Комплексная модель крыс для оценки путей транспорта печени с помощью одновременного отбора образцов лимфатических и кровососудистых систем

Краткое содержание

Этот экспериментальный протокол описывает модель крыс с канюлированием печеночных лимфатических протоков, которая позволяет напрямую и количественно оценивать лимфатический и сосудистый дренаж печени. Модель позволяет одновременно отбирать пробы печеночных лимфы и системной крови для изучения печёночного транспорта, обмена веществ и иммунной сигнализации, поддерживая исследования фармакокинетики лекарств и биологии, специфичной для печени.

Аннотация

Печень является центральным метаболическим и иммунологическим центром, который обрабатывает питательные вещества, ксенобиотики и циркулирующие иммунные медиаторы. Вещества попадают в гепатоциты и другие клетки печени через синусоидальные капилляры, которые получают кровь из кишечника через портальную вену и из системного кровообращения через печёночную артерию. Плазма фильтрует из синусоидальных капилляров в пространство Диссе, где может пройти метаболическую трансформацию, участвовать в иммунном надзоре или проникать в лимфатические сосуды для формирования печеночной лимфы. Отбор проб печеночных лимфы и крови может помочь провести детальный анализ транспорта печени, метаболических процессов и иммунной активности. Описана хирургическая модель крысы, позволяющая одновременно отбирать пробу оттока лимфы из печени и системной крови через три различных участка каннуляции: печеночный лимфатический проток, сонную артерию и яремную вену. Кануляции печеночных лимфатических и артериальных заболеваний обеспечивают непрерывное отбор проб, тогда как канюля яремной вены может использоваться для непрерывной гидратации и поддержки жидкости или для сбора венозной крови, что позволяет сравнивать артериальную и венозную кровь. Успешная каннуляция обеспечивает поток лимфы в печени примерно 0,1 мл/ч у анестезированных крыс, что позволяет проводить непрерывный лимфический отбор образцов до 8 часов при одновременном отборе артериальной и венозной крови. Такая система позволяет напрямую сравнивать системную артериальную кровь и лимфатический отток печени, что даёт возможность всестороннее исследование транспорта и клиренса печени, а также метаболических и иммунных сигнальных процессов. Для дальнейшего расширения модели в конце процедуры может быть проведен конечный отбор проб печененной артерии и воротной вены, что позволяет напрямую сравнивать приток, выход и лимфатический дренаж печени. В конечном итоге эти методы предоставляют универсальную платформу для оценки печеночных процессов, включая фармакокинетику лекарств, поток питательных веществ и метаболизм, а также специфические реакции печени при различных патофизиологических условиях.

Введение

Печень является центральным метаболическим и иммунологическим органом, отвечающим за обработку питательных веществ, ксенобиотическую детоксикацию и иммунный надзор. Печень — крупнейший орган, производящий лимфу в организме. Исследования на крупных млекопитающих показывают, что он вносит вклад от 25%–50% общего^{лимфатического потока 1,2}. У грызунов исследования канюляции показывают, что примерно 10–20% общего грудного лимфатического потока происходит из^{печени 3,4}. Печеночная лимфа происходит из плазмы, фильтруемой через фенестрированный эндотелий синусоидальных капилляров в печеночной паренхиме. Этот фильтрат накапливается в пространстве Диссе — интерстициальном компартменте между гепатоцитами и синусоидальными эндотелиальными клетками. Затем фильтрат проходит через пространство Малла в портальные лимфатические капилляры, которые сходятся в собирательные сосуды, стекающие к печеночному хилю и цистерне^{хили 5,6}.

Печеночная лимфатическая система анатомически разделена на портальную, субкапсулярную и сублобулярную^{сети 6,7}. Недавние исследования объемной визуализации показывают, что печеночные лимфатические сети образуют сильно разветвлённую сеть, зависящую от сосудистого эндотелиального фактора роста C (VEGF-C), в основном ограниченную портальными трактами. Эта сеть состоит преимущественно из лимфатических капилляров, которые ретроградно стекают в сторону портальной вены. С другой стороны, субкапсулярные и сублобулярные лимфатические линии, расположенные соответственно вдоль печёночной поверхности и в центральных венозных областях, являются дополнительными дренажными путями. Посмертная визуализация человека также выявила плотную сеть лимфатических сосудов вдоль печеночных вен, что указывает на то, что перипортальная и печеночная венозные лимфатические линии совместно регулируют отток печеночных^{лимфов 8}.

Печеночная лимфа представляет собой ультрафильтрат, полученный из плазмы, который отражает как метаболические, так и иммунные^{процессы 9,10}. Биохимические анализы показывают, что печеночная лимфа содержит альбумин, липопротеины, цитокины и метаболиты, полученные в результате паренхимальной активности^{печени 3,4,6}, что соответствует общему протеомному профилю лимфатической жидкости, описанному в других^{тканях 10}. Ранние исследования показали, что печеночная лимфа содержит отдельные классы липопротеинов, при этом липопротеины высокой плотности (ЛПВП) представляют собой доминирующую фракцию, что соответствует центральной роли печени в синтезе и ремоделировании^{ЛПВП 11}. Примечательно, что более недавние исследования показали, что печёночная лимфа обогащается эфирами ЛПВП и холестерина по сравнению с мезентериальной лимфой, что подчёркивает её особый вклад в трафик липидов и обратный перенос^{холестерина 3}. Кроме того, печеночная лимфа служит иммунологическим каналом, перенося иммунные медиаторы, клетки, представляющие антиген, и внеклеточные везикулы, связывающие печёночную микросреду с системным^{иммунитетом 9}.

Изменения в формировании и дренаже печеночной лимфы являются ключевыми признаками заболеваний печени. При циррозе и портальной гипертензии повышенное синусоидальное давление приводит к многократному увеличению выработки лимфангии, что приводит к лимфангиэктазии, фиброзу и асциту при превышении дренажной способности. Хроническое повреждение печени также способствует лимфангиогенезу, зависящему от VEGF-C/VEGFR-3, при чрезмерном или аномрантном лимфическом ремоделировании воспалении печени, отёку и накоплению^{липидов 9,12}. Кроме того, при связанном с метаболической дисфункцией стеатозической болезни печени (MASLD) и гепатоцеллюлярной карциноме повышенная плотность лимфатической плотности печени коррелирует с прогрессированием заболевания и^{метастазами 13,14}.

