Интегративное исследование ассоциации по всему транскриптому и менделевская рандомизация определяют LYNX1 и MS4A14 как терапевтические мишени для остеомиелита

Summary

В данном исследовании интегрирован общий анализ ассоциаций на уровне транскриптома и менделевскую рандомизацию для систематического выявления мишеней для лечения остеомиелита. Используя генетические базы данных, авторы выделили LYNX1 и MS4A14 как ключевые кандидаты генов, выделив критически важные молекулярные пути и предоставив точные терапевтические стратегии для управления костными инфекциями.

Abstract

Остеомиелит — это тяжёлое инфекционное заболевание, характеризующееся глубоким воспалением костного и костного мозга, преимущественно вызванное бактериальными патогенами, такими как Staphylococcus aureus (S. aureus). Однако нынешние схемы лечения значительно затруднены появлением антибиотикорезистентности и рецидивирующих инфекций, вызванных устойчивым образованием биопленок и внутриклеточной бактериальной устойчивостью. Поэтому существует острая необходимость выявить новые терапевтические цели, выходящие за рамки традиционных антимикробных препаратов. Для систематического выявления генов причинной восприимчивости, лежащих в основе остеомиэлита, был применён интегративный вычислительный подход, сочетающий транскриптомное исследование ассоциаций (TWAS) с анализом менделевской рандомизации (SMR). Крупномасштабные генетические варианты использовались как инструментальные переменные для прогнозирования экспрессии генов в тканях, что позволило исследовать причинно-следственные связи между этими мишенями и риском заболеваний. Интегративная структура определила LYNX1 и MS4A14 как ключевые кандидаты в гены и потенциальные терапевтические цели. В частности, LYNX1 был связан с повышенной восприимчивостью к остеомиелиту, тогда как MS4A14 проявил потенциальные защитные свойства. Эти результаты подчёркивают регуляторную роль этих генов в иммунном ответе хозяина и воспалительной модуляции во время инфекции костей. Это исследование преодолевает разрыв между результатами ассоциаций по всему геному и биологической интерпретацией, углубляя понимание генетической основы остеомиелита и поддерживая разработку стратегий целенаправленной прецизионной медицины для усиления защиты хозяина и преодоления терапевтической резистентности.

Introduction

Остеомиелит — это тяжёлое инфекционное заболевание, характеризующееся глубоким воспалением костного и костного мозга. Часто он инициируется бактериальной инвазией, при этом Staphylococcus aureus (S. aureus) является распространённым патогеном при острых и хронических гематогенных^{проявлениях 1,2}. Хотя S. aureus широко выражен, остеомиелит часто является полимикробным, и самое уничтожение S. aureus не всегда разрешает инфекцию из-за сохранения некультивируемых микроорганизмов и динамических взаимодействий биоплёнок ^3,4. У восприимчивых хозяев патогены применяют сложные стратегии уклонения, включая внутриклеточную персистентность внутри макрофагов и образование плотных биопленок. Эти биопленки, состоящие из внеклеточной ДНК, полисахаридов и специализированных белков, создают серьёзные физические барьеры, противодействующие иммунной защите хозяина и ограничивающие проникновение обычных антимикробных^{препаратов 5,6}. Следовательно, хотя клиническое лечение обычно включает агрессивное хирургическое дебридментирование и длительную терапию антибиотиками, наличие устойчивых биопленок и полимикробных сообществ значительно снижает эффективность лечения, приводя к продолжительной заболеваемости и повторным^{инфекциям 7,8}. Выяснение молекулярной архитектуры, лежащей в основе взаимодействий хозяина и патогена, остаётся критически важным для выявления новых терапевтических^{целей 9}.

Геномные ассоциативные исследования (GWAS) продвинули понимание остеомиелита, выявив несколько генетических локусов, связанных с восприимчивостью к^{заболеваниям 10}. Однако из-за строгих порогов множества тестов и ограничений статистической мощности и размера выборки многие критические локусы, влияющие на восприимчивость к остеомиелиту, скорее всего, останутся^{невыявленными 7}. Кроме того, интерпретация результатов GWAS остаётся сложной, поскольку большинство идентифицированных вариантов расположены в некодируемых или межгенных областях, что свидетельствует о регуляторном влиянии на экспрессию генов, а не на прямые изменения структуры^{белка 11}. Кроме того, первичные данные ГВАС не имеют прямой тканевой специфичности, что требует дополнительных анализов для определения клеточных контекстов, в которых эти варианты оказывают своё воздействие. Транскриптомные ассоциативные исследования (TWAS) решают эти ограничения, интегрируя генетически предсказанную экспрессию генов из эталонных панелей в существующие наборы данных GWAS, что позволяет систематически идентифицировать функционально значимые заболевания гены в нескольких^{тканях 12}.

