Методическая статья

Выделение и характеристика экзосом, полученных из стволовых клеток зубной пульпы, через клеточные проходы

DOI:

10.3791/70977

⸱

10 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол определяет стандартизированный рабочий процесс для изоляции и характеристики экзосом, полученных из стволовых клеток зубной пульпы (DPSC), по проходам, что позволяет воспроизводимо оценивать качество экзосом и функциональную активность для регенеративных применений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стволовые клетки зубной пульпы (DPSC) представляют собой доступный и клинически значимый источник мезенхимальных стволовых клеток, и их производные экзосомы стали перспективными биоактивными везикулами для безклеточных применений в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Однако воспроизводимые и стандартизированные методы выделения и функциональной валидации экзосом, полученных из DPSC, остаются ограниченными, особенно в отношении вариабельности, вводимой при расширении клетки через проходы. Здесь мы описываем комплексный, стандартизированный, основанный на наборах рабочий процесс для выделения и очистки экзосом из среды, обусловленной DPSC, совместимый с рутинной лабораторной практикой. Этот метод обеспечивает последовательное восстановление целых везикул, подходящих для морфологической, молекулярной и функциональной характеристики с использованием широко доступных методов. Идентичность экзосом оценивается на основе морфологии, распределения размеров и экспрессии маркеров, а биологическая активность — с помощью определённого противовоспалительного теста in vitro. Для изучения эффектов, связанных с проходами, экзосомы, полученные из различных пассажей DPSC, сравниваются с помощью этого функционального показания, предоставляющего практическую основу для оценки согласованности при расширении клетки. Интегрируя изоляцию, очистку, характеристику и функциональную валидацию в единый рабочий процесс, этот протокол предлагает воспроизводимый и масштабируемый подход к генерации функционально валидированных экзосом, полученных из DPSC, для исследований биоматериалов и регенеративных приложений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток, служат ключевыми медиаторами межклеточной коммуникации и демонстрируют значительный терапевтический потенциал в области тканевой инженерии и регенеративной медицины. Экзосомы — это пузырьки диаметром 30–150 нм, способные доставлять биоактивные молекулы и регулировать различные функции в реципиентных клетках, такие как пролиферация, дифференцировка и иммунный ответ 1,2. Среди различных источников мезенхимальных стволовых клеток (MSC) особый интерес вызывают зубные стволовые клетки (DPSC) благодаря их быстрой доступности, устойчивой пролиферативной способности, низкому риску опухолей и минимальным этическимаспектам 3,4,5. Экзосомы, полученные из DPSC (DPSC-Exos), содержат разнообразный репертуар функционального груза, включая белки, мРНК и микроРНК, что позволяет им сохранять многие биологические свойства своих родительских клеток. Предыдущие исследования показали, что DPSC-Exos способствуют ангиогенезу, нейронной реконструкции, регенерации костей и противовоспалительным реакциям. Помимо своей роли в тканевой инженерии, экзосомы всё больше признаются важными регуляторами в онкогенезе и терапии рака, где они способствуют ремоделированию микросреды опухоли, лекарственной устойчивости и уклонению отиммунитета 6. Экзосомы, полученные из MSC, включая те, что из DPSC, обладают врождёнными способностями к самонахождению опухолей и иммуномодуляторными свойствами, что делает их перспективными средствами следующего поколения для таргетной доставки противораковых препаратов или как иммунотерапевтические агенты без клеток. Обходя ряд ограничений, связанных с клеточными терапиями, DPSC-Exos стали перспективным бесцеллюдным биоактивным компонентом для регенеративныхприложений 7,8,9,10,11,12.

Несмотря на эти преимущества, перевод исследований DPSC-Exo в воспроизводимые экспериментальные или клинические применения остаётся сложным. Основным ограничением является отсутствие унифицированных и стандартизированных протоколов для изоляции и очистки экзосом. В настоящее время используемые методы включаютультрацентрифугирование 13, ультрафильтрацию, осаждение, хроматографию с исключением размера и иммуноаффинность14,15. Среди этих методов полимерные осадки имеют практические преимущества, включая высокую пропускную способность, совместимость с широким диапазоном объёмов образцов и простоту эксплуатации, что делает его подходящим для исследований с большим количеством образцов или требованиямимасштабирования 16,17,18. Сравнительный анализ различных методов изоляции, особенно по содержанию белка и соотношению частиц к белкам, широко задокументирован влитературе 19. Однако влияние номера проходов DPSC на характеристики и биологическую активность производных экзосом, что создаёт важный пробел в стандартизации и контроле качества производства DPSC-Exo.

