Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Интравитальная визуализация атенуированного ауксотрофного микобактерия туберкулёза в лёгких мышей во время ранней внутрисосудистой инфекции

104 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71019

⸱

30 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 2Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine, 6Cancer Dormancy Institute, Albert Einstein College of Medicine, 7Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол интравитальной визуализации атенуированной, одобренной BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. Перенапряжение мышиного легкого с помощью постоянного окна лёгких. Этот подход позволяет проводить продольный, одноклеточный анализ ранних взаимодействий хозяина и патогена, включая локализацию бацилляров, сосудистую динамику и поглощение макрофагов в одной и той же микросреде лёгких.

Аннотация

Интравитальная микроскопия позволяет напрямую визуализировать динамические клеточные процессы внутри целостных тканей. Однако её применение к Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ограничено требованиями по содержанию уровня биобезопасности 3 (BSL-3) и техническими трудностями стабилизации лёгких для высокоразрешающей визуализации. Здесь мы представляем протокол, который объединяет торакальное окно для высокоразрешающей визуализации лёгких мыши (WHRIL) с mc27902 — генетически определённым тройным ауксотрофным Mtb штаммом, одобренным для использования в условиях BSL-2. Мы также описываем генерацию mc28471, производного m2 7902, экспрессирующего tdTomato, его приготовление для внутривенного заражения и применение для интравитальной визуализации у репортерских мышей. Эта система позволяет в реальном времени визуализировать раннюю динамику инфекции, включая быстрое проникновение бакцилляров в лёгочную сосудистую систему, агрегацию, распространение в паренхиму лёгких и захват макрофагов в той же микросреде лёгких в течение первых трёх дней после заражения. Позволяя продольную визуализацию взаимодействия бацилл и хозяин-патоген с одноклеточным разрешением, этот подход преодолевает ключевые ограничения, связанные с традиционной визуализацией и моделями с высоким содержанием. Этот протокол предоставляет практическую платформу, совместимую с BSL-2, для интравитальной визуализации в реальном времени ослабленных микобактерий в легких и закладывает основу для механистических исследований бактериальной физиологии, распознавания хозяина и иммунно-опосредованного клиренса.

Введение

Высокоразрешающая интравитальная микроскопия изменила изучение динамического клеточного поведения в целостных тканях, позволив напрямую визуализировать миграцию клеток, сосудистые взаимодействия и иммунный надзор с разрешением одной клетки 1,2,3,4. Хотя эти подходы широко применяются в исследованиях рака 3,5, их применение при лёгочных инфекциях ограничено движением дыхательных путей, хрупкостью тканей и ограничениями по биобезопасности. Недавние достижения в платформах торакальной визуализации, включая вакуумно-стабилизированные и постоянно имплантированные оптические окна, решили многие из этих технических задач, обеспечивая стабильное, безподвижное изображение микросреды лёгких на длительном времени6, 7, 8 и 9 и 10. В частности, постоянно имплантируемые окна являются мощными инструментами, поскольку они позволяют многократно визуализировать сосудистый поток, динамику иммунных клеток и поведение отдельных клеток в течение нескольких часов или недель, а также сыграли ключевую роль в определении механизмов метастазирования рака, сосудистой проницаемости и иммунногонадзора 11,12.

Несмотря на эти достижения, интравитальная визуализация ранее не применялась для инфекции Mycobacterium tuberculosis (Mtb) в легких млекопитающих in vivo с одноклеточным разрешением. Ближайшие прецеденты связаны с интравитальной визуализацией микобактериальных инфекций в других условиях. Визуализация инфекции Mycobacterium marinum в эмбрионахданио-рерио-рерио-данио в реальном времени 13 выявила ранние взаимодействия макрофагов и инициацию гранулёмы, а двухфотонная визуализация гранулом БЦЖ в печенимыши 14,15 выявила динамику макрофагов и Т-клеток в процессе развития гранулемы и продемонстрировала ограниченную презентацию антигена и функцию эффектора Т-клеток в гранулематозных поражениях. Эти исследования заложили фундаментальные представления о взаимодействиях микоббактериального хозяина и патогена, но не получили доступ к целостному легкомумлекопитающему 8,16.

