Надёжная изоляция и мультиплексированная идентификация циркулирующих редких клеток с помощью непрерывной центробежной микрофлюидики и гидрогелевой иммуноцитохимии

Краткое содержание

В данном исследовании представлен непрерывный центробежный микрофлюидный процесс для эффективной изоляции и идентификации циркулирующих редких клеток. Система обеспечивает точное управление жидкостями и минимизирует потери клеток, позволяя одновременно анализировать несколько подтипов CRC, включая CTC и cCAF, для повышения точности диагностики.

Аннотация

Циркулирующие редкие клетки (CRC), включая циркулирующие опухолевые клетки (CTC) и циркулирующие афро-ассоциированные фибробласты (cCAFs), являются перспективными биомаркерами для диагностики и прогноза рака. Однако их крайне низкая численность и фенотипическая гетерогенность делают эффективное выделение и мультипараметрический анализ технически сложными. Здесь мы представляем непрерывный центробежный микрофлюидный рабочий процесс для последовательного выделения и идентификации КРК из цельной крови. Картридж состоит из пяти взаимосвязанных камер с управляемыми клапанами, позволяющими точно работать с градиентом плотности среды и слоями крови во время центрифугирования. Основанный на ранее проверенной платформе обогащения, текущий рабочий процесс интегрирует иммобилизацию клеток на основе гидрогеля с мультиплексированной иммуноцитохимией для поддержки дальнейшей идентификации и характеристики нескольких подтипов CRC, включая CTC и cCAFs. После выделения клетки иммобилизуются в гидрогельном матриксе для поддержки удержания клеток при повторном иммунокрашивании и анализе на основе визуализации. Используя этот рабочий процесс, были идентифицированы как CTC, так и cCAF из одной и той же выборки, что демонстрирует возможность интегрированного анализа нескольких циркулирующих редкоклеточных популяций в рамках одного рабочего процесса жидкостной биопсии. Эта платформа предоставляет практичный и воспроизводимый подход к дальнейшей характеристике редких клеток в жидкостных биопсии.

Введение

Циркулирующие редкие клетки (КРК) определяются как клетки, находящиеся в кровотоке с чрезвычайно низкой частотой по сравнению с обычными компонентами крови, такими как эритроциты, белые кровяные клетки и тромбоциты. CRC возникают из различных источников, таких как продукты биологических процессов, ремоделирования тканей, заживления ран или повреждения сосудов. Репрезентативными примерами являются циркулирующие эндотелиальные клетки, циркулирующие фетальные клетки, мегакариоциты, эритробласти и различные предшественники или стволовые^{клетки 1,2}. Хотя само наличие КРК не обязательно отражает патологическое состояние, повышенные уровни часто указывают на аномальные физиологические или патологические^{состояния 3,4}. Соответственно, чувствительное обнаружение и характеристика CRC даёт ценные представления о динамических физиологических и патологических процессах, происходящих в организме.

Среди подтипов CRC основными биомаркерами рака являются циркулирующие опухолевые клетки (CTC) и циркулирующие фибробласты, связанные с раком, (cCAF). CTC предоставляют прямые доказательства распространения опухолевых клеток и широко^{изучены 5}. Изменения в перечислении КТК часто связаны с ранним выявлением, прогнозом и мониторингом терапевтического^{ответа 6}. Параллельно cCAF представляют собой стромальные компоненты, отбрасываемые в кровоток, отражая взаимодействия микросреды опухолей и формирование предметастазной^{ниши 7}. Однако по сравнению с CTC исследования cCAF остаются ограниченными, и их клиническая полезность только начинает^{изучаться 8}.

