–B) и (D–E) Двумерные диаграммы взаимодействия Acon с белком JNK1/2. (C) и (F) 3D-диаграммы взаимодействия Acon с белком JNK1/2. Сокращения; JNK = c-Jun N-терминальная киназа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Acon регулирует уровень фосфорилирования JNK. (A–B) Уровни экспрессии p-JNK1/2 и JNK1/2 в тканях миокарда крыс были обнаружены методом западного блотинга. Среднее ± SD, n = 3. Все p-значения рассчитывались с помощью независимого одностороннего анализа дисперсии. *p < 0.05, *p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Ингибитор JNK ингибирует фосфорилирование JNK, вызванное Acon. Уровни экспрессии p-JNK1/2 и JNK1/2 в тканях миокарда крыс были обнаружены методом западного блотинга. Среднее ± SD, n = 3. Все p-значения рассчитывались с помощью независимого одностороннего анализа дисперсии. *p < 0,05, **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Ингибитор JNK облегчает патологические повреждения миокарда и окрашивание коллагена у крыс. (A) Патологические изменения в тканях миокарда крыс были обнаружены с помощью окрашивания HE (жёлтая стрелка показывает круглые вакуоли, образованные повреждёнными кардиомиоцитами); масштаб = 100 мкм. (B) Окрашивание коллагена в ткани миокарда крыс было обнаружено с помощью окрашивания Массона; масштаб = 50 мкм. Среднее ±SD, n = 3. Все p-значения рассчитывались с помощью независимого одностороннего анализа дисперсии. *p < 0,05, **p < 0,01. 40 и 400x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Ингибитор JNK понижает уровни CK-MB, AST, LDH, cTn-I и h-FABP в сыворотке крыс. (A–B) Уровни экспрессии CK-MB, AST, LDH, cTn-I и h-FABP были обнаружены с помощью тестовых наборов ИФА. Все p-значения рассчитывались с помощью независимого одностороннего анализа дисперсии. Среднее ±SD, n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Сокращения; CK-MB = креатинкиназа-MB; AST = аспартатаминотрансфераза; LDH = лактатдегидрогеназа; cTn-I = сердечный тропонин I; h-FABP = белок, связывающий жирные кислоты сердечного типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

	Управление	Acet	Acon-1 мг	Acon-2 мг
Крысы	9	9	9	9
Количество смертей крыс	0	0	0	0

Таблица 1: Количество смертей крыс после 1 часа действия Acon. Через 1 час после введения Acon в группах контрольной группы, группы с ацетом, группе Acon-1 мг и Acon-2 мг не умерла крыса. (В итоге количество животных, включенных в анализ по группам, составило 3, а мёртвые крысы не были заменены).

	Управление	Acet	Acon-1 мг	Acon-2 мг
Крысы	9	9	9	9
Количество смертей крыс	0	0	0	0

Таблица 2: Количество смертей крыс после 3 часов действия Acon. Через 3 часа после введения Acon в группе контрольной группы, группе с ацетом, группе Acon-1 мг и Acon-2 мг не погибла крыса. (В итоге количество животных, включенных в анализ по группам, составило 3, а мёртвые крысы не были заменены).

	Управление	Acet	Acon-1 мг	Acon-2 мг
Крысы	9	9	9	9
Количество смертей крыс	0	0	4	4

Таблица 3: Количество смертей крыс после 6 часов действия Acon. Через 6 часов после введения Acon 4 из 9 крыс умерли в группе Acon-1 mg, а 4 из 9 крыс — в группе Acon-2 mg. (В итоге количество животных, включенных в анализ по группам, составило 3, а мёртвые крысы не были заменены).

	Управление	DMSO	Acon	Acon + SP600125	Acon + Anis
Крысы	9	9	9	9	9
Количество смертей крыс	0	0	3	1	3

Таблица 4: Количество смертей крыс после Аниса и SP600125 действия . Количество смертей крыс варьировалось в зависимости от группы лечения: в группе Acon-2 мг 3 из 9 крыс умерли; в группе Acon+SP600125 1 из 9 крыс погибла; а в группе Acon + Anis 3 из 9 крыс погибли. (В итоге количество животных, включенных в анализ по группам, составило 3, а мёртвые крысы не были заменены).