Интравитальные методы визуализации также применялись к лёгким в других инфекционных и биологических контекстах, включая общую лёгочнуювизуализацию 8, исследования показали, что патрулирование альвеолярных макрофагов может скрывать бактерии от иммуннойсистемы 17 и характеризует немедленный миелоидный ответ на инфекцию SARS-CoV-2 в лёгких человека16. Интравитальная визуализация аналогично применялась к легким, инфицированным гриппом, что позволяет напрямую визуализировать динамическое поведение иммунных клеток в инфицированной тканилёгких 18,19.

Методы оптической визуализации всего тела с использованием волоконно-оптической микроэндоскопической возбуждения20 и технологии флуоресценции репортерногофермента 21,22 позволили чувствительно обнаружить Mtb в лёгких мышей, но не могут обнаружить отдельные или небольшие кластеры бацилл, отслеживать динамику агрегации бактерий или визуализировать прямые взаимодействия между микобактериями и клетками хозяина внутри целостной ткани лёгких. Для инфицированных лёгких в условиях BSL-3 внедрены методы интравитальной визуализации с высоким содержанием, включая SARS-CoV-2 синфекцией 23 и мультифотонные платформы с фокусом наMtb 24. Эти исследования демонстрируют возможность визуализации заражённых лёгких под контролем, однако такие установки остаются технически сложными и не являются широко доступными. Работа с вирулентным Mtb требует изоляции BSL-3, что создаёт значительные инженерные и биобезопасность для интравитальнойвизуализации 23,24. В результате большинство исследований ранней инфекции Mtb опираются на статические конечные анализы, которые не могут отразить пространственную и временную динамику поведения бактерий в лёгких.

Разработка генетически определённых, одобренных BSL-2 тройных ауксотрофных Mtb штаммов предоставляет уникальную возможность преодолеть эти ограничения. Штамм mc27902, производный Mtb ауксотрофа Mtb из H37Rv, полностью атенуирован, не размножается у иммунокомпрометированных мышей, сохраняет классическое кислотно-быстрое окрашивание, обладает нормальной восприимчивостью к фагам и может безопасно работать вне установок BSL-325. Эти свойства делают mc27902 идеальным суррогатом для установления интравитальных методов визуализации и исследования ранних взаимодействий между хозяином и патогеном при снижении биобезопасности.

Здесь мы применяем окно для высокоразрешающей визуализации лёгких (WHRIL) с mc28471, флуоресцентным tdTomato-экспрессирующим производным тройного ауксотрофного Mtb штамма mc27902, чтобы визуализировать раннюю инфекцию Mtb в целом мышином лёгком. Эксперименты проводились на мышах с ослабленным иммунитетомRag2-/- 26, скрещённых с мышамиMacBlue 27, в которых промотор Csf1r стимулирует экспрессию усиленного цианового флуоресцентного белка (ECFP) в моноцитах, микроглиях и подгруппах дендритных клеток и макрофагов. Трансген MacBlue позволяет чётко визуализировать популяции мононуклеарных фагоцитов в ранних случаях заражения Mtb. Мы решили использовать мышей с дефицитом Rag2, чтобы сосредоточить систему на самых ранних врожденных взаимодействиях хозяина и патогена и избежать дополнительной сложности адаптивных иммунных ответов в короткое окно визуализации, рассмотренное здесь. Важно, что эта техника не ограничивается мышами с дефицитом Rag2 и может применяться и на иммунокомпетентных животных.

