Оптимизированный метод выделения эпителия уретры самок мыши для одноклеточного и иммунофлуоресцентного анализа

Краткое содержание

Этот протокол представляет оптимизированный метод изоляции эпителиальной оболочки уретры взрослой самки мыши для последующих анализов, включая проточную цитометрию, иммунокрашивание и органоидную культуру. Методы позволили обогащённые, жизнеспособные эпителиальные клетки уретры, что подтверждается анализом проточной цитометрии, целостной визуализацией и эффективным формированием органоидов.

Аннотация

Уретра, покрытая эпителиальными клетками, служит каналом для оттока мочи из организма. Эпителиальная оболочка уретры состоит из различных типов клеток с генными сигнатурами, указывающими на роль в антимикробной и иммунной защите. Резидентные макрофаги, встроенные в эпителиальный слой уретры, представляют собой транскрипционно отличающийся подтип с предполагаемой ролью в иммунном надзоре и презентации антигена. Патогены мочи поднимаются по уретре, чтобы добраться до мочевого пузыря. Изучение эпителиальной оболочки уретры и связанных с ними иммунных клеток позволит пролить свет на защитные механизмы хозяина в нижних мочевыводящих путях. Одной из основных целей этого протокола является обеспечение оптимизированных методов вскрытия уретры самки мыши и выделения эпителиальной оболочки для дальнейших анализов. Протокол описывает оптимизированный метод выделения эпителиальной ткани от уретры самки мыши путём мягкого ферментативного и механического разделения. После эпителиального выделения описаны методы мягкого ферментативного переваривания изолированного уретрального эпителия и сопутствующих иммунных клеток для получения высокожизнеспособных одноклеточных суспензий. Протокол также подробно описывает методы анализа проточной цитометрии изолированных эпителиальных клеток уретры мыши и иммунных клеток, связанных с эпителиями. Кроме того, здесь представлены методы получения стратифицированных трёхмерных эпителиальных органоидов уретры из изолированных эпителиальных клеток. Протокол также описывает оптимизированный метод целостного иммунного окрашивания эпителиальных слоёв уретры, который может использоваться для наблюдения морфологии и молекулярной структуры эпителия уретры мыши и связанных иммунных клеток. В целом, описанные здесь методы выделения и одноклеточного переваривания эпителиальных клеток уретрального эпителия мышей позволяют проводить последующие анализы, включая иммуно-окрашивание, проточную цитометрию, генерацию органоидов и секвенирование одноклеточной РНК.

Введение

Нижние мочевые пути мыши (LUT) состоят из двух частей: мочевого пузыря и уретры. На эмбриональных стадиях структуры LUT формируются из клоаки — временной эндодермальной структуры, расположенной в хвостовой задней части кишечника. Вентральная часть клоаки, урогенитальный синус, образует мочевой пузырь спереди, а уретру —^сзади. Оболочка мочевого пузыря хорошо изучена. Он образует плотный барьер против компонентов мочи через апикальные кристаллические бляшки, состоящие из белков^{уроплакина 2,3,4}. В то время как оболочка мочевого пузыря представляет собой переходный эпителий, уретра демонстрирует различия в эпителиальной архитектуре от шеи мочевого пузыря до дистального уретрального отверстия. Кроме того, уретра демонстрирует половой диморфизм эпителиальных структур и клеточной архитектуры. Уретра самца мыши состоит из переходного эпителия на шее мочевого пузыря, за которым следует столбчатый и стратифицированный эпителий. Самка мышиного уретра покрыта переходным эпителием на шее мочевого пузыря и многослойным стратифицированным плоским эпителием, усеянным небольшими протоками, заканчивающимися секреторными железами ближе к дистальной^{части 5}.

Женщины более подвержены инфекциям мочевыводящих путей (ИМП), преимущественно вызванным уропатогенными бактериями, которые поднимаются из кишечника через уретру и инфицируют мочевой^{пузырь 6}. Уретра — это первая поверхность в LUT, которая контактирует с восходящими патогенами мочевыводящей системы. Функция эпителиальных клеток уретры, особенно их роль как активного иммунологического барьера, была недостаточно изучена. Недавние исследования той же группы предоставили пространственную карту уретры взрослой самки^{мыши 5} с одноклеточным разрешением. Он идентифицировал трёхслойную оболочку уретры с базальной, промежуточной и апикальной клетками. В эпителиальной слизистой среде находятся редкие нейроэндокринные^{клетки 5,7}. Ближе к середине уретры от основного ствола уретры разветвляются небольшие протоки, заканчивающиеся скоплениями секреторных желез, встроенных в стромальный компартмент уретры. Транскриптомические данные показали, что эпителиальные клетки уретры экспрессируют иммуномодулирующие и антимикробные гены, которые могут формировать защиту^{хозяина 5}. Изучение свойств и характеристик эпителиальных клеток уретры, связанных с их защитным потенциалом и иммуномодуляторными функциями, может предложить новые стратегии борьбы с инфекцией мочевыводящих путей.

Использование мыши для изучения уретрального эпителия позволяет проводить временные исследования и исследование полового диморфизма. Учитывая сходство мыши с человеком по клеточной архитектуре мочевого пузыря и^{уретры 1}, мышь широко используется для изучения эмбрионального развития нижних мочевыводящих^{путей 1,8,9}. Мыши также использовались в трансуретральных моделях инстилляции для изучения инфекции мочевыводящих путей, вызванных мочевыводящими^{патогенами} 10,11,12. Нижние ткани мочевыводящих путей труднодоступны у пациентов, если только не проводят резекцию по поводу рака или других заболеваний. Источник стабильной, здоровой человеческой ткани труднодоступен, и мышь служит полезной моделью для изучения тканей нижних мочевыводящих путей для изучения гомеостаза, восстановления и реакции на воспалительные повреждения. Оболочка самок мыши и человеческая оболочка уретры состоят из переходного эпителия на шее мочевого пузыря и стратифицированного неплоского, некератинизированного эпителия ближе к дистальному концу. Плоский эпителий наблюдается на дистальном конце женского уретра, хотя изменчивость наблюдается в женской оболочке уретры с^{возрастом 5,13} лет. Хотя сравнения оболочки уретры на уровне транскриптома между уретрой человека и мыши не проводились, мышь представляет собой полезную модель для фиксации эпителиального паттерна, эпителиально-иммунных взаимодействий и реакции на инфекции в уретре.

В этом исследовании авторы описывают методы рассечения полноразмерной уретры взрослой самки мыши, выделения эпителия уретры и мягкого ферментативного переваривания для получения одноклеточных суспензий. Это первый детальный протокол выделения и переваривания эпителиальной ткани уретры самок мыши. Оптимизированный протокол обеспечивает обогащённую популяцию эпителиальных клеток из одной клетки, которую можно использовать для различных последующих анализов. Как показано в исследовании, авторы провели проточную цитометрию на одноклеточной суспензии изолированных эпителиальных клеток уретры, что демонстрирует наличие жизнеспособных отдельных клеток, преимущественно эпителиального характера. Кроме того, эти эпителиальные клетки способны генерировать органоиды в трёхмерной культуре, напоминающие стратифицированную оболочку уретры мыши. Авторы также демонстрируют целостное окрашивание эпителиальных слоёв уретры для изучения связи эпителиально-ассоциированных иммунных клеток, в частности макрофагов, с клетками уретрального эпителия. Методы, описанные в этой статье, помогут в изучении слизистой уретры и её роли в иммунной защите.

