Этот протокол описывает подход к биологической тонкой настройке фибрина, богатого тромбоцитами, путём обогащения кобаламином и альфа-токоферолом перед центрифугированием, что позволяет контролировать модуляцию фактора роста и высвобождение цитокинов в условиях in vitro .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Обогащение фибрина, богатого тромбоцитами, с использованием кобаламина и альфа-токоферола для модуляции фактора роста
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фибрин, богатый тромбоцитами (PRF), — это аутологичный биоматериал, широко используемый в регенеративной стоматологии благодаря своей биосовместимости и устойчивому вывобождению факторов роста. Недавние исследования сместились в сторону биологической модуляции PRF для повышения её регенеративной эффективности без изменения фундаментальных принципов подготовки. В данном исследовании представлен протокол биологической тонкости PRF посредством обогащения кобаламином и альфа-токоферолом перед центрифугированием, а также оценивается их влияние на фактор роста и провоспалительное высвобождение цитокинов в условиях in vitro . Периферические образцы крови, полученные от здоровых добровольцев, были обработаны с помощью фиксированного протокола центрифуга. Кобаламин или альфа-токоферол добавляли в цельную кровь перед центрифугированием для получения биоактивно модифицированных матриц PRF. Профили высвобождения фактора роста, полученного из тромбоцитов (PDGF), трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1), сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), фактора роста фибробластов-2 (FGF-2), интерлейкина-1β (IL-1β) и фактора некроза опухоли-α (TNF-α) количественно оценивали через 24 и 72 часа с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа. PRF, обогащённый кобаламином, был связан со значительными межгрупповыми различиями в уровнях TGF-β1 и снижением выделения провоспалительных цитокинов, что указывает на переход к более благоприятной регенеративной микросреде. В отличие от этого, увеличения, наблюдаемые при FGF-2 и IGF-1, были зависимы от времени и были обнаружены во всех группах, не демонстрируя специфического кобаламин-специфического эффекта. PRF, обогащённый альфа-токоферолом, продемонстрировал селективное увеличение высвобождения VEGF, что указывает на потенциальное проангиогенное влияние. Эти результаты показывают, что таргетное обогащение витаминов позволяет контролируемо модулировать биоактивность PRF, сохраняя её аутологичную и безантикоагулянтную природу. Этот протокол предоставляет практическую основу для биологической тонкости PRF и поддерживает его использование в качестве настраиваемой регенеративной платформы для будущих трансляционных и клинических применений.
Введение
Фибрин, богатый тромбоцитами (PRF), — это концентрат аутологичных тромбоцитов второго поколения, широко применяемый в пародонтологии, имплантатной стоматологии и хирургии полости рта благодаря своей биосовместимости, простоте приготовления и способности к устойчивому освобождению факторовроста 1,2. PRF получается центрифугированием цельной крови без использования антикоагулянтов или экзогенных активаторов, в результате чего образуется трёхмерный фибриновый матрикс, который захватывает тромбоциты и лейкоциты. Эти клеточные компоненты служат эндогенными резервуарами факторов роста, включая фактор роста, полученный из тромбоцитов (PDGF), трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) и фактор роста фибробластов-2 (FGF-2), которые вместе регулируют ангиогенез, миграцию клеток, пролиферацию и ремоделирование внеклеточного матрикса во время регенерациитканей 3,4.
Помимо биологического состава, регенеративная эффективность PRF сильно зависит от архитектуры её фибриновой сети и биологической активности клеточных компонентов. По этой причине недавние исследования вышли за рамки традиционных протоколов подготовки и начали рассматривать PRF как биологически настраиваемую носительную систему, а не как пассивный каркас 5,6. Стратегии структурной модификации, такие как включение биоматериалов, включая гиалуроновую кислоту и коллаген, показали, что физические и механические свойства PRF могут изменяться, что приводит к изменениям в организации фибрина, механической стабильности и кинетике выбросов факторовроста 7. Эти результаты способствовали росту данных в пользу адаптации PRF к конкретным регенеративным потребностям.
