Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Дисфункция кишечного барьера, опосредованная NEAT1 посредством связывания с miR-29b-3p в клетках Caco-2 с повреждением, вызванным липополисахаридом

105 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71021

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании оценивалась роль NEAT1 как диагностического маркера и регулятора дисфункции кишечного барьера при синдроме раздраженного кишечника с преобладанием диареи. Уровень NEAT1 был повышен в сыворотке крови пациентов; данный некодирующий РНК связывал miR-29b-3p, а его нокдаун улучшал показатели целостности барьера, апоптоза и воспаления в клетках Caco-2, поврежденных липополисахаридом.

Аннотация

Патогенез синдрома раздраженного кишечника с преобладанием диареи (СРК-Д) остается неясным, а доступные методы терапии ограничены. В данном исследовании оценивалась диагностическая значимость NEAT1 при СРК-Д и изучался его потенциальный регуляторный механизм. В исследование было включено 116 пациентов с СРК-Д и 116 здоровых добровольцев из контрольной группы. Уровни NEAT1 и miR-29b-3p в сыворотке крови определяли с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR), а для оценки диагностической ценности использовали ROC-кривые. Для изучения механизмов была создана модель эпителиальных клеток кишечника Caco-2, обработанных липополисахаридом (LPS). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью теста Cell Counting Kit-8 (CCK-8), апоптоз — методом проточной цитометрии, целостность барьера — по трансэпителиальному электрическому сопротивлению (TEER), а уровни мРНК ZO-1, окклюдина и клаудина-2 — методом RT-qPCR. Для подтверждения связи между NEAT1 и miR-29b-3p использовали двухлюциферазный репортерный анализ (DLR) и иммунопреципитацию РНК (RIP). У пациентов с СРК-Д наблюдалась высокая экспрессия NEAT1 и низкая экспрессия miR-29b-3p, при этом их уровни демонстрировали сильную отрицательную корреляцию. Нокдаун NEAT1 в клетках Caco-2, обработанных LPS, приводил к повышению уровня miR-29b-3p, увеличению жизнеспособности клеток и TEER, снижению уровня апоптоза, повышению уровней мРНК ZO-1 и окклюдина, снижению уровня мРНК клаудина-2 и облегчению показателей, связанных с повреждением барьера. В совокупности эти результаты указывают на то, что NEAT1 в сыворотке крови является потенциальным биомаркером СРК-Д, а ось NEAT1/miR-29b-3p может быть задействована в дисфункции кишечного барьера.

Введение

Синдром раздраженного кишечника с преобладанием диареи (СРК-Д) представляет собой распространенное функциональное желудочно-кишечное расстройство, характеризующееся болями в животе, вздутием живота и изменением характера дефекации1. На данный момент патофизиологический механизм СРК-Д полностью не выяснен2. Методы лечения в основном направлены на симптоматическое облегчение, что характеризуется ограниченной эффективностью и высоким уровнем рецидивов3. Считается, что в развитии СРК-Д обычно задействовано взаимодействие множества факторов, таких как нарушение регуляции оси «мозг-кишечник», висцеральная гиперчувствительность, низкоинтенсивное воспаление кишечника и нарушение барьерной функции4,5. Хотя эти критерии в определенной степени стандартизировали диагностику, они субъективны и могут привести к задержке в постановке диагноза или ошибочной классификации, особенно когда симптомы пациента перекрываются с симптомами воспалительных заболеваний кишечника или других органических заболеваний. В рутинной клинической практике в настоящее время отсутствуют валидированные объективные биомаркеры СРК-Д. Таким образом, поиск новой молекулярной мишени, которая могла бы служить диагностическим маркером и обладать потенциальной терапевтической ценностью, стал насущной потребностью в современной области исследований СРК-Д.