Объединяя постоянное окно лёгких с флуоресцентным атенуированным Mtb-штаммом, совместимым с BSL-2, эта платформа позволяет проводить серийную интравитальную визуализацию взаимодействий бацилл и клеток хозяина в одной и той же лёгкой микросреде с разрешением одной клетки в течение нескольких дней. Хотя платформа демонстрирована здесь для раннего заражения, сама платформа не ограничена ранними временными точками и, в принципе, может применяться на более поздних стадиях в зависимости от экспериментальной модели и дизайна исследования. Поскольку успешное применение этой платформы для визуализации зависит от использования конкретной флуоресцентной бациллярной подготовки, описанной здесь, мы включили основные шаги для генерации и подготовки этого реагента в состав полного протокола. Эта платформа обеспечивает прямую визуализацию поведения Mtb in vivo в реальном времени и закладывает основу для будущих механистических исследований бактериальной физиологии, распознавания хозяина и иммунно-опосредованного очищения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности и уходу за животными и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Колледжа медицины Альберта Эйнштейна (IACUC). Штамм mc28471 является преобразователем pYUB1169 из mc27902, тройного ауксотрофного штамма Mtb, одобренного для использования в BSL-2. Вся работа с живыми бактериями проводилась с использованием стандартных мер предосторожности при работе с микобактериями.

1. Строительство утверждённого BSL-2 штамма Mtb mc28471, экспрессирующего tdTomato.

  1. Генерация BSL-2-безопасного m2 8471, экспрессирующегоtdTomato, посредством плазмидного преобразования
    1. Преобразовать одобренный BSL-2 тройной ауксотрофный штамм mc27902 с эпизомной микобактериальной плазмидой pYUB1169, содержащей ген tdTomato, экспрессируемый промотором G13, для получения флуоресцентного производного mc28471.
    2. Инокулятируйте 100 мкл mc27902 (оптическая плотность при 600 нм (OD600 нм) 0,7-1,0) в 10 мл стерильного Middlebrook 7H9 с дополнением обогащения OADC (10% (v/v)), глицерилом (0,2% (v/v)), D-пантотенатом (24 мг/л), L-лейцином (50 мг/л), L-аргинином (200 мг/л), пропионатом натрия (0,1 мМ) и тилоксаполом (0,05% (v/v)) в бутылке объёмом 30 мл.
    3. Инкубировать культуру, медленно встряхивая (100 об/мин) при 37 °C, пока температура не достигнет OD600 нм от 0,7 до 1,0.
    4. Переместите ячейки в коническую центрифугную трубку объёмом 15 мл и проведите центрифугу на 10 минут при 3000 x г при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и снова суспензуйте клетки в 10 мл стерильного 10% глицерина с 0,05% (v/v) тилоксапола (wash #1). Повторяйте центрифугирование и промывку дважды. Суспензировать клеточную гранулу в 0,175 мл 10% глицерина с 0,05% (v/v) тилоксапола и добавить 2 мкл pYUB1169 ДНК (100-200 нг ДНК).
    5. Перенесите mc27902 и pYUB1169 в электропорационный кувет диаметром 0,2 см. Подожди 10 минут. Постукуйте по кювете 2–3 раза, чтобы удалить воздушные пузырьки, и электропорировать при 2500 мВ, 1000 Ω, 25 мФ, постоянной по времени 20 мс, при комнатной температуре.
    6. Добавьте 1 мл стерильного Middlebrook 7H9, дополненного обогащением OADC (10% (v/v)), глицерином (0,2% (v/v)), D-пантотенатом (24 мг/л), L-лейцином (50 мг/л), L-аргнином (200 мг/л), пропионатом натрия (0,1 мМ) и тилоксаполом (0,05% (v/v)) в кювету и перенесите содержимое кюветы в коническую центрифуговую трубку объемом 15 мл. Инкубировать трубку, встряхивая при 37 °C ночью.
    7. Пластина 0,1 мл преобразующей смеси на агарную пластину Middlebrook 7H10, дополненную обогащением OADC (10% (v/v)), глицерилом (0,2% (v/v)), D-пантотенатом (24 мг/л), L-лейцином (50 мг/л), L-аргинином (200 мг/л), пропионата натрия (0,1 мМ) и канамицином (20 мг/л). Центрифугуйте оставшуюся смесь трансформации, сбросьте 0,9 мл супернатанта и снова суспензуйте клеточную гранулу в остаточном супернатанте. Переместить вновь взвешенные клетки на вторую пластину Middlebrook 7H10 агар, содержащую те же добавки и антибиотики. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 3–4 недель. Розовые колонии указывают на успешные трансформанты.
    8. Выберите одну изолированную розовую колонию и выращивайте её при 37 °C, медленно встряхивая, в 5 мл стерильного Middlebrook 7H9, дополненного обогащением OADC (10% (v/v)), глицеролом (0,2% (v/v)), D-пантотенатом (24 мг/л), L-лейцином (50 мг/л), L-аргинином (200 мг/л), пропионатом натрия (0,1 мМ), тилоксаполом (0,05% (v/v)) и 20 мг/л канамицина в бутылке с чернильницей объемом 30 мл.
  2. Подготовка mc28471 для внутривенной инфекции
    1. Выращивайте 10 мл mc28471 при 37 °C, медленно встряхивая, в стерильном Middlebrook 7H9, дополненном обогащением OADC (10% (v/v)), глицерилом (0,2% (v/v)), D-пантотенатом (24 мг/л), L-лейцином (50 мг/л), L-аргинином (200 мг/л), пропионата натрия (0,1 мМ), тилоксаполом (0,05% (v/v)) и 20 мг/л канамицина в бутылке для чернильницы объемом 30 мл до средней фазы (OD600 нм должно быть от 0,7 до 1,0).
    2. Переместить ячейки в коническую центрифугную трубку объёмом 15 мл и провести центрифугу 10 минут при 3000 х г при комнатной температуре. Сбросить супернатант и вновь суспензировать клетки в 10 мл стерильного фосфат-буферного физиологического раствора, содержащего 0,05% (v/v) тилоксапола (PBS-T, промывка #1). Повторяйте центрифугирование и промывку дважды. Повторно суспензировать ячеточную гранулу в 4 мл PBS-T и сониковать элементы на мощности 100 Вт, 2x 1 000 Дж.
    3. Измерьте оптическую плотность посева и разведите её в PBS-T для конечной концентрации 5 x 106 CFU за одну инъекцию, используя приблизительное преобразование, что OD600 нм равна 1 x 108 CFU/mL. Поскольку эта зависимость может варьироваться в зависимости от деформации и условий роста, OD600 нм следует эмпирически калибровать по сравнению с покрытыми значениями CFU для обеспечения точности и воспроизводимости.