Группа	Вес сердца (g)
Управление	0,71 ± 0,03
Acet	0,73 ± 0,02
Acon-1 мг (1 ч)	0,73 ± 0,06
Acon-2 мг (1 час)	0,75 ± 0,02
Acon-1 мг (3 часа)	0,71 ± 0,04
Акон-2 мг (3 часа)	0,77 ± 0,03
Acon-1 мг (6 ч)	0,72 ± 0,03
Acon-2 мг (6 ч)	0,77 ± 0,02
DMSO	0,70 ± 0,03
Acon + SP600125	0,74 ± 0,03
Acon + Anis	0,75 ± 0,04

Таблица 5: Тяжесть сердца крыс . Существенной разницы в весе сердца между группами не наблюдалось.

Лиганд	JNK1	JNK2
Acon	-7,8 Ккал/моль	-8,41 Ккал/моль

Таблица 6: Результаты исследований молекулярного стыковки. Показатели стыковки между Acon и JNK1 составляют -7,8 Ккал/моль, а между Acon и JNK2 — -8,41 Ккал/моль.

Дополнительный рисунок 1: Электрокардиограмма, иллюстрация аритмии у крыс (после 1 часа действия Acon). Сверху вниз — контрольная группа, группа ацета, группа Acon-1 мг и группа Acon-2 мг. Типы аритмий при Acon-1mg-A-гаваже и Acon-2 mg-A-гаваже (в порядке возникновения аритмий сверху вниз): преждевременные желудочковые сокращения; преждевременная желудочковая бигеминия; преждевременный желудочковый триплет; короткая разрывная желудочковая тахикардия; мономорфный желудочковый сердечный ритм тахикардии; двунаправленная желудочковая тахикардия. Acon-2 mg-A-гаваж: двусторонняя желудочковая тахикардия. Сокращения; B-gavage = До Acon gavage; A-gavage = После Acon gavage. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Электрокардиограмма аритмии у крыс (после 3 часов действия Acon). Сверху вниз — контрольная группа, группа ацета, группа Acon-1 мг и группа Acon-2 мг. Типы аритмий при Acon-1mg-A-гаваже и Acon-2 mg-A-гаваже (в порядке возникновения аритмий сверху вниз): преждевременные желудочковые сокращения; короткие всплески желудочковой тахикардии; двунаправленная желудочковая тахикардия. Acon-2 mg-A-гаваж: преждевременные сокращения желудочков; двунаправленная желудочковая тахикардия. Сокращения; B-gavage = До Acon gavage; A-gavage = После Acon gavage. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Acon способствует повреждению миокарда и окрашиванию коллагена после 1 часа действия Acon. (A) Патологические изменения в тканях миокарда крыс были обнаружены с помощью окрашивания HE (Примечание: жёлтая стрелка показывает круглые вакуоли, образованные повреждёнными кардиомиоцитами); масштаб = 100 мкм. (B) Фиброз в ткани миокарда крыс был обнаружен с помощью окрашивания Массона; масштаб = 50 мкм. Среднее ± SD, n = 3. Все p-значения рассчитывались с помощью независимого одностороннего анализа дисперсии. *p < 0.05, **p < 0.01, 40x и 400x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Acon способствует повреждению миокарда и окрашиванию коллагена после 3 часов действия Acon. (A) Патологические изменения в тканях миокарда крыс были обнаружены с помощью окрашивания HE (жёлтая стрелка показывает круглые вакуоли, образованные повреждёнными кардиомиоцитами); масштаб = 100 мкм. (B) Окрашивание коллагена в ткани миокарда крыс было обнаружено с помощью окрашивания Массона; масштаб = 50 мкм. Среднее ± SD, n = 3. Все p-значения рассчитывались с помощью независимого одностороннего анализа дисперсии. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x и 400x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Акон может вызывать аритмии и повреждение миокарда; однако основные механизмы повреждения миокарда, вызванного Аконом, остаются неясными. В этом исследовании была успешно установлена модель острого отравления Аконом на крысе с повреждением миокарда. Эти результаты показали, что активация сигнального пути JNK может представлять собой ключевой следующий механизм повреждения миокарда, вызванного острым отравлением Acon. В частности, уровень фосфорилирования JNK1/2 был значительно повышен у крыс с аритмиями, вызванными Acon, и повреждением миокарда. Кроме того, ингибирование пути JNK частично обратило вспять повреждение миокарда, вызванное острым отравлением Acon. Эти данные свидетельствуют о том, что активация пути JNK играет важную роль в патогенезе повреждения миокарда, вызванного аконитином.

