Механизмы отвара Шэнсянь Цюй при сердечной недостаточности с использованием нецеленаправленного подхода к метаболомике и сетевой фармакологии у крыс

Краткое содержание

Это исследование подтвердило терапевтический эффект отвара Шэнсянь Цюй на сердечную недостаточность с помощью экспериментов на животных. Анализ сверхэффективной жидкостной хроматографии–масс-спектрометрии и сетевой фармакологии выявил потенциальные терапевтические цели и механизмы.

Аннотация

Отвар Shengxian Quyu (SXQY) был предложен как потенциальная терапевтическая стратегия при сердечной недостаточности (HF), однако его терапевтические механизмы остаются неясными. В данном исследовании изучались терапевтические эффекты и лежащие в основе механизмы SXQY при HF. Модель HF у крыс была индуцирована поперечным сужением аорты (TAC) и обработана SXQY. Функция сердца оценивалась с помощью трансторакальной эхокардиографии, а структура миокарда и фиброз — с использованием гематоксилина, эозина и трихромного окрашивания Массона. Образцы сыворотки анализировались с помощью нецелевых метаболомики с использованием сверхэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Компоненты, входящие в кровь, были сопоставлены с мишенями, а пересекающиеся связанные с HF мишени анализировались с помощью анализа сетей взаимодействия белков и белков (PPI), после чего были проведены анализы по онтологии генов и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). SXQY значительно улучшил функцию сердца у крыс с TAC, что подтверждается уменьшением внутреннего диаметра левого желудочка в диастоле и толщины задней стенки левого желудочка у диастолы, увеличением фракции выброса левого желудочка, а также облегчением гипертрофии, воспаления и фиброза миокарда. Всего было выявлено 563 соединения для попадания крови (367 прототипов и 196 метаболитов), при этом в базе данных фармакологии традиционных китайских медицинских систем выявлено 5 ключевых активных соединений, соответствующих 63 целям. Анализ сети выявил 44 перекрывающихся гена, при этом Formononetin, Timosaponin BII и Sinensetin являются основными компонентами, а PTGS2, PPARG и HSP90AA1 — в качестве центральных мишеней. Анализ PPI также выявил ключевые гены, включая ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN и ещё 15 генов. Анализ KEGG показал, что SXQY действует преимущественно через^Ca2+, фосфатидилинозитол-3-киназу-протеинкиназу B, циклический аденозинмонофосфат, а также пути, связанные с воспалениями и гормонами. В заключение, SXQY оказывает защитное действие против HF, улучшая функцию сердца и ослабляя ремоделирование миокарда с помощью многокомпонентных, многоцелевых и многопутных механизмов.

Введение

Сердечная недостаточность (СН) — это клинический синдром, характеризующийся снижением полнения желудочков и способности к выбросу из-за структурных или функциональных нарушений сердца, что приводит к формированию множества клинических признаков^{и симптомов. 1}. Будучи терминальной стадией различных сердечных заболеваний, HF значительно снижает качество жизни пациентов и приводит к высокой смертности и частым повторным госпитализациям, тем самым возлагая значительную нагрузку болезней как на семьи, так и на общество ^2,3. В клиническом лечении фармакотерапия HF является основой и краеугольным камнем лечения, в основном включающей ключевые классы лекарств, такие как диуретики, ингибиторы системы ренин–ангиотензин, бета-блокаторы, антагонисты минералокортикоидных рецепторов и ингибиторы натрий–глюкозы котранспортера² 3,4,5,6 . Хотя эти препараты частично улучшили прогноз у пациентов с HF, каждый из них имеет определённые ограничения и побочные эффекты, такие как нарушения электролитов, брадикардия и инфекции мочевыводящих^{путей 7}. Поэтому фармакологические методы лечения HF всё ещё требуют дальнейших исследований.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) накопила обширный клинический опыт в долгосрочном лечении СН. Делая акцент на целостной регуляции и многоцелевом вмешательстве, она предлагает уникальный подход к^{лечению 8}. В последние годы ряд рандомизированных контролируемых исследований (РКИ) продемонстрировали терапевтическую эффективность китайских травяных формул для^HF 9,10,11,12,13,14,15. Отвар Шэнсянь Цюйю (SXQY) уже начал проходить строгие РКИ для подтверждения своей терапевтической эффективности, но его специфические терапевтические механизмы всё ещё требуют дальнейших и более комплексных^{исследований 16}. Сетевая фармакология, как новая дисциплина, объединяющая системную биологию, полифармакологию и вычислительный анализ, представляет собой мощный инструмент для разъяснения целостных механизмов действия китайских травяных формул 17,18,19. Поэтому в данном исследовании применяется интегрированная стратегия, объединяющая нецелевую метаболомику и сетевую фармакологию, для выявления поглощённых крови компонентов SXQY и разъяснения его потенциальных терапевтических механизмов. Эта работа направлена на создание основы для дальнейшего клинического применения SXQY.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике и благополучию животных Китайско-японской больницы дружбы (одобрение No zryhyy21-23-01-09) и проводились в соответствии с принципами замены, сокращения и совершенствования с целью минимизации использования и страданий животных. Исследователи, выполнявшие сбор и анализ данных (включая эхокардиографические измерения и гистологическую оценку), были ослеплены к распределению групп.

