Интегрированный метод моделирования фототромботического инсульта и in vivo optrode записи нейронной и астроцитной активности у мышей с поведением

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает интегрированный метод, включающий доставку вирусов, имплантацию оптрода, фототромботическую индукцию, одновременное учёта активности астроцитов и нейронов, а также оптогенетическую стимуляцию астроцитов. Этот интегрированный метод направлен на одновременное исследование взаимосвязи между астроцитами и нейроном на стадии ишемического инсульта от острого до хронического периода.

Аннотация

Изучение динамики астроцит-нейронов после ишемического инсульта крайне важно для понимания механизмов восстановления после инсульта. Однако современные методологии часто не отражают взаимодействия нейронов и астроцитов в реальном времени у животных, выполняющих конкретные поведенческие задачи, что ограничивает наши возможности исследовать острую фазу патологии инсульта. Этот протокол представляет интегрированный метод, сочетающий фототромботическое моделирование инсульта с одновременной многоканальной электрофизиологией и фотометрией волокон в бодрствующем состоянии, при этом мыши ведут себя с использованием специально изготовленного опроуда. Протокол включает индукцию фокальной ишемии посредством фототромбоза с последующим одновременном записыванием нейронных всплесов и астроцитных кальциевых транзиентов. Оптрода позволяет одновременно проводить фототромбоз, запись кальциевых сигналов и оптогенетическую манипуляцию без необходимости отдельных хирургических вмешательств. Репрезентативные результаты подтверждают успех одновременной фиксации астроцитного кальциевого сигнала и нейронных скачков. Оптогенетическая манипуляция астроцитами приводит к измеримым изменениям в паттернах возбуждения нейронов (снижение частоты активации пирамидальных нейронов на 1,55 ± 0,45 Гц и интернейронов на 3,64 ± 1,37 Гц по сравнению с преоптогенетической стимуляцией, n = 2), подтверждая, что система способна исследовать взаимодействия астроцитов и нейронов. Этот интегрированный подход устраняет критические пробелы в методологии исследований инсульта, предоставляя мультимодальные записи в реальном времени от острой до хронической стадии инсульта у животных с поведением.

Введение

Ишемический инсульт остаётся основной глобальной проблемой здравоохранения, являясь ведущей причиной как смертности, так и долгосрочной приобретённой инвалидности во всём^{мире 1,2,3}. Высокий уровень инвалидности, связанный с ишемическим инсультом, связан с разнообразными клиническими симптомами — от моторного паралича и сенсорной потери до когнитивных^{нарушений 4,5,6}. Существует острая необходимость глубже понять патологические и восстановительные механизмы ишемического инсульта на этапе восстановления. Помимо нейронной недостаточности, недавно было отмечено катастрофическое разрушение^{астроцитов 7,8}. Астроциты, самые многочисленные глиальные клетки, являются важной частью центральной нервной системы, а также трёхчастного синапса. В каждой фазе ишемического каскада астроциты играют незаменимую роль и глубоко влияют на восстановление нейронов и^{функционала 9,10,11}. В здоровом мозге астроциты и нейроны функционально связаны через трёхчастный синапс, где астроцитные процессы покрывают пре- и постсинаптические терминалы и активно участвуют в синаптической^{передаче 7,8}. Астроциты регулируют концентрации внеклеточного глутамата с помощью возбуждающих аминокислотных транспортеров, поддерживают гомеостаз калия через каналы Kir4.1 и модулируют синаптическую силу за счёт высвобождения глиотрансмиттеров с помощью кальциозависимого экзоцитоза ^7,8. В этом контексте астроцитные внутриклеточные кальциевые транзиенты представляют собой астроцитную активность и тесно связаны с нейронным^{активированием 7}. Во время ишемического инсульта эта тонко настроенная связь быстро нарушается. Коллапс ионных градиентов после энергетического отказа вызывает массовое высвобождение глутамата и распространение деполяризации, что приводит к эксайтотоксическому повреждению нейронов и пролиферации реактивных^{астроцитов 12}. Астроциты в инфарктном ядре и вокруг него подвергаются цепочке патологических изменений, включая перегрузку кальцием, нарушение обратного поглощения глутамата, потерю синапсной связи и сбой выпуска^{глиомедиатора 13}. Одновременно активность нейронов резко подавляется, поскольку нейроны теряют жизнеспособность и целостность^{мембранного потенциала 14,15}. В периинфарктной зоне выжившие нейроны и реактивные астроциты участвуют в динамических взаимодействиях, которые считаются ключевыми для определения исхода восстановления после инсульта; Однако электрофизиологические и кальциевые корреляты этого взаимодействия в реальном времени у бодрствующих, ведущих себя животных остаются плохо^{охарактеризованными 13,16}. Таким образом, понимание астроцитовой активности рядом с нейронными сигналами считается краеугольным камнем восстановления нейронных функций после ишемического повреждения.