Параллельно с подходами, основанными на биоматериалах, обогащение на основе витаминов стало биологически значимой стратегией для модуляции биоактивности PRF. Известно, что витамины регулируют основные клеточные процессы, такие как метаболизм, редокс-баланс, синтез коллагена, ангиогенез и воспалительные сигналы. В частности, витамины, такие как аскорбиновая кислота, холекальциферол, кобаламин и альфа-токоферол, влияют на поведение клеток и заживление тканей через различные молекулярныепути 8. Предыдущие исследования in vitro показали, что витаминно-обогащённые формулы PRF могут модулировать профили высвобождения факторов роста, экспрессию воспалительных цитокинов и биомеханические характеристики фибриновой матрицы, что указывает на то, что витаминные добавки представляют собой эффективный способ биологической модификации PRF без изменения его аутологичнойприроды 9.
Кобаламин (витамин B12) и альфа-токоферол (витамин E) являются необходимыми микроэлементами, участвующими в ключевых биологических процессах, связанных с гомеостазом и восстановлением тканей. Витамин B12 играет ключевую роль в синтезе нуклеиновых кислот, клеточном метаболизме и эритропоэзе, а его дефицит связан с изменениями слизистой полости рта и распадом пародонтальнойткани 10,11. Витамин E функционирует как мощный антиоксидант, который ограничивает перекисление липид, снижает окисляющий стресс и способствует стабилизации коллагена и модуляции воспалительныхреакций 12,13. Важно, что хотя текущая работа основывается на предыдущих исследованиях, изучающих различные биологические и физиологические модуляторы PRF, текущее исследование вводит отдельный протокол, предназначенный специально для обогащения кобаламином и альфа-токоферолом перед центрифугированием. Соответственно, цель данного исследования — описать воспроизводимый протокол для приготовления обогащённых кобаламином и альфа-токоферолом PRF и оценить влияние этого биоактивного подхода к тонкой настройке на фактор роста и провоспалительное высвобождение цитокинов в условиях in vitro.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это экспериментальное исследование было проведено в соответствии с этическими принципами, изложенными в Хельсинкской декларации, и получило одобрение Комитета по этике клинических исследований Университета имени Чукуровой (Одобрение No 139/25; Дата:8 декабря 2023 года). Перед участием все участники были информированы о процедурах исследования, и от каждого участника получалось письменное информированное согласие. Все процедуры, связанные с человеческими образцами крови, проводились в соответствии с институциональными нормами биобезопасности. На протяжении экспериментального процесса использовались соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, маски и лабораторные халаты. Биологические материалы обрабатывались с помощью асептических методов, а все отходы утилизировались в соответствии с установленными протоколами управления биологическими опасностями. Все реагенты, расходные материалы и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов, включая данные производителя и соответствующие спецификации для обеспечения воспроизводимости.
1. Отбор участников
Участники были привлечены из системно здоровых взрослых в возрасте от 20 до 30 лет, которые продемонстрировали адекватное соответствие процедурам исследования. Лица с историей системных заболеваний, гематологических расстройств или состояний, известных как влияющие на функцию тромбоцитов или заживление ран, не считались подходящими. Дополнительные критерии исключения включали беременность или лактирование, текущее курение, недавние инфекции, известную гиперчувствительность к кобаламину или альфа-токоферолу, а также использование витаминных добавок или лекарств, которые могли нарушать активность тромбоцитов в течение предыдущих шести месяцев. Для снижения биологической вариабельности были зачислены только добровольцы с нормальными исходными гематологическими показателями, а все участники оценивались перед включением для обеспечения пригодности к подготовке к ПРФ. В качестве предварительного исследовательского клинического исследования в этом исследовании использовался размер выборки, основанный на возможности и доступности подходящих участников в течение периода, а также были проанализированы выборки двенадцати участников.
2. Анализ крови и распределение групп
Периферическая венозная кровь была взята у каждого участника с помощью стеклянных трубок объемом 10 мл без добавок в асептических условиях. Всего на каждого участника было получено пять трубок. Одна трубка была выделена для полного анализа анализов крови, а одна — для определения исходных уровней кобаламина и альфа-токоферола в сыворотке. Оставшиеся три трубки были назначены для приготовления фибрина, богатого тромбоцитами (PRF). Среди них одна трубка служила контрольной группой PRF без добавок, одна трубка получила кобаламин (1 мл) перед центрифугированием для получения PRF, обогащённого кобаламином, и одна трубка получила альфа-токоферол (0,5 мл) перед центрифугированием для получения PRF, обогащённого альфа-токоферолом. Кобаламин вводили в виде стерильного инъекционного раствора (1000 мкг/мл), а альфа-токоферол — в ампуле (2 мл). Все образцы были обработаны сразу после сбора крови, чтобы избежать преждевременного свертывания.
