Мышиная модель одиночной и повторяющейся вращательной закрытой черепно-мозговой травмы

Краткое содержание

Описывается воспроизводимая мышиная модель вращательного сотрясения головного мозга, предоставляющая универсальный метод для изучения тонких функциональных и биологических основ — включая нейрососудистые, воспалительные и поведенческие изменения — после единичного или повторяющегося воздействия при отсутствии явного структурного повреждения мозга.

Аннотация

Сотрясение мозга (КБИ), патофизиологический субстрат, лежащий в основе клинического сотрясения, является частым, но недостаточно изученным состоянием с потенциальным долгосрочным неврологическим нарушением у части пациентов. Особенно повторяющийся КБИ, то есть в контактных видах спорта, связан с длительными когнитивными нарушениями и прогрессирующей нейродегенерацией (например, хроническая травматическая энцефалопатия, ХТЭ). Для устранения этого пробела в знаниях была создана воспроизводимая мышиная модель вращательного повреждения головного мозга с закрытой головой, которая повторяет ключевые биомеханические и патологические особенности КБИ. Стереотактически управляемый электромагнитный ударник использовался для нанесения стандартного удара по целому черепу. Для снижения фокусной нагрузки на череп и прилегающую ткань мозга на наконечник импактора был установлен специально изготовленный силиконовый колпачок. Такая конфигурация надёжно вызывала вращение головы с низкой изменчивостью между животными, предотвращая переломы черепа или микроскопические повреждения тканей. Для сохранения физиологической нейронной и сосудистой активности и предотвращения потенциально нейромодуляторных эффектов глубокой анестезии у сознательных мышей под лёгкой седацией с помощью α2-агониста медетомидина вызывали повреждение мозга. Индуцированные удары вызывали воспроизводимое вращательное движение головы с лишь незначительной изменчивостью, обусловленной положением головы. Структурная целостность мозга была оценена с помощью in vivo T2-взвешенной магнитно-резонансной томографии и подтверждена экс-виво гистологическими анализами, которые не выявили признаков разрушения тканей, контузии или микрокровоизлияний, но показали лёгкое, широкое нарушение микрососудистой границы. Эта новая модель ротационной закрытой черепно-мозговой травмы предоставляет надежную экспериментальную платформу для продольных исследований тонких изменений нейроваскулярных, воспалительных и гематоэнцефалических барьеров, происходящих при отсутствии явной структурной патологии. Его применение позволяет механистически понимать патофизиологию клинического сотрясения мозга и возможные нейродегенеративные последствия повторяющихся травм, тем самым способствуя разработке крайне необходимых клинических биомаркеров.

Введение

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) остаётся значимой причиной долгосрочной инвалидности во всех возрастных группах, при этом подростки и молодые взрослые непропорционально страдают ^1,2,3. Подавляющее большинство ЧМТ классифицируются как лёгкие (mTBI), обычно называемые сотрясением мозга на клиническом уровне. Хотя сотрясение мозга по определению не связано с явным структурным повреждением мозга, обнаруживаемым с помощью традиционной нейровизуализации, всё больше данных свидетельствует о том, что основной механизм травмы — здесь называемый сотрясением мозга (КБИ) — представляет собой отдельную и клинически значимую патофизиологическую структуру.

В частности, повторяющаяся ЦБИ, особенно при происходящем в тесно-временной последовательности, как часто встречается в контактных видах спорта и военных условиях, связана с устойчивым когнитивным снижением, нейропсихиатрическими симптомами и развитием хронической травматической энцефалопатии (ХТЭ)^1,2,3. Это очевидное несоответствие между лёгкой формой первоначальной травмы и возможностью долгосрочных неврологических последствий представляет собой серьёзную проблему как для клинической диагностики, так и для механистических исследований.