CTC и cCAFs могут предоставлять дополнительную биологическую информацию в жидкой биопсии, поскольку CTC отражают распространение опухолевых клеток и метастатические признаки, тогда как cCAF могут представлять собой сигналы стромального ремоделирования и прогрессии, связанные с микроокружением опухоли. Таким образом, одновременный анализ этих двух циркулирующих редкоклеточных популяций может поддержать более интегрированное понимание прогрессирования рака, чем анализ отдельных популяций. Однако их клиническая и трансляционная полезность существенно ограничена экстремальной редкостью в периферической системе крови, отсутствием универсально признанных маркеров cCAF и значительной гетерогенностью экспрессии маркеров между клеточными субпопуляциями, что вместе затрудняет надёжную идентификацию. Поэтому минимизация потерь клеток во время обогащения и идентификации крайне важна для обеспечения надёжного и надёжного анализа. Кроме того, комплексная характеристика функционального и маркерного разнообразия CTC и cCAF необходима для разъяснения их роли в метастазировании и для разработки клинически значимых^{биомаркеров 8,9}.

Здесь мы представляем метод одновременной изоляции cCAF и CTC^10,11, в сочетании с мультимаркерной идентификацией с использованием гидрогелевой инкапсуляции редких клеток иммуноцитохимии (ICC)¹². Современные методы изоляции CRC часто сталкиваются с техническими ограничениями, включая потерю клеток при многоступенчатой обработке, ограниченное захватывание фенотипически гетерогенных клеток и смещение отбора, связанное с маркерно-зависимыми стратегиями обогащения. В отличие от этого, непрерывная центробежная микрофлюидная платформа, использованная в этом исследовании, основана на комплексной структуре обогащения, что снижает зависимость от традиционных маркеров положительного отбора. Аналитические и рабочие процессы базовой платформы обогащения были описаны в наших предыдущих^{исследованиях 9}.

Опираясь на эту проверенную платформу, настоящее исследование сосредоточено на интеграции гидрогелевой иммобилизации клеток и мультиплексированной иммуноцитохимии для обеспечения комплексного выделения и идентификации нескольких циркулирующих редкоклеточных популяций, включая CTC и cCAF, в едином рабочем процессе. Сочетая обогащение, стабильное удержание клеток и многократный анализ, совместимый с окрашиванием, этот протокол предоставляет практическую основу для интегрированного анализа редкоклеточных клеток из жидких биопсийных образцов.

Протокол

Все процедуры, связанные с взятием образцов человеческой крови от пациентов и здоровых доноров, проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального обзорного совета (IRB) больницы Severance. Протокол исследования был утверждён Институциональным обзорным советом больницы Северанс (IRB No 4-2013-0059). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка устройства

1. Нажмите выключатель питания , чтобы включить прибор.
2. Включите переключатель лазерной блокировки, затем включите выключатель питания.
3. Запустите операционное ПО и убедитесь, что система инициализируется нормально.
4. В основном программном интерфейсе выберите «Операция устройства » и заранее установленный протокол для стандартных образцов цельной крови EDTA.

2. Работа устройства —^{первый шаг}

ПРИМЕЧАНИЕ: Детали позиций впуска и структуры картриджа показаны на рисунке 1A.

1. От входа 6 добавьте 2 мл реагента A (среда градиента плотности) в начальную камеру.
2. От входа 8 добавьте 875 мкл реагента A в камеру истощения.
3. Установите картридж на дисковую стойку, обеспечив правильный баланс для центрифуга.
4. Нажмите кнопку «Дверь » на CTCeptor, чтобы открыть крепление, затем закрепите дисковую стойку на CTCeptor и закрепите его крепкими винтами.
5. Нажмите кнопку «Дверь », чтобы закрыть крепление, и выполните шаг Spin Down с помощью программы CTCeptor (примерно 30 секунд).
6. После подтверждения передачи реагента A в нижнюю часть начальной камеры отпустите фиксирующие винты и снимите дисковую стойку с инструмента, при этом оставляя картридж закреплённым.

3. Работа устройства —^2-й шаг

1. Перед взятием образцов крови выполните все процедуры в сертифицированном биологическом шкафе и наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и защиту глаз, в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности.
2. После извлечения патрона введите 3 мл крови в начальную камеру через вход 6.
3. Закрепите стойку для дисков на CTCeptor и закрепите его крепкими винтами.
4. Запустите этап удаления эритроцитов с помощью программного обеспечения CTCeptor (примерно 40 минут). На этом этапе центрифугирование разделяет плазму, эритроцитные клетки и периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) внутри картриджа, а фракция, содержащая PBMC, переносится в следующую камеру для последующего истощения лейкоцитов.
5. После завершения этапа удаления эритроцитов уберите дисковую стойку с инструмента.