Подготовка образца SXQY

SXQY состоит из следующих растительных компонентов: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 г), Codonopsis pilosula (Dangshen; 20 г), Cornus officinalis (Shanyurou; 15 г), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12 г), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15 г), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10 г), Bupleurum chinense (Chaihu; 10 г), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10 г), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu; 15 г), и Leonurus japonicus (Yimu; 15 г), с общей массой сырой травы 152 г на рецепт. Все травяные материалы были закуплены в Департаменте фармации Китайско-японской больницы дружбы и подтверждены главным фармацевтом по стандартным фармакогностическим методам идентификации. Клинически SXQY вводится по дозе одного рецепта (152 г) в день. При среднем весе взрослого тела 70 кг, соответствующая человеческая доза составляет 2,17 г (сырая трава)/кг. На основе нормализации площади поверхности тела между человеком и крысами, аналогичная доза крыс составляла 13,67 г (сырая трава)/кг. Для приготовления навара один рецепт SXQY замачивался в дистиллированной воде с соотношением 10 мл на грамм сырых трав (с в/в, исходя из начального объёма растворителя без корректировки после замачивания) в течение 1 часа, затем варили с помощью электрической нагревательной мантии и поддерживали при 100°C при непрерывном кипячении в течение 1 часа. Затем экстракт фильтровали через марлю (поры размером 200–300 мкм). Остаток затем извлекали ещё дважды при одинаковых условиях. Объединённые фильтраты концентрировались под пониженным давлением с помощью ротационного испарителя при 60°C до конечного объёма 111 мл, что дало концентрацию 1,37 г (сырой препарат)/мл. Концентрированный напой снова фильтровали через марлю (поровый размер 200–300 мкм) и хранили при 4°C, используя в течение 24–48 часов. Для введения раствор использовался напрямую, а объём гавирования рассчитывался на основе концентрации 1,37 г/мл, что приводило к объему примерно 10 мл/кг для достижения целевой дозы 13,67 г/кг.

Animal Model

Восемнадцать 8-недельных самцов крыс Sprague–Dawley (SD) содержались в стандартной кондиционированной среде (23°C ± 2°C, относительная влажность 50 ± 5% и 12-часовой цикл света и темноты) с свободным доступом к корму и воде. Животных случайным образом распределяли на три группы (n = 6 на группу) с использованием таблицы случайных чисел: группа, управляемая с фиктивной схемой (Sham), поперечная группа сужения аорты (TAC) и группа, обработанная SXQY (SXQY). Крысы из групп, обработанных TAC и SXQY, были анестезиированы вдыханием изофлурана (индукция 4%, поддержание 2%) и помещались в положение лежа на термостатически контролируемой грелке с поддержанием температуры 37°C. Адекватная анестезия подтверждалась отсутствием рефлекторных реакций на щипание лапы, стабильным дыханием и отсутствием спонтанных движений. На оба глаза была нанесена офтальмологическая мазь для предотвращения пересыхания роговицы. После эндотрахеальной интубации животных подключали к аппарату искусственной вентиляции легких животных с приливным объёмом 4–6 мл на 200 г массы тела, частотой дыхания 70 вдохов в минуту и соотношением дыхательных к выдоховым состояниям 1:1.

Все хирургические процедуры проводились в асептичных условиях. Хирургические инструменты стерилизовались автоклавированием, а операционная зона подготовлена путём бритья и дезинфекции повидоном-йодом, а затем 70% этанола. После подготовки места операции был сделан разрез кожи в левом отделе грудной клетки, а большая и малые мышцы грудной мышц были тупо рассечени, чтобы обнажить рёбра. Горизонтальный разрез примерно 1,0 см был создан во втором и третьем межреберном пространстве, прилегающем к левому борту грудины. Кровеносные сосуды и фасции были резко разделены, а тимус аккуратно убрался, полностью обнажая дугу аорты.