Для устранения этих технических ограничений в этом исследовании представлен стандартизированный протокол на основе наборов для выделения и очистки экзосом из среды, обусловленной DPSC. Помимо физической и молекулярной характеристики, протокол включает функциональный анализ для оценки противовоспалительной активности экзосом, полученных из различных проходов DPSC, что позволяет сравнительно оценивать согласованность качества и функции экзосом, зависящих от проходов. Рабочий процесс разработан для простого внедрения в лабораториях, оснащённых стандартными оборудованиеми для клеточной культуры и молекулярной биологии. Он опирается на коммерчески доступные наборы для снижения межэкспериментальной вариабельности и может быть легко масштабирован под различные экспериментальные потребности. Чтобы минимизировать вариабельность между донорами, DPSC изолируют из отдельных зубов и расширяют независимо, а не объединяют от нескольких доноров. Этот протокол особенно полезен для исследователей, стремящихся создать функционально валидированные экзосомы, полученные из DPSC, для последующих применений, включая заживление ран, инженерию костной ткани и иммуномодуляционные исследования, где необходима согласованность между партиями. В целом, она предоставляет практическую и стандартизированную основу для производства экзосом, полученных из DPSC, для использования в тканевой инженерии и исследованиях регенеративной медицины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено институциональными этическими комитетами. Ткани зубной пульпы человека были получены из отброшенных третьих моляров или ортодонтических премоляров, собранных в стоматологической больнице Нинбо в соответствии с этическими рекомендациями учреждения (Протокол No NBKQYY2025LS-04; дата утверждения: 30 мая 2025 года). Человеческие кожные ткани были получены из отброшенных образцов крайней плоти, собранных во время рутинных процедур обрезания в отделении урологии Аффилированной народной больницы Университета Нинбо, в соответствии с институциональными этическими рекомендациями (Протокол No 2024104; дата утверждения: 30 октября 2024 года). Письменное информированное согласие было получено от всех доноров или их законных опекунов перед сбором образца.