Новые данные указывают на то, что тонкие, но продолжительные изменения на нейроваскулярном и нейроглиальном интерфейсе являются релевантным механизмом заболевания⁴. Эти изменения охватывают целостность гематоэнцефалического барьера (BBB), структуру микрососудов, активацию глии, возбудимость нейронов и эндогенные процессы восстановления, что потенциально связывает клеточную патофизиологию с долгосрочными функциональными и поведенческими нарушениями, наблюдаемыми после, особенно повторяющихся,^{CBI 5,6,7,8}. В совокупности такие изменения всё чаще признаются потенциальными факторами задержки функциональных и поведенческих дефицитов после ЦБИ. Однако разрозненный и многогранный характер усложняет механистическое понимание и до сих пор препятствует разработке целенаправленных терапевтических вмешательств.

Доклинические модели, которые перерабатывают ключевые аспекты патофизиологического каскада, являются ключевыми инструментами для анализа этих механизмов и выявления новых терапевтических путей. Хотя существует широкий спектр экспериментальных моделей ЧМТ, большинство из них были разработаны для имитации умеренных и тяжёлых травм или основания на фокальном структурном^{повреждении 9,10,11}. В отличие от этого, поразительно мало животных моделей характерного механизма повреждения^КБИ-5. В основном церебральная травма, обозначенная как «лёгкая», вызвана фокальной ударной в жестко фиксированную голову или даже прямым кортикальным ударом после краниотомии, что принципиально противоречит диффузному механизму травмы, вызванному ускорением и замедлением, определяющим сотрясение мозга у^{человека 6,7}. Хотя такие подходы позволяют точно контролировать параметры травм, их ограниченная способность воспроизводить динамику реальных сотрясений снижает их трансляционную значимость.

Для преодоления этих ограничений существует несколько методов для индуцирования воспроизводимой и диффузной закрытой черепно-мозговой^травмы 12,13,14. Опираясь на эти концепции и стремясь минимизировать техническую сложность, была разработана модель контролируемой ротационной травмы у мышей с использованием коммерчески доступного электромагнитного импактора, часто применяемого в других экспериментальных моделях травмы (например, контролируемый кортикальный удар, CCI). Обеспечивая воспроизводимый эффект на свободно движущуюся голову, этот подход сохраняет структурную целостность, одновременно позволяя проводить продольное исследование нейроваскулярных, нейроглиальных и функциональных изменений после однократного и повторяющегося КБИ в условиях, близких к биомеханическим особенностям сотрясения человека.

В сочетании с лонгитюдной поведенческой оценкой, in vivo визуализацией и экс-виво гистологией эта модель предоставляет универсальную и доступную платформу для изучения нейроваскулярных, глиальных и поведенческих изменений после одиночных или повторяющихся воздействий. Таким образом, он хорошо подходит для изучения тонких вторичных заболеваний CBI, выявления трансляционных суррогатных параметров и оценки возможных терапевтических вмешательств в клинически значимых экспериментальных условиях.

Протокол

Все процедуры с животными соответствовали Немецкому закону о благополучии животных и были одобрены институциональными и государственными органами (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Схематический рабочий процесс подробно описан на рисунке 1. Этот протокол надёжно вызывает сотрясение мозга, что подтверждается определённой панелью структурных, поведенческих и нейроваскулярных валидационных результатов (рисунок 2). Все материалы, использованные в этом исследовании, подробно описаны в Таблице материалов.

1. Общие соображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей содержали в стандартизированных условиях (12-часовой цикл свет/темнота) с импровзационным доступом к еде и воде. Мыши акклиматизировались к экспериментальной лаборатории не менее 7 дней до операции. В этом пилотном исследовании было использовано всего 40 мышей, при этом по 10 животных были распределены в каждую экспериментальную группу (фиктивная как контрольная группа, одна группа CBI, повторяющаяся CBI в высокочастотной группе и повторяющаяся CBI в низкочастотной группе). Установите высокоскоростную камеру на уровне глаз с головой мыши в фиксированном положении перед мышью (например, на расстоянии 10 см). Чтобы обеспечить единообразие между испытаниями, сохраняйте постоянное положение и ориентацию камеры. В этом исследовании использовался GoPro Hero6 с частотой 240 кадров в секунду (fps) с разрешением 1080 пикселей. Для описанных кинематических анализов используется открытое программное обеспечение для анализа движения Kinovea (версия 2025.2.0).