3. PRF подготовка
У каждого участника были собраны образцы периферической венозной крови с помощью стерильных стеклянных трубок без антикоагулянтов. Сразу после сбора трубки помещались в центрифугу и обрабатывались без задержек, чтобы предотвратить преждевременное свертывание. Центрифугирование проводилось при 2700 об/мин (708 × г) в течение 12 минут (при комнатной температуре) с использованием роторной системы с фиксированным углом. После завершения центрифугирования были обнаружены три различных слоя: нижняя фракция эритроцитов, верхний слой плазмы, бедный тромбоцитами, и промежуточный фибриновый тромб, представляющий собой фибрин, богатый тромбоцитами (PRF). Тромб PRF был аккуратно отделён от слоя эритроцитов с помощью стерильных инструментов и выделен для дальнейшей обработки. Для подготовки обогащённых групп PRF назначенные добавки вводились в образцы крови непосредственно перед центрифугированием в стандартизированных условиях. Этот подход позволил включать биоактивные соединения в развивающуюся фибриновую матрицу во время образования сгустков (см. рисунок 1).
Рисунок 1: Блок-схема, демонстрирующая методологический протокол получения образцов PRF. 1 мл кобаламина (A) и 0,5 мл альфа-токоферола (B) были добавлены в образцы крови перед центрифугированием. Полученный образец PRF получается в пробирках (C) и после отделения от слоя эритроцитов (D). Конечный PRF, обогащённый кобаламином (E) и PRF с альфа-токоферолом (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
4. Инкубация образцов PRF in vitro
Каждый сгусток PRF перемещался в стерильную трубку, а среда для клеточной культуры добавлялась в стандартизированном соотношении 1 мл на 1 г сгустка (1:1, v/w) для обеспечения равномерной среды диффузии во всех образцах. Трубки устанавливались на орбитальный шейкер и инкубировали при 37 °C в общей продолжительности 72 часа, чтобы облегчить постепенное высвобождение факторов роста и цитокинов из матрицы PRF. Супернатанты собирались через 24 часа и 72 часа, перемещались в стерильные микротрубки и хранили при −80 °C до дальнейшего анализа. Среда для культивирования клеток использовалась без добавления сыворотки, чтобы избежать вмешательства экзогенных факторов роста и гарантировать, что все измеренные биомолекулы происходят исключительно из матрици PRF.
5. Анализ фактора роста по ИФК
Концентрации фактора роста, полученного из тромбоцитов (PDGF), трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1), сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), фактора роста фибробластов-2 (FGF-2), интерлейкина-1β (IL-1β) и фактора некроза-α опухоли (TNF-α) в собранных супернатантах количественно измерялись с помощью ферментно-связанных иммунорбентных тестовых наборов согласно инструкциям производителя. Значения поглощения измерялись на 450 нм с помощью считывателя микропластин, а концентрации анализируемых веществ рассчитывались на основе стандартных калибровочных кривых.
6. Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием IBM SPSS Statistics for Windows (версия 20.0). Данные выражались в виде среднего ± стандартного отклонения и медианы (минимум–максимум), в зависимости от случая. Нормальность распределения данных оценивалась с помощью теста Шапиро–Вилка. Внутригрупповые сравнения между временными баллами проводились с помощью парного t-теста или теста Уилкоксона со знакомым рангом, а межгрупповые сравнения проводились с использованием анализа дисперсии с повторяющимися измерениями или теста Фридмана, в зависимости от необходимости. p-значение <0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешная подготовка контрольного, обогащённого кобаламином и альфа-токоферолом фибрина (PRF), богатого тромбоцитами (PRF), была достигнута у всех участников. Макроскопическое исследование подтвердило образование хорошо структурированных PRF-тромбов с сохраненной целостностью фибрина и достаточной механической стабильностью, что позволило стандартизировать обработку, инкубацию и последующие биохимические анализы (Таблица 1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящее исследование демонстрирует, что фибрин, богатый тромбоцитами (PRF), может быть биологически тонко настроен путём целенаправленного обогащения кобаламином и альфа-токоферолом перед центрифугированием, что приводит к чёткой и воспроизводимой модуляции профилей выделения факторов роста и цитокинов. Эти результаты подтверждают развивающееся представление о том, что PRF — это не просто пассивный аутологичный каркас, а биологически чувствительная матрица, регенеративное поведение кот...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Ни одного.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Альфа-токоферол (витамин E) | AKSU FARMA, Стамбул, Турция | A11HA03 | Ампула EVIGEN 2 мл |