Аортальная дуга была аккуратно поднята между правой неноминационной артерией и левой общей сонной артерией с помощью стерильных изогнутых щипцов, а под ней провёл шелковый шов размером 2-0. Игла с тупым наконечником с изогнутой игной толщиной 16 калибра (внешний диаметр 1,6 мм) была вручную модифицирована путём затупления кончика и согнания до соответствующей кривизны перед использованием, после чего следовала стерилизация с помощью автоклава. Подготовленная изогнутая игла с тупым кончиком затем располагалась параллельно дуге аорты, после чего шов плотно завязывался вокруг аорты и иглы. Игла была немедленно удалена для создания стандартизированного сужения, а тимус был перестановлен. После подтверждения отсутствия активного кровотечения грудная клетка и кожа были закрыты слоями. После операции искусственная вентиляция продолжалась примерно в течение 10 минут, пока не восстановилось спонтанное дыхание, что подтверждалось стабильной и регулярной частотой дыхания, а также способностью поддерживать спонтанное дыхание без поддержки вентиляции. В этот момент эндотрахеальная трубка была удалена. Животные, оперируемые имитацией, подвергались тем же хирургическим вмешательствам, за исключением того, что дуга аорты не была перевязана.

После операции место разреза дезинфицировали, а животных помещали в чистые клетки для восстановления для снижения риска инфекции. Крыс затем возвращали в приют для животных для восстановления и регулярного содержания. Анальгезия применялась с помощью бупренорфина (0,05 мг/кг, подкожно). Крысы наблюдались каждые 12 часов в течение первых 72 часов по признакам боли, страдания или хирургических осложнений, включая снижение подвижности, пилоэрекцию, аномальную осанку, затруднённое дыхание или расслабление раны.

Через три дня после операции крысам из группы, обработанной SXQY, перорально обрабатывали 1 мл/100 г массы тела отвара SXQY в течение 9 недель. Тем временем крысы из групп с поддельным управлением и TAC получали равный объём (1 мл/100 г массы тела) дистиллированной воды по методу гавери.

Трансторакальная эхокардиография

В конце периода лечения во всех группах проводилась трансторакальная эхокардиография. Крыс анестезировали с помощью вдыхания изофлурана и помещали в лежащее положение на специальной платформе для визуализации. Передняя часть груди была аккуратно выбрита и покрыта щедрым слоем геля для ультразвука. Ультразвуковая визуализация проводилась с использованием высокоразрешающей ультразвуковой системы мелких животных, оснащённой высокочастотным преобразователем (18–40 МГц) в режимах B и M. Преобразователь был плавно расположен на гелевом участке, с глубиней 12,29 мм и усилением 22 дБ; Фокус был отрегулирован для оптимизации качества изображения. Были получены изображения и видеопетли для последующей количественной анализа. Были измерены конец диастолы левого желудочка (LVIDd) и толщина задней стенки левого желудочка в конце диастолы (LVPWd), а фракция выброса левого желудочка (LVEF) рассчитана с использованием формулы Тейхольца на основе измерений M-моды. Для каждого параметра измерения усреднялись в течение 3–5 последовательных сердечных циклов. Все эхокардиографические заборы и анализы проводились сертифицированным оператором с формальной подготовкой в эхокардиографии в соответствии со стандартизированными эхокардиографическими протоколами.

Сбор и обработка образцов

После процедуры УЗИ крыс анестезировали изофлураном. Животных помещали в положение лежа на спине, а грудная полость открывалась для открытия сердца. Сердца быстро удалялись, промывались холодным физиологическим раствором с буфером фосфатов и распределялись вдоль сагиттальной плоскости. Сердечные ткани немедленно фиксировались в 4% параформальдегиде при 4°C в течение 24 часов, после чего следовало обезвоживание с помощью серии градуированного этанола (70%, 80%, 90%, 95% и 100%) в течение 1 часа на каждом этапе, в течение которого ткани постепенно становились полупрозрачными без заметного уменьшения. Образцы очищались в ксилоле, инфильтровались расплавленным парафином при 60°C в течение 3 часов и оставляли затвердеть при комнатной температуре (RT; 20°C–25°C). Блоки сердечной ткани с парафином были обрезаны и разрезаны толщиной 4–6 мкм с помощью микротома. Секции плавали на водяной бане при температуре 45°C, устанавливались на стеклянные стеклянные горки и сушились при 37–40°C ночью. Стекли хранились в RT при условиях низкой влажности и использовались в течение недели для гистологического окрашивания.