Для усиления причинно-следственных выводов менделевская рандомизация (МР) использует генетические варианты в качестве инструментальных переменных, используя случайное распределение аллелей при зачатии для снижения смешивания и обратной^{причинности 13,14}. Количественный анализ признаков экспрессии (eQTL) дополнительно связывает варианты GWAS с транскрипцией^{генов 15}, тогда как суммарная менделевская рандомизация (SMR) интегрирует наборы данных GWAS и QTL для приоритизирования причинных генов и их отличия от ассоциаций, вызванных дисбалансом связей с помощью тестирования на гетерогенность¹⁶.

Это исследование представляет собой первое применение интегративной структуры TWAS и MR, специально сосредоточенной на остеомиелите, устраняя разрыв между результатами GWAS и клинически применимыми инсайтами. Объединяя экспериментальные транскриптомические данные с крупномасштабными популяционно-генетическими данными, гены восприимчивости к болезням систематически картографировались и были выведены причинно-следственные связи. Эта интегративная стратегия направлена на выявление ранее неизвестных молекулярных путей, участвующих в устойчивости хозяина к остеомиелиту, и выявление кандидатов для точной терапевтической разработки.

Protocol

Все сводные статистические данные, использованные в анализах менделевской рандомизации (MR) и Transcriptome-Wide Association Study (TWAS), были получены исключительно из ранее опубликованных, неидентифицированных наборов данных. Этическое одобрение и индивидуальное согласие на оригинальные исследования задокументированы в соответствующих публикациях. В результате дополнительное этическое одобрение этого исследования по анализу данных было отменено Институциональным обзорным советом больницы Тундэ провинции Чжэцзян (Zhe Tongde Lunshen 2024 [Yan] No. 028-JY). Инструменты, используемые для этого исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Сбор и обработка данных по RNA-seq

Данные транскриптома были получены из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE272198) для оценки сохранения врождённых иммунных путей у видов млекопитающих для первоначальной^{валидации 17}. Макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM), инфицировались S. aureus (множественность инфекции, MOI = 10) в течение 1 часа, после чего проводилась обработка лизостафином (20 мкг/мл) и гентамицином (50 мкг/мл) для удаления внеклеточных бактерий. После трёх промываний с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) BMDM культивировали в течение 24 часа, лизировали в полном реагенте для экстракции РНК и секвенировали.

Качество РНК оценивалось с помощью автоматизированной системы электрофореза для обеспечения целостности. Библиотеки были подготовлены на основе трёх независимых экспериментов и секвенированы на высокопроизводительной платформе секвенирования. Исходные считывания выравнивались с геномом мыши (GRCm38, mm10) с помощью STAR (v2.7.10a). Дифференциально экспрессированные гены (DEG) были выявлены с помощью DESeq2 (v1.38.0). Для снижения ложноположительных результатов статистическая значимость была определена как скорректированное p-значение (FDR) < 0,05 и |log₂ fold shift| > 1. Анализ генной онтологии (GO) проводился с помощью clusterProfiler (v4.6.0), а анализ обогащения наборов генов (GSEA) — с использованием GseaVis (v0.0.5). Тепловые карты генерировались с помощью пакета pheatmap (v1.0.12) в R (v4.2.0).

Анализ TWAS

Данные секвенирования цельной крови РНК и секвенирования цельного генома (WGS) были получены в рамках проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) (V8)¹⁸. Ранее обученные модели экспрессии генов использовались из публичного репозитория (https://doi.org/10.5281/zenodo.3842289). Сводная статистика по остеомиелиту для TWAS была получена из консорциума FinnGen, включающая 2 336 случаев и 473 264^{контрольных группы 12}.

TWAS проводился с использованием трёх алгоритмов: импутация суставов и тканей (JTI),^{PrediXcan 19} и UTMOST^12,20. JTI оценивает сходство экспрессии генов и доступность эпигенетического хроматина для оптимизации точности прогнозирования. PrediXcan применяет эластичную чистую регрессию с пятикратной кросс-валидацией, в то время как UTMOST повышает точность, используя данные экспрессии нескольких тканей с помощью LASSO разреженной группы. Модифицированная структура UTMOST, описанная Чжоу и ^др.12, стандартизирует гиперпараметры для беспристрастной оценки. Гены со стабильными баллами перекрёстной валидации — заранее определёнными как коэффициент корреляции r > 0,1 и прогностическая значимость p < 0,05²¹ — были сохранены как импутируемые. Были установлены модели цельнокровного транскриптома с использованием ковариационных матриц SNP из эталонного набора данных 1000 геномов.

Впоследствии были проанализированы связи между предсказанной экспрессией генов и риском остеомиелита. Для учёта множественного тестирования статистическая значимость для TWAS в первую очередь определялась с помощью порога ложного обнаружения (FDR) < 0,05. Учитывая гипотезный характер этого многоступенчатого исследования, локусы, достигающие сугестивного (номинального) порога p < 0,05, также были приоритетом для анализов менделевской рандомизации (SMR) и колокализации. Эта интегративная стратегия направлена на максимальное привлечение потенциальных регуляторных факторов, при этом опираясь на мультиомическую кросс-валидацию (TWAS + SMR) для обеспечения надёжности приоритетных кандидатов.