2. Постоянная имплантация окна лёгких у мышей для интравитальной визуализации

  1. Подготовьте мышь MacBlue Rag2KO для интравитальной визуализации. В этом исследовании использовался 10-недельный самец мыши весом 30 г. Однако для этой процедуры подходят мыши любого пола, в возрасте от 8 до 12 недель и в пределах ожидаемого веса для этого возраста. Этот штамм экспрессирует усиленный циановый флуоресцентный белок (ECFP) у макрофагов на фоне Rag2-нокаут и был получен путём скрещивания мышей B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 (Rag2, модель RAGN12) с мышами Tg (Csf1r-GAL4/VP16, UAS-ECFP)1Hume/J (запасной No 026051).
  2. Имплантируйте окно для высокоразрешающей визуализации лёгких (WHRIL) за 24 часа до бактериальной инфекции, чтобы обеспечить стабильный оптический доступ к лёгкому и обеспечить восстановление до проведения визуализации.
  3. Индуцировать анестезию с 5% изофлураном в индукционной камере. Убедите достаточную глубину анестезии перед началом любой процедуры и наблюдайте за животным во время операции и визуализации, чтобы предотвратить боль, дискомфорт или нарушение дыхания.
  4. Введите предоперационную анальгезию: подкожно вводите 10 мкл (0,1 мг/кг) бупренорфина, разбавлённого в 90 мкл стерильного PBS.
  5. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы во время наркоза.
  6. Завяжите швом из шва 2-0 вокруг основания катетера на 22G, оставив хвосты длиной ~2 дюйма для закрепления катетера.
  7. Интубируйте мышь катетером, завязанным швами. Визуализируйте отверстие трахеи с помощью трансосвещения и подтвердите его расположение с помощью надувной лампы (двусторонний подъём грудной клетки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: неправильная интубация может привести к травме дыхательных путей или недостаточной вентиляции. Продолжайте только после того, как правильное расположение подтверждено двусторонним расширением груди.
  8. После успешной интубации закрепите катетер, закрепив шелковый шов размером 2-0 вокруг морды. Подключите катетер к аппарату искусственной вентиляции.
  9. Поместите мышь в правый боковой декубитус на нагреваемую хирургическую платформу, чтобы открыть левую грудную клетку, затем закрепите передние, задние конечности и спину скотчем, чтобы сохранить стабильное положение на протяжении всей процедуры.
  10. Уменьшите дозу изофлурана до 3% на оставшуюся часть операции. Удалите волосы с левой верхней части груди с помощью депиляционного крема.
  11. Подготовьте хирургическое поле с помощью антисептического раствора. Поднимите кожу и сделайте круглый разрез диаметром 5–10 мм с биопсийным пуншом (33-35-SH) примерно в 7 мм левее грудины и на 7 мм выше подреберного края, по центру над 6–7-м межреберным пространством.
  12. Осмотреть открытое поле на наличие поверхностных сосудов. Если необходимо деление видимого сосуда, прижглите оба конца для поддержания гемостаза. Удалите поверхностные мягкие ткани, чтобы чётко обнажить рёбра перед входом в грудную полость.
  13. Захватите и поднимите 6-е или 7-е ребро щипцами, а затем аккуратно проколите межреберную мышцу между ними тупыми микродисекционными ножницами (округлая сторона, обращённая к лёгкому), чтобы войти в грудную полость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Войдите в грудную полость аккуратно и под прямой визуализацией, чтобы избежать разрывов лёгких, межреберных сосудов или окружающих тканей.
  14. Примените короткие, мягкие вспышки сжатого воздуха в межреберном отверстии, чтобы временно сдуть прилегающую поверхность лёгких и отделить её от грудной стенки перед созданием оконного отверстия.
  15. Разместите биопсийный пуансон на режущем инструменте и проведите режущий инструмент через межреберное отверстие, удерживая его параллельно грудной стенке. Пробьите 5-мм круглый дефект в грудной клетке.