2. Индукция анестезии и анестезией

1. Подготовьте установку, включая стереотактическую раму и крепление для электромагнитного ударника.
2. Вводите трамадол (1 мг/мл) в питьевой воде за два дня до индукции травмы и продолжайте три дня после (последней) операции.
3. Индуцировать анестезию с использованием изофлурана в смеси закиси азота и кислорода (_O2 30%, N₂O 70%) с 4–4,5% изофлурана в индукционной камере.
4. Оцените хирургическую толерантность с помощью рефлекса «щипка пальцев». Продолжайте, когда отменный ответ отсутствует.
5. Вынимите мышь из индукционной камеры и положите её на грелку внутри стереотактической рамки. Поддерживайте температуру ядра на уровне 37 ± 1,0 °C с помощью волоконно-оптического ректального зонда. Защитите глаза от высыхания, нанеся офтальмологическую мазь.
6. Поддерживайте анестезию, доставляя изофлуран в дозе 2,0–2,5% через носовой конус, подключённый к стереотаксической установке.

3. Подготовка черепа

1. Зафиксируйте мышь внутри стереотактического кадра с помощью определённых наушных планок.
2. Побрийте кожу головы и тщательно продезинфицируйте операционную зону спиртовым антисептиком.
3. Применяйте местную анестезию с помощью подкожной инъекции бупивакаина (0,1 мг/кг).
4. Переоцените рефлекс сжатия пальцев перед разрезом кожи. Применяйте только при отсутствии реакции на отмену, чтобы обеспечить стабильную глубину анестезии.
5. Проведите разрез кожи по средней линии примерно 7 мм, чтобы обнажить череп.
6. Аккуратно обнажите череп над правой теменной костью между Брегмой и Лямбда.
7. Убедитесь, что стереотаксическая рамка ориентирована перпендикулярно черепу, а вертикальная ось расположена под углом 90° относительно поверхности головы.
8. Закрепите маркерный штифт в стереотаксический держатель и центрируйте его прямо на Bregma.
9. Обнулить все стереотактические координаты и переместить маркерный контакт в заранее заданную антерозаднюю (AP) и медиолатеральную (ML) координаты (в нашей модели на AP 0,5, ML -2,5). Отметьте цель водостойким фломастером.

4. Корректировка обезболивающей

1. Освободите мышь от наушников.
2. Вводите медетомидин подкожно (0,5 мг/кг) и постепенно снижайте дозу изофлурана до <0,5 %.
3. Поддерживайте анестезию на уровне < 0,5% изофлурана, постоянно контролируя дыхание и температуру тела.
4. Позволить уравновесить в этих условиях 10 минут, чтобы достичь устойчивого состояния анестезии, сохраняя активность нейронных сетей. Частота дыхания, отсутствие рефлекторных реакций и стабильная температура тела (37 ± 1,0 °C) использовались в качестве стандартизированных индикаторов для обеспечения сопоставимой глубины анестезии у животных.

5. Ударная индукция

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом изготовьте держатель для головки для животной модели из коммерчески доступной полиэтиленовой (PE) изоляции из пенопласта — закрытой, несшитой полимерной пенопласта, которая ограничивает ускорение вниз и позволяет вращаться. Кроме того, изготовьте индивидуально изготовленный сферический наконечник 5 мм из силпурана (соотношение 1:1; жесткость 830 кПа).

