Обнаружение половых гормонов в слёзной пленке человека с помощью ферментно-связанных иммуносорбентных тестов

Краткое содержание

Этот протокол описывает оптимизированный ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) для обнаружения и количественной оценки 17β-эстрадиола и тестостерона в человеческой слезной жидкости, собранной через микрокапиллярные трубки. Этот подход позволяет минимально инвазивно измерять уровень слёзного гормона.

Аннотация

Слёзная пленка — это сложная, многослойная жидкость, необходимая для поддержания здоровья поверхности глаз, прозрачности зрения и защиты от патогенов и стрессоров окружающей среды. Состоящая преимущественно из липидов, водной жидкости, растворимых белков и муцинов, она служит не только для смазки и защиты глаза, но и служит ценным диагностическим средством для выявления заболеваний поверхности глаза, таких как сухость глаза (DED). Известно, что половые гормоны, включая андрогены и эстрогены, влияют на состав слёзной плёнки, но измерение этих гормонов в слезной жидкости ограничено низким объёмом образца и техническими сложностями. Этот протокол описывает пошаговый метод адаптации коммерчески доступных наборов для ферментно-связанного иммуноанализа (ELISA) для обнаружения и количественного определения 17β-эстрадиола и тестостерона в базальных разрывах, собранных с помощью микрокапиллярных трубок. Рабочий процесс включает оптимизированные стратегии сбора образцов, разбавления и подготовки анализов для проведения анализа небольших объёмов слез. Протокол демонстрирует осуществимость и воспроизводимость обнаружения гормонов в слезной жидкости с помощью адаптированных методов ИФС. Репрезентативные результаты получаются из объединённых пилотных образцов и предназначены для иллюстрации эффективности анализа, а не биологических различий. Такой подход может поддержать будущие исследования, изучающие слезную жидкость как матрицу для измерения гормонов в исследованиях поверхности глаз.

Введение

Слёзная плёнка играет важную роль в защите, питании и смазке поверхности^глаза. Толщина примерно 2–5,5 мкм и объем 3–10 мкл, скорость оборота 1–2 мкл в минуту на здоровом^{глазу 2,3}. Слёзные железы выделяют водный компонент слёз, богатый водой, электролитами, белками и антимикробными факторами, в то время как мейбомиевые железы вырабатывают липиды, замедляющие испарение слёзной плёнки, а конъюнктивальные кубочные клетки выделяют муцины, поддерживающие смазку поверхности глаз⁴. Производство слёз происходит двумя основными способами: 1) базальная секреция, которая поддерживает стабильную слёзную пленку на здоровой глазной поверхности, и 2) рефлекторная секреция, вызываемая такими раздражителями, как раздражение, эмоции или яркий свет. Биохимический состав различается между двумя методами, что в конечном итоге может повлиять на метод сбора слёз для анализа ^5,6. Базальные разрывы обычно содержат более высокие концентрации белков и липидов, которые поддерживают стабильность пленки и здоровье роговицы, тогда как рефлекторные разрывы имеют больший водный объём и более разбавлены, чтобы размыть раздражители и защищать поверхность глаз ^7,8,9.

Поскольку слёзы модулируют воспаление, защищают от патогенов и обеспечивают питательные вещества аваскулярной^{роговицы 1}, они стали центром исследований^{биомаркеров 10}. Слёзы представляют собой минимально инвазивную и относительно экономичную альтернативу анализу крови для мониторинга физиологических изменений, особенно тех, что происходят рядом с местом^{заболевания 8}. Для точного сбора этих данных необходим правильный^{сбор 10}. Стеклянные микрокапиллярные трубки широко используются для отбора базальных разрывов, так как позволяют собирать их с минимальным раздражением и разбавлять^{слезы 5}. Этот метод минимизирует риск стимуляции рефлекторного разрыва, которое может изменять состав^{разрыва 9,11}, за счёт аккуратного расположения трубки, чтобы избежать контакта с булбарной конъюнктивой и краем крышки. Используя этот подход, исследователи могут получить неразбавленные базальные разрывы, отражающие физиологическое состояние глазной поверхности. Это гарантирует, что образец остаётся надёжной средой для количественной оценки чувствительных аналитов, таких как половые^{гормоны 10,12}. Однако ограниченный объём представляет аналитические сложности для биохимических анализов на последующих этапах. Базальный сбор слёз с использованием микрокапиллярных трубок обычно даёт несколько микролитров на образец, что ограничивает совместимость со стандартными анализами.