  16. Наместите шов из шелкового кошелька с ниткой 5-0 на расстоянии ~1 мм от края круглого дефекта, проходя между соседними рёбрами, чтобы окружить отверстие.
  17. Поставьте оконную раму так, чтобы края дефекта грудной стенки вписались в канавку рамы, затем затяните и закрепите шов сумочной шнурки, чтобы зафиксировать раму на месте.
  18. Загрузите цианоакрилатный гель-клей в шприц объемом 1 мл. Аккуратно поднимите раму, чтобы отделить её от лёгкого, затем нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на нижнюю поверхность каркаса.
  19. Высушите поверхность лёгких с помощью непрерывного, мягкого потока сжатого воздуха, пока поверхность не станет матовой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только мягкий поток воздуха и избегайте длительного сушения, так как чрезмерная нагрузка или чрезмерное высыхание могут повредить поверхность лёгких и ухудшить прилипывание окна.
  20. С помощью положительного конечного выдохового давления (PEEP) надуйте лёгкое, а затем прикрепите окно к рамке. Освободите PEEP и держите давление на оконную раму 20-30 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточное давление при надувании или установке рамы может повредить лёгкое или повредить герметичность. Прикладывайте минимальное давление для достижения мягкой апозиции.
  21. Наместите второй шов из шелковой сумочки размером 5-0 <1 мм от края разреза кожи. Заправьте кожу под раму, убедитесь, что лишняя кожа задержана под оконной рамой или подстрижена, затем плотно зафиксируйте шов из сумочки и крепко завяжите.
  22. Используя вакуумный звукосниматель, нанесите очень тонкий слой клея на нижнюю сторону 5-мм накладного стекла, соскребая излишки с края прямоугольного стекла. Снова сушите поверхность лёгких непрерывным, мягким потоком сжатого воздуха.
  23. Разместить круглый накладной спуск в углублении оконной рамы под малым углом (~15°) над поверхностью лёгких. Кратко увеличьте давление в дыхательных путях, чтобы надуть лёгкое, затем поверните накладку в параллельное положение так, чтобы поверхность лёгких была противоположна нижней стороне стекла. Поддерживайте мягкое давление примерно 25 секунд, пока клей затвердевает, затем отсоедините вакуумный датчик от накладки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте задержки пузырьков и нанесения избытка клея при размещении накладки на покрытие, так как это может снизить качество изображения, нарушить герметичность или повредить поверхность лёгких.
  24. Нанесите небольшое количество жидкого цианоакрилата на границе между накладкой и металлической рамой, чтобы укрепить герметичное уплотнение.
  25. Прикрепите стерильную иглу к шприцу на 1 мл инсулин. Введите иглу чуть ниже отростка ксифовидного отростка и продвигайте к левому плечу через диафрагму в грудную полость. Аккуратно аспирируйте, чтобы удалить остатки внутригрудного воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно продвигайте иглу, чтобы не проколоть лёгкое, сердце или крупные сосуды. Вдыхайте воздух аккуратно и только до тех пор, пока не будет удален остаточный воздух.
  26. Отключите изофлуран и продолжайте вентиляцию с 100% кислородом, пока почти не восстановится почти нормальная частота дыхания в бодрствованном состоянии. Не оставляйте животное без присмотра во время восстановления. Если нормальное спонтанное дыхание не возобновится своевременно, обеспечьте соответствующую поддерживающую помощь или усыпьте в соответствии с институциональными рекомендациями.
  27. Снимите закрепляющий шов, экстубуйте мышь и поместите её в чистую, тёплую клетку для восстановления. Следите за животным, пока оно не станет полностью передвигаться; Мышей, не восстанавливающим нормальное дыхание, следует эвтаназировать согласно институциональным рекомендациям.
  28. Введите послеоперационную анальгезию: введите 10 мкл (0,1 мг/кг) бупренорфина, разбавленного в 90 мкл стерильного PBS, подкожно.