Несмотря на центральную физиологическую и клиническую роль печеночной лимфы, она остаётся недостаточно изученной и недостаточно изученной в экспериментальных исследованиях, главным образом из-за технических трудностей при выделении чистой печеночной лимфы. Модели сбора грудной и мезентериальной лимфы описаны более широко, но они дают лишь косвенное представление о механизмах транспорта печени. Ограничение в области было решено разработкой модели каннулирования печеночной лимфы у крыс, что позволило проводить прямой сбор^{печеночной лимфы 4}. Используя этот подход, было показано, что большая часть лимфатического поглощения внутривенно введённых терапевтических белков происходит в печени и брыжейке. Эти результаты выделяет печеночную лимфу как ключевой путь макромолекулярного обмена между кровью и лимфатической системами, что имеет важное значение для фармакокинетики и распределения биологических^{терапевтических средств 4}.

Для устранения оставшихся пробелов в данном исследовании описывается комплексная модель крыс, позволяющая одновременно брать пробу печеночных лимфических и системной крови посредством канулирования печеночного лимфатического протока, сонной артерии и яремной вены. Этот подход позволяет в реальном времени оценивать транспортировку растворённых веществ и обмен между печеночными интерстициальными и системными компартментами, предоставляя надёжную экспериментальную платформу для изучения транспорта печени, обмена веществ, иммунной сигнализации и размещения лекарственных средств в физиологических и патологических условиях. Модель также включает опциональное конечное отбор проб печененной артерии и воротной вены для прямого сравнения притока, оттока и лимфатического дренажа печени.

Рисунок 1. Схема мультиканюляционной модели для одновременного отбора образцов лимфатической и крови. Комплексная модель кануляции, иллюстрирующая одновременный отбор проб из сонной артерии, яремной вены, печеночной артерии, печеночного лимфатического протока и воротной вены. (A) Сонная артерия канюляется для периодического взятия пробы крови. (B) Наружная яремная вена канюляется для непрерывной инфузии физиологического раствора для поддержания гидратации и компенсации потери жидкости во время отбора проб. (C) Общая печёночная артерия, проходящая параллельно печеночному лимфатическому протоку, канюляется для смертельной пробы крови. (D) Печеночной лимфатический проток канюлируется для непрерывного сбора лимфовы. (E) Портальная вена осуществляется с помощью игловой проколы для смертельной пробы крови. Процедуры, показанные в пунктах (A), (B) и (D), проводятся перед концевым отбором проб, затем (C) отбором проб печёночной артерии, а затем (E) — портальной вены. Сокращения: EJV, наружная яремная вена; КА, сонная артерия; SVC, верхняя полая вена; IVC, нижняя полая вена; Ao, аорта; ХАР — обычная печёночная артерия; HL — печеночный лимфатический проток; ML, мезентериальный лимфатический проток; СМА — верхняя брыжейная артерия; ПВ, портальная вена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол

Все экспериментальные процедуры с участием животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Института фармацевтических наук Монаша (Ethics ID #46283) и проводились в строгом соответствии с руководящими принципами Австралийского и Новозеландского совета по уходу за животными в исследованиях и преподавании (ANZCCART) и Австралийским кодексом по уходу и использованию животных в научных целях (Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям, Австралия)¹⁵.

Животные модели: использовались самцы или самки альбиноса Rattus norvegicus или крысы Sprague–Dawley (SD) весом 250–350 г. Животных собирали у лицензированных поставщиков лабораторных животных (Monash Animal Research Platform) и содержали в индивидуально вентилируемых клетках при контролируемой температуре (22 ± 2 °C) и 12-часовом цикле свет-темнота, с свободным доступом к корму и воде до начала экспериментов. Животных акклиматизировали не менее одной недели перед операцией, чтобы минимизировать физиологические вариации, связанные со стрессом.

Описана модель каннулирования печеночных лимфатических протоков, сонной артерии и яремной вены, позволяющая одновременно брать образцы печеночных лимфических и системной крови. Опциональное конечное отбор проб печёночной артерии и воротной вены может проводиться под анестезией для сравнительного анализа печёночного и лимфатического оттока. Используемые реагенты и оборудование перечислены в таблице материалов.

1. Подготовка за день до операции

1. Постите крысу на ночь, если это необходимо для конкретного экспериментального протокола. Обеспечьте свободный доступ к воде в любое время.
2. Приготовьте стерильный физиологический раствор для внутривенной инфузии во время сбора лимфы. Определите необходимый объём на основе длительности сбора (обычно 3–5 часов) и рекомендуемой скорости инфузии 1,5–3,0 мл/ч для компенсации потери жидкости из-за лимфы и сбора крови, а также физиологических потерь, таких как выброс мочи.
3. Приготовьте три полиэтиленовые канюли для канюляции лимфатических протоков печени, сонной артерии и яремной вены следующим образом:
   1. Печеночной лимфатический проток
      1. Вырежьте канюлю наружного диаметра 0,8 мм (O.D.), внутреннего диаметра 0,5 мм (I.D.) до 30–35 см. Убедитесь, что длина позволяет собирать без натяжения.
      2. Скошено наконечник для установки под углом примерно 45° стерильным хирургическим лезвием для облегчения установки.
   2. Сонная артерия
      1. Вырежьте канюлю с 0,8 мм O.D., 0.5 мм I.D. до 20–30 см. Отметьте примерно 2–2,5 см от внутреннего конца, чтобы показать глубину вставки.
   3. Яремная вена
      1. Вырежьте канюлю с 0,8 мм, 0,5 мм I.D. или 0,96 мм, 0,58 мм I.D. до 50 см и более. Отметьте глубину вставки на 1–1,5 см от внутреннего конца. Убедитесь, что длина достигает инфузионного насоса без натяжения.
4. Приготовьте антикоагулянтный раствор, состоящий либо из 0,1% ЭДТА в стерильной воде, либо 20 МЕ/мл гепарина в стерильном физиологическом растворе.
5. Наполните шприц объёмом 1 мл раствором антикоагулянта и прикрепите иглу на 25 G к канюлям с 0,8 мм O.D. или иглу 23G к канюлям 0,96 мм.
6. Промывайте каждую канюлю примерно в три раза больше внутреннего объёма, чтобы не осталось пузырьков воздуха.
7. Держите канюли наполненными антикоагулянтом и забитыми иглой и шприцом на ночь. Предварительное замачивание антикоагулянтом минимизирует образование сгустков.
8. Подготовьте трубки для сбора крови и лимфы. Добавьте антикоагулянтный раствор для достижения конечной концентрации 1 мг/мл EDTA или 10 МЕ/мл гепарина после сбора образца.