1. Выделение экзосом, полученных из стволовых клеток зубной пульпы

  1. Изоляция, культура и идентификация DPSC
    1. Сбор и транспортировка образцов
      1. Собирайте целые человеческие третьи моляры у доноров в возрасте 18–25 лет или премоляры у доноров в возрасте 12–16 лет после удаления ортодонтии.
      2. Немедленно поместите удалённые зубы в предварительно охлаждённый фосфатный буферный физиологический раствор (PBS), дополненный 100 U/mL пенициллина-G и 100 мкг/мл стрептомицина.
      3. Транспортировать образцы в лабораторию при 4 °C и обрабатывать их в течение 6 часов после извлечения.
    2. Экспозиция зубной пульпы и диссоциация тканей
      1. Погружение в 70% этанола в течение 30 секунд; Стирать три раза с 1× PBS с 3% P/S (по 30 секунд каждая). Аккуратно удаляйте остатки десневых и пародонтальных тканей с поверхности зуба с помощью стерильных ножниц или скальпеля.
      2. Обмотайте зуб стерильной марлей, затем аккуратно откройте коронку стерилизованным молотком, чтобы открыть камеру пульпы.
      3. Аккуратно отделите ткань пульпы от дентина, измельчите её на мелкие фрагменты (<1мм 3) стерильными хирургическими лезвиями.
      4. Переместить фрагменты ткани в центрифугную трубку объёмом 1,5 мл, содержащую раствор для пищеварения 2,5 мг/мл Dispase II и 2,5 мг/мл коллагеназы типа I.
      5. Инкубировать смесь при 37 °C в инкубаторе 30–45 минут с аккуратным перемешиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность ферментативного пищеварения определялась на основе объёма и степени гомогенизации зубной пульпы.
    3. Прекращение пищеварения и первичная клеточная культура
      1. Остановите ферментативное пищеварение, добавив равный объём Modified Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненный 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS).
      2. Центрифугуйте суспензию клетки при 200 × г в течение 5 минут, чтобы пеллетировать клетки и фрагменты ткани.
      3. Отбросьте супернатант и суспензуйте гранулу в 1 мл полной культурной среды (α-MEM с 20% FBS, 100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).
      4. Засейте восстановленные клетки и экспланты в 60-мм культурную чашу и добавьте полную культурную среду к итоговому объёму 5 мл.
      5. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажнённой атмосфере, содержащей 5% CO₂.
    4. Содержание и субкультура клеток
      1. Обновляйте посевную форму каждые 2–3 дня.
      2. Ежедневно следите за ячейками.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные DPSC обычно мигрируют из тканевых эксплантов и достигают слияния 80–90% в течение 7–14 дней.
      3. Для субкультуры отделяйте клетки с помощью 0,05% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), когда они достигают слияния 80–90%.
        ВНИМАНИЕ: Трипсин — раздражитель. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и очки безопасности.
      4. Проходные клетки в соотношении 1:3 с использованием полной культурной среды (с 20% FBS).
      5. Используйте DPSC в пассажах 2, 4 и 6 для всех нижних экзосомных изоляций и функциональных анализов.
    5. Характеристика DPSC с помощью потоковой цитометрии
      1. Отсоедините DPSC в нужном проходе с помощью 0,05% трипсина-EDTA, нейтрализуйте с помощью полной культурной среды и собирайте клеточную суспензию.
      2. Центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте супернатант. Суспензировать клеточную гранулу в PBS и посчитать клетки. Отрегулируйте плотность клеток примерно на 1 × 106 клеток/мл.
      3. Аликвот 100 мкл суспензии клетки в каждую проточную цитометрическую трубку. Инкубировать клетки с антителами, конъюгированными с фторхромом, против CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 и CD14 при разбавлении 1:100 в PBS в течение 30 минут при 4 °C в темноте.
      4. Промывайте клетки, добавляя 1 мл PBS в каждую пробирку, затем центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут. Аккуратно сбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в 300–500 мкл PBS для анализа.
      5. Включайте соответствующие антитела контроля изотипа в соответствующих концентрациях для каждого фторохрома для обеспечения коррекции и фиксации фона.
      6. Анализируйте образцы с помощью потокового цитометра, оснащённого соответствующими лазерами и фильтрами для выбранных флюорохромов. Соберите не менее 10 000 событий на образец.
      7. Проводите анализ данных с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии. Во-первых, жизнеспособные элементы на основе прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для исключения мусора. Затем нанесите синглетное гейтинг, чтобы убрать дублеты.
      8. Определить экспрессию маркеров путём сравнения интенсивности флуоресценции с соответствующими контрольными изотипами для определения положительных и отрицательных популяций.
  2. Изоляция и очистка DPSC-Exos
    1. Подготовка кондиционированной среды
      1. Культивируйте DPSC в посевной чашке диаметром 10 см, пока они не достигнут 70–80% слияния.
      2. Удалите отработанную среду, а затем аккуратно промой монослой клетки дважды с предварительно подогретым PBS.
      3. Добавьте 10 мл полного материала с добавлением 10% FBS с истощёнными экзосомами.
      4. Далее инкубировать культуру при 37 °C до тех пор, пока слияние клеток не достигнет 90–100% (процесс обычно превышает 24 часа).
    2. Коллекция кондиционируемой среды
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги держите на льду или при 4 °C.
      1. Перенесите кондиционированную среду в центрифугную трубку.
      2. Центрифугуйте среду при температуре 4 °C и 3 000 × г в течение 10 минут, чтобы удалить клетки и крупный мусор.
      3. Аккуратно перенесите супернатант в новую центрифугную трубку, не нарушая гранулу.
      4. Центрифугуйте супернатант при температуре 4 °C и 10 000 × г в течение 10 минут, чтобы пелулировать мелкие частицы и апоптотические тела.
      5. Фильтруйте супернатант через шприцовый фильтр 0,22 мкм в чистую центрифугную трубку на 50 мл.