Основная причина смерти от острого отравления Аконом — кардиотоксичность. Предыдущие исследования показали, что после обработки Acon волокна миокарда у крыс деградировали и неорганизованы, окрашивание ядра углублялось, происходила инфильтрация нейтрофилами, и появилось круглое количество вакуолей^. Это соответствует результатам исследований. Окрашивание HE показало, что ткань миокарда в группе, обработанной Acon, проявила патологические изменения, включая неорганизованное расположение мышечных пучков, расширение мышечных щелей и разрыв мышечных волокон. Кроме того, при нормальных условиях сердечные ферменты CK-MB, AST, LDH и сердечные белки cTn-I и h-FABP содержатся в очень малых количествах в^{сыворотке 29}. Когда клетки миокарда повреждаются, эти маркеры выделяются в кровь в больших^{количествах — 30, 31, 32, 33.}

Результаты этого исследования показывают, что уровень CK-MB, AST, LDH, cTn-I и h-FABP в венозной сыворотке крыс группы Acon увеличивался в разной степени в каждой точке наблюдения. Уровень экспрессии максимальный после 6 часов внутрижелудочного введения. Этот вывод соответствует предыдущим^{исследованиям 34}. Они обнаружили, что Acon повреждает кардиомиоциты H9C2 крыс и повышает уровень AST. В то же время предыдущие исследования использовали Acon для индуцирования повреждения миокарда у крыс с целью изучения влияния противоядий на повреждение миокарда³⁵. Они обнаружили, что уровни LDH и CK-MB в сыворотке крыс с повреждением миокарда были повышены. Короче говоря, экспериментальные результаты суставного обнаружения маркеров повреждения миокарда показывают, что модель повреждения миокарда у крыс, вызванная острым отравлением Acon, может быть успешно установлена через 1, 3 и 6 часов после внутрижелудочного введения 1–2 мг/кг Acon. Лучший результат моделирования 2 мг/кг акона после внутрижелудочного введения в течение 6 часов является лучшим, что соответствует требованиям последующих экспериментов.

Исследования показали, что влияние Acon на ионные каналы Na⁺ и^Ca2+ приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция, что дополнительно активирует сигнальный путь P38-MAPK и впоследствии запускает каскадную реакцию^JNK 36,37,38. Активация JNK увеличит повреждения миокарда ^39,40. Это соответствует результатам данного эксперимента. В этом исследовании мы обнаружили, что Acon способствует фосфорилированию JNK1/2 в кардиомиоцитах и активирует сигнальный путь JNK. Это указывает на то, что активация JNK может представлять собой сигнальный ответ по низу, способствующий повреждению миокарда, вызванному аконитином. Однако молекулярные и фармакокинетические механизмы, лежащие в основе стимуляции фосфорилирования JNK1/2 в Acon, требуют дальнейших исследований.

Исследования показали, что при фосфорилировании большого количества JNK1/2 активируется сигнальный путь JNK, который, в свою очередь, опосредует неконтролируемую экспрессию генов в ядре кардиомиоцитов и нарушает клеточный цикл. Ингибирование сигнального пути JNK может облегчить повреждение миокарда^41,42. В результатах HE ингибитор пути JNK SP600125 может значительно уменьшить патологические изменения в ткани миокарда, вызванные Acon. В то же время предыдущие исследования показали, что в модели острого инфаркта миокарда у крыс, вызванного коронарной перевязкой артерий, синие окрашенные коллагеновые волокна и отложение коллагена в ткани миокарда значительно увеличились, сопровождаясь активацией сигнального пути JNK. Лечение гранулами традиционной китайской медицины снижало отложение коллагена миокарда за счёт ингибирования сигнального пути^{JNK 43,44} .