2. Подготовка непосредственно перед операцией

1. Промывайте все канюли антикоагулянтом для подтверждения проездности. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков.
2. Индуцировать анестезию у крысы с 5% изофлурана в кислороде при 1 л/мин в индукционной камере.
3. Следите за дыханием и убедитесь, что частота замедлилась примерно до 1,5 вдоха в секунду (примерно 90 вдохов в минуту), что указывает на достаточную глубину анестезии.
   ВНИМАНИЕ: Изофлуран — это летучий анестетик, и его следует использовать в правильно вентилируемой анестезиологической системе или в вытяжной вытяжке для минимизации профессионального воздействия.
4. Переместить крысу на нагретую хирургическую площадку (37°C) и поддерживать анестезию с 1–3% изофлурана в кислороде, подаваемом со скоростью 0,4–0,6 л/ мин через носовой конус.
5. Подтвердите достаточную глубину анестезии по отсутствию рефлексов сжатия роговицы и пальцев ног. Поддерживайте анестезию на протяжении всей операции и сбора лимфы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывная анестезия необходима для предотвращения боли во время операции и предотвращения смещения канюли из-за движения.
6. Хирургические области бритья, включая правый брюшной квадрант (от середины до правого фланга, примерно на 2 см ниже грудной клетки) и правую или левую ключичную область.
7. Дезинфицируйте все хирургические участки с помощью 0,5% хлоргексидина, затем 70% этанола.

3. Канюляция сонной артерии

ПРИМЕЧАНИЕ: Канюляция сонной артерии может проводиться до или после канюляции яремной вены.

1. Сохраняйте то же положение спины и шейный разрез.
2. Поместите небольшую опору (например, шприц объемом 3 мл) под шею, чтобы поднять сонную артерию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необязательный.
3. Разделите мышцы шеи, чтобы открыть сонную артерию примерно в 1 см ниже поверхности кожи.
4. Изолируйте артерию с помощью изогнутых щипцов радужки. Определите и аккуратно отдельте соседний блуждающий нерв, чтобы предотвратить повреждение нерва.
5. Положите прямые щипцы Graefe под артерию, чтобы перекрыть кровоток, и наденьте под ним два шва 4-0 из шелка. Крепко завяжите проксимальный (черепный) шов.
6. Сделайте небольшой разрез на поверхности артерии.
7. Аккуратно поднимите лоскут сосуда кончиком щипцов, чтобы стабилизировать просвет сосуда для установки канюли.
8. Вставьте канюлю на заранее отмеченную глубину 2–2,5 см. Ожидайте лёгкий обратный поток; Если это избыточно, заново окклюзируйте и очистите перед началом.
   ВНИМАНИЕ: Сосудистая пункция и канюляция требуют острых инструментов и должны выполняться аккуратно, чтобы избежать случайных травм.
9. Подтвердите правильное расположение, аккуратно отведя небольшой объём крови и вводя антикоагулянтный раствор обратно в канюлю без ощущения сопротивления и подкожного отёка.
10. Закрепите канюлю швами и запечатайте внешний конец пробкой.
11. Процедуру можно ненадолго приостановить после кануляции сонной артерии с сохранением анестезии.
12. Закройте рану на шее стерильными швами. Обзор изоляции сонных артерий и успешной канюляции показан на рисунке 2.

Рисунок 2: Каннуляция сонной артерии. (A) Парные мышцы шеи, обрамляющие сонную артерию (оранжевые стрелки). Слюнная железа (синие стрелки) заправлена черепно. (B) Открытая сонная артерия находится примерно на 1 см ниже поверхности кожи. Слюнная железа (синие стрелки) заправлена черепно. (C) Хирургическая установка перед установкой канюля, показывающая перекрытие кровотока с помощью прямых щипцов Грефе и двух шелковых швов, изолирующих артерию, с перевязанным верхним концом. (D) Примерно 2 см канюли успешно вводятся в сонную артерию (жёлтые стрелки). Канюля сонной артерии отмечена зелёными стрелками. (E) Успешное канюляцию сонной артерии было подтверждено забором крови в канюлю. (F) Три шва (размер 4-0) связаны вокруг сонной артерии и канюли для закрепления (фиолетовые стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Канюляция яремной вены

1. Поставьте крысу в спинное положение, вытянув шею и слегка повернув голову влево.
2. Определите яремную вену над ключицей по её расположению и видимому кровотоку. Сделайте косой разрез диаметром 1–1,5 см от ключицы к трахее.
3. Грубо рассечьте подкожную ткань, чтобы обнажить вену.
4. Отдельте вену от окружающей соединительной ткани с помощью изогнутых щипцов радужки. Подтвердите изоляцию, проведя щипцы под вену.
5. Положите два шва 4-0 под вену на каждом конце открытого сегмента. Надёжно завяжите черепный (верхний) шов, чтобы перекрыть кровоток.
6. Чтобы предотвратить обратный поток крови, положите прямые щипцы Грефе под вену и опирайте ручки на шприц или опору.
7. Сделайте небольшой (~1 мм) разрез на верхней части вены, на треть вдоль изолированного сегмента, используя радужные ножницы.
8. Аккуратно поднимите лоскут сосуда кончиком щипцов, чтобы стабилизировать просвет сосуда для установки канюли.
9. Вставьте кончик канюли в разрез с помощью щипцов радужки и продвигайте его на заранее отмеченную глубину (1–1,5 см).
10. Освободите окклюзию после стабилизации канюли для обеспечения кровотока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте устойчивый захват, чтобы предотвратить венозный обратный поток. Если происходит кровотечение, немедленно повторно окклюзируйте и очищайте поле перед началом процедур.
11. Подтвердите правильное расположение, аккуратно отведя небольшой объём крови и вводя антикоагулянтный раствор обратно в канюлю без ощущения сопротивления и подкожного отёка.
12. Закрепите канюлю швами на проксимальном и дальнем концах.
13. Временно закройте внешнюю трубку, уберите шприц и запечатайте канюлю пробкой.
14. Накройте разрез марлей, увлажненной тёплым физиологическим раствором, пока каннуляция сонной артерии не завершится. На рисунке 3 показаны репрезентативные изображения изоляции и канюляции яремных вен.