Окрашивание гематоксилином и эозином (HE)

Срезы с парафином обработаны следующим образом. Срезы сначала депарафинизировались путём погружения в ксилол I, II и III на 5 минут каждая, затем гидратация с помощью серии безводных этанолов I и II и сортированных растворов этанола (95%, 90%, 80%, 70% и 50%) по 5 минут каждая, а затем промывались в дистиллированной воде без видимых остатков воска. Затем секции окрашивались гематоксилином Харриса в течение 5 минут и промывались под проточной водопроводной водой в течение 1–2 минут. Дифференцировка проводилась в растворе кислотного спирта примерно 1–2 секунды, при этом конечная точка определялась визуальным осмотром, когда фон выглядел бледным, а ядерное окрашивание оставалось чётко выраженным. Затем следовало засиняние в воде при 37°C–45°C и промывание дистиллированной водой. Впоследствии секции были покрыты спирторастворимым эозином в течение 40 секунд, промыты дистиллированной водой, обезвожены с помощью сортированного этанола, очищены в ксилоле и, наконец, установлены нейтральной смолой.

Массон Стейнинг

Парафинные секции последовательно депарафинизировались в ксилоле I, II и III по 5 минут каждая, затем гидратированы с помощью безводного этанола I и II, а также сортируемые растворы этанола (95%, 90%, 80%, 70% и 50%) по 5 минут каждый, а затем промывались в дистиллированной воде. Срезы погружались в уксусную кислоту 0,5% (предварительно охлаждена до 4°C) в течение 1 секунды, затем окрашивались раствором фуксина из коммерческого трихромного окрашивателя Masson в течение 10 минут, затем дифференцировали в фосфомолибдовой кислоте в течение 5 минут и контрокрашивали анилин-синим в течение 3 минут. Все реагенты входили в состав одного коммерческого комплекта и использовались согласно инструкциям производителя. После окрашивания секции трижды промывались уксусной кислотой, предварительно охлаждали до 4°C (примерно 30 с за промывку), затем обезвоживались с помощью градированного этанола, очищали в ксилоле и крепили нейтральной смолой.

Сбор образцов сыворотки для анализа метаболомики

Шесть 8-недельных самцов SD содержались в тех же условиях, что и в описанном выше эксперименте in vivo. Животные случайным образом были распределены в группу, обработанную SXQY, и в контрольную группу транспортных средств (дистиллированная вода; n = 3 на группу) с использованием компьютерного метода рандомизации. Крысам в группе SXQY перорально вводили SXQY с дозой 1 мл/100 г массы тела, тогда как контрольная группа получала одинаковый объём дистиллированной воды. После семи дней ежедневного гавирования последняя доза на седьмой день была удвоена. После последнего введения животных потерпели голодание в течение 12 часов. Крыс подвергались анестезии изофлураном, пока не подтвердилась потеря рефлектора отъезда педали как признак адекватной анестезии. Образцы крови были собраны из ретро-орбитального венозного сплетения с помощью стерильных капиллярных трубок и немедленно переведены в микроцентрифугные пробирки объемом 1,5 мл без антикоагулянта. Затем всю кровь оставили на RT в течение 1 часа и центрифугировали при 1000 × г в течение 15 минут при 4°C для получения сыворотки. Когда между верхним прозрачным слоем сыворотки и тромбом появлялось чёткое разделение, супернатантная сыворотка аккуратно аспирировалась и перемещалась в чистые микроцентрифугальные трубки. Образцы сыворотки хранили при −80°C до анализа компонентов, поступающих в кровь.

Предварительная обработка образца для анализа метаболомики

Образцы сыворотки размораживались на льду после извлечения из хранилища −80°C и кратковременно смешивались в вихрях (10 с) для обеспечения однородности. Аликвот с 100 мкл сыворотки был перемещён в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, после чего добавлено 500 мкл экстракционного растворителя (20% ацетонитрил-метанол с 2-хлор-L-фенилаланином в качестве внутреннего стандарта при конечной концентрации 1 мкг/мл) для индуцирования осаждения белков. Смесь была интенсивно вихрена в течение 3 минут и центрифугирована при 12 000 × г в течение 10 минут при 4°C. Часть получающегося супернатанта объемом 470 мкл была перенесена в новую трубку и испарена до сухости с помощью азотного испарителя при низком контролируемом потоке азота. После восстановления в 200 мкл с 70% метанол-водой и вихря в течение 1 минуты образцы были центрифугированы при 12 000 × г в течение 10 минут при 4°C, а 180 мкл очищенного супернатанта было передано в автопробопробные флаконы для анализа жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS).