В последние годы длинные некодирующие РНК, являясь ключевыми молекулами эпигенетической регуляции, продемонстрировали большой потенциал в качестве диагностических маркеров и терапевтических мишеней при различных заболеваниях6,7. Основной причиной СРК с диареей (СРК-Д) является нарушение функции кишечного барьера8. Разрушение белков плотных контактов приводит к "синдрому повышенной кишечной проницаемости", что, в свою очередь, активирует слизистый иммунный ответ9,10. Активация иммунной системы вызывает высвобождение многочисленных провоспалительных факторов, которые могут привести к дисфункции кишечника путем активации иммунно-нервной системы кишечника. Исследования показали, что некоторые lncRNA способны регулировать кишечный эпителиальный барьер11,12. Было сообщено, что экспрессия NEAT1 повышена в тканях слизистой оболочки толстой кишки у пациентов с колитом13. Ингибирование LncRNA NEAT1 может облегчить дисфункцию эпителиальных клеток кишечника (ЭКК) при язвенном колите14. Однако профиль экспрессии NEAT1 при СРК-Д и его диагностическая ценность до сих пор не были изучены. Более того, NEAT1 может обладать потенциалом в качестве диагностического биомаркера15. Если NEAT1 аномально экспрессируется в сыворотке крови пациентов с СРК-Д, это могло бы дополнить существующие критерии Рим IV, предоставив инструмент молекулярной диагностики. В то же время профиль экспрессии miRNA также значительно изменяется у пациентов с СРК. Например, снижение экспрессии miR-29b-3p связывают с патогенезом СРК16. Однако вышестоящие регуляторные механизмы, управляющие экспрессией miR-29b-3p при СРК-Д, остаются совершенно неизученными. В частности, роль NEAT1 как конкурентной эндогенной РНК (ceRNA) для miR-29b-3p в контексте СРК-Д никогда не исследовалась, хотя этот механизм хорошо изучен при других заболеваниях17,18. Кроме того, в то время как предыдущие исследования были сосредоточены преимущественно на экспрессии на уровне тканей, потенциал циркулирующей NEAT1 в качестве неинвазивного сывороточного биомаркера для диагностики СРК-Д остается совершенно неизвестным.

Мы предполагаем, что lncRNA-NEAT1 может участвовать в регуляции функции кишечного барьера при СРК-Д, выступая в роли ceRNA, которая секвестрирует miR-29b-3p. Исходя из вышеизложенного, целью данной работы является: (1) оценка уровней NEAT1 и miR-29b-3p в сыворотке крови пациентов с СРК-Д и их диагностической значимости; (2) подтверждение прямого связывания между NEAT1 и miR-29b-3p; и (3) выяснение функциональной роли оси NEAT1/miR-29b-3p в регуляции целостности кишечного барьера и воспаления с использованием модели клеток Caco-2, обработанных LPS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Включение пациентов

Все участники предоставили письменное информированное согласие после полного ознакомления с содержанием исследования. Комитет по этике Народной больницы нового района Пудун города Шанхая рассмотрел и утвердил данный протокол исследования (№ 2024k007). Размер выборки был рассчитан с помощью G*Power: был выбран t-критерий, и статистический тест был разработан для выявления различий между двумя независимыми выборками. При величине эффекта d = 0.5, α = 0.05 и мощности 0.9 расчеты показали, что в каждую группу должно быть включено не менее 86 испытуемых. Чтобы учесть возможные непредвиденные обстоятельства в ходе исследования, в каждую группу было включено по 116 пациентов. В качестве экспериментальной группы в исследование были включены в общей сложности 116 пациентов с СРК-Д, обратившихся в Народную больницу нового района Пудун города Шанхая в период с июля 2024 по июль 2025 года. Критерии включения были следующими: (1) СРК-Д, соответствующий диагностическим критериям Рим IV; (2) данные колоноскопии, указывающие на отсутствие органических поражений слизистой оболочки. Критерии исключения: (1) пациенты с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), колоректальным раком и т. д.; (2) пациенты с сахарным диабетом; (3) пациенты с недавно перенесенными операциями на брюшной полости; и (4) пациенты с тяжелой сердечной, печеночной или почечной недостаточностью. Одновременно с этим в качестве контрольной группы были набраны 116 здоровых добровольцев, соответствующих демографическим характеристикам пациентов, таким как возраст и пол. Было подтверждено, что у здоровых controls отсутствовал анамнез хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта или соответствующие клинические симптомы. У всех испытуемых было взято пять миллилитров периферической венозной крови. Затем супернатант был перенесен в ультранизкотемпературный холодильник при -80 °C для криоконсервации перед последующей экстракцией RNA.

Каждый участник в течение 10 дней заполнял опросник для регистрации следующих клинических проявлений: (а) оценка выраженности боли в животе по 10-балльной визуально-аналоговой шкале; (б) частота возникновения болей в животе в период исследования (количество дней с болями); (в) частота дефекации (максимальное количество стульев в сутки); (г) Бристольская шкала формы кала для оценки характеристик стула. Эмоциональное состояние испытуемых оценивали с помощью Госпитальной шкалы тревоги и депрессии (HADS).