Протокол

Все исследования на мышах проводились с одобрения Институционального комитета по этике в отношении животных (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) и Институционального комитета по биобезопасности (inStem/G-141(3)-22/DBJ) в Институте науки о стволовых клетках и регенеративной медицине BRIC, Бангалор. Для этого исследования использовались самки мышей CD-1 или C57BL6/J возрастом от 6 до 12 недель, содержащиеся в Центре ухода за животными и ресурсами (ACRC) при Национальном центре биологических наук (NCBS), Бангалорском кластере наук о жизни (BLiSC). Мышей содержали в определённых условиях, свободных от патогенов, в рамках 12-часового цикла светло-тёмный цикл с пищей и водой ad libitum.

Все используемые материалы перечислены в Таблице материалов.

1. Вскрытие и сбор уретры взрослой самки мыши

1. Усыпить мышь с помощью_CO2 , пока она не перестанет дышать. Выполните вывих шейки матки как способ вторичной эвтаназии.
2. Положите мышь в положение на спине и распылите 70% этанола, чтобы увлажнить шерсть на животе (рисунок 1A).
3. Поднимите кожу на брюшной полости с помощью щипцов и сделайте вертикальный разрез к нижней части тела, заканчивающийся наружным уретральным отверстием (рисунки 1B и 1C).
4. Определите мочевой пузырь и аккуратно поднимите его щипцем. В некоторых случаях она может быть наполнена мочой. Аккуратно сжимайте мочевой пузырь между щипцами, чтобы опустошить его.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мочевой пузырь будет выглядеть как выпуклое сооружение.
5. Обрезайте жир и соединительные ткани вокруг мочевого пузыря с помощью маленьких пружинных ножниц, чтобы обнажить структуру в форме бабочки, где две лобковые кости соединяются в лобковой симфизе (рисунок 1D). Уретра проходит под лобковым симфизом.
6. Разрезайте в лобковой симфизе, поднимая его щипцами и разрезая маленькими пружинными ножницами (рисунок 1E). Удалите фрагменты лобковой кости, чтобы уретра была видна, спускающаяся вниз от мочевого пузыря (рисунок 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уретра выглядит как тонкая красная трубка, расположенная на вентральной поверхности стенки влагалища (рисунок 1G).
7. Аккуратно поднимите мочевой пузырь вверх от полости тела с помощью тонких щипцов и проведите маленькими пружинными ножницами между уретрой и стенкой влагалища, чтобы разделить мочевые и репродуктивные пути.
8. Сохраняйте лёгкое напряжение мочевого пузыря при разрезе вдоль задней части уретры, чтобы отделить его от стенки влагалища (рисунок 1H–J). Разрезайте до дистального уретрального отверстия, чтобы получить полноразмерную мышиную уретру (1,2–1,5 см в длину) (рисунок: 1K и 1L).
9. Отдельте уретру от мочевого пузыря, сделав один разрез на шее мочевого пузыря.

2. Выделение эпителиальной ткани уретры

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол по выделению эпителиальных слоёв из уретры был модифицирован и оптимизирован из протокола по выделению^{эндометриального эпителия 14}. На рисунке 2 показаны шаги для выделения эпителиальных слоёв уретры от окружающего стромального компартмента (рисунок 2A).

1. Переложите вскрытые уретры в стерильную чашку Петри с свежим 1x сбалансированным раствором солей Хэнкса (без HBSS, Ca и Mg, подробности приведены в дополнительной таблице 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется собирать 4–5 уретр на этом этапе для разделения эпителий и одноклеточного переваривания.
2. Под вскрытием микроскопа обрезайте жир и соединительные ткани вокруг уретры с помощью тонких щипцов и маленьких пружинных ножниц (рисунок 2B).
3. Разрежьте каждую уретру на две одинаковые по размеру части поперечно и положите на верхнюю часть нейлоновой сетки объемом 100 микрон (рисунок 2C–G).
4. Промывайте ткани, проведя 1 мл 1x HBSS (без Ca и Mg) на ткани.
5. Переместить части ткани в микроцентрифугную трубку (MCT) объёмом 1,5 мл (рисунок 2H), содержащую 1 мл трипсина 1% (1% трипсина, с в/в до 1x sHBSSa, подробности приведены в дополнительной таблице 2).
6. Переварить ткань, инкубируя 15–30 минут на ротаторе образца (30 об/мин) при 4 °C.
7. После инкубации удалите трубки при температуре 4 °C. Добавьте_{MgCl 2} (1 M_{MgCl 2}, бульон, приготовленный в 1x HBSS) к конечной концентрации 10 мМ и DNазу I (10 мг/мл DNase I, бульон, приготовленный в 1x PBS) до окончательной концентрации 10 мг/мл в той же пробирке с кусочками ткани.
8. Перенесите трубку в гибридизационную печь при температуре 37 °C на ротаторе образца для инкубации в течение 15–30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации трипсина при 4 °C и 37 °C можно регулировать в зависимости от последующей процедуры. Предпочтительнее использовать 15-минутное время инкубации для окрашивания цельным креплением и 30 минут для одноклеточного переваривания.
9. Перенесите ткани в MCT объемом 1,5 мл, содержащую 10% овечью сыворотку в 1x HBSS (без Ca и Mg), чтобы уменьшить активность трипсина.
10. Переносите ткани уретры в новую трубку с ледяным 1x HBSS (без Ca и Mg). Затем переложите в стерильную чашку Петри с ледяной температурой 1x HBSS.
11. С помощью двух тонкоконечных щипцов выжать эпителий из уретры. Держите один конец уретрального элемента с помощью одной пары щипцов.
12. Другой рукой сожмите уретральный кусок между зубцами щипцов, проходя вдоль всей длины, чтобы выдавить эпителий. Повторите это для оставшихся уретральных фрагментов в чашке, чтобы изолировать эпителий (рисунок 2I–J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При механическом отделении тонкий слой прозрачной эпителиальной ткани будет экструдирован из просвета уретры. Эпителий уретры можно определить как тонкие, слоевидные фрагменты ткани, которые кажутся светлее (прозрачными), чем стромальная ткань. Эпителиальные изоляты должны быть тонкими, прозрачными кусочками ткани, которые можно перенести в чашку Петри для измельчения. Тканевые изоляты не должны быть полностью разрушены. Если ткани полностью разрушаются, время инкубации трипсина можно сократить.