Человеческая глазная поверхность всё чаще признаётся мишенной тканью для половых^{гормонов 13,14}. Доказательствами в поддержку этого являются обнаружение транскриптов мРНК для андрогенных рецепторов (AR), эстрогеновых рецепторов (ER) и прогестероновых рецепторов (PR) в ацинарных клетках слёзной и мейбомиевой желез, а также в эпителиальных клетках роговицы, конъюнктивы и конъюнктивальных кубочных^{клеток 15}. Кроме того, в этих тканях выявлены мРНК, кодирующие стероидогенные ферменты, что свидетельствует о способности локально превращать стероидные предшественники в биологически активные половые^{гормоны.} Это указывает на потенциал in situ синтеза гормонов на поверхности глаза и поднимает критический вопрос о том, выделяются ли эти гормоны в слёзную пленку на обнаруживаемых уровнях.

Современные данные свидетельствуют о том, что половые гормоны являются неотъемлемой частью поддержания гомеостаза глазной поверхности, хотя точные молекулярные механизмы остаются предметом^{изучения 13,14}. Андрогены, такие как тестостерон, по-видимому, стимулируют выделение липидов и подавляют воспаление; Следовательно, дефицит андрогенов широко признан причиной испарения сухости^глаз 13,14,17. В отличие от эстрогена, роль эстрогенов более нюансирована и зависит от^{контекста} 13,14,18. Хотя колебания эстрогена участвуют в модуляции состава и объёма слёз, такие как во время менопаузы, беременности или использования оральных контрацептивов, часто сопровождаются снижением водной секреции, снижением стабильности слёзной плёнки и воспалением поверхности глаз^19,20. В результате люди, испытывающие такие гормональные дисбалансы, представляют собой группу с повышенным риском развития болезни сухого глаза (DED⁾13,14,20.

Несмотря на эти данные, мониторинг гормонального состояния у пациентов с ДЭД остаётся сложной задачей. В частности, пока не установлено, точно ли уровень системных гормонов в сыворотке отражает локальные уровни гормонов в^{глазу 21}. Это различие важно, поскольку было показано, что ткани поверхности глаз обладают рецепторами половых гормонов и экспрессией стероидогенных ферментов, поддерживающих локальный синтез и метаболизм половых^{стероидов 16}. Эта внутрикринная способность свидетельствует о том, что концентрации локальных гормонов в слезной пленке могут значительно отличаться от уровней циркулирующей^{сыворотки 13}. Поэтому необходимо прямое измерение концентрации гормонов в слезной жидкости для лучшего понимания местных гормональных эффектов на поверхность глаза. Однако такие показатели технически сложны из-за небольшого объёма образцов слёз, доступных для анализа. Передовые аналитические методы, такие как жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS), использовались для количественного определения гормонов в крови и слезных жидкостях с высокой чувствительностью, но этот метод требует специализированных приборов и технической экспертизы, которые могут быть недоступны всем^{исследователям 21,22}.

Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) — широко известная методика обнаружения и количественной оценки белков, антител и гормонов. Для анализа малых молекул, таких как половые стероиды, этот протокол использует конкурентный формат связывания. В этом методе немаркированный гормон, присутствующий в образце слезы, конкурирует с аналогом гормона, маркированного ферментом, за ограниченное количество сайтов связывания антител. Из-за этой конкуренции интенсивность сигнала, измеряемая как оптическая плотность, обратно пропорциональна концентрации гормона в образце; Фактически, более низкий сигнал указывает на более высокую концентрацию целевого^{гормона 23,24}.