3. Интравитальная визуализация

  1. Дайте мышам восстановиться после установки окна перед визуализацией. Проведите визуализацию через 1–5 дней после операции.
  2. Индуцировать анестезию с помощью 3% изофлурана, затем поддерживать 1,5% на время проведения визуализации.
  3. Вставьте индивидуальный адаптер ступени между кожей и внешним краем рамы легкого окна и закрепите стандартную пластину микроскопа с помощью клейкой ленты.
  4. Поместите мышь с адаптером для кастомной пластины-окна, прикреплённым к этапу трансляции микроскопа. Поддерживайте температуру тела на уровне ~37 °C с помощью камеры с принудительным подогревом воздуха с обратной связью датчика температуры.
  5. Когда мышь находится на сценической пластине, аккуратно оттяните кожу вокруг глаза со стороны инъекции, чтобы обнажить медиальный кантус, и введите FITC-декстран (150 кДа; 20 мг/мл, 100 мкл) ретро-орбитально, чтобы маркировать сосудистую систему.
  6. Получите снимки, z-стек или таймлапс-изображения сосудистых органов лёгких перед бактериальной инъекцией, используя следующие параметры.
    1. Для настроек конфокальной микроскопии: Битовая глубина: 12 бит, Частота кадров: 2 кадра в секунду, Размер изображения: 512 × 512 пикселей, Размер пикселя: 0,497 мкм/пиксель, 0,994 мкм/пиксель, Z-шаг: 2 мкм, Общая z-глубина: 50–70 мкм, Средняя частота кадра: 3, Скорость сканирования: 2 мкс/пиксель (977 строк/с), Длины волн возбуждения лазера: 405 нм, 488 нм, 559 нм, Мощность лазера на образце: 230 мкВт (405 нм), 75 мкВт (488 нм), 40 мкВт (559 нм), фильтры обнаружения: 430-470 нм (синий), 505-540 нм (зелёный), 575-675 нм (красный), усиление детектора: 800 В для синего, 650 В для зелёного, 700 В для красного, диаметр отверстия: 60 мкм или 1 единица Эйри для 559 нм
    2. Для мультифотонной микроскопии используйте те же параметры визуализации, что и для конфокальной микроскопии, за исключением того, что на образце применялся возбуждающий лазер с мощностью 25 мВт на образце.
  7. Ретро-орбитально вводят 5 x 106 CFU tdТомат-экспрессирующий mc28471.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ретро-орбитальные инъекции выполняйте только при соответствующей подготовке и сдержанности, так как неправильная техника может привести к повреждению глаз, кровотечению или неудаче введения прививки.
  8. Получить снимки, z-стек и таймлапс-изображения туберкулёза и флуоресцентно маркированных клеток и сосудов, используя параметры визуализации из 3.6.1 и 3.6.2. Отрегулировать усиление всех детекторов для максимизации сигнала, избегая насыщения детектора.
  9. После съёмки отключите изофлуран и уберите мышь из микроскопа. Держите мышь в тепле и следите за её до полного восстановления.
  10. Повторная визуализация в следующие моменты после инъекцииmc 28471: 0-60 минут, 6 часов и 3 дня. Для каждой сессии визуализации повторно вводите FITC-декстран (100 мкл, ретро-орбитально) для визуализации сосудистой системы, затем получайте изображения, описанные в шагах 3.8–3.9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После электропорации и отбора канамицина изолированные колонии mc28471 проявили ярко-красную флуоресценцию, что подтвердило стабильное выражение tdTomato. MC28471 бациллы были