Рисунок 3: Каннуляция яремной вены. (A) Яремная вена (чёрный точечный контур) расположена прямо под кожей над ключицей. Установленная канюля сонной артерии наблюдается непосредственно рядом с яремной веной (зелёные стрелки). (B) Яремная вена изолирована двумя шелковыми швами; верхний конец завязывается. (C) Примерно 1 см канюли успешно вводится в яремную вену (жёлтые стрелки). Канюля яремной вены обозначена синими стрелками; Канюля сонной артерии обозначена зелёными стрелками. (D) Три шва (размер 4-0) обвязываются вокруг яремной вены и канюли для закрепления (фиолетовые стрелы). Успешная канюляция яремной вены подтверждена гладким солевым раствором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

5. Канюляция печеночного лимфатического протока

1. Поместите крысу в спинное положение под хирургическим микроскопом.
2. Сделайте горизонтальный разрез кожи шириной 4–5 см от средней линии до правого фланга, примерно на 1,5–2 см ниже рёбер (рисунок 4A, B).
3. Оттяните кожу и сделайте соответствующие разрезы на наружных и внутренних косых мышцах.
4. Прижгите или перевязывайте любые крупные кровеносные сосуды, чтобы предотвратить избыточную потерю крови.
5. Аккуратно перемещайте органы ватными палочками, увлажнёнными физиологическим раствором: перемещайте печень к диафрагме, желудок — влево, тонкую кишку — вниз.
6. Держите органы втянутыми с помощью марли, пропитанной физиологическим раствором. Место разреза и расположение органов показаны на рисунке 4C.
7. Определите лимфатический проток печени (диаметр ~0,6 мм) с помощью установленных анатомических ориентиров. Проток проходит параллельно и слегка хвостово печеночной артерии, расположен медиально от правой почки и рядом с нижней полой веной.
8. Обратите внимание на внешний вид печеночного лимфатического протока. Обычно он кажется полупрозрачным и узким.
9. Различайте печеночной лимфатический проток от брыжейного лимфатического протока, который крупнее и обычно выглядит непрозрачным или белым из-за содержания хиломикрона. Таким образом, мезентериальный лимфатический проток может служить анатомическим ориентиром, помогающим в идентификации печеночного лимфатического протока, расположенного черепно.
10. Удалять соединительные ткани, лежащие над лимфатическим протоком и полой веной, с помощью прямых щипцев Грефе.
11. Создайте проход под полой веной, введя прямые щипцы Грефе через жировое слое под правой почкой. Продвигайтесь, пока кончики не появятся на противоположной стороне под полой веной, параллельно печеночному лимфатическому протоку.
12. Схватите внешний конец подготовленной канюли прямыми щипцами Грефе и протяните её через туннель, созданный под полой веной, пока кончик не появится с противоположной стороны.
13. Используя щипцы гемостата Halsted-Mosquito, согните кончик иглы объёмом 25G примерно под углом 90°. С помощью согнутой иглы проколите печеночный лимфатический проток справа (ближе всего к оператору).
    ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при обращении с острыми иглами во время прокола лимфатических протоков, чтобы избежать случайных травм.
14. Убедитесь, что канюля наполнена антикоагулянтным раствором без пузырьков воздуха. Вставьте скошенный конец примерно на 2 мм в воздуховод.
15. Наблюдайте за наружным концом канюли на наличие лимфатического потока (~ 100 мкл/ч). Если потока не наблюдается, отрегулируйте или вставьте канюлю обратно.
16. После подтверждения лимфопотока заблокируйте канюлю перед нанесением небольшой капли ветеринарного клея, чтобы закрепить место установки. После высыхания подтвердите лимфопоток через трубку.
17. Снимите марлю и верните органы на исходные места.
18. Разместите трубку с антикоагулянтом под выходом канюлы. Убедитесь, что лимфа поступает по капле в трубку.
19. Закройте брюшную стенку, последовательно накладывая внутренние косые, внешние косые и кожные слои. Идентификация и успешное каннулирование печеночного лимфатического протока показаны на рисунке 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После успешного канюляции лимфатических протоков печени процедуру можно ненадолго приостановить для поддержания анестезии и гидратации перед началом сбора лимфопровода.

Рисунок 4: Экспозиция лимфатических протоков печени. (A) Анатомический ориентир, указывающий на 1,5–2 см ниже правой грудной клетки для разреза. (B) Разрез кожи и мышц брюшной полости, обнажающий внутренние органы. (C) Органы переместились, чтобы открыть печёночный лимфатический проток. Печень сдвинута к диафрагме, желудок — слева от животного, а тонкий кишечник поджат снизу. Печеночный лимфатический проток расположен между печененной артерией (зелёная стрелка) и брыжейной артерией (синяя стрелка). L: печень; SI: тонкая кишка; IVC: нижняя полая вена; РК: правая почка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Идентификация и кануляция печеночных лимфатических протоков. (A) Лимфатические и артериальные структуры можно наблюдать после перестановки органов и до удаления окружающей соединительной ткани. Печёночная артерия (зелёные стрелки) расположена черепно относительно соседнего печеночного лимфатического протока (жёлтые стрелки). Мезентериальный лимфатический проток (фиолетовые стрелки) расположен над брыжейной артерией (черный пунктирный контур). Эти структуры расположены перпендикулярно нижней полой вены. IVC: нижняя полая вена; РК: правая почка. (B) Печеночный лимфатический проток (жёлтые стрелки) можно чётко визуализировать после удаления окружающей соединительной ткани. Печеночный лимфатический проток проходит параллельно печеночной артерии (зелёный пунктирный контур) и краниально относительно брыжейкового лимфатического протока (фиолетовые стрелки) и брыжейной артерии (черный пунктирный контур). (C) Канюля (белые стрелки) вводится в печеночный лимфатический проток (жёлтые стрелки) через небольшой пробок, сделанный в лимфатическом протоке (оранжевые стрелки). Можно визуализировать мезентериальный лимфатический проток (синие стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Послеоперационный период