      6. Немедленно обработайте очищенную среду для выделения экзосом, или аликвот, и храните при -80 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенная кондиционированная среда может храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания.
    3. Изоляция экзосом с помощью полимерного осадка
      1. Разморозить просветлённую кондиционированную среду на льду, если она была заморожена.
      2. В стерильной трубке на льду смешайте среду с раствором экзосомной концентрации в соотношении объёма 4:1 (например, среда 20 мл: раствор 5 мл). Закрутите смесь в течение 1 минуты для обеспечения однородности.
      3. Оставьте смесь нетронутой при 4 °C на 16–18 часов, чтобы обеспечить выпадание экзосом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации можно соответствующим образом продлить для потенциального увеличения урожая, но не должно превышать 24 часа.
      4. Центрифугуйте смесь при 4 °C и 10 000 × г в течение 75–80 минут, чтобы пеллетировать экзосомы. Аккуратно аспирируйте и выбросьте супернатант, не нарушая гранулу.
      5. Центрифугуйте трубку при 4 °C и 10 000 × г на 2 минуты. Удалите остатки супернататора пипеткой.
      6. Суспензуйте экзосомную гранулу в 1x PBS (используйте 200 мкл PBS на 20 мл кондиционированной среды).
      7. Перенесите ресуспензию в новую трубку центрифугы на 1,5 мл и центрифугу при 4 °C и 12 000 × г на 2 минуты, сохраняя супернатант, который обогащён экзосомами (повторяйте при необходимости).
    4. Очищение экзосом
      1. Примените суспензию экзосомы к колонке фильтра для очистки экзосом, помещённой в сборную трубку.
      2. Центрифугуйте колонку при 4 °C и 3 000 × г в течение 10 минут.
      3. Собирайте проточную жидкость со дна трубки для сбора трубки. Эта жидкость содержит очищенные экзосомы.
    5. Хранение очищенных экзосом
      1. Аликвот — очищенную суспензию экзосом, размещённую для одноразовых объёмов, подходящих для последующих экспериментов.
      2. Храните аликвоты при -80 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Алицитирование критически важно для предотвращения повторяющихся циклов замораживания и оттаивания, которые могут ухудшить целостность экзосомы и биологическую активность.
    6. Характеристика и идентификация DPSC-Exo
      1. Проведите морфологический анализ с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM), как описано в шагах 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. Используйте пипетку, возьмите 10 мкл подготовленного образца суспензии экзосомы и опустите его на готовую парапленку. Поместите формвар/углеродное покрытие медной сетки, стороной пленки вниз, на каплю, чтобы она естественно адсорбировала 10–15 минут.
      3. Используйте полоску фильтрующей бумаги, чтобы отвести лишнюю жидкость и дать ей ненадолго высохнуть на воздухе.
      4. Используйте пипетку, наберите 10 мкл 2% фосфоронгстой кислоты и капите на парапленку. Инвертируйте сетку, завершившую этап адсорбции, так, чтобы её плёнка была обращена к раствору для окрашивания, и оставьте её на 3–5 минут.
      5. Используйте фильтрующую бумагу, чтобы отвести лишнюю жидкость и дать сетке высохнуть под лампой накаливания.
      6. Наблюдайте и делайте снимки с помощью трансмиссионного электронного микроскопа.
      7. Провести анализ распределения размеров и концентрации с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA), как описано в шагах 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. Промыйте камеру для образцов три раза ультрачистой водой.
      9. Калибруйте прибор стандартными бусинами полистирола диаметром 100 нм согласно инструкциям производителя. Продолжайте измерения после успешной калибровки.
      10. Промывайте пробную камеру с помощью 1× PBS.
      11. Разведите образец экзосомы в 1× PBS (разбавление 1:500) и загрузите его в камеру для образца. Отслеживайте движение частиц в реальном времени с помощью программного обеспечения прибора.
      12. Соберите данные и подготовьте соответствующий отчёт по анализу.
      13. Определить белковые маркеры с помощью анализа западного блота, как описано в шагах 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. Анализируйте образцы экзосом, используя буфер лизис-специфического белка, и количественно измеряйте концентрацию белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA).
      15. Подготовьте гели для разрешения и укладки. Загружайте равное количество белка на каждый участок и добавляйте 5 мкл белкового маркера в каждый гель.
      16. Проводите электрофорез при постоянном напряжении 80 В до тех пор, пока фронт красителя не достигнет разрешающего геля, затем увеличьте до 120 В и продолжайте, пока фронт красителя не достигнет низа геля.
      17. Разрежьте мембрану поливинилиденфторида (PVDF) до нужного размера и активируйте её, замочив в метаноле на 5 минут.
      18. Подготовьте буфер переноса, состоящий из основания 25 мМ Трис, 192 мМ глицина и 20% (v/v) метанола (pH = 8,3). Уравновесить все компоненты передачи в буфере передачи.
      19. Соберите сэндвич переноса в следующем порядке от катода к аноду: губка – фильтрующая бумага – гель – мембрана PVDF – фильтрующая бумага – губка. Удалите воздушные пузырьки и проведите перенос белка при постоянном токе 300 мА.
      20. После переноса ненадолго прополосните мембрану PVDF физиологическим раствором с Tris-буфером с 0,1% Tween20 (TBST) и заблокируйте 5% обезжиренным молоком на 1 час при комнатной температуре с мягким встряхиванием.
      21. Инкубировать мембрану первичными антителами (например, анти-CD63 и анти-TSG101), разбавленных в 5% обезжиренном молоке на ночь при 4 °C с мягким встряхиванием. Промой мембрану три раза с помощью TBST по 5 минут каждая.
      22. Инкубировать с соответствующим вторичным антителом при комнатной температуре в течение 30 минут, затем три промывания с ТБСТ (по 5 минут каждая).
      23. Подготовьте свежий рабочий раствор электрохемилюминесценции (ECL) (смешивайте растворы A и B в соотношении 1:1), наносите на мембрану и обнаружите сигналы с помощью системы хемилюминесцентной визуализации.