Фототромбоз — широко используемая ишемическая модель; Он использует светочувствительный краситель и локализованный свет для индуцирования ишемических поражений в определённых целевых областях¹⁷. Современные протоколы моделирования и регистрации инсульта затрудняют исследование взаимодействия астроцитов и нейронов после инсульта тремя основными техническими узкими^{местами 17, 18 и 19}. Сегрегация моделирования и записи является распространённым недостатком большинства современных протоколов, вызывая временной разрыв между созданием модели и записью сигналов^{в реальном времени 20,21}. Однако от минут до часов после ишемического инсульта — это важный период, в течение которого как нейроны, так и астроциты подвергаются резким^{колебаниям 12,22}. Без одновременного мониторинга взаимодействия астроцитов и нейронов сразу после ишемического инцидента исследование эффективного раннего вмешательства при ишемическом инсульте будет сильно затруднено. Дополнительное ограничение существующих протоколов заключается в изоляции методов записи; Большинство современных методологий оптимизированы для одного типа сигнала. Например, многоканальная электрофизиология позволяет обнаруживать возбуждение нейронов и локальные полевые потенциалы (LFP), но не замечает сигнальных состояний глиальных^{клеток 15,16}. Напротив, мониторинг динамики астроцитов через in vivo. кальциевые изображения фиксируют астроцитные флуктуации, но не содержат данных о воздействии нейронов. Последним узким местом в текущих протоколах, по-видимому, является статус записи животного; В большинстве протоколов животное анестезируется или находится в свободном движении. Однако моторная дисфункция считается одним из самых проблемных последствий инсульта; Понимание связи между определённым поведением и событиями астроцит-нейрон крайне важно. Поэтому существует острая необходимость в интегрированном методе, способном выполнять модель фототромботического инсульта, одновременно фиксируя как астроцитные, так и нейронные сигналы у бодрствующих мышей, проводящих определённые поведенческие тесты. Существующие методологии охватывают лишь часть этих требований. Двухфотонная кальциевая визуализация обеспечивает исключительное пространственное разрешение динамики астроцитарных микродоменов в целостном мозге, но требует фиксации головы или анестезии животных, что исключает натуралистическую поведенческую оценку и не может одновременно фиксировать многоканальные данные нейронных^{спайков.} Автономная фотометрия волокна позволяет контролировать астроцитный кальций у свободно ведущих себя животных, но при этом остаётся слепой к нейронным паттернам активации, не обеспечивая электрофизиологического показания функции^{цепи 16}. Многоканальная внеклеточная электрофизиология разрешает скачущую активность нейронных единиц и локальных полевых потенциалов с высоким временным разрешением, но не даёт информации о сигнальном состоянии^{астроцитов 15}. Однако ни один из этих подходов не может одновременно вызвать точно локализованный фототромботический инсульт и провести мультимодальную запись с одного и того же анатомического участка без прерываний.

Для устранения существующих технических ограничений мы предлагаем эту интегрированную систему. Эта система решает все три ограничения в рамках одного хронически имплантированного устройства, обеспечивая одновременное индукцию фототромбоза, запись астроцитного кальция с помощью волоконной фотометрии и многоканальную нейронную электрофизиологию у бодрствующих, свободно ведущих себя мышей — от момента инсульта до хронических фаз инсульта. Осуществимость этого метода подтверждается хронической имплантацией специально изготовленного оптрода в мозг мышей с индикатором кальция, специфическим для астроцита, и оптогенетическим вирусным вектором. С помощью этого метода одновременно регистрируются и анализируются астроцитные кальциевые транзиенты и активность нейронов во время поведенческих задач и при оптогенетической модуляции.