ELISA предлагает несколько практических преимуществ для целенаправленной количественной оценки. Он экономически эффективен и технически доступен, позволяя внедрять его в стандартных лабораторных условиях без необходимости специализированного оборудования. Кроме того, ELISA обеспечивает высокопроизводительное скринингование в форматах пластин с 96 лунностями при минимальной подготовке образцов, обеспечивая как экономичность по времени, так и высокую^{воспроизводимость 23}. Однако коммерчески доступные наборы для ИФС обычно оптимизированы для биологических образцов большего объёма, таких как сыворотка или плазма, и их эффективность в образцах слёз с низким объёмом не определена должным образом. Для устранения этого ограничения протокол включает оптимизированные стратегии разведения и обработки образцов, позволяющие выявлять гормоны в пределах диапазона чувствительности анализа.

В этом исследовании мы представляем визуализированный протокол, который адаптирует коммерчески доступные наборы ELISA для обнаружения и количественной оценки 17β-эстрадиола и тестостерона в образце слёз человека с низким объёмом, собранном с помощью стеклянных микрокапиллярных трубок. Этот протокол акцентирует внимание на практических изменениях в сборе образца, обработке и подготовке анализа, чтобы позволить воспроизводимое измерение гормонов при ограниченных объёмах слёз. Эта работа направлена на создание жизнеспособного рабочего процесса для применения существующей методологии ELISA для анализа слёзной жидкости. Такой подход может служить основой для будущих исследований по изучению локальных уровней гормонов на поверхности глаза.

Протокол

Это исследование было одобрено Институциональным обзорным советом Университета Индианы (IRB#1908362633), и все участники получили письменное информированное согласие перед сбором образцов.

1. Коллекция фильмов Tear

1. Приготовление
   1. Определите объём слёз, который нужно собрать, учитывая, что для статистической надёжности результатов ELISA требуется 2 реплики.
   2. Подготовьте микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл для хранения слёзной плёнки.
   3. Выберите подходящие микрокапиллярные трубки для сбора разрывов. Рекомендую начинать с 3,33 мкл или 5 мкл и переходить на меньший размер, если собираешь с меньшего объёма слёз на поверхности глаза.
   4. Подготовьте резиновую лампу для сжатия в комплекте с набором для микрокапиллярных трубок, чтобы облегчить перенос слезной жидкости в микроцентрифугную трубку.
2. Коллекция слёз
   1. Попросите участника смотреть прямо вперёд или чуть вверх.
   2. Аккуратно поместите отверстие микрокапиллярной трубки в мениск слёзы возле латерального кантуса для сбора базальных разрывов.
   3. Минимизируйте контакт с булбарной конъюнктивой и краем веки, чтобы максимально избежать рефлекторных разрывов.
   4. Наполните трубку слезами, пока она не наполнится.
   5. Если требуется несколько сеансов, планируйте их с интервалом в 24 часа и в одинаковое время в течение дня, чтобы минимизировать вариабельность уровней гормонов.
3. Слёзное хранение
   1. Закройте отверстие в верхней части резиновой лампы, затем вставьте микрокапиллярную трубку в луковицу, а открытый конец сразу же поместите внутрь трубки микроцентрифуга, чтобы разрывы вытекли из микрокапиллярной трубки. Может потребоваться дополнительное сжатие луковицы, чтобы получить как можно больше образца разрыва из микрокапиллярной трубки.
   2. Закройте крышку трубки микроцентрифуги, чтобы предотвратить испарение.
   3. Прокрутите пробирку с помощью настольного микроцентрифугного устройства при 2000 × г в течение 3–5 секунд, чтобы образец оказался на дне пробирки перед хранением.
   4. Храните при -80 °C для сохранения стабильности анализа перед анализом.