Аликвот объёмом 200 мкл образца SXQY затем был перемечен в заранее маркированную центрифугную трубку на 1,5 мл. Внутренний стандартный раствор для экстракции добавлялся к каждому образцу с объёмным соотношением 1:1 (v/v). Смесь была смешана в вихри в течение 15 минут и центрифугирована при 12 000 × г в течение 3 минут при 4°C. Полученный супернатант был аккуратно собран и профильтрован через микропористую мембрану диаметром 0,22 мкм, получив прозрачный фильтрат без видимых частиц. Фильтрат был перемещён в флаконы автосэмплера и хранён при 4°C перед ультраэффективным анализом LC-MS/MS (UPLC–MS/MS).

Подготовка внутренних стандартных решений

Внутренний стандартный раствор (2-хлоро-L-фенилаланин) был приготовлен путём растворения 1 мг эталонного стандарта в 1 мл метанол-воды 70% (v/v), с получением концентрации 1000 мкг/мл. Этот стандартный раствор дополнительно разбавляли тем же растворителем для получения рабочего внутреннего стандартного раствора с конечной концентрацией 1 ppm, который был свежеприготовлен, хранён при 4°C и использовался в течение 48–72 часа.

Условия UPLC–MS/MS

Хроматографическое разделение проводилось с использованием системы UPLC, связанной с тандемным масс-спектрометром. Разделение осуществлялось на колонке C18, поддерживаемой при температуре 40°C, с расходом 0,35 мл/мин и объёмом впрыска 4 мкл. Подвижная фаза состояла из сверхчистой воды, содержащей 0,1% (v/v) муравьиной кислоты (A) и ацетонитрила, содержащего 0,1% (v/v) муравьиной кислоты (B). Градиентная элюция применялась следующим образом: 5% B при 0,0 мин; линейно увеличился до 25% B через 2,0 мин, 35% B на 3,0 мин, 60% B на 5,0 минуте и 99% B на 6,0 мин; удерживали 99% B в течение 1,5 минуты; вернулся к 5% B на 7,6 минуты; и уравновешенных при 5% B до 10,0 минуты.

Масс-спектрометрическое обнаружение проводилось с помощью высокоразрешающего масс-спектрометра, оснащённого источником ионизации электроспреем, работающим в положительном и отрицательном режимах ионов. Напряжения распыления были установлены на 3500 В в положительном режиме и 3200 В в отрицательном. Оболочный газ и вспомогательный газ были установлены соответственно на 30 и 5 произвольных единиц (по приборам). Температура ионопереносной трубки и вапорайзера поддерживались на уровне 320°C и 300°C соответственно. Полные MS-сканы были получены в диапазоне 84–1250 с разрешением 35 000 с целью автоматического управления усилением (AGC) 1,0 × 10⁶, затем следовало получение MS/MS (верхние 10) с разрешением 17 500 с целевой AGC 2,0 × 10⁵ и окном изоляции 1,0–1,5 м/з. Применялись шаговые нормированные энергии столкновений 30, 40 и 50. Топ-10 самых интенсивных ионов-предшественников были выбраны для фрагментации с длительностью динамического исключения 3 секунды.

Обработка сырых данных

Сырые данные масс-спектрометрии были преобразованы в формат mzML с помощью ProteoWizard. Для обеспечения аналитической надёжности образцы объединённого контроля качества (QC) были подготовлены путём смешивания равных объёмов всех образцов сыворотки. Образцы QC вводились с регулярными интервалами (одна инъекция QC каждые 5–10 аналитических образцов) на протяжении всего анализа UPLC–MS/MS для мониторинга стабильности прибора, согласованности времени удержания и воспроизводимости сигнала. Воспроизводимость оценивалась на основе относительного стандартного отклонения пиковых интенсивностей в образцах QC.

Обнаружение пиков, коррекция времени удержания и выравнивание пиков выполнялись с помощью пакета XCMS. Признаки с отсутствующей частотой более 50% в любой группе были исключены из дальнейшего анализа. Коррекция дрейфа сигнала впоследствии применялась к пиковым зонам с помощью метода нормализации на основе векторной регрессии поддержки (SVR), реализованного в статистическом программном обеспечении R с использованием моделирования на основе контроля качества для коррекции дрейфа сигнала на протяжении аналитического запуска.