Протокол

Этот протокол получил одобрение Комитета по уходу и использованию животных при Гуанчжоуском университете китайской медицины (00379474) и проводился в соответствии с руководящими принципами и нормативами, разработанными Руководством Национального института здоровья по уходу и использованию лабораторных животных. Были реализованы все возможные меры для минимизации количества животных, используемых в этом исследовании.

1. Доставка вирусных векторов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается стереотаксичное введение специфических для астроцитов AAV-векторов в моторную кору (M1FL). Цель состоит в обеспечении стабильной, специфичной для астроцитов экспрессии как кальциевого индикатора GCaMP6, так и оптогенетической конструкции опто-vTRAP до имплантации оптрода. Основное необходимое оборудование: стереотаксичный каркас, цифровая верньерная система, стеклянная микропипетка и микроинфузионный насос.

1. Поместите мышь в индукционную камеру; Начинайте индукцию анестезии с 3%–4% изофлурана, и концентрацию изофлурана можно увеличить до максимума 5% в первую минуту, пока мышь не перестанет реагировать.
   ВНИМАНИЕ: Изофлуран — летучий анестетик. Выполняйте все процедуры при активной вентиляции. Избегайте длительного личного контакта.
2. Перенесите мышь в стереотаксичную раму с анестезиологической маской, и используйте 1–2% изофлуран для поддержания глубокой анестезиологической плоскости.
3. Проверяйте глубину анестезии каждые 10 минут с помощью ритма дыхания, пальпебрального рефлекса и защемления пальцев. Поддерживайте температуру тела мыши на уровне 36–37,5 °C с помощью подогреваемой подушки с обратной связью.
4. Нанесите глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить повреждение роговицы во время операции.
5. Закрепите мышь на стереотаксичной раме с ушными планками и планкой для рта. Отрегулируйте наушники, чтобы головка мыши была симметрично фиксирована. Убедитесь, что голова обездвижена аккуратным исследованием.
6. Тщательно удаляйте волосы с помощью депиляционного крема и сделайте разрез по средней линии хирургическими ножницами, чтобы обнажить череп. Очистите надственное тело физиологическим раствором и ватными палочками, чтобы обнажить Брегму и Лямбда.
7. Опустите стеклянную микропипетку, чтобы соприкасаться с Брегма и Лямбда последовательно; обратите внимание на Z-координату на цифровом вернье. Отрегулируйте ротовую планку, чтобы разница составила <0,04 мм.
8. Опустите стеклянную микропипетку, чтобы соприкоснуться с Брегмой, и сбросьте цифровой верньер на ноль. Переместите микропипетку на 2,3 мм влево и вправо от Брегмы последовательно; обратите внимание на Z-координату на цифровом вернье. Отрегулируйте наушные планки так, чтобы двусторонние разницы были <0,04 мм.
9. Сбросьте цифровой верньер на ноль в Брегме и отметьте кору мотора (M1FL; AP: +1,5 мм, ML: +0,74 мм). Используйте микродрель с сверлами диаметром 0,5 мм (круглый кончик), чтобы просверлить небольшое отверстие диаметром примерно 0,5 мм в отмеченном месте. Тщательно сверлите, чтобы избежать кровотечений и повреждения мозговой ткани; Капите ледяной физиологический раствор, чтобы компенсировать тепло, образующееся во время бурения.
10. Опустите стеклянную микропипетку, прикреплённую к микроинфузионному насосу, к целевой точке (DV: -0,94 мм от поверхности мозга). Перед загрузкой смешайте AAV9-GfaABC1D-GCaMP6 и AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP в равных объёмах, чтобы подготовить вирусную смесь. Вливайте 400 нл смеси (по 200 нл каждого вектора) со скоростью 50 нл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусный коктейль содержит: 200 нл астроцитарно-специфического кальциевого индикатора (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1,0 × 10¹³ vg/mL) и 200 nL специфического для астроцита оптогенетического вирусного вектора (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 10¹³vg/mL). Успешная астроцитарно-специфическая трансдукция была подтверждена у подгруппы животных с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания для GFAP, что подтвердило совместную локализацию флуоресцентного репортера с GFAP-положительными клетками и отсутствие экспрессии в клетках с GFAP-отрицательными клетками.
    ВНИМАНИЕ: AAV-векторы являются рекомбинантными биологическими агентами; Обрабатывайте все вирусные переносчики и отходы в соответствии с требованиями биобезопасности учреждения.
11. Оставьте пипетку на месте на 10 минут после завершения инфузии, чтобы обеспечить лучшую диффузию вируса и предотвратить обратный поток. Медленно вынимите пипетку, зашвите кожу головы (4-0, 20 мм, 3/8 круга) и положите мышь на грелку, пока она полностью не восстановится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной экспрессии вируса требуется период 3–4 недели. Подробная хронология протокола показана на рисунке 1A.