Анализ SMR

Это исследование соответствовало рекомендациям по укреплению отчетности о наблюдательных исследованиях в эпидемиологии (STROBE^{) 22}. Для вычислительного определения фенотипа, отражающего генетическую предрасположенность к дисфункции митохондрий (далее — «митоди» для целей анализа), из базы данных MitoCarta3.0²³ были извлечены транскрипты, соответствующие всем известным генам, связанным с митохондриями. Этот набор генов служил заранее определённой, биологически обоснованной основой для дальнейшего прогнозирования полигенного риска. Все последующие функциональные интерпретации, связанные с «митодиями», выводятся из этого вычислительного вывода и должны считаться предсказательными и генерирующими гипотезы.

Инструменты количественных признаков выражения (eQTL) генерировались с использованием вариантов в пределах 1000 кб кодируемых последовательностей (cis-eQTL). Сводная статистика была получена из консорциума eQTLGen и GTEx V8²⁴. Всего было выбрано 8 932 843 SNP, связанных с 1 013 транскриптами, связанными с митодисом, на основе геномного порога значимости P < 5E-8. Исходная статистика GWAS по результатам остеомиелита была получена из^{FinnGen 20}.

Анализ менделевской рандомизации (SMR) на основе сводных данных был проведён с использованием SMR (версия 1.0.3) с стандартными параметрами для оценки плейотропных ассоциаций между признаками экспрессии генов и исходами при остеомиелите. Причинный эффект beta_mitodys–остеомиелит представляет оценочный размер логарифмического эффекта дисфункции митохондрий при остеомиелите и рассчитывается как:

Коэффициенты шансов (OR) отражают изменение естественного логарифмического увеличения стандартизированных уровней экспрессии генов на одну единицу. Ко-локализация дополнительно оценивалась с помощью теста гетерогенности в зависимых инструментах (HEIDI).

Results

Характеристика массового секвенирования РНК и функциональных обогащений

Следуя методологии выделения неинфицированных (контрольных) и инфицированных S. aureus BMDM, в экспериментальной группе было выявлено 3 775 DEG, включая 1 686 повышенных и 2 089 пониженных генов. Анализ GO выявил сеть, сильно обогащённую для активации врожденного иммунитета, включая положительную регуляцию (GO:0045089) и активацию (GO:0002218) врождённого иммунног...

Discussion

Интегрируя анализы TWAS и SMR в трансляционные наборы данных, это исследование выявило основную сеть генетических локусов, связанных с фенотипами остеомиелита. Идентификация LYNX1 и MS4A14 в качестве кандидатных генных мишень является ключевым вкладом, предоставляя механистическое понимание, выходящее за рамки традиционных результатов GWAS, благодаря включению транскриптомического контекста. Этот интегративный подход подчёркивает потенциал стратегий прецизионной медицины для продвижения ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
clusterProfiler	Команда Guangchuang Yu (Университет Сунь Ятсена)	НД	Используется для функционального анализа обогащения Gene Ontology (GO) дифференциально экспрессированных генов.
DESeq2	Проект Bioconductor (Открытый исходный код)	НД	Используется для выявления дифференциально экспрессированных генов (DEG).
GSEA / GseaVis	Broad Institute / Сообщество открытого исходного кода	НД	Используется для анализа обогащения генных наборов (GSEA) для выявления координатно экспрессированных генных наборов. GseaVis, вероятно, используется для визуализации.
HEIDI (Heterogeneity in Dependent Instruments) тест	Интегрированная функция в программном обеспечении SMR	НД	Используется для проверки, обусловлена ли ассоциация, наблюдаемая в SMR, несбалансированностью связи, а не общей причинной вариацией. P_HEIDI > 0,05 указывает на отсутствие основной гетерогенности
JTI (Joint-Tissue Imputation)	Zhou и др. (Открытая модель исходного кода)	НД	Алгоритм TWAS, который оценивает сходство экспрессии генов и доступность эпигенетического хроматина для оптимизации точности предсказания.
pheatmap	Raivo Kolde (пакет R)	НД	Используется для создания тепловых карт дифференциально экспрессированных генов для визуализации данных.
PrediXcan	Gamazon и др. (Открытая модель исходного кода)	НД	Алгоритм TWAS, который применяет регрессию с упругой сеткой с пятикратно перекрестной проверкой для импутации экспрессии генов и тестирования ассоциации с риском заболевания.
SMR (Summary-data-based Mendelian Randomization)	Разработано командой из Университета Фудань (Открытое программное обеспечение)	НД	Используется для проведения сводного анализа менделевской рандомизации на основе обобщенных данных для исследования причинно-следственных связей между экспрессией генов и риском остеомиелита. Была использована версия 1.0.3.
STAR	Alexander Dobin (Лаборатория Cold Spring Harbor)	НД	Используется для сопоставления ридов RNA-seq с эталонным геноmom (геном мышей GRCm38/mm10).
UTMOST	Hu и др. (Открытая модель исходного кода)	НД	Алгоритм TWAS, который повышает точность предсказания за счет использования данных многолетнего экспрессии в рамках структуры с объединенным групповым LASSO.