2. Выделение и культивирование первичных эпидермальных кератиноцитов кожи человека

  1. Сбор и транспортировка образцов
    1. Получите образцы тканей крайней плоти у здоровых мужских доноров в Аффилированной народной больнице Университета Нинбо.
    2. Немедленно поместите извлечённую ткань крайней плоти в 4 °C PBS, дополняя 100 U/mL пенициллина-G и 100 мкг/мл стрептомицина.
    3. Транспортировать образцы в лабораторию при 4 °C и обрабатывать в течение 6 часов.
  2. Асептическая подготовка и фрагментация тканей
    1. Погрузите ткань в 70% этанол на 30–3 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорректируйте время погружения в зависимости от размера ткани для начальной дезинфекции.
    2. С помощью стерильных ножниц или скальпеля вскрыть и удалять подкожный жир и соединительные ткани из промытого образца.
    3. Измельчите его на мелкие фрагменты (размер фрагмента <1мм 3) с помощью стерильных хирургических лезвий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фарширование 3–4 образцов тканей обычно занимает менее 15 минут. Добавляйте небольшое количество PBS во время измельчения, если ткань кажется сухой.
    4. Переместить измельчённую тканевую суспензию в центрифугную трубку объёмом 50 мл, содержащую раствор для пищеварения 2,5 мг/мл коллагеназы первого типа и 2,5 мг/мл Dispase II. Добавьте 10–20 мл раствора для пищеварения на каждый кусок измельчённой ткани.
    5. Инкубировать смесь при инкубаторе при температуре 37 °C в течение 60 минут. Поддерживайте мягкое перемешивание при 80 × г или интенсивно перемешивайте трубку вручную каждые 20 минут.
  3. Вторичное пищеварение и лечение ДНКазой
    1. Добавьте 0,25% трипсина-ЭДТА в варительную смесь в соотношении объёма 1:5. Инкубировать трубку при 37 °C в течение 25 минут с мягким перемешиванием.
      ВНИМАНИЕ: Трипсин — раздражитель. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и очки безопасности.
    2. Добавьте раствор DNase I (10 мг/мл) в смесь с соотношением 10 мкл на мл общего объёма пищеварения. Инкубировать при 37 °C в течение 5 минут с мягким перемешиванием.
  4. Прекращение пищеварения и первичная клеточная культура
    1. Остановите ферментативное переваривание, добавив равный объём DMEM с 10% FBS.
    2. Тщательно тритурируйте смесь, примерно 20 раз вверх и вниз для диссоциации фрагментов ткани. Фильтруйте суспензию ячейки через сито 100 мкм в новую центрифугную трубку на 50 мл.
    3. Центрифугуйте суспензию клетки при 200 × г в течение 5 минут, чтобы пеллетировать клетки и фрагменты ткани.
    4. Отбросьте супернатант и суспензуйте гранулу в 1 мл полной культурной среды (α-MEM с 20% FBS, 100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).
    5. Засейте вновь взвешенные клетки и эксрастения в 10-сантиметровую культурную миску и добавьте полный культурный материал к итоговому объёму 6 мл.
    6. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополните культуры кератиноцитов Y-27632 при конечной концентрации 5 мкм во время посева.
  5. Содержание и субкультура клеток
    1. Обновляйте посевную форму каждые 2–3 дня.
    2. Ежедневно следите за ячейками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные кожные эпидермальные кератиноциты обычно мигрируют из тканевых эксплантаций и достигают слияния 80-90% в течение 10-14 дней.
    3. Для субкультуры отделяйте клетки с помощью 0,05% трипсина-ЭДТА, когда они достигают слияния 80–90%.
      ВНИМАНИЕ: Трипсин — раздражитель. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и очки безопасности.