2. Осмотр оптроде и функциональная проверка

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед имплантацией изготовленный на заказ оптрода необходимо физически осмотреть и оптически проверить, чтобы подтвердить, что он способен передавать свет во всех трёх функциональных режимах (фототромбоз, оптогенетическая стимуляция и фотометрия волокон). Основное необходимое оборудование: микроскоп, оптический измеритель мощности и лазерные источники на 532 нм, 488 нм, 470 нм и 405 нм.

1. Физический осмотр оптроде:
   1. Поместите поддельный оптрод под микроскоп, чтобы осмотреть расположение мест записи.
   2. Убедитесь, что 16 вольфрамовых микропроводов равномерно связаны и окружают центральное оптическое волокно. Проверьте наличие согнутых или пересекающихся проводов, которые могут вызвать короткие замыкания.
   3. Убедитесь, что кончик оптического волокна короче вольфрамовых микропроводов (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптоволоконный наконечник должен быть утоплен на 100-200 мкм от наконечников^{электрода 23}. Это смещение, заимствованное у Lee и ^{др. 22}, обеспечивает достаточное покрытие светового конуса зону записи, предотвращая чрезмерный фотоэлектрический шум. Исследователей поощряют эмпирически проверять соответствующее смещение в рамках собственного оптрода.
2. Подключите оптическое волокно к источнику лазерного моделирования и записи. Используйте оптический измеритель мощности для измерения выхода на кончике волокна для следующих трёх функциональных режимов (рисунок 1B):
   1. Режим фототромботического моделирования: убедитесь, что система способна доставлять свет высокой интенсивности непрерывной волны (CW) (532 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используется волокно с NA 0.22. Оценочный диаметр освещённого пятна на расстоянии 100–200 мкм ниже кончика волокна составляет примерно 200–400 мкм. Убедитесь, что мощность на кончике достигает >20 мВт, чтобы обеспечить успешную активацию Rose Bengal и формирование тромба.
   2. Режим оптогенетической манипуляции: Проверьте импульсный лазерный выход (например, 488 нм для опто-vTrap).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Откалибруйте мощность на кончике до 10 мВт; он оптимизирован для активации опто-vTRAP на глубине записи 0,94 мм в моторной коре. Для других областей мозга рекомендуется поведенческая или электрофизиологическая проверка.
   3. Режим фотометрии волокна (запись кальция): Проверка низкомощного возбуждающего света (например, 470 нм и 405 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выход стабилен и поддерживается на очень низком уровне (<50 μW), чтобы минимизировать фототоксичность и фотоотбеливание индикатора кальция (например, GCaMP6) во время длительной записи.

3. Хроническая имплантация оптрода

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе рассматривается хирургическая процедура хронической имплантации оптрода в место инъекции вируса. Точное расположение координат инъекции критически важно для обеспечения того, чтобы записывающие электроды и оптоволокно пробирали пробы в области экспрессии GCaMP6 и опто-vTRAP. Основное необходимое оборудование: стереотаксичная рама, микродрель, щипцы, винты для краниопластики, агарозный гель и зубной цемент.