Идентификация метаболитов проводилась путём сопоставления скорректированных признаков с внутренней библиотекой эталонных стандартов (содержащей примерно 5 000 соединений с спектральными данными MS1 и MS2; проприетарными и недоступными публично), а также с общедоступными спектральными базами данных, включая Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometry Database (METLIN), MassBank и Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS). на основе точного сопоставления массы, выравнивания времени удержания и спектрального сходства MS/MS. Массовое сопоставление проводилось с использованием допуска ±25 ppm для ионов предшественников (MS1) и фрагментов (MS2), с допуском времени удержания ±6 с. Для поиска в библиотеке применялась толерантность ±25 ppm к ионам прекурсоров (Q1) и ±50 ppm к фрагментам MS/MS, при этом минимальный балл соответствия MS/MS составлял 0,3. Для нецелевого выявления сохранялись только метаболиты с комплексным показателем идентификации выше 0,5. Итоговый балл рассчитывался как взвешенная сумма фрагмента (0,1), вперёд (0,3) и обратной (0,6) совпадающих оценок. Данные, полученные в положительном и отрицательном режимах ионизации, объединялись на уровне соединения. Для дублированных аннотаций выбиралась запись с наибольшей достоверностью идентификации и наивысшим баллом. Окончательные аннотации были скомпилированы в файл аннотации метаболитов.

Критерии идентификации поглощаемых соединений

Поглощённые прототипные составляющие определялись как соединения, обнаруженные в экстракте SXQY и группе, обработанной SXQY, с соответствующим временем удержания в пределах допуска ±0,1 мин. Кроме того, эти соединения должны были демонстрировать пиковую зону в группе, обработанной SXQY, которая была как минимум вдвое выше, чем в контрольной группе транспортного средства, или отсутствовать в образцах управления транспортным средством.

Абсорбированные метаболиты идентифицировались по иному набору критериев. Эти соединения не были обнаружены в экстракте SXQY, но присутствовали в группе, обработанной SXQY. Их масс-спектрометрические особенности должны были быть согласованы с характерными метаболическими преобразованиями, включая гидроксилирование (Δm/z = +15,9949 Da) и деметилирование (Δm/z = −14,0157 Da). Кроме того, пиковая зона в группе, обработанной SXQY, должна была быть как минимум вдвое выше, чем в контрольной группе автомобиля на основе нормализованных пиковых зон после коррекции дрейфа сигнала, либо соответствующий сигнал должен был быть необнаруживаем в выборках управления транспортным средством.

Извлечение поглощённых генов, связанных с соединениями

Компоненты, поступающие кровь, были исследованы в базе данных и аналитической платформы фармакологии традиционных китайских медицинских систем (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; доступ в январе 2026 года)²⁰. Соединения, задокументированные в ТКМСП, были отбранены как кандидаты в качестве биоактивных компонентов на основе установленных фармакокинетических порогов пероральной биодоступности ≥ 30% и подобия препарата ≥ 0,18^21. Предполагаемые мишени, соответствующие сохранившимся соединениям, были впоследствии извлечены, и все идентификаторы мишени стандартизированы к официальным символам генов с помощью базы данных^{UniProt 22}.

Извлечение мишеней, связанных с заболеваниями, и генов пересечения

Гены, связанные с HF, были собраны из базы данных GeneCards (https://www.genecards.org/; доступ в январе 2026 года) с использованием запроса «сердечная недостаточность», а для дальнейшего анализа были отобраны гены с показателем релевантности ≥ 10. Связанные с HF-мишени впоследствии были пересечени с соединениями, идентифицированными из TCMSP с помощью платформы Weishengxin (https://www.bioinformatics.com.cn; доступ в январе 2026 года). Перекрывающиеся гены были определены как мишени для пересечения и использовались для последующего построения сетей белок-белкового взаимодействия (ИПП) и анализа функционального обогащения.

Анализ строительства сети и функционального обогащения

Анализ PPI выявленных целей проводился с использованием базы данных STRING (http://cn.string-db.org/; доступ в январе 2026 года)²³ с видом, установленным в Homo sapiens, и пороговым показателем доверия ≥0,7. Данные взаимодействия импортировались в инструмент визуализации Cytoscape для визуализации сети. Топологический анализ проводился с помощью плагина NetworkAnalyzer в инструменте визуализации, а гены хаба были идентифицированы с помощью плагина CytoHubba^24,25. Анализ обогащения генной онтологии (GO) проводился на целях пересечения, включая категории биологических процессов (BP), клеточных компонентов (CC) и молекулярной функции (MF). Термины GO со значением P < 0,05 считались значимыми, и для визуализации²⁶ были выбраны топ-10 обогащённых терминов из каждой категории. Цели пересечения дополнительно подвергались анализу путей обогащения путей Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) с использованием пакета clusterProfiler в статистическом программном обеспечении. Пути со значением P < 0,05 считались статистически значимыми, а для визуализации были выбраны 20 лучших обогащённых путей. Эти пути впоследствии использовались для построения сети взаимодействия целевой и путь²⁷.