| Центрифуга (40 градусов; ротор с фиксированным углом) | Процесс для PRF, Ницца, Франция | 913023410238 | Duo Centrifuge |
| Кобаламин (витамин B12) | DEVA HOLDING, Стамбул, Турция | B03BA01 | Ампула DODEX 1000 мкг/мл |
| Трубы Эппендорфа | Axygen | PCR-02-C | 200 штук |
| Стеклянные трубки для сбора крови | Хема и Tube (Стамбул, Турция) | HNM8080 | (10 мл) Без антикоагулянта |
| Решение HRP | Включено в комплект ELISA | ||
| Набор для ELISA для человека — FGF | Wuhan Fine Biotech | EH0541 | Fine Test |
| Человеческий набор ELISA — IGF-1 | Wuhan Fine Biotech | ER0030 | Fine Test |
| Человеческий набор ELISA — PDGF | Wuhan Fine Biotech | ER1240 | Fine Test |
| Набор для ИФФ для человека — TGFβ-1 | Wuhan Fine Biotech | EH0287 | Fine Test |
| Человеческий набор для ELISA — VEGF | Wuhan Fine Biotech | EH0327 | Fine Test |
| Человек IL-1 и бета; ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech | EH0185 | Fine Test |
| Человеческий TNF и альфа; ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech | EH0302 | Fine Test |
| Микропипетки и Советы | Эппендорф | 3123000063 | 1 Набор |
| Считыватель микропластин | Биохром | EZ Read 400 | 450 нм |
| Орбитальный встряхиватель | Стюарт | SSM3 | Мини-Гиро-Рок |
| Шкала точности | Сарториус | H51-D | 1 предмет |
| Среда для клеточной культуры RPMI-1640 | HyClone, Цитива, США | SH30027.01 | 500 мл |
| Стерильные ножницы | ASA Dental (Стамбул, Турция) | 0305-1 | 1 предмет |
| Стоп-решение | Включено в комплект ELISA | ||
| Раствор субстрата | Включено в комплект ELISA | ||
| Буфер для мойки | Включено в комплект ELISA |
Ссылки
- Dohan, D. M., Choukroun, J., Diss, A., Dohan, S. L., Dohan, A. J. J., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part I: technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).
- Miron, R. J., Zucchelli, G., Pikos, M. A., Salama, M., Lee, S., et al. Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry: a systematic review. Clin Oral Investig. 21 (6), 1913-1927 (2017).
- Kobayashi, E., Flückiger, L., Fujioka-Kobayashi, M., Sawada, K., Sculean, A., et al. Comparative release of growth factors from PRP, PRF, and advanced-PRF. Clin Oral Investig. 20 (9), 2353-2360 (2016).
- Choukroun, J., Diss, A., Simonpieri, A. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part IV: clinical effects on tissue healing. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e56-e60 (2006).
- Miron, R. J., Fujioka-Kobayashi, M., Bishara, M., Zhang, Y., Hernandez, M., Choukroun, J. Platelet-rich fibrin and soft tissue wound healing: a systematic review. Tissue Eng Part B Rev. 23 (1), 83-99 (2017).
- Ghanaati, S., Booms, P., Orlowska, A., Kubesch, A., Lorenz, J., et al. Advanced platelet-rich fibrin: a new concept for cell-based tissue engineering by means of inflammatory cells. J Oral Implantol. 40 (6), 679-689 (2014).
- Demirbilek, F., Alkaya, B., Ucak Turer, O., Yilmaz, M. B., Haytac, M. C., Ozcan, M. Enhancing platelet-rich fibrin: influence of hyaluronic acid and collagen on growth factor release and biomechanical properties in vitro. J Vis Exp. (222), e68693 (2025).
- Fawzy El-Sayed, K. M., Cosgarea, R., Sculean, A., Doerfer, C. Can vitamins improve periodontal wound healing/regeneration?. Periodontol 2000. 94 (1), 539-602 (2024).
- Ozcan, M., Topcu, B. E., Alkaya, B., Yilmaz, M. B., Ucak Turer, O., Haytac, M. C. Effects of ascorbic acid and cholecalciferol on growth factor release, cytokines, and biomechanical properties of platelet rich fibrin: in vitro. study. BMC Oral Health. 26 (1), 262 (2026).