1. Для анестезии, стереотаксикальной фиксации, подготовки черепа и балансировки следует процедуре того же, что описано в разделе 1, за исключением того, что во время разреза на коже головы удаляют 1,5 см × 1,5 см кожи головы, при этом сохраняется достаточное количество кожи вокруг глаз.
2. Очистите череп перекисью водорода и 0,9% физиологическим раствором. Определите Брегму и сбросьте цифровой верньер на ноль.
3. Используйте сверло (0,8 мм, круглый кончик), чтобы слегка огрубить поверхность черепа для лучшей адгезии зубного цемента.
4. Отметьте кору мотора маркером (M1FL; AP: 1,5 мм, ML: 0,74 мм), затем используйте его как центральную точку для нарисования квадрата размером 5 мм × 5 мм (рисунок 1C).
   1. Используйте микродрель на подходящей скорости (около 10000 об/мин) и обведите квадрат. Во время бурения постоянно капите ледяной физиологический раствор на траекторию, чтобы компенсировать тепло, вырабатываемое при высокоскоростном бурении, и предотвратить повреждение мозговой ткани. Немедленно прекратите, если костный лоскут ослабнет (рисунок 1C).
5. Просверлите три небольших отверстия (диаметром 0,5 мм) над противоположным полушарием и мозжечком и вставьте в отверстия краниопластику. Убедитесь, что каждый винт достигает твердой мозговой поверхности, но избегайте дальнейшего проникновения и дополнительного вреда ткани мозга (рисунок 1C).
6. Используйте щипцы, чтобы снять костный лоскут, который был ослаблен ранее. Избегайте дополнительного давления вниз при удалении, чтобы предотвратить повреждение мозговой ткани и сохранить твердую мозговую опухлину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если происходит кровотечение, гемостатическая губка может быть использована для быстрого остановки кровотечения.
7. Используйте щипцы с ультратонким наконечником (<0,03 мм × 0,01 мм), чтобы удалить твердую матеру у окна черепа. Предотвратите прямое защемление кончика щипца в мозговую ткань во время этого процесса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления кости очень важно поддерживать влажную ткань мозга. Рекомендуется использовать стерильные ватные шарики, пропитанные физиологическим раствором, чтобы закрыть окно, когда не проводится процедура, чтобы избежать отёка и повреждения нейронов из-за сухости.
8. Закрепите оптроде к руке микроманипулятора стереотаксичной рамки и переместите его над окном черепа. Надёжно переплетайте серебристые и опорные провода оптрода с тремя винтами для краниопластики (рисунок 1C).
9. Очистите поверхность окна черепа стерильным физиологическим раствором, чтобы избежать кровотечений или тромбов, которые могли бы затруднить введение электродов. Постепенно опускайте оптроде до нужной глубины (DV: -0,94 мм) со скоростью 1 мкм/с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Открытая кортикальная ткань должна быть увлажнена стерильным физиологическим раствором во время имплантации.
10. После имплантации нанесите слой агарозы на окно черепа, чтобы защитить кортикальную ткань от зубного цемента.
11. Нанесите 3–4 слоя зубного цемента, чтобы покрыть открытый череп, убедившись, что весь оптрод закреплён. Вынимите мышь из стереотаксичной рамки, когда зубной цемент станет жёстким (рисунок 1C).
12. Дайте обезболивание в течение 3–5 дней и дайте мыши восстановиться в течение 1–2 недель перед записью и моделированием.

4. Фототромботическое моделирование и параллельная запись

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются поведенческая привычка, базовая запись, индукция инсульта фототромбозом и процедуры продольного записи после инсульта. Фототромбоз осуществляется через имплантированный оптрод, при этом одновременно ведутся электрофизиология и фотометрия волокон. Основное необходимое оборудование: роторный аппарат, измеритель прочности захвата, система фотометрии волокон, многоканальная нейронная запись, краситель Rose Bengal и лазерный источник с частотой 530 нм.