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего ± SD. Нормальность распределения данных оценивалась с помощью теста Шапиро–Уилка, а однородность дисперсии — с помощью теста Левена или теста Брауна-Форсайта перед анализом. Статистические сравнения между группами проводились с помощью одностороннего анализа дисперсии, за которым последовал пост-хок тест Тьюки с использованием GraphPad Prism. P < 0,05 считался статистически значимым.

Результаты

Трансторакальная эхокардиография

Эхокардиографический анализ выявил выраженное ремоделирование сердца и дисфункцию у крыс с TAC (рисунок 1). По сравнению с Sham контрольной группой, TAC значительно увеличил LVIDd и LVPWd, тогда как LVEF заметно снизился. Примечательно, что введение SXQY частично обратило эти патологические изменения, что отражено в значительном снижении LVIDd и LVPWd, а также в сопутствующем улучш...

Обсуждение

SXQY широко используется в клинической практике более двух десятилетий, демонстрируя свою эффективность в лечении различных сердечно-сосудистых заболеваний. В последнее время его применение распространили на пациентов с сердечной недостаточностью с уменьшенной фракцией выброса и слегка уменьшенной фракцией^{выброса 16}. В настоящем исследовании была установлена модель крыс с помощью TAC-хирургии для имитации патологических изменений HF, и в то же время некоторые крыс...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-хлор-L-фенилаланин	Аладдин	C105993-1g	Внутренний стандарт; ≥ 98%
Ацетонитрил (класс LC-MS)	Аладдин	A120771-1L	Растворитель для экстракции
Уксусная кислота	Solarbio	G1340	Массонское окрашивание; предварительное охлаждение до 4 и градусов; C
Автосэмплерные флаконы	Agilent	5190-9590	Для загрузки образцов LC-MS/MS
Бупренорфин	Цериллиант	B-044S	Анальгетик
Колонка C18 (1.8 &m; m, 2,1 мм и раз; 100 мм)	Воды	176001125	Колонка ACQUITY Premier HSS T3
Капиллярные трубки, стерильные	Фишербранд	22-362-566	Ретроорбитальный сбор крови
Центрифуга (в холодильнике)	КУБОТА	N61196-F000	Для обработки сыворотки и образцов
пакет clusterProfiler	Биопроводник	—	Пакет R для анализа обогащения KEGG; v4.0.2
Изогнутые щипцы, стерильные	HL-SQX	HL-JP	Манипуляция дугой аорты
Программное обеспечение Cytoscape	NHGRI	NIH NHGRI U24 HG012107	Версия 6.4.1
Специализированная платформа для визуализации	Fujifilm VisualSonics	Система ультразвуковой визуализации VisualSonics Vevo 1100	Положение животных во время эхокардиографии
Дистиллированная вода	Н/Д	Н/Д	Подготовка навара и управление транспортным средством
Электрический нагревательный мантия	Мидеа	WK2102	Кипячение навара
Эндотрахеальная трубка	CWE Inc., США	SAR-1000	Эндотрахеальная интубация; Эндотрахеальная трубка, использованная в этом исследовании, была интегрирована в конфигурацию вентилятора и не являлась отдельным или автономным устройством
Этанол (абсолют)	Пекинская Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	64-17-5	Обезвоживание и стерилизация
Муравьиная кислота	Аладдин	O930702	Мобильный фазовый аддитив
Марля	Solarbio	YA0720	Фильтрация насмешей; 200– 300 μ m размер пор
База данных GeneCards	GeneCards	—	Получение мишеней, связанных с заболеваниями; дата обращения: январь 2026
База данных GNPS	Калифорнийский университет в Сан-Диего	—	Спектральная база данных; версия 1.3.16, данные архивированы в декабре 2025 года
Программное обеспечение GraphPad Prism	Программное обеспечение GraphPad	—	Версия 10.1.2; SCR_002798
Грелка (термостатический)	Physitemp	HP-4M	Поддерживается при 37 градусах; C
Гематоксилин и эозин (H& E) Набор для окрашивания	Solarbio	G1120	Гистологическое окрашивание
Высокочастотный преобразователь	VisualSonics	Vevo F2	18– 40 МГц
Высокоразрешающий масс-спектрометр	Термо Фишер Сайентифик	Q Exactive	Q Exactive HF-X
Система ультразвукового исследования мелких животных высокого разрешения	Fujifilm VisualSonics	Система ультразвуковой визуализации VisualSonics Vevo 1100	Vevo 2100