3. Переваривание в одноклеточную суспензию

1. Переместите отдельные участки эпителия в стерильную чашку Петри с помощью небольшой пластиковой трансферной пипетки или наконечника пипетки объёмом 200 мкл. Измельчить эпителий на мелкие фрагменты с помощью маленьких пружинных ножниц с каплём 1x HBSS, добавленной непосредственно к фрагментам (рисунок 2K).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся после отделения эпителия участки стромальных тканей могут быть переварены тем же методом, что и изолированный эпителий.
2. Переместите измельчённые кусочки с помощью пипетки в 2 мл MCT, содержащую 1,5 мл предварительно нагретого (37 °C) раствора аккутазы. Раствор для расщепления аккутазы содержит следующее: аккутазу, 10 мкм Rocki Y-27632 и 100 мкг/мл ДНКазу I.
3. Переместите пробирку с тканью и раствором для пищеварения в ротатор образца в печь для гибридизации при температуре 37 °C. Инкубировать 1 час.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Содержимое трубки можно проверить на успешное пищеварение перед началом процедуры. Успешное пищеварение: Измельчённая ткань хорошо распределяется в растворе аккутазы, после инкубации остаётся лишь несколько видимых частей. Неудачное пищеварение: крупные участки ткани остаются после инкубации в растворе аккутазы. Ткани необходимо измельчить как можно мелче для успешного пищеварения.
4. Через 1 час переложите всё содержимое 2 мл MCT в центрифугную трубку на 5 мл и добавьте 2 мл буфера для промывания (1x PBS без Ca и Mg, с 1% бычьей сывороткой альбумином).
5. Прокрутите подвеску при давлении 600 x g на 5 минут в центрифуге при температуре 4 °C с вращающимся ротором.
6. Аспирируйте супернатант с помощью мягкого вакуума и повторно суспензируйте гранулу в 1 мл буфера с помощью пипетки объемом 1 мл с фильтрующей трубкой.
7. Используя кончик пипетки, разбивайте гранулу, продвигая вверх и вниз, пока комки не станут меньше. Пропустите подвеску четырьмя ходами через иглу калибра 23 1/2 калибра, прикреплённую к шприцу 1 мл, затем 4–6 ударов через иглу калибра 26 1/2, прикреплённую к шприцу объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прохождение через иглу малого калибра необходимо для достижения равномерной одноклеточной суспензии и предотвращения скупления клеток. Хотя этот шаг может вызвать сдвиговый стресс и гибель клеток, авторы оптимизировали количество ударов с помощью иглы и шприца, чтобы обеспечить единое подвесление без чрезмерной клеточной гибели. Пропуск этого этапа приводит к значительным количеству скопленных клеток, что запутает дальнейший анализ, такой как секвенирование одноклеточной РНК и потоковая цитометрия.
8. Добавьте 1 мл буфера для мытья, чтобы смочить поверхность предварительного фильтра на 30 микрон, установленного поверх трубки объемом 5 мл. Используйте шприц, подключённый к игле 26 1/2 калибра, чтобы перевести 1 мл раствора клетки через сито.
9. Добавьте 1 мл дополнительного буфера для промывки в трубку с клетками, затем заберите этот раствор шприцом и пропустите через фильтр. Пеллетные ячейки центрифугированием при 600 x г в течение 5 минут при 4 °C с помощью качающегося ротора.
10. Аспирируйте супернатант и ресуспензируйте гранулу в 100 мкл буфера для промывания, а также добавьте 100 мкл 1x буфера лизиса эритроцитов (эритроцитов). Инкубуйте суспензию при комнатной температуре ровно 3 минуты, затем добавьте 4 мл буфера для промывки и снова подвесьте пеллет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лиза эритроцитов рекомендуется для удаления кровяных клеток из суспензии эпителиальных клеток уретры. Хотя этот этап может незначительно повлиять на жизнеспособность эпителиальных клеток, протокол использовал буфер лизиса эритроцитов в 0,5 раза и 3-минутную инкубацию для минимизации потерь клетки и сохранения жизнеспособности клетки.
11. Собирайте ячейки центрифугой при 600 x г в течение 5 минут при 4 °C с помощью вращающегося ротора ведра.
12. Аспирируйте супернатант и ресуспензируйте гранулу в 50–200 мкл буфера промывки в зависимости от размера гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер гранул из тканей, полученных из 4–5 образцов эпителиального уретрального эпителия мышей, будет небольшим, но всё ещё видим глазом. Важно центрифугировать ячейки с помощью вращающегося ротора ковша, чтобы гранула собиралась на дне трубки, а не размазывалась по бокам. Исследователи зафиксировали выход клеток от 28 000 до 34 000 живых клеток на эпителий уретры у мыши.
13. Перенесите 5 мкл аликвота клеток на 0,5 мл МСТ и добавьте 5 мкл трипан-синего. Смешайте и загрузите гемоцитометр для проверки выхода и жизнеспособности клеток.

4. Анализ потоковой цитометрии одноклеточных изолятов эпителиального уретрального эпителия

1. Аликвот 100 000 клеток в центрифужной трубке объемом 5 мл для проведения флуоресцентного иммуноокрашивания отдельных клеток из уретрального эпителия или стромального компартмента для проточной цитометрии. Компенсируйте объём лампы до 4 мл с помощью 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения надёжных результатов с помощью потоковой цитометрии рекомендуется минимум 50 000 клеток на образец.
2. Опустите подвеску ячейки при давлении 500 x g на 5 минут при 4 °C с помощью качающегося ротора.
3. Сбросьте супернатант и подвесьте гранулу в 50 мкл 1x PBS.
4. Добавьте 50 мкл 2x красителя Ghost красителя Violet 450 (1 мкл красителя Ghost в 500 мкл при 1x PBS) к суспензии ячейки, чтобы получить 100 мкл раствора красителя Ghost.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ghost Dye V450 — это аминно-реактивный краситель, который можно использовать для различия жизнеспособных и нежизнеспособных клеток в проточной цитометрии.
5. Добавьте 5 мкл раствора блокировки Fc-рецепторов (противомышиный CD16/32) на каждые 100 мкл суспензии клетки и инкубуйте 5 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходим для блокировки связывания иммуноглобулина с Fc-рецепторами.
6. Инкубировать суспензия клетки на льду ещё 25 минут.
7. Разведите суспензию клетки до 5 мл с помощью буфера для окрашивания клеток (1x PBS, 0,02% (w/v) натрия азида и 1% (w/v) BSA, см. дополнительную таблицу 3). Вращайтесь вниз при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C с помощью качающегося ротора. Сбросьте супернатант и снова суспензируйте клеточную гранулу в 100 мкл клеточного буфера для окрашивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Азид натрия очень токсичен. Избегайте контакта с кожей, глазами и одеждой. При обращении с ними используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
8. В 100 мкл клеточной суспензии добавьте 5 мкл конъюгированных первичных антител: анти-CD326/EPCAM (маркирует эпителиальные клетки), анти-F4/80 (маркирует мышиные макрофаги) и анти-CD45 (паниммунный маркер) с разбавлением 1:20. Инкубировать суспензию клетки на льду в течение 30 минут.
9. Разведите суспензию ячейки до 5 мл с помощью буфера для окрашивания клеток, а затем опустите при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C с помощью вращающегося ротора. Аспирируйте супернатант и ресуспензируйте клеточную гранулу в 500 мкл клеточного буфера для окрашивания.
10. Переведите суспензию ячейки через 35-микронную нейлоновую сетчатую сетку на фильтрующих трубках для сортировки крышек. Поставьте трубки на лед до дальнейшего анализа.
11. Проведите начальную установку и проверку работы на цитометре.
12. Регулируйте напряжение, используя незапятнанные и полностью окрашенные образцы. Выполните компенсацию с помощью контроля бусинок и приступите к приобретению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с несколькими флуорофорами требуют проведения компенсации. Подготовьте необходимые меры контроля компенсации. Для каждого флуорофора, используемого в эксперименте, понадобятся однократные контроллеры (то есть компенсирующие шарики). Компенсация может выполняться автоматически в соответствии с настройками программного обеспечения потокового цитометра. Рекомендуется контролировать ФМО (флуоресценция минус один) для различения положительных и отрицательных клеточных популяций для данного фторофора. Подготовьте FMO, включив в образец все флуорофоры, кроме того, за которым контролируется.
13. Корректируйте элементы с помощью FMO (флуоресценция минус один) контролей и получайте 50 000 событий на образец.