4. Работа устройства —^3-й шаг

1. Тщательно дезинфицируйте рабочую зону для поддержания стерильности.
2. Вихрь реагента B (шарики для выделения лейкоцитов) для обеспечения однородной суспензии.
3. Подготовьте буфер для промывания, смешав Ca²⁺/mg^{2⁺ без} DPBS с 0,1% BSA и 2 mM EDTA (pH 7,4).
4. Передайте желаемый объём реагента B в трубку объёмом 1,5 мл (например, 50 мкл на картридж).
5. Добавьте буфер для стирки в пять раз больше объёма реагента B и аккуратно перемешайте с помощью пипета.
6. Поставьте трубку на магнитную подставку на 1 минуту, чтобы шарики в реагенте B могли собраться, затем аккуратно сбросьте супернатант.
7. Подвесьте бусины в буфере для стирки на объёме, равном первоначальному объёму бусины.
8. Храните бусины при 4 °C до использования.
9. Непосредственно перед использованием смешайте 50 мкл подготовленных шариков с 50 мкл DPBS и загрузите 100 мкл смеси в вход 7.
10. Закрепите стойку для дисков на CTCeptor и закрепите его крепкими винтами.
11. Запустите этап удаления лейкоцитов с помощью программного обеспечения CTCeptor (примерно 50 минут). На этом программируемом этапе нагруженные лейкоцитарные изоляционные шарики смешиваются с фракцией, содержащей PBMC, путём встряхивания для стимулирования связывания бусинок с лейкоцитами, а затем центрифугирующей удаление фракции лейкоцитов, связанной с шариками.
12. После завершения этапа удаления лейкоцитов уберите дисковую стойку с инструмента.

5. Извлечение образцов

1. Вставьте кончик пипетки в выход 9 конечной камеры и подвесьте содержимое обратно, затем перенесите собранный образец в трубку объемом 15 мл.
2. Введите 2 мл DPBS в выход 9, тщательно промыйте камеру с помощью пипетки и переведите промывку в ту же трубку на 15 мл.
3. Повторите этап стирки дважды.
4. Отрегулируйте объём собранной жидкости в трубке на 15 мл до 14 мл с помощью DPBS, закройте трубку и аккуратно перемешайте инверсией.
5. Центрифугуйте трубку при 380 × г в течение 4 минут при комнатной температуре.
6. Аккуратно удалите супернатант, оставив примерно 1 мл, и используйте оставшуюся суспензию для дальнейшего анализа.

6. Идентификация CRC

1. Для подготовки прегидрогельного полимера смешивают Ca^2⁺/^{mg 2⁺}-свободный DPBS, раствор A (преполимер) с пелликулной иммуноцитохимией (HypICC) и Photoinitiator в соотношении 80:20:1.
2. Смешайте 870 мкл CRC-суспензии с 270 мкл полимера с прегидрогелем.
3. Переведите смесь в камеру HypICC и центрифугуйте при температуре 500 × г в течение 5 минут, чтобы клетки оселились на платформе.
4. Вставьте контроллер толщины в камеру HypICC, чтобы установить толщину гидрогеля.
5. Облучить образец ультрафиолетовым светом (365 нм) в течение 20–30 секунд снизу для сшивания слоя гидрогеля.
6. Удалите контроллер толщины и трижды промыйте клетки, покрытые гидрогелем, с помощью DPBS.
7. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом (PFA) на 10 минут при комнатной температуре, затем промывайте образцы три раза с помощью DPBS, по 10 минут каждый.
8. Пропустите клетки с 0,05% Triton X-100 на 10 минут при комнатной температуре. Затем промой образцы три раза с помощью DPBS, по 10 минут каждый.
9. Заблокируйте образцы 2% BSA на 1 час при комнатной температуре.
10. Инкубировать образцы первичными антителами за ночь при 4 °C.
11. Промывайте образцы пять раз с помощью DPBS, по 20 минут на одну стирку.
12. Окрашивайте ядра Hoechst в течение 10 минут при комнатной температуре, затем три раза промывайте образцы DPBS, по 10 минут каждый.
13. При необходимости инкубация вторичных антител может проводиться в тех же условиях за ночь, что и инкубация первичных антител.
14. Проведите флуоресцентную микроскопию и идентифицируйте КРК.