3. Функциональная проверка противовоспалительной функции экзосом из разных проходов

  1. Посев и подготовка клеток
    1. Семена эпидермальных кератиноцитов плотностью 1,5 × 105 клеток на каждую скважину в пластину с 12 лунами. Добавьте по 1 мл полного материала в каждую колодцу и выращивайте клетки в течение 24 часов.
    2. Когда слияние клеток достигает примерно 70%, аккуратно аспирируйте среду, аккуратно промывайте монослой клетки дважды предварительно нагретым 1× PBS.
  2. Воспалительная стимуляция и лечение экзосом
    1. Индуцировать псориазиформную клеточную модель, стимулировать клетки провоспалительной цитокиновой смесью «M5» (содержащей IL-1α, IL-17A, IL-22, онкостатин M и TNF-α, каждая с конечной концентрацией 10 нг/мл).
    2. Для групп лечения совместно инкубировать стимулированные клетки с DPSC-Exos (50 мкг на скважину).
    3. Для отрицательной контрольной (NC) группы добавьте эквивалентный объём PBS вместо экзосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите все стимуляции и процедуры в среде без содержания Y-27632, чтобы предотвратить его воздействие воспалительным сигнальным путям.
  3. Сбор образцов и анализ qRT-PCR (функциональное сравнение между отрывками)
    1. Собрать клетки и извлечь РНК после 24 часов обработки.
    2. Проанализировать экспрессию ключевого воспалительного маркера IL-23A.
      1. Сравните ингибирующие эффекты на экспрессию IL-23A среди групп лечения экзосом, полученных из различных проходов (P2, P4 и P6), с помощью qRT-PCR для оценки прохожих изменений функции экзосом.
      2. Проведите qRT-PCR с использованием следующих циклических условий: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 минут, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с и отжиг/расширение при 60 °C в течение 30 секунд.
      3. Проведите анализ кривой расплава от 65 °C до 95 °C для подтверждения специфичности амплификации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Начальные последовательности: Человек-IL-23A (вперед: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3', обратная: 5'-TATCCGATCCCTAGCAGCTTC-3'); Человек-H36B4 (вперед: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTGT-3', задняя часть: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация и характеристика стволовых клеток зубной пульпы
Первичные стволовые клетки зубной пульпы (DPSC), выделенные по описанному протоколу, демонстрировали стабильный рост и типичную мезенхимальную морфологию во время экспансии in vitro. Как показано на рисунке 1, DPSC в пассажах 2, 4 и 6 демонстрировали однородную популяцию веретенообразных, фибробластоподобных клеток, без видимых морфологических разли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стандартизированный протокол, описанный в этом исследовании, предоставляет воспроизводимую основу для выделения стволовых клеток зубной пульпы (DPSC), производства экзосом, полученных из DPSC (DPSC-Exos), а также функциональной валидации этих везикул в нескольких клеточных проходах. Ниже рассматриваются ключевые процедурные аспекты, стратегии оптимизации, методологические ограничения и более широкое значение этого рабочего процесса для исследований в области регенеративной медицины.