5. Культура эпителиальных органоидов уретры

ПРИМЕЧАНИЕ: Для эпителиальных органоидов уретры у мышей следуйте Протоколам, раздел 3, Пищеварение до одноклеточной суспензии, шаги 3.1–3.11. чтобы получить суспензии с одной ячейкой.

1. Суспензировать гранулу эпителиальной клетки уретры в среде расширения органоидов объемом 50–100 мкл (подробности приведены в дополнительной таблице 4). Определите жизнеспособность и количество клеток, рассчитывая на гемоцитометр.
2. Приготовьте смесь суспензии ячейки в соотношении 1:4 (1 часть) и Cultrex (4 части), с конечной концентрацией 5000 элементов в 25 мкл. Добавьте 3 капли суспензии 25 мкл (5000 клеток на каплю) в каждую яме пластины с 12 лунками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда осторожно наносите Cultrex на пипетку, чтобы избежать пузырей.
3. Перенесите пластину в инкубатор при температуре 37 °C (5%_CO2) на 15 минут, чтобы капли затвердели.
4. Накройте капли 800 мкл органоидной экспансионной среды, аккуратно с боков колодца, и перенесите пластину обратно в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смена медиа требуется каждые 2 дня. Замените отработанную среду на свежие органоидные расширяющиеся среды объемом 800 мкл.
5. Делайте снимки органоидов каждый день с 0 по 6 дней с помощью инвертированного микроскопа с увеличением 4–20 раз.

6. Гистология уретральных органоидов и иммунокрашивка

ВНИМАНИЕ: Ксилол — это высоковоспламеняющийся растворитель. Используйте соответствующие средства защиты для обработки химиката. Собирайте использованный ксилол в качестве органических растворителей. Утилизировать их через утверждённые программы по опасным химическим отходам. Формалин токсичен и вызывает раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Избегайте контакта кожи и вдыхания. Используйте соответствующие средства защиты для обработки химиката. Утилизация через институциональные системы утилизации опасных химических отходов. Протокол встраивания органоидов уретры в парафиновые блоки был модифицирован и оптимизирован из протокола для встраивания эндометриальных^{органоидов 14}.

1. На 6-й день посева органоидов выбросьте отходящую среду и промыйте их 1x HBSS при комнатной температуре. Добавьте в скважины 1,5 мл нейтрального буферного формалина (10%) на 15 минут.
2. Отбросьте фиксатив и добавьте 1,5 мл гематоксилина в колодцы на 10 минут. Уберите морилку и дважды стирайте с помощью 1x HBSS.
3. Добавьте 1 мл 2% агарозы UltraPure с низкой температурой плавления, приготовленной в 1x HBSS, в каждую яму, содержащей 3 капли, оставьте агарозу затвердеть на 15 минут при комнатной температуре.
4. Аккуратно уберите агарозу из колодца плоским концом тонкой лопатки, чтобы капли Cultrex ушли вместе с ней.
5. Перенесите диск агарозы в тканевую кассету и обезвоживайте в 70% этаноле в течение 30 минут при комнатной температуре с постоянным перемешиванием.
6. Дополнительное обезвоживание в различных концентрациях этанола и продолжительности: 90% этанола 30 минут, 100% этанола 30 минут, 100% этанола 60 минут, 100% этанола 90 минут.
7. Смыть лишний этанол и прочистить ксилолом в течение 45 минут при комнатной температуре с постоянным перемешиванием. Повторяйте этап очистки ксилола в течение 60 минут.
8. Смойте лишний ксилол и перенесите на ночь в инфильтрационный парафиновый воск (65 °C).
9. Добавьте тонкий слой воска к основанию металлической формы и положите агарозный диск поверх неё. Снимите форму из подогрева и быстро наложите на неё воском через планки на нижней части кассеты. Дайте затвердеть при комнатной температуре.
10. Вырезать органоидные парафиновые блоки на микротоме для получения срезов размером 5 мкм. Размещайте секции на положительно заряженных слайдах.
11. Окрашивание гематоксилином-эозином
    1. Выпекать слайды при 60 °C, депарафинизировать ксилолом и регидратировать с помощью серии промыв этанолом (ксилол 1 мин, 100% этанол 1 мин, 95% этанол 1 мин, 75% этанол 1 мин)
    2. Стирайте слайды в водопроводной воде и инкубуйте с Гематоксилином No2 Гилла в течение 3 минут. Положите горки под струю водопроводной воды, чтобы приобрести синий цвет.
    3. Инкубация скользит в 95% этанола в течение 1 минуты, затем раствор 0,25% эозина в течение 1 минуты. Промывайте слайды в воде из-под крана, пока вода не станет прозрачной.
    4. Дегидратирующие стекли (95% этанола 1 мин, 100% этанол 1 мину) и прочистки с ксилолом (1 мин) перед монтажом с быстро затвердевающим монтажным материалом.
12. Иммуноокрашивание парафиновых срезов
    1. Запекать 5 мкм парафиновые секции в гибридизационной печи при 60 °C в течение 1–2 часа.
    2. Девосковые слайды, погружая в ксилол на 6 минут в банке для окрашивания стекла.
    3. Регидратация накладывается на 100%, 95%, 75% этанола в дистиллированную воду по 6 минут каждая. Затем стирайте слайды в дистиллированной воде на 5 минут.
    4. Добавьте слайды в квадратную чашу Pyrex с раствором для извлечения антигена с содержанием 0,01 M лимонной кислоты (в дистиллированной воде) и накройте блюдо пищевой пленкой. Проведите получение антигена, разогревая в микроволновке на высокой мощности в течение 20 минут.
    5. Охладите до теплого 20 минут и промывайте слайды в PBS на 5 минут. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг срезов тканей и добавьте 100 мкл/секция буфера для блокировки лошадей на 1 час при комнатной температуре с лёгким покачиванием (см. дополнительную таблицу 5 для подготовки буфера для блокирования лошадей).
    6. Приготовьте первичный раствор антител в буфере, блокирующем лошади, добавив первичные антитела в соответствующем разбавлении (1:100–1:200). Добавьте 100 мкл раствора первичного антитела в каждую секцию. Инкубировать слайды на ночь при 4 °C с лёгким покачиванием.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды были окрашены антителами к Кератину 5/KRT5 (базальный эпителиальный маркер), P63 (базальный эпителиальный маркер), KRT4 (промежуточный/супрабазальный эпителиальный маркер) и KRT13 (промежуточный/супрабазальный эпителиальный маркер).
    7. После ночной инкубации используйте слайды в PBS 4 x 5 минут при комнатной температуре с лёгким покачиванием.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны выполняться в светозащищённой коробке при комнатной температуре.
    8. Приготовьте вторичный раствор антител в буфере, блокирующем лошади, добавив флуоресцентно маркированные вторичные антитела при разбавлении 1:500. Инкубировать слайды в течение 1 часа при комнатной температуре с лёгким покачиванием.
    9. Стиральные слайды в PBS 4 x 5 минут при комнатной температуре с лёгким покачиванием.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательный шаг: используйте наборы для автофлуоресценционного гасления для подавления сигнала автофлуоресценции.
    10. Инкубировать раствором DAPI на 300 нМ в течение 5 минут с лёгким покачиванием. Постирайте в PBS 2 x 5 минут при комнатной температуре с аккуратным покачиванием.
    11. Крепление с помощью раствора против затухания (90% глицерила, 0,2% n-пропилгаллята в 1x PBS). Срезы изображения на широкополовом люминесцентном микроскопе.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки экспозиции камеры для каждого флуорофора должны быть отрегулированы для максимизации соотношения сигнал/шум, избегая насыщения пикселей. Используйте те же настройки экспозиции при съёмке органоидов, окрашенных за сеанс.