2. Тестостероновый анализ

1. Подготовьте стандарты тестостерона, соблюдайте протокол
   1. Следуйте протоколу набора, убедитесь, что реагенты и оборудование для подготовки стандартов, контролей и образцов тестостерона доступны.
   2. Восстановите стандарт тестостерона с помощью деионизированной или дистиллированной воды, чтобы получить стандартный раствор 100 нг/мл. Обеспечьте полную реконструкцию и дайте ему постоять минимум 15 минут.
   3. Подготовьте стандарт тестостерона в день эксперимента.
   4. Подготовьте 6 микроцентрифугных трубок для стандарта, с 900 мкл калибровочного разбавления в трубку 10 нг/мл и 400 мкл в оставшиеся трубки.
   5. Пипетка 100 мкл стандартного раствора в первую трубку (трубка 10 нг/мл), тщательно перемешайте и замените кончик пипетки для следующего переноса.
   6. Пипетте 200 мкл первой трубки (10 нг/мл) в следующую трубку (3,33 нг/мл), тщательно перемешайте, меняйте кончик пипетки для следующей передачи и повторяйте этап до последней трубки (0,041 нг/мл).
   7. Примечание: после выполнения всех этапов должно быть 7 специальностей стандартов. Калибровочный разбавитель служит нулевым стандартом (0 нг/мл). Каждый подготовленный стандарт более чем достаточно для двух повторений.
2. Подготовьте контроль тестостерона: низкая, средняя и высокая концентрация
   1. Восстановьте каждый флакон с объёмом деионизированной или дистиллированной воды, указанным в сертификате анализа (COA) контрольного комплекта
   2. Разведите каждый регулятор в 2-кратном разбавлении в калибраторе перед использованием в анализе
3. Подготовьте образцы
   1. Удалите образцы слёз при температуре -80 °C и положите их на лёд для размораживания.
   2. После полного оттаивания образцов кратковременно центрифугуйте образцы слёз, чтобы убедиться, что все образцы находятся на дне пробирок при комнатной температуре в течение 3–5 секунд.
   3. Смешайте 20 мкл образца с 80 мкл разбавителя калибратора, чтобы получить общий объём 100 мкл на каждую реплику.
   4. Планируйте две реплики для эксперимента по надёжности и неспецифические связывающие (NSB) колодцы для контроля фона.
   5. Примечание: Каждый образец анализируется в дублирующих скважинах. Поэтому для проведения анализа требуется 40 мкл образца слёзы на участника, смешивая с 160 мкл разбавителя калибра для получения общего объёма 200 мкл.
4. Процедура анализа
   1. Подготовьте все реагенты, стандарты работы, образцы слёз и контрольные механизмы.
   2. Удалите лишние колодцы из каркаса микропластины и восстановите их в осушительном пакете при температуре 4 °C.
   3. Добавьте 50 мкл первичного раствора антител (синего цвета) в каждую скважину, за исключением скважин, предназначенных для NSB-скважин. Накройте пластину алюминиевой фольгой.
   4. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 1 часа на горизонтальном орбитальном шейкере микропластин (орбита 0,12"), установленном на 500 ± 50 об/мин или на максимально близкой доступной настройке.
   5. Подготовьте достаточный буфер для промывки на 8 промывок — 400 мкл/скважин/промывку (4 промывки до и 4 после 3-часового инкубационного этапа).
   6. Аспирируйте содержимое каждой колодцы и промой тарелку 4 раза с буфером для мойки.
   7. Добавьте 100 мкл разбавителя калибровщика в скважины NSB и ноль стандартных скважин.
   8. Добавьте 100 мкл стандартных, контрольных и подготовленных образцов слёз в назначенные скважины.
   9. Добавьте в каждую колодцу 50 мкл конъюгата тестостерона и тщательно перемешайте с помощью пипетки.
   10. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 часов на горизонтальном орбитальном микроплитном шейкере (орбита 0,12", установленном на 500 ± 50 об/мин или на максимально близкой доступной настройке.
   11. Аспирируйте каждую скважину и стирайте 4 раза с помощью буфера для стирки.
   12. Подготовьте раствор субстрата непосредственно перед использованием, смешав цветной реагент A и цветной реагент B в соотношении 1:1. Выделяйте по 200 мкл на каждую скважину. Полная аспирация остаточного буфера для промывки перед добавлением субстрата.
   13. Добавьте 200 мкл раствора субстрата в каждую скважину в течение 15 минут после подготовки. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре на столе. Защитите от света, накрыв алюминиевой фольгой.
   14. Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую скважину в том же порядке, что и в растворе подложки. Тщательно перемешайте каждую деталь, и цвет должен смениться с синего на жёлтый.
   15. Измерьте оптическую плотность на 450 нм и 560 нм в течение 30 минут после добавления раствора Stop с помощью считывателя микропластин.
   16. Примечание: В инструкции производителя рекомендуют референсную длину волны 540 нм или 570 нм. В этом протоколе длина волны 560 нм использовалась как ближайший вариант на считывателе микропластин для коррекции фоновых сигналов и оптических несовершенств.
5. Расчёт
   1. Вычитаем оптическую плотность, измеренную на 560 нм (опорная длина волны), от оптической плотности, измеренной на 450 нм.
   2. Вычтите среднюю оптическую плотность NSB из каждого отдельного показания стандартов, образцов и контролей, затем вычислите среднее количество дублирующихся измерений.
   3. Генерируйте стандартную кривую, подгоняя данные с помощью четырёхпараметрической логистической (4PL) модели.
   4. Определите концентрацию тестостерона, интерполяцируя образцы из стандартной кривой.
   5. Скорректируйте рассчитанные концентрации, применяя коэффициент разбавления 5 для учёта разбавления образца 1:5.
   6. Проверьте измерение, вычислив коэффициент вариации (CV) между репликами, который не должен превышать 20%.
      1. Примечание: %CV = (SD/среднее) × 100