...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект был профинансирован Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 82273554). Авторы выражают признательность Лаборатории биоматериалов и регенерации тканей в больнице стоматологии Нинбо за постоянную поддержку и выражают благодарность как нынешним, так и бывшим сотрудникам за их ценные обсуждения. Авторы также выражают благодарность доктору Лилян Шэню из Аффилированной народной больницы Университета Нинбо за его щедрую помощь и активную поддержку в предоставлении образцов тканей крайней плоти.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.05% Trypsin-EDTA SolutionGibco25300054Благодаря своей способности к пищеварению трипсин широко используется для диссоциации клеток, рутинного переноса клеток в культуру и диссоциации первичных тканей.
100 mm Cell and Tissue Culture DishBiofilTCD010100Поверхностная обработка/не обработанная
Стерельное & Не-пирогенное
Не содержит ДНКазу/РНКазу
100 nm PS beadsThermo Fisher3100AПеред проведением экспериментов по анализу отслеживания наночастиц (NTA) прибор должен быть калиброван с использованием стандарта с точным известным размером частиц (100 нм).
15-mL Bulk Conical Centrifuge TubeKIRGENKG2611Стерильные, без РНКазы/ДНКазы и пирогенных веществ
200-mesh Formvar-carbon-coated copper gridZhongjing Scientific InstrumentsAZH200Поддерживает образцы экзосом для TEM-визуализации. Покрытие Formvar-углерод улучшает адгезию образца и проводимость, в то время как сетка с 200 ячейками обеспечивает достаточную открытую область для равномерного распределения частиц и стабильной визуализации.
37 °C IncubatorThermo Scientific5103287737-градусный CO2-инкубатор обеспечивает идеальную in vitro среду.
50-mL Bulk Conical Centrifuge TubeKIRGENKG2811Стерильные, без РНКазы/ДНКазы и пирогенных веществ
Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5]Abcamab193349Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5] (ab193349) - это моноклональное мышиное антитело, обнаруживающее CD63 в Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. Подходит для Человек.
Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]Abcamab125011Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] (ab125011) - это моноклональное кроличное антитело, обнаруживающее TSG101 в Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. Подходит для Человек, Мышь, Крыса.
Automated cell counterCountstarIC1000Автоматический счетчик клеток для быстрого и точного подсчета клеток
BCA Protein Assay KitBeyotimeP0012Хорошая линейная зависимость в пределах концентрации 50 - 2000 μg/ml.
Benchtop CentrifugeBIORIDGETD5Настольный центробежный аппарат для быстрого и эффективного разделения образцов в лабораторных условиях
Biological safety cabinetThermo Scientific1379Биологический безопасностный шкаф является стерильным контейнером, который защищает операторов, образцы и окружающую среду от биоопасностей путем фильтрации воздушных патогенов и предотвращения скрещивания при микробиологических работах.
Cell Culture Plate,12-WellEppendorf0030721110Обработка тканевой культуры, с крышкой, плоское дно
Стерельное, без обнаружения пирогенов, РНКазы & ДНКазы, ДНК человека & бактерий
Нетоксичный
Cell Culture Plate,96-WellNEST 701001 0714BОбработка тканевой культуры, полистирол, не-пирогенное, стерильное
CellsavingNCMC40100Без сыворотки, без животных белков
Среда для замораживания клеток
Collagenase, Type I, powderGibco17100017Коллагеназа - это протеаза, которая расщепляет связь между нейтральной аминокислотой (X) и глицином в последовательности Pro-X-Gly-Pro, которая встречается с высокой частотой в коллагене.
Dispase II, powderGibco17105041Dispase II (нейтральная протеаза) - это амино-эндо пептидаза, которая гидролизует N-концевые пептидные связи неполярных аминокислотных остатков.
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco C11995500BT[+]4.5г/л D-Глюкоза
[+]L-Глутамин
[+]110мг/л Натрий Пируват
Evo M-MLV Reverse Transcription KitAGAG11707Специальный реагент для обратной транскрипции для Real Time RT-PCR. Он использует обратную транскриптазу Evo M-MLV с сильной способностью к расширению, что позволяет эффективно синтезировать ДНК в течение короткого периода времени.
Exosome Concentration SolutionUmibioUR52111Извлечение экзосом из клеточного супернатанта