1. Удалите датчик ректальной температуры и прекратите подачу изофлурана, затем положите мышь в положение лежа на держателе для головки.
2. Прикрепите специально изготовленную силиконовую крышку к коммерчески доступному наконечнику ударного механизма.
3. Установите электромагнитный импактор в стереотаксический держатель и убедитесь, что устройство ориентировано под углом 10° относительно поверхности черепа.
4. Выровняйте кончик импактора над заранее определённой целевой областью черепа.
5. Опустите наконечник ударника в вытянутом положении, пока он не слегка коснётся поверхности черепа.
6. Втяните наконечник ударника и сдвините его до нужной глубины вмятины (то есть 3 мм в этих экспериментах) к поверхности черепа. Для контрольных животных опустите опускание и поднимите кончик на такое же расстояние.
7. Начинайте запись видео. Выполнить одно вращательное сотрясение, активируя электромагнитный болт через управляющий переключатель со скоростью 5 мм/с и длительностью импульса 0,1 мс.
8. Сразу после завершения удара убратьте.
9. Антагонистировать анестезию медетомидина с помощью антагониста атипамазол (0,5 мг/кг, s.c.).

6. Оценка после удара и закрытие раны

1. Поверните мышь в положение на спине.
2. Оцените рефлекс выпрямления, записывая время, необходимое животному для возвращения в положение лежа.
3. Повторно индуцировать анестезию с помощью изофлурана в смеси закиси азота и кислорода (_O2 30%, N₂O, 70%) при 4% изофлуран.
4. Вынимите мышь из камеры впуска и положите её на грелку у стереотактической рамы. Поддерживайте температуру ядра на уровне 37 ± 1,0 °C с помощью волоконно-оптического ректального зонда.
5. Закрепите мышь в стереотактическом кадре с помощью наушников.
6. Закройте кожный разрез с помощью прерванных швов с самопоглощающими нитями (например, Polyglactin 910, 6-0).
7. Перенесите мышь в согревающую коробку и следите за ним до полного восстановления сознания.
8. Верните животное в его домашнюю клетку.

7. Парадигма повторяющихся воздействий

1. Назначьте мышей на фиктивные, одиночные или повторяющиеся группы CBI в соответствии с экспериментальной моделью.
2. Для групп с повторными травмами планируйте последующие сеансы CBI с определёнными интервалами (например, каждые 48 часов).
3. Перед каждым последующим CBI вводите предоперационную анальгезию с помощью трамадола в питьевой воде, как описано в разделе 3.1.
4. Повторная анестезия, стереотаксическая маркировка и воздействие по той же процедуре, описанной в разделах 3–6, включая местную анестезию бупивакаином (0,1 мг/кг, s.c.), введение медетомидина (0,5 мг/кг, s.c.) с поддержанием изофлурана на уровне < 0,5%, стереотаксическое нацеление при AP 0,5 и ML −2,5 относительно Bregma, а также доставку вращательного ударного удара с помощью электромагнитного импактора (глубина углубления 3 мм, скорость 5 мм/с, длительность импульса 0,1 мс, угол 10° относительно поверхности черепа).
5. Обеспечить равномерное позиционирование (положение лежа на держателе для головки из полиэтиленовой пены с возможностью вращательного движения), одинаковые параметры удара (угол, глубина, скорость и продолжительность) и стандартизированные пери- и постпроцедурные условия, включая антагонистизацию медетомидина атипамазолом (0,5 мг/кг, s.c.), повторное введение анестезии (4% изофлуран в O₂ 30%/N₂O 70%) и контроль температуры при 37 ± 1,0 °C на повторных сеансах для поддержания воспроизводимости между животными и временными точками.
6. Обеспечьте согласованное позиционирование, параметры удара и условия восстановления на повторных сессиях, чтобы поддерживать воспроизводимость между животными и временными точками.
7. Постоянно следите за животными на наличие накопленных поведенческих дефицитов после повторяющихся воздействий.