У крыс с диабетическим повреждением миокарда содержание коллагена (синие пятна) и объемная фракция коллагена (CVF) значительно увеличились. Одновременно был активирован сигнальный путь JNK. Сообщается, что низкодозовый этанол ингибирует активацию пути JNK, тем самым снижая увеличение отложения коллагена и CVF в ткани миокарда^{крыс 45}. В настоящем исследовании анализ молекулярного стыкинга показал, что аконитин может взаимодействовать с JNK1 и JNK2 через несколько нековалентных взаимодействий; однако эти результаты следует считать подтверждающими доказательствами и не являются прямым доказательством физиологической связывания. Кроме того, эксперименты in vivo показали, что Acon, как стрессор, усиливает фосфорилирование JNK1/2, тем самым активируя сигнальный путь JNK. Эта активация была связана с увеличением отложения коллагена (синими пятнами) и повышенным CVF в ткани миокарда крысы, что в конечном итоге привело к повреждению миокарда. Однако добавление ингибитора JNK SP600125 значительно подавило токсичное действие Acon, уменьшая увеличение CVF-значения ткани миокарда. Повреждение миокарда нарушает целостность нормальной миоцитной мембраны сердца и потерю внутриклеточного содержимого в внеклеточное пространство, что проявляется в виде повышения уровня миокардиальных ферментов в^{крови 46,47}. Эти результаты показали, что повышение уровня ферментов миокарда в крови крыс также указывало на повреждение миокарда. В то же время ингибиторы JNK подавляли секрецию ферментов миокарда, что позволяет предположить, что ингибиторы JNK могут частично облегчить повреждение миокарда, вызванное Acon.

Следует признать ряд ограничений этого исследования. Во-первых, размер выборки в каждый момент времени был относительно малым (n = 3 на группу), что может ограничивать статистическую мощь анализа, и формальный анализ мощности не проводился до определения размера выборки. Кроме того, оценивался только один диапазон доз аконитина и относительно короткие периоды наблюдения (1–6 ч), что ограничивало оценку долгосрочных патологических изменений и взаимосвязей дозового ответа. Во-вторых, хотя усиление фосфорилирования JNK1/2 и фармакологическое вмешательство указывали на участие сигнального пути JNK при повреждении миокарда, вызванном аконитином, механизмы, связывающие воздействие Аконитина с активацией JNK, не были полностью изучены. Известно, что аконитин в первую очередь влияет на напряжение-зависимые Na⁺ каналы и внутриклеточный Ca²⁺ гомеостаз, что может способствовать активации JNK на последующих этапах. Однако связанные сигнальные события, включая окислительный стресс и пути перегрузки кальцием, не были непосредственно изучены в настоящем исследовании. В-третьих, анализ молекулярного стыкинга предоставил лишь подтверждающие доказательства возможных взаимодействий между аконитином и JNK1/2 и не отражал прямого физиологического связывания. Дополнительной экспериментальной валидации, такой как поверхностный плазмонный резонанс или анализы с вытяжением вниз, не проводилось. Кроме того, исследованы только JNK1/2, а потенциальная роль JNK3 в кардиотоксичности, вызванной аконитином, остаётся неясной. Наконец, электрокардиографическая оценка не проводилась после SP600125 или вмешательства анизином. Поэтому вопрос, влияет ли регуляция путь JNK непосредственно на желудочковые аритмии, вызванные аконитином, требует дальнейшего изучения.