7. Целостное иммунокрашивание изолированных эпителиальных слоёв уретры

ПРИМЕЧАНИЕ: Для целостного иммунокрашивания следуйте протоколу, раздел 2, Выделение эпителиальной ткани уретры, шаги 2.1–2.12. для получения эпителиальных слоёв уретры.

1. Аккуратно переместите эпителиальную ткань с помощью трансферной пипетки или кончика пипетки объёмом 200 мкл в колодец 24-луночной тканевой культуры, содержащей 500 мкл 10% нейтрального буферного формалина. Запечатайте крышку пластины парафином и инкубуйте её на коровале 20 минут при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы в одном колодце, чтобы избежать потери эпителиальной ткани.
2. Аккуратно вдыхайте формалин из колодца. Проведите промывку с 500 мкл 1x PBS и инкубуйте на коровале 5 минут при комнатной температуре. Повторите тот же этап стирки ещё раз.
3. Добавьте в скважину 500 мкл раствора проницаемости, содержащего 1x PBS + 1% тритона X-100. Запечатайте крышку пластины парапленкой и инкубуйте 2 часа при 4 °C с лёгким покачиванием.
4. Аккуратно аспирируйте раствор проницаемости из скважины.
5. Проведите блокировку путём инкубации тканей в 500 мкл лошадиного блокирующего буфера, содержащем дополнительно 1% Triton X-100 (Рецепт буфера для блокировки лошадей приведён в дополнительной таблице 5). Закройте крышку блюда парапленкой и инкубуйте ночью при 4 °C с лёгким покачиванием.
6. Приготовьте первичный раствор антител в буфере, блокирующем лошади, содержащем дополнительное 1% Triton X-100, добавив первичные антитела в соответствующем разбавлении (1:100–1:200). Аспирируйте блокирующий раствор и добавьте 500 мкл первичного раствора антител: анти-CDH1 (маркер эпителиальных клеток) и анти-F4/80 (маркер макрофагов мышей). Закройте крышку парапленкой и инкубуйте 48–72 часа при 4 °C с лёгким покачиванием.
7. Аккуратно аспирируйте первичный раствор антител и промывайте 3 раза с 1x PBS по 30 минут при комнатной температуре с лёгким покачиванием.
8. Подготовьте вторичные растворы антител в буфере, блокирующем лошади, с дополнительным 1% Triton X-100, добавив вторичные антитела в подходящем разбавлении (1:500).
9. Добавьте в скважину 500 мкл вторичного раствора антител, накройте пластину алюминиевой фольгой и инкубируете 4–6 часов при комнатной температуре на коромысле.
10. Аккуратно аспирируйте вторичный раствор антител и промывайте 3 раза с 1x PBS по 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание DAPI можно проводить путём инкубации тканей с разбавленной раствором DAPI (конечная концентрация 300 нм) в течение 10 минут при комнатной температуре. Стирайте салфетки с 1x PBS (2x 5 мин) при комнатной температуре на короалке.
11. Аккуратно перенесите эпителиальные ткани в стеклянный стекло или рентгеновую чашу и добавьте раствор против выцветания (90% глицерила, 0,2% n-пропилгаллята в 1x PBS).
12. Изображение тканей на флуоресцентном микроскопе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая толщину образца, авторы рекомендуют снимать на флуоресцентном микроскопе, способном к оптическому сечению. В данном исследовании авторы использовали широкопольный флуоресцентный микроскоп с оптическим сечением Apotome для удаления расфокусированного света и получения z-стеков. Были получены z-стеки изображений для визуализации дендритных проекций эпителиально-ассоциированных макрофагов.

Результаты

Вскрытие и сбор уретры взрослой самки мыши

В первой части исследования авторы предлагают подробный протокол вскрытия уретры самки мыши. Учитывая его прикрепление к вентральной стенке влагалища и расположение под лобковой симфизом, приведённый здесь метод позволяет провести чистую диссекцию полноразмерной женской уретры (рисунок 1).

Выделение эпителиальной ткани уретры и анализ потоковой цитометрии для одноклеточных изолятов

Переваривание трипсина приводит к лёгкому отделению эпителиальной оболочки уретры от окружающей стромы. После отделения можно наблюдать эпителиальные слои с большей прозрачностью, чем стромальная ткань (рисунок 2). Отдельные эпителиальные слои приводили к образованию суспензии в одной клеточке при ферментативном расщеплении. Отдельные клетки, изолированные из уретрального эпителия, демонстрируют стабильно высокую жизнеспособность (>80%) за счёт исключения трипанового синего на гемоцитометре (рисунок 2L) и проточной цитометрии с использованием красителей жизнеспособности для гейтинга живых клеток (рисунок 3, дополнительный файл 1).