расширены, подготовлены в виде одноклеточной суспензии и введены внутривенно мышам с хирургически имплантированным WHRIL. Была проведена интравитальная визуализация для визуализации ранней динамики инфекции Mtb в микросреде лёгких. Для этого исследования были получены базовые изображения сосуд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта платформа устраняет реальный пробел в исследованиях туберкулёза, позволяя напрямую визуализировать взаимодействия бацилл и хозяина в целом лёгком млекопитающих при условиях BSL-2. Ранее применялись стратегии in vivo визуализации, включая оптическое обнаружение всего тела с помощью волоконно-оптической микроэндоскопической возбуждения20, репортерную флуоресцентнуювизуализацию 21 и ближний инфракрасный флуоресцентный протеин-эксп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах или других конфликтах интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана следующими грантами: AI26170; Фонд семьи Эвелин-Липпер и Центр биофотоники Грусс Липпер. Мы признаём поддержку от Центра аналитической визуализации, поддерживаемой грантом NCI Cancer Center P30 CA013330.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл конусная пробиркаCorning430790
2-0 шелковый узел Ethicon, IncLA55G
5 мм покровное стеклоElectron Microscopy Sciences72296-05
5 мм одноразовый биопсионный пункционерIntegra33-35-SH
5-0 шелковый портной шов Ethicon, Inc640G
Тупые микрохирургические ножницыRobozRS-5980
БупренорфинHospira0409-2012-32Инъекция 10 мкл бупренорфина (рабочий раствор 0,3 мг/мл) разбавленного в 90 мкл стерильного PBS (конечная доза = 0,1 мг/кг) 
Баллон с сжатым воздухомFalconDPSJB-12
Цианоакрилатный клейLoctite234790
D-кальция пантотенатAcros243305000
Система электропорации ECM 630 Полная, с ограничивающим столикомBTX Harvard Apparatus45-0051
Электропорационная кюветаFisher ScientificFB102
FITC-дексранSigma-AldrichFD150S-1G150 кДа
ГлицеринFisher ChemicalsG33-1
Пинцет ГраефеRobozRS-5135Для захвата и поднятия ребра во время процедуры установки окна легких
Иофлуран Pivetal78949580
Иофлуран испарятельSurgiVetVCT302
КанамицинGoldbio.comK-120-25
L-аргинин моногидрохлоридSigma-AldrichA5131-100G
L-лейцинSigma-AldrichL8000
Маки BlueJackson LabsStrain #: 026051
Агар Middlebrook 7H10Difco262710
Бульон Middlebrook 7H9Difco271310
Средство для обогащения Middlebrook OADCBecton Dickinson 212351
Муринный вентиляторKent ScientificPS-02PhysioSuite
NairChurch & Dwight Co., Inc.40002957
PBSCorning21-031-CV
Бутылка для смеси PETGThermo Scientific342020
PhysioSuiteKent ScientificPS-5623Для контроля тидального объема мыши посредством интубации во время операции
Плазмида pYUB1169Кастомная плазмида
Мыши Rag2 KOJackson LabsStrain #: 008449
Мелкая нагнетательная губка для легкихHarvard Apparatus72-9083
Пропионат натрияThermo ScientificA17440.36
Ультразвуковой омниксFisher ScientificFB705
Центрифуга Sorval X pro seriesThermo Scientific75009020
Спектрофотометр Genesys 10 UVThermo Spectronic335903
SurgiSuiteKent ScientificSURGI-M02Многофункциональная хирургические платформа для мышей с нагревом
Трахеальный катетерExelint International2674622G
ТилоксапольSigma-AldrichT0307-50G
Металлическая щуповая система вакуумного захвата Ted Pella, Inc.528-112