В заключение, Acon активирует сигнальный путь JNK, что подтверждается увеличением фосфорилирования JNK1/2, что может способствовать повреждению миокарда, что подтверждается усиленным отложением коллагена и повышенным высвобождением сердечных ферментов в ткани миокарда крыс. Учитывая, что кардиотоксичность, вызванная аконитином, включает несколько восходящих событий, включая активацию Na⁺ канала, перегрузку Ca²⁺ и окислительный стресс, активация пути JNK может представлять собой ключевое сигнальное событие, способствующее повреждению миокарда.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4% параформальдегид	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	HJ203501	Фиксация тканей
Аконитин (Acon)	Chengdu DeSiTe Biological Technology Co., Ltd.	DRK-0335-960330	Токсичное соединение для модели гаважа
Анилиновое синее решение	Beijing Solarbio Co., Ltd.	G1350	Массонское окрашивание
Анизомицин (Anis)	MedChemExpress Co., Ltd.	153154	Активатор/управление путём JNK
AST ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E13023r	Обнаружение сердечных ферментов
AutoDock Vina	Открытый исходный код	Н/Д	Молекулярная стыковка
Набор для анализа белков BCA	Sangon Biotech (Шанхай, Китай)	Не указано	Количественная оценка белков
Центрифуга	Dongguan cnzcn Co., Ltd.	TD5M-WS	1000 и раз; Центрифугирование g
Программное обеспечение Chem3D	ПеркинЭлмер	Н/Д	Минимизация энергии лиганда
CK-MB ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E14403r	Обнаружение сердечных ферментов
cTn-I набор ELISA	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E08594r	Обнаружение сердечных белков
Одноразовая игла для сбора венозной крови	KINDLY Co., Ltd.	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	Сбор крови
Реагент усиленной хемилюминесценции (ECL)	Millipore Co., Ltd.	21302A4	Визуализация вестерн-блот
Эозин	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20200905	H& E-окрашивание
GraphPad Prism 8	GraphPad Software, Inc.	Н/Д	Статистический анализ
Гематоксилин	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	CR2203066	H& E-окрашивание
h-FABP ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E16184r	Обнаружение сердечных белков
ImageJ Software	Национальные институты здравоохранения (NIH)	Н/Д	Количественная оценка западного блота
Первичные антитела JNK1/2	HuaAn Biotechnology (Ханчжоу, Китай)	ET1609-42	Антитела вестерн-блот
Набор ЭЛИСА LDH	Шанхайская биотехнология, связанная с ферментами	ml003416	Обнаружение сердечных ферментов
Массон Блю Солюс	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20220303	Массонское окрашивание
Считыватель микропластин	Термо Фишер Сайентифик	ME001000C	Измерение OD ELISA (450 нм)
Оптический микроскоп (Olympus C33)	Olympus (Токио, Япония)	C33	Гистологическая визуализация
Парафиновый воск	Leica  Co., Ltd.	2110068	Вложение тканей
PBST Buffer	Meilunbio Co., Ltd.	MA0015-Apr-27G2	Промывочный буфер
Первичное антитело p-JNK1/2	HuaAn Biotechnology (Ханчжоу, Китай)	ET1601-28	Фосфорилированное антитело JNK
Белковый банк данных (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Источник структуры белка
Набор для извлечения белка	Sangon Biotech (Шанхай, Китай)	C510003-0050	Извлечение тканевого белка
База данных PubChem	NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	Источник структуры лиганды
Мембрана PVDF	Millipore Co., Ltd.	R1PB81493	Западная мембрана переноса блота
PyMOL	Schrö Dinger, Inc.	https://pymol.org/	Визуализация стыковки
SDS-PAGE Gel (10%)	Beijing Solarbio Co., Ltd.	817X031	Электрофорез белков
Обезжиренное молоко	Beijing Solarbio Co., Ltd.	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	Блокирующий реагент (5%)
Пентобарбитал натрия	Thermo Fisher Scientific Inc.	57-33-0	Анестезия для процедур на животных
SP600125 (ингибитор JNK)	MedChemExpress Co., Ltd.	112518	Ингибитор пути JNK
Дом для животных SPF	Куньминский медицинский университет	Н/Д	Условия содержания животных
Крысы Спраг-Доули (самцы, 2 месяца, ~230 г)	Beijing Huafukang Biological Technology Co., Ltd.	http://www.hfkbio.com/	Экспериментальные животные (n = 51)
Железный гематоксилин Вейгерта	Guangzhou Wexis Co., Ltd.	18092001	Массонское окрашивание
Ксилол	Tianjin Tjhxsj Co., Ltd.	20220208	Очищение тканей