Авторы провели проточную цитометрию для оценки обогащения эпителиальных клеток от суспензии уретрального эпителия. Для проверки жизнеспособности клетки подвеска ячейки была окрашена маркером «живой/мёртвой» — амин-реактивным призрачным красителем V450. Авторы постоянно наблюдали жизнеспособность клеток >80% по маркеру живых/мёртвых. Маркер «живой/мёртвый» позволял выводить обломки и мёртвые клетки во время анализа потока. Они окрашивали образцы маркером эпителиальных клеток (CD326/EPCAM), макрофаговым маркером (F4/80) и маркером иммунных клеток (CD45), чтобы зафиксировать состав клеток, выделенных этим методом. Результаты потоковой цитометрии показали, что авторы выделили обогащённую популяцию эпителиальных клеток из самок уретрального эпителия. В обоих независимых экспериментах группа достигла 80–90 % EPCAM-положительных эпителиальных клеток после гейтинга на живых клетках. Авторы также наблюдали ~1,30 % иммунных клеток CD45+ в эпителиальной подготовке. Макрофаги, связанные с эпителиальной оболочкой, составляли ~1,18 % живых клеток из эпителиального компармента. Анализ потоковой цитометрии одноклеточных суспензий из эпителиальных слоёв показывает минимальное загрязнение стромами (5–6%), которое, согласно предыдущему^{исследованию 5}, в основном связано с сосудистым эндотелием. Дополнительный файл 1 показывает результаты потоковой цитометрии для одноклеточных препаратов из эпителиального и стромального компартментов. По сравнению с 80–90% обогащением эпителиальных клеток, выделенных из эпителиального компартмента, стромальный компартмент также содержал 40–50% эпителиальных клеток, которые происходят из коротких протоков и железистого эпителия, простирающихся от уретрального просвета в окружающую строму (рисунок 3, дополнительный файл 1).

Культура эпителиальных органоидов уретры, гистология и иммунокрашивание

Авторы также демонстрируют, как отдельные эпителиальные клетки, выделенные из уретры, жизнеспособны и могут образовывать органоиды в трёхмерном матриксе, а также наблюдали рост органоидов из отдельных эпителиальных клеток уретры до 6-го дня в культуре (рисунок 4B–G). Они проводили окрашивания гематоксилин-эозином (H&E) для наблюдения гистологии органоидов (рисунок 4H–J). Авторы наблюдали две разные морфологии эпителиальных органоидов уретры: одна большая и полая, а другая — меньше и твёрдая. В обоих случаях органоиды были стратифицированы и рекапитулировались маркеры, экспрессируемые в эпителиальной оболочке женской уретры, включая KRT5 и P63, отмечающие базальный слой, а KRT4 и KRT13 маркировали сверхбазальные/промежуточные клеточные слои (рисунок 4K–N), дополнительный рисунок 1). Были изучены различия в органоидной способности образования между проксимальной и дистальной уретрой. Органоиды, образованные из проксимальной уретры, имели большую долю полых органоидов, тогда как органоиды из дистальной уретры образовывали твёрдые сферы (рисунок 4O–P). Кроме того, они наблюдали различия в эффективности образования органоидов в эпителиальных клетках, изолированных из проксимальной и дистальной частей уретры. Дистальный уретральный эпителий сформировал органоиды с более высокой эффективностью, чем проксимальный уретральный эпителий с той же начальной плотностью посева (5000 клеток на каплю) (рисунок 4Q–S).

Целостное иммунокрашивание изолированных эпителиальных слоёв уретры

Исследователи также представляют оптимизированный метод целостного окрашивания эпителиальных слоёв уретры самок мыши. Здесь они окрашивали эпителиальные слои двумя маркерами: F4/80 для макрофагов и E-кадгерин/CDH1 для обозначения соединений эпителиальных клеток (рисунок 5). Ткани были получены с помощью микроскопа Zeiss Axio Observer 7 с оптическим сечением Apotome 3. Эпителиальные листы демонстрируют сильную маркировку антителами CDH1. Цельные препараты уретрального эпителия, помеченные антителами к F4/80, показали макрофаги, образующие арбор из дендритов в эпителиальной оболочке. Макрофаги можно было наблюдать, посылающие дендритные процессы между эпителиальными клетками уретры. В целом результаты демонстрируют полезность описанных здесь протоколов для изучения эпителиальной оболочки уретры самки мыши.