1. Пусть мышь пройдет поведенческое обучение перед моделированием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные содержались и протестировались в стандартизированных лабораторных условиях. Условия жилья: температура в комнате 20–25 °C, относительная влажность 50%–60%, при 12-часовом цикле свет/темнота (свет включен в 07:00). Животные имели свободный доступ к еде и воде на протяжении всего исследования. Все анализы и хирургические процедуры проводились в световой фазе. Сеансы поведенческой записи проводились в световой фазе в одинаковое время каждый день, чтобы минимизировать циркадные вариации нейронной активности и динамику астроцитного кальция. Корпус для записи также поддерживался при температуре окружающей среды 20–25 °C.
   1. Для ротародного теста пусть мышь работает непрерывно на вращающем стержене в течение 5 минут в течение трёх последовательных испытаний, при этом ротарод ускоряется с 4 до 40 об/мин за 5 минут.
   2. Для теста на силу хвата пусть мышь научится тянуть штангу передними лапами и выполнить три подряд попытки с колебаниями менее 10%.
2. Установите параметры сбора данных для фотометрии волокон.
   1. Используйте фотометрическую систему с двумя или тремя длинами волн для возбуждения индикатора кальция (например, GCaMP6). Для GCaMP6 установите сигнальный канал на 470 нм, а управляющий канал — на 405 нм, чтобы корректировать артефакты движения и автофлуоресценцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно повторно проверить мощность записывающего лазера, чтобы убедиться, что выход на кончике волокна составляет от 20 до 40 мкВт и избежать фотоотбеливания и фототоксичности.
   2. Установите частоту сбора дискретизации на уровне 60–100 Гц, что будет достаточно для захвата транзиентов астроцитного кальция.
3. Задайте параметры сбора данных для многоканальной электрофизиологии.
   1. Убедитесь, что все компоненты системы записи (включая устройство для теста на прочность рукоятки и клетку) правильно заземлены, чтобы снизить шум. Используйте общий медианный ориентир (CMR) во время записи, чтобы устранить глобальные артефакты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно проверить спектрограмму сигнала в системе записи, чтобы убедиться, что нет помех на линии электропередачи и минимизирован шум, вызванный артефактами движения. Крупные артефакты движения могут указывать на отказ винтов и фиксации заземляющего провода во время операции по имплантации.
   2. Убедитесь, что широкополосные и LFP-сигналы выбраны в программном обеспечении для записи, и отслеживайте наличие шума, возникающего во время сессии записи.
4. Проведите запись базовой линии.
   1. Кратковременно анестезировать изофлураном (в течение 60 секунд); Подключите Optrode к записывающей линии через адаптер.
   2. Поместите мышь в домашнюю клетку для записи и дайте 10 минут акклиматизации после пробуждения.
   3. Запись выполняется одновременно с тестом на силу хвата, мышь должна тянуть тест-планку раз в минуту в течение 5 минут.
   4. Убедитесь, что поведенческие тесты точно отмечены временем как в многоканальных, так и в оптоволоконных фотометрических системах для обеспечения выравнивания данных (рисунок 1D).
5. Установите фототромботическую модель.
   1. Введите 1,5% раствор красителя Rose Bengal внутрибрюшно (i.p.) в дозе 10–20 мг/кг, подождите 5 минут, пока краситель циркулирует по корковой сосудистой системе.
      ВНИМАНИЕ: Розовый бенгал — это краситель, способствующий фотосенсибилизации. Защитите реагент от яркого окружающего света. При обращении носите перчатки и защиту для глаз.
   2. Обезболить мышь изофлураном, следуя тем же параметрам индукции и поддержания, что описаны ранее.
   3. Когда мышь находится в глубокой анестезиологической плоскости и поддерживается с помощью анестезиологической маски, подключите оптический зонд оптрода к источнику лазера.
   4. Индуцировать фокальную ишемию, подая лазерный луч 530 нм с мощностью 15 мВт через имплантированный оптрод в течение 5–8 минут.
      ВНИМАНИЕ: Лазер 530 нм при 15 мВт опасен. Все исследователи должны носить лазерную защитную защиту глаз. Никогда не смотрите напрямую в кончик волокна во время фототромбоза.
6. Проведите запись после инсульта.
   1. Положите мышь на нагретую подкладку для восстановления. Когда мышь полностью проснулась (обычно в течение 10 минут), инициируйте первую острую запись после инсульта.
   2. Повторяйте запись каждый день для тщательного мониторинга прогресса заболевания.
7. Проведите оптогенетические манипуляции.
   1. Помимо записи кальциевых сигналов и излучения лазерного луча для ишемической индукции, оптрода также способна обеспечивать оптогенетическую стимуляцию, что показано в репрезентативных результатах (см. рисунок 4).
   2. Подключите оптогенетический лазерный стимулятор с правильной длиной волны и мощностью лазера (в данном случае это 488 нм, 10 мВт, 5 минут для опто-vTrap), и включите стимулятор для проведения оптогенетических манипуляций.