3. Анализ на эстрадиол

1. Подготовьте стандарты, контроли и образцы эстрадиола
   1. Следуйте протоколу комплекта, убедитесь, что реагенты и оборудование доступны для подготовки стандартов, контролей и образцов.
   2. Дайте всем реагентам и материалам достичь комнатной температуры перед использованием.
   3. Подготовьте свежий реагент в день эксперимента.
   4. Стандарты и контроль готовы к использованию. Aliquot — только количество необходимого для текущего анализа, чтобы минимизировать загрязнение и ограничить повторные перепады температуры при обработке.
   5. Убедитесь, что подготовлены шесть стандартов (No 0–5), при этом стандарт 0 соответствует 0 пг/мл, и включите один контрольный образец, предоставленный в комплекте.
   6. Разморозьте замороженные образцы при температуре -80 °C, положив их на лёд.
   7. Прокрутите образцы слёз вниз, чтобы убедиться, что все образцы находятся на дне пробирки.
2. Процедура анализа
   1. Удалите лишние колодцы из микропластины и восстановите их в осушительном пакете при температуре 4 °C.
   2. Добавьте 20 мкл стандартов, контролей и образцов в скважины.
   3. Примечание: каждый стандарт и образец должны быть проанализированы с двумя репликами.
   4. Для обеспечения однородного распределения тщательно смешивайте все стандарты, контрольные элементы и образцы непосредственно перед пипетированием в скважины.
   5. Добавьте 160 мкл 17 бета эстрадиола-HRP конъюгата в тестовые скважины.
   6. Оставьте пустую ямочку для субстрата.
   7. Перед установкой в инкубатор накройте скважину алюминиевой фольгой. Раствор в скважинах может испаряться в алюминиевую фольгу.
   8. Инкубировать при 37 °C в течение 2 часов.
   9. Подготовьте буфер для мойки из раствора 10X во время инкубации.
   10. После завершения инкубации удалите алюминиевую фольгу и аспирируйте жидкость из скважин.
   11. Помой каждую колодцу три раза с помощью буфера для стирки. Замачивайте > 5 секунд в каждом цикле стирки.
   12. Добавьте 100 мкл раствора субстрата TMB во все колодцы.
   13. Накройте всю тарелку алюминиевой фольгой и инкубуйте при комнатной температуре ровно 30 минут.
   14. Добавьте 100 мкл раствора стопа во все скважины в том же порядке и с той же скоростью, что и в предыдущем добавленном растворе подложки TMB.
   15. Если аккуратно встряхнуть микропластину, реагент меняет цвет с синего на жёлтый.
   16. Измерьте поглощение на 450 нм в течение 30 минут после добавления раствора Stop.
3. Расчёт
   1. Вычтите поглощение пустой ямы из показаний всех стандартов, образцов и органов управления для коррекции дефектов фонового сигнала и оптических несовершенств.
   2. Рассчитайте среднее количество дублирующихся измерений.
   3. Сгенерировать стандартную кривую с наилучшим соответствием с использованием четырёхпараметрической логистической (4PL).
   4. Определите концентрацию эстрадиола, интерполируя значения образца из стандартной кривой...
   5. Проверьте измерение, вычислив коэффициент вариации (CV) между репликами, который не должен превышать 20%.
      1. Примечание: %CV = (SD/среднее) × 100.