1. Сразу после успешной каннуляции печеночной лимфы начинайте регидратацию, вводя стерильный физиологический раствор со скоростью 1,0–2,0 мл/ч через яремную вену.
2. Поддерживайте инфузию во время сбора лимфы. В качестве альтернативы регидратация может проводиться через желудочную или двенадцатиперстную канюлю, что позволяет зарезервировать яремную вену для взятия венозной крови при необходимости.
3. Держите животное под наркозом на подогретой хирургической подложке (37°C) на протяжении всего периода сбора.
4. Отслеживайте частоту дыхания и глубину анестезии на протяжении всего эксперимента, наблюдая дыхательные паттерны и рефлекторные реакции при сохранении анестезии изофлурана через носовой конус.
5. Гидратация поддерживалась непрерывной инфузией физиологического раствора (1,0–2,0 мл/ч ) через яремную вену.
6. Для минимизации физиологических нарушений общий объём собранной крови перед терминальной пробой был ограничен <10% от предполагаемого объёма циркулирующей крови в соответствии с этическими рекомендациями учреждения по животным.
7. Непрерывно собирайте лимфу печени в трубки, содержащие антикоагулянты. Меняйте трубки для сбора раз в час или по необходимости.
8. Собирайте образцы артериальной крови в определённые моменты времени:
   1. Временно закройте внешнюю трубку и прикрепите пустой шприц.
   2. Забирайте кровь до заполнения трубки.
   3. Замените шприц на новый для взятия образцов и забирайте примерно 100–200 мкл артериальной крови в каждом назначенном времени отбора.
   4. После каждого сбора промывайте канюлю антикоагулянтным раствором.
   5. Запечатайте канюлю пробкой.
9. После завершения сбора образца либо проводите конечный отбор проб печененной артерии и воротной вены, либо гуманным образом убивайте крысу пентобарбитоном натрия (>100 мг/кг ) через сонную или яремную канюлю.

7. Конечный отбор проб печёночной артерии и воротной вены

1. После завершения сбора лимфо- и крови поддерживайте глубокую анестезию и обеспечивайте стабильное дыхание перед проведением терминального сосудистого отбора.
2. Аккуратно откройте разрез брюшной полости, чтобы открыть верхнюю брюшную полость.
3. Аккуратно отведите печень к диафрагме, желудок — влево и тонкую кишку вниз, используя марлю, увлажнённую физиологическим раствором, чтобы показать канюлированный печеночной лимфатический проток.
4. Определите печёночную артерию, которая идёт параллельно и хвостово печеночному лимфатическому протоку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Артерия кажется меньше и светлее портальной вены, и демонстрирует более пульсирующее течение.
5. Приготовьте поливиниловую канюлю 0,61 мм O.D., 0.28 мм I.D., предварительно заполненную раствором антикоагулянта и без воздушных пузырьков.
6. Используя изогнутые щипцы радужки, изолируйте короткий сегмент печеночной артерии и наместите под него шелковый шов размером 4-0.
7. Аккуратно поднимите артерию и наложите второй шов дистально от первого. Завязывайте дистальный шов для контроля обратного потока, оставляя проксимальный шов развязанным для последующего закрытия.
8. С помощью микроножниц с мелкой точкой сделайте небольшой поперечный разрез (примерно 0,5 мм) в стенке артерии между швами.
9. Аккуратно поднимите клапан сосуда кончиком щипцов Дюмона, чтобы стабилизировать просвет сосуда для установки канюлы.
10. Вставьте скошенный конец поливиниловой канюли в отверстие и продвигайте примерно на 2–3 мм.
11. Закрепите канюлю, завязывая проксимальный шов вокруг сосуды и канюлы.
12. Проверьте правильное расположение, наблюдая пульсирующее кровообращение в канюлю или аккуратно вдыхая небольшое количество ярко-красной артериальной крови.
13. Соберите 0,5–1 мл крови в заранее маркированную трубку с антикоагулянтом.
14. После сбора снимите канюлю и достичьте гемостаза, затянув оба шва. Экспозиция печеночных артерий и процедура канюляции показаны на рисунке 6.
15. Определите портальную вену, которая проходит медиально и перпендикулярно печеночной артерии. Портальная вена имеет больший диаметр и более тёмную окраску по сравнению с печеночной артерией.
16. Поместите иглу на 23G или 25G на шприц объёмом 1 мл, предварительно промытый антикоагулянтом.
17. Вводите конез иглы в портальную вену под малым углом (примерно 20°–30°), чтобы избежать коллапса или разрыва сосуда.
18. Аккуратно вдыхайте необходимый объём крови.
19. Поскольку прокол портальной вены является терминальным способом, гуманно убивайте животное сразу после взятия образца, введя >100 мг/кг пентобарбитона натрия через сонную или яремную канюлю, пока животное находится под глубокой анестезией. Расположение портальной вены и метод конечной пробы показаны на рисунке 7.
    ВНИМАНИЕ: Пентобарбитон натрия — это контролируемое вещество, и с ним следует обращаться и применяться в соответствии с институциональными нормами и соответствующими мерами безопасности.
20. Подтвердить смерть путём прекращения дыхания и сердечной активности до утилизации туши в соответствии с Австралийским кодексом по уходу и использованию животных в научных целях (NHMRC)¹⁵ и руководящими принципами ANZCCART.