Рисунок 1: Вскрытие мыши для сбора женских уретры. (A) Положите мышь на спину и распылите живот 70% EtOH. (B–C) Откройте живот, подняв кожу и сделав вертикальный разрез. (D) Обрезать жир и соединительные ткани, чтобы обнажить лобковые кости в форме бабочки, соединённые в (Arrow in black) лобковый симфиз. (E) Перерезать лобковый симфиз. (F) После удаления лобковых костей уретра начинает идти вниз (обведённая пунктирной черной линией) от мочевого пузыря. (Г) Аккуратно подтяните мочевой пузырь щипцем. Уретра хорошо видна в виде тонкой красной трубки. (H–I) Вытяните мочевой пузырь вверх из полости тела. Используйте натяжение мочевого пузыря, чтобы отделить уретру от вентральной стенки влагалища. Проведите ножницы между уретрой и стенкой влагалища, чтобы разделить мочевые и репродуктивные пути. (J–K) Отсоедините дистальный конец уретры, прикреплённый к коже. (L) Изображение рассеченной самки мыши в нижних мочевыводящих путях (FLUT), на котором видны мочевой пузырь и уретра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Выделение уретрального эпителия и подготовка одноклеточной суспензии. (A) Схема, изображающая ферментативное переваривание и механическое разделение эпителиального и стромального компартментов уретры с последующим одноклеточным перевариванием. (B) Очистить лишний жир из нижних мочевыводящих путей женщин. (C–F) Отрежьте уретру от области шеи мочевого пузыря, чтобы отделить уретру от мочевого пузыря. Затем разрежьте уретру на две половины тонкими ножницами. (G) Промыть уретральные уретры раствором 1x HBSS, проведя через 100-микронный фильтр. (H) Перенести фрагменты уретральной ткани в раствор трипсин 1%. Инкубировать образец на ротаторе образца в холодной комнате. Добавьте MgCl₂ и DNase I в одну трубку. Инкубировать при 37 °C в гибридизационной печи на ротаторе образца. (I–J) Изолируйте эпителий, мягко сжимая тонкими щипцами вдоль длины уретрального фрагмента. (K) Ткани измельчаются на мелкие фрагменты с помощью тонких ножниц. Переместить измельчённую эпителиальную ткань в раствор для расщепления аккутазы и инкубировать при 37 °C в гибридизационной печи на ротаторе образца. (L) Подсчитать эпителиальные клетки и оценить жизнеспособность с помощью трипан-синего с гемоцитометром. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Потоковая цитометрия для оценки суспензий отдельных клеток из уретрального эпителия и компартментов стромы. Проточная цитометрия проводилась на одноклеточных препаратах из объединённых эпителиальных и стромальных компартментов уретры мыши (A). Живые клетки были закрыты, чтобы исключить мёртвые клетки, окрашенные Ghost Dye V450. Живые клетки оценивались на экспрессию CD45 (паниммунный маркер), CD326/EPCAM (панэпителиальный маркер) и F4/80 (маркер макрофагов мышей). Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов, проведённых на пуле из 5–6 мышей в каждом эксперименте с целью получения эпителиальных и стромальных образцов. Сокращения; SSC-A = площадь бокового рассеяния; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Гистология и иммунокрашивание эпителиальных органоидов уретры. (A) Схема, показывающая рабочий процесс для генерации эпителиальных органоидов уретры. (B–G) Репрезентативные микрофотографии эпителиальных органоидов уретры (UEO), полученные из отдельных клеток в разные дни расширения in vitro. Репрезентативные яркополые изображения (H) полых и (I) твёрдых эпителиальных органоидов уретры (UEOs), окрашенных гематоксилином и эозином (H&E). (J) Количественная оценка типов органоидов, полученных в трёх независимых экспериментах. Шкала ошибки представляет собой стандартную ошибку среднего значения. Репрезентативные изображения (K) полых и (L) твердых уретральных эпителиальных органоидов (UEO), окрашенных эпителиальными маркерами KRT13 (сверхбазальный эпителиальный маркер), KRT5 (базальный эпителиальный маркер) и P63 (базальный эпителиальный маркер). Изображения, изображающие одиночные люминесцентные каналы, изображены в K', K'', K'', L'' и L''. Репрезентативные изображения (M) полых и (N) твердых уретральных эпителиальных органоидов (UEOs), окрашенных с помощью эпителиальных маркеров KRT4 (сверхбазальный эпителиальный маркер) и KRT5 (базальный эпителиальный маркер). Изображения, изображающие одиночные люминесцентные каналы, представлены в цветах M', M'', N' и N". (O) Схема вскрытия проксимальной и дистальной уретры. (P) Количественная оценка типов органоидов, полученных из проксимальной и дистальной уретры, в двух независимых экспериментах. Репрезентативные микрофотографии эпителиальных органоидов уретры 6-го дня (UEO), полученных из эпителия, выделенного из (Q) проксимальной и (R) дистальной уретры. Данные органоидов, полученных из полной уретры, представляют собой 3 независимых эксперимента, проведённых с пулом из 3–5 мышей в каждом эксперименте. (S) Данные об органоидах, полученных из проксимальной и дистальной уретры, представляют собой 2 независимых эксперимента, проведённых с пулом из 3–4 мышей в каждом эксперименте. Ядра маркированы DAPI (синим цветом). (Шкалы, 100 мкм). Схемы подготовлены с помощью BioRender и Adobe Illustrator. Создано в BioRender. Биной Джозеф, Д. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Целостное иммунокрашивание эпителиальных слоёв уретры. (A) 10-микронная заморожённая секция уретры взрослой самки мыши в оптимальной резочной среде, демонстрирующая иммунное окрашивание маркера мышиного макрофага F4/80 (красный цвет) и эпителиального белка E-cadherin/CDH1 (зелёным). (A') обозначает увеличенный вид вставки в (A). (B) Схематическая диаграмма, показывающая шаги для целостного монтажного окрашивания изолированных эпителиальных слоёв уретры. Целостное иммунокрашивание изолированной слизистой уретрального эпителия мыши проводилось с использованием антител против маркера мышиного макрофага F4/80 (красный) и эпителиального белка E-cadherin/CDH1 (зелёный). (C) Репрезентативное изображение объединённого вида. (D) Ортогональная максимальная интенсивность проекции красного канала, показывающая организацию макрофагов. (E–F) Увеличенный вид эпителия и сопутствующих макрофагов. Полоса белой шкалы, 50 мкм. Полоса серой шкалы, 500 мкм. Данные представляют собой 2 независимых эксперимента, проведённых на пуле из 4–5 мышей. Схемы подготовлены в BioRender и Adobe Illustrator. Создано в BioRender. Биной Джозеф, Д. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительная таблица 1: Подготовка 1x HBSS (без Ca, Mg).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Подготовка 1x раствора sHBSSa и 1 % трипсина.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 3: Подготовка буфера для окрашивания клеток/потока.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 4: Подготовка органоидного расширения среды для эпителиальных органоидов уретры.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 5: Подготовка буфера, блокирующего лошадей.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Количество клеток для эксперимента с проточной цитометрией, проведённого на отдельных клетках из эпителиального и стромального компартментов уретры из двух независимых экспериментов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Сравнение эпителия уретры взрослой самки мыши с эпителиальными органоидами уретры. Репрезентативные изображения (A) эпителия уретры взрослой самки мыши, (B) полых органоидов уретры и (C) твердых органоидов уретрального эпителия (UEOs), окрашенных эпителиальными маркерами KRT13 (сверхбазальный эпителиальный маркер), KRT5 (базальный эпителиальный маркер) и P63 (базальный эпителиальный маркер). Изображения, изображающие одиночные люминесцентные каналы, представлены в цветах A', A'', A''', B', B', C', C'' и C''. Репрезентативные изображения (D) эпителия уретры взрослой самки мыши, (E) полых органоидов уретрального эпителия и (F) твердых уретральных эпителиальных органоидов (UEOs), окрашенных эпителиальными маркерами KRT4 (спрабазальный эпителиальный маркер) и KRT5 (базальный эпителиальный маркер). Изображения, изображающие одиночные люминесцентные каналы, представлены в буквах D', D'', E', E'', F' и F". Данные, отражающие три независимых эксперимента, проведённые с пулом из 3–4 мышей в каждом эксперименте. Ядра маркированы DAPI (синим цветом). (Шкалы, 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Эпителиальные барьеры в теле критически важны для защиты хозяина. Это специализированные компартменты с несколькими типами эпителиальных клеток и сопутствующими резидентными иммунными клетками. Эпителиальные барьеры меняются со временем развития, часто получая экспрессию защитных генов хозяина в ответ на микробиоту или воздействие окружающей среды. Дефекты целостности эпителия или экспрессии генов могут влиять на защиту^{хозяина 15}. Необходимо изучать эпителиальную ткань изолированно для понимания транскриптомических сигнатур, а также для изучения контактов между клетками и целостности эпителия. В настоящее время не описано подробно методов, оптимизированных для выделения эпителиальной ткани уретры у самки мыши. В то время как эпителий мочевого пузыря можно выделить только^{механическим отделением 16}, эпителий уретры находится внутри стромальной трубки уретры и требует сочетания ферментативного и механического разделения для выделения эпителиальной ткани.