4. Анализ данных с использованием R и RStudio

1. Установите R и RStudio, а также установите необходимые пакеты, указанные в Таблице материалов , перед проведением анализа данных.
2. Импортируйте измерения оптической плотности для стандартов, контролей и образцов в программное обеспечение для анализа.
3. Предварительно обработайте данные, применяя коррекцию длины волны, указанную в анализе. Затем вычитаем пустые или NSB значения и вычисляем среднее по дублирующимся измерениям.
4. Подгонка стандартной кривой с использованием четырёхпараметрической логистической (4PL) регрессионной модели с концентрацией как независимой переменной и оптической плотностью как переменной отклика.
5. Выполните подгонку кривой в R с помощью функции drm() из корпуса drc, при этом модель обозначена как fct = LL.4() для регрессии 4PL, с данными концентрации и оптической плотности в качестве входа.
6. Проверьте качество подгонки кривой (например, R² > 0,99 или приемлемое соответствие) перед интерпретацией концентраций образца.
7. Вычислите концентрации гормонов с помощью обратного предсказания с использованием функции ED() на основе стандартной кривой, задавая эффективную дозу, соответствующую значениям оптической плотности образца на основе подходящей модели.
8. Корректируйте рассчитанные концентрации, применяя соответствующий коэффициент разведения (например, ×5 для разбавления 1:5).
9. Сообщайте о конечных концентрациях гормонов в соответствующих единицах (например, нг/мл или пг/мл), обеспечивая согласованность со стандартной кривой, и экспортируйте обработанные данные для дальнейшего анализа или визуализации.

Результаты

Пилотное исследование фильма Tear

В это исследование было включено всего 20 женщин (45–63 года). Классификация DED основывалась на симптомах и как минимум одном клиническом признаке DED. В частности, все участники DED имели индекс глазной поверхностной болезни (OSDI) > 12 и хотя бы один глаз с интервалом разрыва слезы флуоресцеина (TBUT) < 5 с или баллом окрашивания роговицы (CFSS) > 3 (шкала^{NEI 25}). Участники, классифи...

Обсуждение

Сбор и анализ слёз позволяют легко получить доступ к научной оценке состояния поверхности глаз и выявлению потенциальных^{биомаркеров 10,22}. Наш протокол описывает успешную адаптацию широко используемых методов ИФА для анализа образцов слёзной плёнки на половые гормоны. Мы разработали этот метод для устранения основного ограничения анализа разрывов — относительно небольшого объёма доступных разрывов. Оптимизируя рабочий процесс с у...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
17 бета-Эстрадиол ЭЛИСА-набор	Abcam	ab108667
Алюминиевая фольга	Reynolds Wrap	10900000154	Любая доступная алюминиевая фольга для кухни для защиты реагентов от света
Микрокапиллярная трубка 3,33 мкл	Drummond	1-000-0033	Включает в себя резиновый шприц для перекачки жидкости
Микрокапиллярная трубка 5 мкл	Drummond	1-000-0050	Включает в себя резиновый шприц для перекачки жидкости
Микроцентрифуга	Benchmark Scientific	C1012
Микроцентрифужная трубка 1,5 мл	Fisher	05-408-129
Микротитрационный анализатор	Promega	GM3000
Орбитальный микротитрационный миксер	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
Язык программирования R	Posit Software, PBC (ранее RStudio Inc.)	Версия R 4.5.1	Скачать язык R до Rstudio через https://cran.r-project.org/
Программное обеспечение RStudio	Posit Software, PBC (ранее RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
Пакеты R "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (ранее RStudio Inc.)		Установите пакет в Rstudio
Контрольный набор для тестостерона	R&D Parameter	QC165	Продается отдельно от ЭЛИСА-набора (KGE010)
ЭЛИСА-набор для тестостерона	R&D Parameter	KGE010