Рисунок 6: Идентификация и кануляция печеночных артерий. (A) Обнажение печёночной артерии (зелёные стрелки). Печёночная артерия расположена рядом с брыжейной лимфатической протоком (с черным пунктирным контуром) и перпендикулярна нижней полой вены. IVC: нижняя полая вена; L: печень. (B) Изоляция печеночной артерии с помощью изогнутых щипцов. (C) Успешное введение (фиолетовыми стрелками) 0,61 мм × 0,28 мм поливиниловой канюли (оранжевые стрелки) в печеночную артерию (зелёные стрелки), закрепленное 4-0 шелковыми швами для отбора конечной артериальной анализа. Можно визуализировать мезентериальный лимфатический проток (черный пунктирный контур). PV: портальная вена. (D) После закрепления канюли её протягивание подтверждается путем закачивания крови в канюлю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Идентификация портальных вен и конечный отбор проб .(A) Портальная вена (обозначена иглей 25G) находится между печененной артерией (белый точечный контур) и желчным протоком (чёрный пунктирный контур). Портальная вена кажется больше и темнее, чем печёночная артерия, и получается под глубокой анестезией для терминального сбора крови. PV: портальная вена; IVC: нижняя полая вена; L: печень; SI: тонкая кишка; РК: правая почка. (B) Успешное введение иглы 25G в портальную вену (чёрный пунктирный контур) для сбора терминальной венозной крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Хирургический подход, описанный в разделе «Протокол», позволяет чётко определить печёночный лимфатический проток, расположенный медиально от правой почки и идущий параллельно целиакияльной и печеночной артериям, как ранее^{сообщалось 4}. Репрезентативная анатомия и каннуляция показаны на рисунке 5. Успешная канюляция подтверждается немедленным появлением прозрачной или слегка мутной лимфатической жидкости, свободной от молочного загрязнения хиломикроном, что указывает на минимальное смешение с брыжейной лимфой. Это наблюдение соответствует описанным характеристикам лимфы^{печени 3}. Идентификация печеночной лимфы основывалась на её анатомическом положении относительно печененной артерии и нижней полой вены, а также на её характерном чётком виду, в отличие от типично непрозрачного или молочного облика брыжейной лимфы.

Поток лимфы в печени должен оставаться стабильным на протяжении всего периода сбора, со средней скоростью примерно 0,1 мл/^{ч 3,4,11}. Поток лимфы в печени обычно остаётся наиболее стабильным примерно 2–3 часа после канюляции в условиях анестезии, хотя при оптимальных экспериментальных условиях возможны более длительные периоды сбора (до ~6–8 ч). Репрезентативные значения лимфатического потока, описанные в предыдущих^{исследованиях 4}, обобщены в Таблице 1. Поток в печеночной лимфе, как правило, ниже, чем при показателях потока в шмезентериальных и грудных лимфатических протоках у анестезированных крыс.

Лимфатические участки (сознательное состояние)	Средний лимфатический поток (мл/ч)
Грудная лимфа (сознательная)	1,74 ± 0,33
Грудная лимфа (анестезированная)	0,65 ± 0,10
Мезентериальная лимфа (анестезированная)	0,45 ± 0,11
Печеночная лимфа (анестезирована)	0,12 ± 0,02

Таблица 1: Средние темпы потока лимфаты (мл/ч) через каннуляции грудного, брыжного и печеночного лимфатических протоков у сознательных и анестезированных крыс .Данные представлены как среднее ± SEM для n = 3–5 крыс. Адаптировано из таблицы 3 в Yadav и др. (2018)⁴.

Репрезентативные результаты, иллюстрирующие лимфатический транспорт макромолекул, показаны на рисунке 8. Эти примеры демонстрируют, как модель может быть использована для оценки восстановления лимфы после внутривенного введения терапевтических макромолекул, включая примерно 60 кДа пегилированного интерферона α2a (IFN-PEG40), примерно 31 кДа пегилированного интерферона α2b (IFN-PEG12) и моноклональное антитело трастузумаб, что указывает на то, что печень является основным центром экстравазации и лимфатического доступа для макромолекулярных^{терапевтических средств 4}.

Рисунок 8: Лимфатическое восстановление внутривенно введённых макромолекулярных препаратов в грудной, брыжейной и печеночной лимфе .Общий процент дозы, восстановленной в грудной, брыжейной и печеночной лимфе после внутривенного введения ПЭГилированных интерферонов различных молекулярных размеров (IFN-PEG12 и IFN-PEG40) и моноклонального антитела (трастузумаб). Данные представляют средний ± SEM восстановления дозы за 8 часов. Адаптировано из Yadav и др. (2018)⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Модель также позволяет подробно профилировать липопротеины^{лимфы печени 3}. Репрезентативные анализы состава лимфолипидов показаны на рисунке 9. По сравнению с грудной и брыжейной лимфой, печёночная лимфа демонстрирует заметно низкое общее содержание липид, но концентрацию белка, сопоставимую с концентрацией других лимфических источников. Анализ липопротеинов печёночной лимфы подчеркивает уникальную роль печени в транспортировке липидов и обратном транспорте холестерина. Данные о репрезентативном составе липидов приведены в таблице 2. ЛПВП в печени обогащается холестериловыми эфирами, ЛПВП в мезентериальной лимфе преимущественно богата триглицеридами, а грудная лимфа ЛПВП содержит относительно более высокое содержание фосфолипидов. Эти различия в составе указывают на разные роли каждого лимфатического источника в метаболизме и транспорте липид.

	%wt/wt
Дроби	Фосфолипид	Свободный холестерин	Холестерилэфир	Триглицерид
Мезентериальная лимфа
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
Печеночная лимфа
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
Грудная лимфа
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
Плазма
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

Таблица 2: Липидный состав плотности (D-HDL) и легких (L-HDL) фракций липопротеинов высокой плотности, выделенных из брыжей, печени и грудной лимфы и плазмы. Значения представляют процент по массе (% массы/массы) фосфолипида, свободного холестерина, холестерилэфира и триглицеридов относительно общей липидной доли. Данные представлены как среднее ± SEM. Адаптировано из таблицы 1 в Gracia et al. (2020)³.