Здесь авторы представляют оптимизированный метод выделения эпителиальных слоёв из просвета уретры самок мышей. Метод может использоваться для получения высокожизнеспособных одноклеточных суспензий эпителиальных клеток уретры для последующих применений, таких как проточная цитометрия, органоидная культура и иммунокрашивание. Совместимость этого метода с рабочими процессами секвенирования РНК для одной клетки ранее была продемонстрирована той же^{группой 5}. С помощью модификаций и дальнейшей оптимизации представленный здесь протокол может быть адаптирован для извлечения эпителиальных тканей из других трубчатых органов для последующих применений.

Ключевые этапы протокола включают тщательное вскрытие полноразмерной уретры взрослой самки мыши, что позволяет изучать региональные различия вдоль проксимально-дистальной оси. После этого протокол использует мягкое ферментное переваривание для ослабления эпителиальной оболочки уретры от окружающей стромы. Ферментативное переваривание ослабляет эпителий для механического разделения, мягко сжимая уретральную трубку между щипцами для освобождения эпителиальной ткани. Исследователи тщательно оптимизировали время расщепления трипсина, чтобы обеспечить выделение эпителия уретры с высокой жизнеспособностью (> 80%) в виде листов для иммунокрашивания или для последующей изоляции отдельных клеток (Рисунок 3, Дополнительный файл 1). Одноклеточное расщепление эпителия уретры выявило 80–90% эпителиальных клеток в эпителиальных изолятах уретры. Из предыдущего исследования авторы выяснили, что неэпителиальные клетки в этом препарате в основном состоят из эпителиально-ассоциированных иммунных клеток и сосудистого^{эндотелия 5}. Современный метод одиночной изоляции обеспечивает высококачественные суспензии с одной ячейкой для последующих применений, таких как проточная цитометрия и секвенирование одноклеточной РНК, устраняя сгустки клеток за счёт механического нарушения с помощью аспирации с помощью малой калибровочной иглы и удаления эритроцитов путём мягкой лизи.

Результаты показывают, что этот метод может быть использован для обогащения специфических иммунных клеток компартмента (рисунок 3). Эпителий, выделенный из проксимальной и дистальной уретры, также можно изучать отдельно. Кроме того, авторы продемонстрировали, что изолированные эпителиальные клетки могут использоваться для генерации органоидов уретры, которые ранее не были описаны (рисунок 4). Эти результаты также демонстрируют региональную вариабельность генерационной способности органоидов в женском уретре. Хотя недавние исследования автора показали проксимально-дистальные различия в экспрессии эпителиальных генов и организации иммунных клеток в уретре⁵ у самки мыши, текущее исследование показывает, что проксимальные эпителиальные клетки уретры образуют меньше органоидов, чем эпителий, изолированный из дистальной уретры (рисунок 4). Одно из ограничений этой пространственной демаркации на проксимальную и дистальную уретру заключается в отсутствии анатомического ориентира, который можно было бы использовать на момент вскрытия для различия этих двух областей. В этом исследовании авторы разделили длину уретры пополам, чтобы получить проксимальные и дистальные компартменты. Описанный здесь метод изоляции эпителия может быть использован для дальнейшей характеристики различий в экспрессии генов и клеточном составе между проксимальной и дистальной уретральной эпителией.

Хотя оптимизированный протокол, представленный здесь, доступен и воспроизводим, некоторые шаги требуют практики и тщательной калибровки. В частности, метод диссекции, показанный здесь, требует аккуратного извлечения уретральной трубки снизу лобкового симфиза при сохранении всей длины уретры. Кроме того, необходимо внимательно удалить всю ткань влагалища, прикреплённую к дорсальной стенке уретры, после вскрытия. Жир, присутствующий вокруг шеи мочевого пузыря, следует аккуратно удалять для снижения загрязнения адипоцитами при последующих приложениях, таких как секвенирование одноклеточной РНК. Кроме того, пищеварение трипсина следует тщательно оптимизировать с каждой партией фермента для обеспечения равномерного пищеварения. Чрезмерное переваривание тканей может привести к потере жизнеспособности клеток. Авторы тщательно оптимизировали время переваривания трипсина, указывая на 15–30 минут для этапов инкубации при 4 °C и 37 °C. Это можно дополнительно оптимизировать в зависимости от используемой партии фермента. Также крайне важно измельчивать ткани на мелкие кусочки для эффективного одноклеточного переваривания. Авторы использовали Аккутазу для дальнейшего пищеварения отдельных клеток, так как она приводит к мягкой диссоциации. В случае снижения жизнеспособности клетки время инкубации Аккутаз может быть сокращено. Кроме того, авторы включили ингибитор породы в смесь пищеварения аккутазы для повышения выживания клеток. Рекомендуется переваривание ДНКазы для снижения скупчивания клеток путём переваривания внеклеточной ДНК, выделяемой из мёртвых и умирающих клеток. Авторы также рекомендуют использовать буфер лизиса эритроцитов для снижения загрязнения эритроцитами, что может запутать последующие результаты, такие как потоковая цитометрия и секвенирование одноклеточных РНК.

Одно из ограничений метода эпителиальной изоляции, представленного здесь, заключается в том, что он был оптимизирован для уретры самки мыши. Уретра самца мыши более анатомически сложна, с изменяющейся эпителиальной архитектурой от проксимальной к дистальной уретре. Кроме того, метод может выделить только эпителиальные клетки, выстилающие просвет уретры. Секреторные железы уретры, соединённые с просветом уретры через короткие эпителиальные протоки, не могут быть выделены, так как они встроены в стромальную ткань. Вместо этого эти эпителиальные структуры обогащаются стромным компартментом, оставшимся после изоляции эпителиальной оболочки уретры (см. рисунок 3).

Несмотря на эти ограничения, этот метод позволил получить важное понимание архитектуры эпителия уретры и позволит дальнейшее исследование иммунных клеток, связанных с эпителиями, посредством визуализации эпителиально-ассоциированных макрофагов in situ. Уже доказано, что метод совместим с процессами секвенирования одноклеточной РНК для выявления клеточной гетерогенности эпителия уретры и связанных иммунных^{клеток 5}. Кроме того, возможность изолировать эпителий от проксимальной и дистальной уретры позволит изучать пространственные различия в уретре. Важно, что метод расщепления эпителиальных клеток даёт жизнеспособные отдельные клетки, способные генерировать эпителиальные органоиды уретры, полезные для изучения взаимодействий хозяина и патогена и эпителиальной биологии уретры. В целом эти методы расширяют набор инструментов для более глубокого изучения биологии эпителиального уретра.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		Для создания панелей рисунков
Adobe Photoshop	Adobe		Для создания панелей рисунков
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 разбавление, для анализа на цитомере
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 разбавление, для анализа на цитомере
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 разбавление
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 разбавление, для анализа на цитомере
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 разбавление
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	1:200 разбавление
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	1:200 разбавление
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	1:800 разбавление
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 разбавление
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	1:200 разбавление
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 разбавление
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 разбавление
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 разбавление
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 разбавление
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 разбавление
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 разбавление
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 разбавление
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	Анализ данных цитометрии
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	13624S
R-s