- Kozlak, S. T., Walsh, S. J., Lalla, R. V. Reduced dietary intake of vitamin B12 and folate in patients with recurrent aphthous stomatitis. J Oral Pathol Med. 39 (5), 420-423 (2010).
- Alekhya, K., Muppirala, S. Oral manifestations of vitamin B12 (cobalamin) deficiency: a review. Int Healthc Res J. 3 (1), 9-15 (2019).
- Pavithra, R., Ramaprabha, G., Rajasekar, S., Lakshmi Sree, S. Vitamin deficiency and periodontal disease: a tie-in relationship. Sch J Appl Med Sci. 5 (1A), 74-81 (2017).
- Singh, N., Chander Narula, S., Kumar Sharma, R., Tewari, S., Kumar Sehgal, P. Vitamin E supplementation, superoxide dismutase status, and outcome of scaling and root planing in patients with chronic periodontitis: a randomized clinical trial. J Periodontol. 85 (2), 242-249 (2014).
- Miron, R. J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Optimization of platelet-rich fibrin. Periodontol 2000. 94 (1), 79-91 (2024).
- Miron, R. J., Estrin, N. E., Ahmad, P., Farshidfar, N., Fujioka-Kobayashi, M., et al. Thirty years of autologous platelet concentrates: from platelet-rich plasma to platelet-rich fibrin. J Periodontal Res. , (2025).
- Caruana, A., Savina, D., Macedo, J. P., Soares, S. C. From platelet-rich plasma to advanced platelet-rich fibrin: biological achievements and clinical advances in modern surgery. Eur J Dent. 13 (2), 280-286 (2019).
- Pietruszka, P., Chruścicka, I., Duś-Ilnicka, I., Paradowska-Stolarz, A. PRP and PRF-subgroups and divisions when used in dentistry. J Pers Med. 11 (10), 944 (2021).
- Dohan Ehrenfest, D. M., Bielecki, T., Jimbo, R., Barbé, G., Del Corso, M., et al. Do the fibrin architecture and leukocyte content influence the growth factor release of platelet concentrates? An evidence-based answer comparing a pure platelet-rich plasma (P-PRP) gel and a leukocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Curr Pharm Biotechnol. 13 (7), 1145-1152 (2012).
- Schär, M. O., Diaz-Romero, J., Kohl, S., Zumstein, M. A., Nesic, D. Platelet-rich concentrates differentially release growth factors and induce cell migration in vitro. Clin Orthop Relat Res. 473 (5), 1635-1643 (2015).
- Isobe, K., Watanebe, T., Kawabata, H., Kitamura, Y., Okudera, T., et al. Mechanical and degradation properties of advanced platelet-rich fibrin (A-PRF), concentrated growth factors (CGF), and platelet-poor plasma-derived fibrin (PPTF). Int J Implant Dent. 3 (1), 17 (2017).
- El Bagdadi, K., Kubesch, A., Yu, X., Al-Maawi, S., Orlowska, A., et al. Reduction of relative centrifugal forces increases growth factor release within solid platelet-rich-fibrin (PRF)-based matrices: a proof of concept of LSCC (low speed centrifugation concept). Eur J Trauma Emerg Surg. 45 (3), 467-479 (2019).
- Yaşar, N. &. #. 1. 9. 9. ;., Ünsal, G., Kocaelli, H. A., Orhan, K., Sağ, F. B. Comparative analysis of local application of titanium-platelet rich fibrin (T-PRF) and leukocyte-platelet rich fibrin (L-PRF) in bone defect healing: a micro-CT and histopathological study in rabbit models. Microsc Res Tech. 88 (7), 2073-2084 (2025).
- O'Leary, F., Samman, S. Vitamin B12 in health and disease. Nutrients. 2 (3), 299-316 (2010).
- Traber, M. G., Atkinson, J. Vitamin E, antioxidant and nothing more. Free Radic Biol Med. 43 (1), 4-15 (2007).
- Ozcan, M., Arçay Polat, G., Alkaya, B., Uçak Türer, O., Yilmaz, M. B., Haytac, M. C. Evaluation of circadian variation in growth factors of platelet-rich fibrin: a pilot study. J Vis Exp. (224), e68902 (2025).
- Ozcan, M., Ciritci Kabaklı, S., Alkaya, B., Isler, S. C., Ucak Turer, O., Oksuz, H., et al. The impact of local and systemic penicillin on antimicrobial properties and growth factor release in platelet-rich fibrin: in vitro. study. Clin Oral Investig. 28 (1), 61 (2024).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.