7. Мультиплексное иммунокрашивание CRC

1. После иммунокрашивки и визуализации CRC могут пройти дополнительный цикл окрашивания антител после закалки.
2. Приготовьте раствор для закалки, состоящий из 4,5% H_2O2 и 24 мМ NaOH в PBS.
3. Вынимите DPBS из камеры HypICC и добавьте раствор для закалки.
4. Инкубировать 1 час при комнатной температуре при белом свете с встряхиванием.
5. Замените раствор для закалки и инкубируйте ещё 1 час при тех же условиях.
6. Промывайте образцы четыре раза с помощью DPBS по 10 минут за раз.
7. Заново начинайте процедуру иммунного окрашивания с этапа блокировки с использованием 2% BSA.

Результаты

На рисунке 1A показано изображение одного картриджа, используемого для изоляции редких ячеек. Картридж состоит из пяти отдельных камер, соединённых микроканалами и регулируемыми клапанами, регулирующими поток жидкости. Структура патрона следующая: (1) плазменная камера, собирающая плазму, отделённую от цельной крови; (2) начальной камеры, в которой цельная кровь разделяется на плазменный, эритроцитный и PBMC-слой; (3) смешивающую камеру, где изолированные PB...

Обсуждение

CRC являются важными биомаркерами, имеющими потенциальную ценность как для диагностики рака, так и для прогноза. Однако для повышения клинической полезности CRC-анализа важно охватить более широкий спектр фенотипически разнообразных популяций CRC и поддерживать параллельную мультипараметрическую^{характеристику 13}. Кроме того, растущие данные в онкоиммунологии свидетельствуют о том, что иммунные компоненты и микросреда опухоли играют критическую роль в формировании ...

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл коническая пробирка	SPL	50015
16% формальдегид (w/v), без метанола	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure донорская антитела к кролику IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure донорская антитела к козе IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Белок сыворотки бычьей крови	GenDepot	A0100-010
CD45 антитело	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Диск-картридж
Стояк для CTCD	CTCELLS	CTDR-CM3	Диск-стеллаж
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Реагент A	CTCELLS	CTR-S1001	медиа для плотностного градиента
CTR-S Реагент B	CTCELLS	CTR-S1002	бусины для изоляции лейкоцитов
FAP антитело	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Фотоинициирователь HypICC	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC раствор A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC блок	CTCELLS	CTH-V01	HypICC камера
Латексная перчатка	Ansell	93743080
Магнитная подставка			Изготовлено внутри лаборатории с использованием 3D-принтера
Ручное пиपेटирование  (0,5-10 мкл)	Eppendorf	3120000020
Ручное пипетирование  (100-1000 мкл)	Eppendorf	3120000062
Ручное пипетирование  (10-100 мкл)	Eppendorf	3120000046
Ручное пипетирование  (20-200 мкл)	Eppendorf	3120000054
Ручное пипетирование  (2-20 мкл)	Eppendorf	3120000038
панцитокератиновое антитело	Invitrogen	53-9003-82
PBS (фосфатный буферный раствор соли)	Welegene	LB001-02
SMA антитело	Invitrogen	PA5-18292
Наконечник, 10 мкл	TipOne	9104020333
Наконечник, 1250 мкл	TipOne	9104020740
Наконечник, 200 мкл	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Цельная кровь			Хранится при температуре 4-8 °C путем сбора в ЭДТА
β актин антитело	abcam	ab8226

```