Exosome Depleted Fetal Bovine SerumUmibioUR50202Экзосомно-свободная фетальная бычья сыворотка была получена путем фильтрации стерильно собранной здоровой фетальной бычьей сыворотки, и ≥99% эндогенных экзосом в фетальной бычьей сыворотке были удалены. У нее была такая же скорость роста клеток и морфология, как и у фетальной бычьей сыворотки до обработки.
Fetal Bovine Serum,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lotfy, A., AboQuella, N. M., Wang, H. Mesenchymal stromal/stem cell (MSC)-derived exosomes in clinical trials. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 66 (2023).
  2. Shan, Z., Su, X., Liu, L., Duan, S. Liquid biopsy based on EV biomarkers: a new frontier for early diagnosis and prognosis assessment of cancer at ESMO 2024. Nano TransMed. 4, 100084 (2025).
  3. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 81 (8), 531-535 (2002).
  4. Pineda, J. R., et al. In vitro preparation of human Dental Pulp Stem Cell grafts with biodegradable polymer scaffolds for nerve tissue engineering. Methods Cell Biol. 170, 147-167 (2022).
  5. Chansaenroj, J., et al. Potential of Dental Pulp Stem Cell Exosomes: Unveiling miRNA-Driven Regenerative Mechanisms. Int Dent J. 75 (2), 415-425 (2025).
  6. Dhar, R., Subramaniyan, V. Exosomes: a next-generation cancer theranostics. Nano TransMed. , 100096 (2025).
  7. Wang, Y., et al. Therapeutic effect of mesenchymal stem cells and their derived exosomes in diseases. Mol Biomed. 6 (1), 34 (2025).
  8. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduction Targeted Ther. 9, 17 (2024).
  9. Li, L., Ge, J. Exosome‑derived lncRNA‑Ankrd26 promotes dental pulp restoration by regulating miR‑150‑TLR4 signaling. Mol Med Rep. 25 (5), 152 (2022).
  10. Lin, T., et al. Inhibition of chondrocyte apoptosis in a rat model of osteoarthritis by exosomes derived from miR‑140‑5p‑overexpressing human dental pulp stem cells. Int J Mol Med. 47 (3), 7 (2021).
  11. Liang, X., et al. Dental pulp mesenchymal stem cell-derived exosomes inhibit neuroinflammation and microglial pyroptosis in subarachnoid hemorrhage via the miRNA-197-3p/FOXO3 axis. J Nanobiotechnology. 22 (1), 426 (2024).
  12. Lin, T. Y., et al. 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside-stimulated dental pulp stem cells-derived exosomes for wound healing and bone regeneration. J Dent Sci. 20 (1), 154-163 (2025).
  13. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
  14. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335 (2019).
  15. Li, P., et al. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  16. Ludwig, A. K., et al. Precipitation with polyethylene glycol followed by washing and pelleting by ultracentrifugation enriches extracellular vesicles from tissue culture supernatants in small and large scales. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1528109 (2018).
  17. Veerman, R. E., et al. Molecular evaluation of five different isolation methods for extracellular vesicles reveals different clinical applicability and subcellular origin. J Extracell Vesicles. 10 (9), e12128 (2021).
  18. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  19. Gao, M., et al. Comparison of Yield, Purity, and Functional Properties of Large-Volume Exosome Isolation Using Ultrafiltration and Polymer-Based Precipitation. Plast Reconstr Surg. 149 (3), 638-649 (2022).
  20. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Res. 353 (1), 65-78 (2013).
  21. Noda, S., et al. Effect of cell culture density on dental pulp-derived mesenchymal stem cells with reference to osteogenic differentiation. Sci Rep. 9 (1), 5430 (2019).
  22. Ahmad, P., et al. Isolation methods of exosomes derived from dental stem cells. Int J Oral Sci. 17 (1), 50 (2025).
  23. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971 (2021).
  24. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  25. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  26. Yakubovich, E. I., Polischouk, A. G., Evtushenko, V. I. Principles and problems of exosome isolation from biological fluids. Biochem (Mosc) Suppl, Membr Cell Biol. 16 (2), 115-126 (2022).
  27. Li, Y., et al. Dental stem cell-derived extracellular vesicles as promising therapeutic agents in the treatment of diseases. Int J Oral Sci. 14, 2 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Dental Pulp Stem CellsDPSC ExosomesExosome IsolationExosome PurificationExosome CharacterizationCell PassagesMesenchymal Stem CellsSize DistributionMarker ExpressionAnti Inflammatory Assay

Похожие статьи