5. Мультимодальный конвейер анализа данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается рабочий процесс анализа для обработки многоканальных электрофизиологических данных (сортировка спайков), астроцитных кальциевых сигналов (расчёт ΔF/F) и кроссмодального выравнивания двух потоков данных. Требуемое программное обеспечение: Plexon Offline Sorter (офлайн-программное обеспечение для сортировки спайков), NeuroExplorer (программное обеспечение для анализа нейронных данных) и RWD OFRs (фотометрия волокон).

1. Сортировка нейронных спайков (система Плексон):
   1. Импортируйте сырые .pl2-файлы в офлайн-программу для сортировки spike. Примените цифровой высокополосный фильтр (<300 Гц) для выделения активности высокочастотных скачков.
   2. Установите порог напряжения (обычно -5 стандартных отклонений шума) для обнаружения потенциальных скачков.
   3. После ручного скрининга и аннулирования шумовых сигналов используйте функцию сканирования в офлайн-программном обеспечении сортировки спайков для проведения анализа основных компонентов (PCA) с целью группировки волн и сканирования различных кластеров^{нейронов 24}.
   4. Проверьте гистограммы межшиповых интервалов (ISI). Убедитесь, что у каждой «Единой единицы» уровень нарушения ISI составляет <1% (отражающий огнеупорный период). Коэффициент нарушения ISI отображается в левом верхнем углу каждого блока в офлайн-программном обеспечении для сортировки шипов.
   5. Экспортируйте отсортированные временные метки в программное обеспечение для анализа нейронных данных. Используйте функции гистограммы скорости и гистограмм по времени в программном обеспечении для анализа нейронных данных для создания скоростных гистограмм и гистограмм перистимульного времени (PSTH).
   6. Выведите среднюю длину волны и среднюю скорость воздействия каждой единицы из раздела статистики программного обеспечения для анализа нейронных данных для дальнейшего анализа.
2. Обработка астроцитных кальциевых сигналов (программное обеспечение для анализа фотометрии волокон)
   1. Откройте сырые флуоресцентные данные (канал 470 нм для сигнала и канал 410 нм для управления движением) в программном обеспечении анализа.
   2. В разделе предварительной обработки системы фотометрии волокон выполните 410 нм как управление коррекцией движения, установите коэффициент сглаживания на 8 и выберите PLS Fit в качестве базовой коррекции.
   3. Вычислите изменение флуоресценции (ΔF/F) по^{формуле 25}:
      
   4. Провести анализ кальциевых сигналов астроцитов на основе временных меток событий, извлечь пери-события для визуализации (например, тепловые карты и средние следы) и вычислить площадь под кривой (AUC).
3. Синхронизированная корреляция астроцит-нейрон
   1. Выровняйте нейронные скачки и кальциевые сигналы астроцитов, используя общий временной метку поведенческого события как нулевую временную метку.
   2. После извлечения перисобытийных данных выровняйте оба потока данных с этим общим временным нулем и визуализируйте корреляцию астроцит-нейрон (рисунок 3).

Результаты

Экспериментальная хронология

Рисунок 1 суммирует экспериментальные хронологии и ключевые хирургические ориентиры. Трёхнедельный интервал между вирусной инъекцией и имплантацией оптрода критически важен для достижения достаточной экспрессии GCaMP6s, и устойчивые астроцитные кальциевые сигналы должны быть подтверждены путём изучения фотометрии волокон в период записи перед индукцией инсульта.

Обсуждение

Описанный здесь интегрированный протокол представляет собой значительный прогресс в изучении взаимодействий астроцитов и нейронов во время прогрессирования ишемического инсульта. Сочетая фототромботическую индукцию с оптоэлектрофизиологическим мониторингом в реальном времени и оптогенетической манипуляцией, эта методология эффективно преодолевает разрыв между началом инсульта и наблюдением реорганизации нейронов и астроцитов на уровне цепи. Недавние исследования Бойса и др. продемонстрир...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diameter 0.005 mm & acute; 0.025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Customized with 16 tungsten electrode surrounding 1 optical fiber
Prism	GraphPad	5.01 version
R studio	Posit	version 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrocyte-specific calcium indicator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrocyte-specific optogenetic viral vector
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Photosensitive dye for thrombus induction/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Anesthesia machine for controllable inhalation anesthesia for mice