8. Кинематический анализ

1. Экспортируйте видео в стандартном формате (например, MP4) для анализа и загрузите их в программное обеспечение Kinovea.
2. Перейдите к соответствующему временному окну, содержащему кадры до и после удара (например, от -0,025 до 0,3 с от удара). Обязательно установите адекватную частоту кадров (например, 240 fps) в настройках программного обеспечения. Определите референс масштабирования (например, расстояние между глазами).
3. Используйте инструмент отслеживания Kinovea, чтобы установить трехточечную систему отслеживания (например, правый глаз, левый глаз, нос; Рисунок 3A). Начните отслеживание каждой точки и вручную исправляйте ошибки отслеживания, особенно при быстром движении или окклюзии.
4. Экспортировать отслеживаемые координаты в виде файлов CSV или Excel.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейший кинематический анализ был проведён с использованием индивидуального скрипта MATLAB. Данные отслеживания с временным разрешением, экспортированные из Kinovea, импортировались и предварительно обработаны для удаления недопустимых записей и обеспечения стабильного масштабирования времени. Сдвиг головы определялся как центроид трёх ориентиров (правый глаз, левый глаз и нос), из которых с помощью числового дифференцирования выводились линейные смещения, скорость и ускорение. Вращение головы оценивалось по ориентации оси глаз–нос, при этом угловое смещение рассчитывалось относительно исходной линии до удара и угловой скорости, полученной в качестве первой производной. Для снижения усиления шума все позиционные и угловые сигналы сглаживались с помощью фильтра Савицкого–Голея перед дифференциацией. Основным параметром исхода было максимальное угловое смещение, а профили скорости и ускорения анализировались как относительные показатели динамики движения головы в разных испытаниях.

Результаты

Общие соображения:

Применение этого протокола воспроизводимо вызывает сотрясение мозга, что подтверждается определённым набором структурных, поведенческих и нейроваскулярных валидационных показаний (см. рисунок 2). После повреждения была сохранена целостность конструкции. Явного макроскопического нарушения тканей или кровоизлияния не выявлено, что указывает на то, что протокол вызывает сотрясение, а не контузивно...

Обсуждение

Характеризована новая мышиная модель закрытой головы CBI, основанная на ускорении и замедлении, характеризующаяся лёгким, но широко распространённым нарушением BBB и выраженным нейропсихиатрическим фенотипом, напоминающим клиническое сотрясение мозга. Воспроизводя ключевые признаки КБР контролируемо и последовательно, сохраняя структурную целостность, модель предоставляет полезную и хорошо охарактеризованную экспериментальную основу для изучения механизмов, лежащих в основе КБР и его ней...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лекарственные средства
Антипамезол	Vetoquinol	VM 06043/4004	Антагонист медетомидина (антагонист α2-адренорецепторов), подкожно (0,5 мг/кг)
Бепантен офтальмическая мазь	Bayer	11809917	Защита глаз при анестезии, местно
Бупивакаин	Sigma-Aldrich	B1160000	Местная анестезия, подкожно (0,1 мг/кг)
Изофлуран	CP pharma	1214CN	Анестезия, ингаляция (индукция и поддержание)
Медетомидин	Vetoquinol	VM 06043/4003	Седативное/анестезирующее средство (агонист α2-адренорецепторов), подкожно (0,5 мг/кг)
Трамадол гидрохлорид (100 мг/мл)	Grünenthal	6867645	Аналгетик, вводимый через питьевой раствор, конечная концентрация 1 мг/мл для мышей, начиная с 2 дней до операции и до 3 дней после
Оборудование
Полиэтиленовая подушечка для шеи	На заказ		Поддержка для положения на животе при ударе
Стеротаксический аппарат Silupran Cover	На заказ		Распределяет механическую нагрузку, предотвращает фокальный повреждения черепа, крепится к наконечнику аппарата, 830 кПа
Стеротаксический аппарат	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Электромагнитное устройство для контролируемого воздействия
Инструменты
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(версия 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	НД