База данных HMDB	Исследовательская группа Wishart / Центр инноваций в метаболомике, Университет Альберты	—	Спектральная база данных; Текущая версия HMDB 5.0; релиз 5.0; Январь 2022
Внутренняя библиотека справочных стандартов	METWARE	—	Состав собственной справочной стандартной библиотеки: библиотека содержит всего 5 000 соединений и включает как информацию MS1 (предшественники), так и MS2 (фрагментационные) спектральные данные. Отчет о доступности: формат данных библиотеки — .txt. Состояние хранения: база данных хранится на внутреннем сервере компании. Права доступа: Эта собственная стандартная библиотека является собственной внутренней спектральной библиотекой компании. Он используется исключительно для идентификации метаболитов, проверки результатов и отслеживания качества в рамках контролируемых аналитических рабочих процессов компании. Библиотека не доступна для скачивания публично. Клиенты могут получать результаты аннотаций, информацию о попаданиях и необходимые описания полей, сформированные на основе этой библиотеки.
Изофлуран	Сигма-Олдрич	792632	Ингаляционный анестетик
Система жидкостной хроматографии (UPLC)	SCIEX	ExionLC AD	ExionLC AD
База данных MassBank	консорциум MassBank; Общество масс-спектрометрии Японии / MassBank Europe	—	Спектральная база данных; версия 2024.06; данные архивированы в декабре 2025 года
Массон s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340	Гистологическое окрашивание
Мембранный фильтр (0,22 и мю; m)	Beyotime	FF362	Полиэфирсульфон (PES)
База данных METLIN	Исследовательский институт Скриппса / Лаборатория Сиуздака	РРИД: SCR_010500	Спектральная база данных; Эта база данных не содержит фиксированного годового номера версии; Данные загружены в 2023 году
Метанол (класс LC-MS)	Пекинская Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	67-56-1	Растворитель для экстракции
Микроцентрифугные трубки (1,5 мл)	Corning Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd.	MCT-150-C	Обработка образцов
Микротом	Leica	DSC1	Сечение тканей
Нейтральная смола	Solarbio	G8590	Крепление затвора
Испаритель/источник газа на основе азота	Органомация	N-EVAP	Сушка образцов
Офтальмологическая мазь	Аладдин	08-03-8009	Защита глаз во время анестезии
Парафин	Solarbio	YA0010	Вложение тканей
Параформальдегид (4%)	Solarbio	P1110	Фиксация тканей
Фосфатно-буферный физиологический раствор	ТЫ ТЕБЯ	DYP1021	Промывка салфеток
Фосфомолибная кислота	Solarbio	G1340	Массонское окрашивание
Povidone– йод	Solarbio	IP3800	Хирургическая дезинфекция
Программное обеспечение ProteoWizard	Фонд ProteoWizard	—	Версия 3.0.19254
Программное обеспечение R	Фонд R	—	Версия 4.2.2
Роторный испаритель	QINGDAO JINGCHENG INSTRUMENT CO., LTD	JC-2LZF	Концентрация навара при пониженном давлении
Шёлковый шов (2-0)	ФУЛАНЬ	NL30RH26A-76	Сужение аорты
Аппарат искусственной вентиляции легких животных	CWE Inc., США	SAR-1000	Механическая вентиляция
Спраг и Ндаш; Крысы Доули (самцы, 8 недель)	SPF Bio Co., Ltd.	—	RGD_70508; Номер лицензии. SCXK(jing)2024-0001
База данных STRING	STRING Consortium	—	Анализ взаимодействия белков; дата обращения: январь 2026
Поддержка пакета/скрипта нормализации векторной регрессии	MetNormalizer	—	Коррекция дрейфа сигнала; v1.3.02
База данных TCMSP	TCMSP	—	Извлечение соединений и целей; дата обращения: январь 2026
База данных UniProt	Консорциум UniProt	—	Стандартизация символов гена
Гель для ультразвука	MAGNAFLUX	25-912	Эхокардиография
Ультрачистая вода	Лабораторно подготовлено	—	Растворитель подвижной фазы
Вихревой миксер	Ялин	VM-ST	Микширование сэмплов
Водяная баня	Джулабо	PURA22	Участок плавает под углом 45°; C
Платформа Вэйшэнсинь	Вэйшэнсин	—	Анализ пересечения целей; дата обращения: январь 2026
Программное обеспечение XCMS	Фонд R	—	Версия 3.16.1
Ксилол	Аладдин	X775162	Депарафинизация