Рисунок 9: Состав белков и липидов брыжейки, печени и грудной лимфы. Пропорциональное содержание белка и общего количества липидов в брыжей, печеночной и грудной лимфе. Содержание липидов включает фосфолипиды (PL), триглицериды (TG), холестериловые эфиры (CE) и свободный холестерин (FC), выражаемые в проценте массы липидов относительно общего веса белка и липидов. Данные представлены как среднее ± SEM. Адаптировано из Gracia и др. (2020)³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Каннулирование лимфатических протоков печени — технически сложная процедура, даже для опытных микрохирургов. Несколько критически важных шагов могут повысить вероятность сохранения целостности лимфатических протоков и обеспечения стабильного лимфатического потока. При идентификации и изоляции печеночного лимфатического протока (шаги протокола 5.7-5.10) первым шагом является удаление соединительной ткани и жира, лежащих над мезентериальным лимфатическим протоком и полой веной рядом с печеночным лимфатическим протоком. Печеночный лимфатический проток полупрозрачный и хрупкий по сравнению с более толстым и непрозрачным брыжейным лимфатическим протоком и может легко разрываться при прямом обращении. Мезентериальный лимфатический проток служит полезным анатомическим ориентиром, поскольку очищение его наложенной ткани обнажает печеночный лимфатический проток, расположенный сверху. Поскольку печеночный лимфатический проток часто проявляет изгибы или кривизну, оператор должен выбрать точку канюляции вдоль прямого сегмента и ориентировать канюлю параллельно естественному ходу протока, чтобы минимизировать риск окклюзии или разрыва (шаги 5.11-5.14).

Сама каннуляция — самый важный фактор успеха. После прокола воздуховода (шаг 5.13) внутренний доступ можно визуально подтвердить, вставив кончик щипца в отверстие и убедившись, что над прибором находится только одна стенка сосуда. Появление двух противоположных стен указывает на насквозную прокол. После подтверждения внутрилюминального доступа канюлю можно плавно продвигать вдоль протока под тем же углом. Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить соседние сосуды, так как кровотечение в поле может привести к попаданию крови в канюлю лимфосбора, загрязняя образец и значительно увеличивая риск образования тромба. После установления лимфопотока (шаг 5.15) конец для сбора канюли следует закрыть крышкой и аккуратно нанести ветеринарный клей, чтобы предотвратить его попадание в просвет. Канюлю также необходимо проверить на наличие воздушных пузырьков, так как захваченный воздух увеличивает обратное давление и может затруднять поток лимфы. Поскольку печёночная лимфа образуется при низком движущем давлении, сборная часть канюли всегда должна находиться ниже уровня хирургического места для облегчения дренажа под действием гравитации.

Успешная кануляция печеночных лимфатических протоков обозначается немедленным началом лимфатического потока. После установления печёночная лимфа обычно циркулирует примерно со скоростью 0,1 мл/ч, с устойчивым выходом в течение нескольких часов. Скорость потока может варьироваться в зависимости от анатомии, физиологии и экспериментальных условий животного. Например, лимфа была собрана под анестезией изофлурана в этом протоколе. Анестезия изофлурана может влиять на физиологические параметры, соответствующие функции лимфаты, поэтому при интерпретации скоростей формирования лимфы следует учитывать экспериментальные условия с анестезией¹⁶. Кануляция лимфатических протоков печени требует лапаротомии и деликатной микрохирургической манипуляции лимфатических сосудов брюшной полотной, поэтому сбор лимфы у сознательных крыс в этой модели невозможен. Предыдущие исследования, сравнивающие транспорт лимфы при наркозируемых и сознательных условиях или при использовании различных режимов анестезии, показали, что анестезия может умеренно влиять на абсолютные скорости лимфатического потока, но существенно не изменяет общие паттерны лимфатического^{транспорта 4}. Поэтому значения лимфатического потока, полученные в этой модели, следует интерпретировать в контексте анестезируемых экспериментальных условий.

Постепенное уменьшение или прекращение потока во время сбора чаще всего вызвано образованием тромба внутри канюли, вызванным загрязнением крови или отложением фибрина. Поток иногда можно восстановить, локализируя и аккуратно сжимая канюлю тонким щипцом для механического фрагментирования сгустка, либо аккуратно вдыхая через конец сбора канюли для удаления препятствия. Если закупорка ограничена внешней частью, канюлю можно разрезать непосредственно к сгустку и подключить к свежей трубке с помощью стерильного силиконового соединителя. Если тромб образуется в месте каннуляции, обычно требуется повторная канюляция. В таких случаях удаление клея можно сделать с большой осторожностью, чтобы избежать разрыва протока или прилегающих кровеносных сосудов. Гемостаз должен быть достигнут до повторной попытки канюляции, так как даже незначительная утечка крови в канюлю значительно способствует свертыванию в лимфатической системе низкого давления печени.

Физиологические факторы также влияют на лимфический поток и проездность. Поток в печеночной лимфе у крыс по своей природе медленнее, чем поток в брыжейке или грудных протоках, даже при базальных^{условиях 17,18}. Кроме того, общая анестезия может снижать лимфатический поток в других лимфатических цепях по сравнению с осознанными, свободно движущимися^{крысами 19}. Поскольку канюляция печеночных лимфических заболеваний требует анестезии и лапаротомии, эти факторы, вероятно, способствуют относительно низким расходам и увеличению склонности к тромбированию, наблюдаемым при длительном сображении. Поддержание гидратации через яремную вену или желудочно-кишечную канюлю во время сбора помогает стабилизировать лимфатический поток и уменьшить образование тромбов. В этой модели стабильный поток печеночных лимфов обычно возможен в течение 2–3 часов, после чего поток может ухудшаться, и свертывания свертывания повышаются. Однако при оптимальных экспериментальных условиях сбор лимфы может сохраняться дольше, максимальная продолжительность — до ~8 часов,^{сообщается 4}.

Включение выборки печеночных артерий и воротных вен (рисунок 6 и рисунок 7) расширяет применимость модели, позволяя напрямую сравнивать приток печени, лимфатический выброс и системный кровообращение. Этот терминальный этап отбора проб позволяет одновременно оценивать транспортный микрососудистый процесс печени и межсосудистый клиренс у одного животного. Такие сравнения дают ценные данные о распределении растворённых веществ между сосудистыми и лимфатическими компартментами печени, особенно для крупных макромолекул или липофильных соединений, зависящих от интерстициальной диффузии.