Ссылки

  1. Scheele, C., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-26 (2022).
  2. Niesner, R. A., Hauser, A. E., Entenberg, D. Life Through a Lens: Technological Development and Applications in Intravital Microscopy. Cytometry A. 97 (5), 445-447 (2020).
  3. Perrin, L., Bayarmagnai, B., Gligorijevic, B. Frontiers in Intravital Multiphoton Microscopy of Cancer. Cancer Rep (Hoboken). 3 (1), e1192(2020).
  4. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  5. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  6. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).
  7. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J Vis Exp. (116), e62761(2016).
  8. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  9. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  10. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917(2014).
  12. Prunier, C., Chen, N., Ritsma, L., Vrisekoop, N. Procedures and applications of long-term intravital microscopy. Methods. 128, 52-64 (2017).
  13. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  14. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  15. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  16. Magnen, M., et al. Immediate myeloid depot for SARS-CoV-2 in the human lung. Sci Adv. 10 (31), eadm8836(2024).
  17. Neupane, A. S., et al. Patrolling Alveolar Macrophages Conceal Bacteria from the Immune System to Maintain Homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125.e11 (2020).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. van de Wall, S., et al. Dynamic landscapes and protective immunity coordinated by influenza-specific lung-resident memory CD8(+) T cells revealed by intravital imaging. Immunity. 57 (8), 1878-1892.e5 (2024).
  20. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensitivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with beta-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. 10 (6-7), 821-829 (2017).
  21. Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J Vis Exp. (132), e56801(2018).
  22. Sommer, R., Cole, S. T. Monitoring Tuberculosis Drug Activity in Live Animals by Near-Infrared Fluorescence Imaging. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01280-19(2019).
  23. Castanheira, F. V. S., et al. Intravital imaging of three different microvascular beds in SARS-CoV-2-infected mice. Blood Adv. 7 (15), 4170-4181 (2023).
  24. Barlerin, D., et al. Biosafety Level 3 setup for multiphoton microscopy in vivo. Sci Rep. 7 (1), 571(2017).
  25. Vilcheze, C., et al. Rational Design of Biosafety Level 2-Approved, Multidrug-Resistant Strains of Mycobacterium tuberculosis through Nutrient Auxotrophy. mBio. 9 (3), e00938-18(2018).
  26. Shinkai, Y., et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell. 68 (5), 855-867 (1992).
  27. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  28. Cohen, S. B., et al. Alveolar Macrophages Provide an Early Mycobacterium tuberculosis Niche and Initiate Dissemination. Cell Host Microbe. 24 (3), 439-446.e4 (2018).
  29. Pandey, A. K., Sassetti, C. M. Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (11), 4376-4380 (2008).
  30. Bhatt, A., et al. Deletion of kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and subclinical latent tuberculosis in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5157-5162 (2007).
  31. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  32. Vilcheze, C., Porcelli, S. A., Chan, J., Jacobs, W. R. Jr Sterilization by Adaptive Immunity of a Conditionally Persistent Mutant of Mycobacterium tuberculosis. mBio. 12 (1), e02391-20(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

232232JoVEin vivo
Интравитальная визуализация атенуированного ауксотрофного микобактерия туберкулёза в лёгких мышей во время ранней внутрисосудистой инфекции
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.