Несмотря на эти трудности, модель каннулирования печеночной лимфы остаётся ценным и информативным методом. Печень вносит значительную долю общего лимфопотока в организме, а печеночная лимфа содержит белки и другие компоненты, происходящие из межпеченочной жидкости. Отбирая образцы лимфы, дренирующейся непосредственно из печени, эта модель позволяет анализировать молекулы и клетки, выходящие из печени до того, как они будут разбавлены брыжейной и системной лимфой в грудном протоке. Биохимический анализ печеночной лимфы даёт представление о гепатиальном интерстициальном метаболизме и процессах транспорта^{липидов 12,20}. Это дополняет информацию, полученную из портальной или системной крови, которая интегрирует эффекты печёночного метаболизма и внепеченочного обмена. Важно, что такая конфигурация, сочетающая каннуляции печеночных лимф, сонных артерий и яремных вен, позволяет динамично оценивать градиенты растворённых веществ между выбросом печени и сосудистым притоком, предоставляя более полное представление о транспорте и клиренсе печени.

Предыдущие исследования с этой моделью показывают, что отбор проб печеночной лимфы позволяет оценить лимфатическое восстановление макромолекулярных терапевтических средств и сравнивать транспорт растворённых веществ между печеночной лимфой и системным кровообращением. Вместе каннулирование печеночных лимф, сопутствующий отбор сосудистых образцов и биохимическое профилирование обеспечивают надёжную экспериментальную платформу для изучения динамики печёночной микрососудистой и интерстициальной динамики. Модель позволяет одновременно оценивать перенос печени, обмен веществ, обработку липидов и иммунную сигнализацию, а также может быть адаптирована для изучения изменений при патофизиологических состояниях, таких как MASLD или воспаление печени.

В заключение, эта усовершенствованная хирургическая модель, интегрирующая доступ к печеночно-лимфатическим, печёночно-артериальному и портальному венозному доступу, предлагает комплексный и воспроизводимый подход к изучению транспортных путей печени. Она позволяет напрямую сравнивать сосудистый приток, интерстициальный выброс и лимфатический дренаж, что поддерживает исследования, предоставляющие механистическое понимание специфического для печени транспорта, метаболизма и фармакокинетических процессов. Кроме того, возможность брать образцы печеночной лимфы предоставляет уникальную возможность изучать трафик иммунных клеток и антигенов из печени, предоставляя ценные сведения о гепатичном иммунном надзоре, воспалении и механизмах толерантности.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антикоагулянтный раствор (ЭДТА 0,1%)	Invitrogen	AM9261	Предотвращает образование сгустков в канюлях и собранных образцах
Антикоагулянтный раствор (Гепарин 20 МЕ/мл)	Pfizer	00409-2723-01	Предотвращает образование сгустков в канюлях и собранных образцах
Хлоргексидin (0,5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Используется для дезинфекции хирургического участка
Коллекционные пробирки (микроцентрифуги)	Greiner Bio-One	616201	Используются для сбора лимфы и крови
Ватные бинты	Winc Australia	18874125	Используются для манипуляций с органами и поддержания влажности
Ватные тампаны	Pacific Laboratory	1005199	Используются для перемещения органов во время операции
Изгибающиеся щипцы для радужной оболочки	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Используются для изоляции сосудов и манипуляций с тканями
Щипцы Dumont	Fine Science Tools	11251-35	Используются для открытия и стабилизации просвета сосудов печеночной артерии для введения канюли
Этанол (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Используется для дезинфекции хирургического участка
Гемостатическая пинцетная клеща Halsted-Mosquito	Fine Science Tools	13009-12	Используется для изгиба иглы 25G для пункции печеночного лимфатического протока
Нагреваемый хирургический валик (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Поддерживает температуру тела во время операции
Индукционная камера	Darvall	1859	Используется для первоначального введения анестезии
Инфузионный насос	Adelab Scientific	NE-300	Обеспечивает контролируемую инфузию физиологического раствора через канюлю
Ножницы для радужной оболочки	Stark Medical	E-AC985-11	Используются для кожных и мышечных разрезов
Изофлуран	Provet Pty Ltd	ISOF07	Ингаляционный анестетик, используемый для введения и поддержания анестезии
Пинцет-клещи Kelman-McPherson	ProSciTech	TY-1301	Используются для открытия и стабилизации просвета сосудов яремной вены и сонной артерии для введения канюли
Игла (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Используется для пункции портальной вены и забора крови
Игла (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Используется для промывания канюли и пункции печеночного лимфатического протока
Насадка для носа системы наркоза	Darvall	7885	Поддерживает наркоз во время операции
Поставка кислорода с флюсметром	BOC	400NE	Носительный газ для анестезии изофлураном
Полиэтиленовая канюля (0,8 мм наружный диаметр, 0,5 мм внутренний диаметр)	Microtube Extrusions	PE8050	Используется для кануляции сонной артерии, яремной вены и печеночного лимфатического протока
Поливинилкануля (0,61 мм наружный диаметр, 0,28 мм внутренний диаметр)	Microtube Extrusions	PIV6128	Используется для кануляции печеночной артерии
Шелковые шовные материалы (4-0)	SMI AG	SM8015	Используются для закрепления сосудов и канюль
Натрий пентобарбитон	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Используется для эвтаназии (>100 мг/кг)
Стерильный физиологический раствор (0,9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Используется для регидратационной терапии и промывания
Прямые щипцы Graefe	Fine Science Tools	11150-10	Используются для изоляции тонких сосудов
Хирургические стерильные лезвия (для скальпеля)	Livingstone	SBLDCL15	Используются для заточки наконечников канюль во время подготовки
Шприц (1 мл)	Terumo	19032-TE	Используется для промывания канюль
Шприц (3 мл)	Terumo	19048-TE	Используется для забора крови
Шприц (30 мл)	Terumo	19034-TE	Используется для инфузии физиологического раствора
Ножницы Vannas	Fine Science Tools	91500-09	Используются для сосудистых разрезов
Ветеринарный тканевый клей	3M	1469SB	Используется для закрепления канюли печеночного лимфатического протока