Культивирование и моделирование клеток

Клетки Caco-2 регулярно культивировали в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина, в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. Линия клеток Caco-2 спонтанно дифференцируется в поляризованный монослой клеток с плотными контактами и микроворсинками, проявляя морфологические и функциональные характеристики, сходные с характеристиками зрелых эпителиальных клеток кишечника. LPS вызывает воспалительную реакцию и нарушает плотные контакты в эпителии кишечника, увеличивая его проницаемость — процесс, в значительной степени схожий с патологическими признаками СРК-Д. Кроме того, учитывая, что клетки Caco-2, обработанные LPS, широко использовались в предыдущих исследованиях19,20,21 для моделирования воспаления и нарушения барьерной функции, связанных с СРК, для создания модели СРК-Д in vitro в данной работе была выбрана обработка клеток Caco-2 липополисахаридом (LPS). Когда клетки достигали примерно 80% конфлюэнтности, культуральную среду заменяли на полную среду, содержащую 5 µg/ml LPS22, и стимулировали клетки в течение 24 h. В качестве контрольной группы использовали клетки, культивируемые обычным способом без добавления LPS.

Трансфекция клеток

Для исследования роли NEAT1 и miR-29b-3p в клетках Caco-2 была проведена трансфекция клеток Caco-2. Клетки разделили на шесть групп следующим образом: 1. контрольная группа (без обработки); 2. группа LPS; 3. группа LPS + si-NC; 4. группа LPS + si-NEAT1; 5. группа LPS + si-NEAT1 + ингибитор NC; и 6. группа LPS + si-NEAT1 + ингибитор miR-29b-3p. Были разработаны и синтезированы две малые интерферирующие РНК (si-NEAT1), нацеленные на NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) и si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). В качестве отрицательного контроля использовали siRNA с нецелевой случайной последовательностью (si-NC). Одновременно с этим были синтезированы ингибитор miR-29b-3p и соответствующий отрицательный контроль. Ингибитор miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Отрицательный контроль: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Клетки Caco-2 высевали в 24-луночные планшеты и трансфицировали после достижения конфлюэнтности 60–70% в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, 1,25 µL siRNA разводили в 25 µL среды с пониженным содержанием сыворотки для достижения конечной концентрации siRNA 50 nM. Для ингибирования miRNA 2 µL ингибитора miR-29b-3p или его негативного контроля разводили в 25 µL среды с пониженным содержанием сыворотки до конечной концентрации 100 nM. Отдельно 1,5 µL реагента для трансфекции смешивали с 25 µL среды с пониженным содержанием сыворотки. Затем разведенную siRNA (или ингибитор/негативный контроль) смешивали с разведенным реагентом для трансфекции для формирования трансфекционного комплекса, который добавляли к клеткам по каплям. Через шесть часов после трансфекции смесь для трансфекции заменяли свежей полной средой, и клетки инкубировали еще 48 h перед проведением последующих функциональных анализов. Эффективность нокаута или ингибирования подтверждали методом RT-qPCR перед дальнейшими экспериментами.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-кПЦР)

Общую РНК выделяли из образцов сыворотки и клеток Caco-2, подвергнутых указанным воздействиям. Кратко: каждый образец лизировали 1 mL реагента для экстракции РНК и смешивали с 200 µL хлороформа. После центрифугирования при 12,000 × g в течение 15 min при 4 °C верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку, смешивали с 500 µL изопропанола и выдерживали при −20 °C в течение 30 min. Затем образцы центрифугировали при 12,000 × g в течение 10 min при 4 °C. Полученный осадок РНК дважды промывали 75% этанолом, высушивали на воздухе и ресуспендировали в 20 µL воды, свободной от РНКаз. Выход и чистоту РНК измеряли с помощью микроспектрофотометра; использовали только образцы со значениями A260/A280 в диапазоне 1.8–2.0. РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК согласно протоколу производителя. Для детекции NEAT1, ZO-1, occludin, claudin-2, и GAPDH использовали 1 µg общей РНК на каждую реакцию обратной транскрипции объемом 20 µL, содержащую 1× буфер для ОТ, 0.5 mM dNTPs, 0.5 µM олиго(dT)-праймер, 200 U обратной транскриптазы и воду, свободную от РНКаз. Реакцию проводили при 37 °C в течение 15 min с последующей инактивацией фермента при 85 °C в течение 5 s.

Количественную ПЦР проводили с использованием кДНК в качестве матрицы с помощью системы ПЦР в реальном времени на основе SYBR Green. Уровни экспрессии NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, и claudin-2 измеряли с использованием ген-специфических праймеров. U6 служил референсным геном для miR-29b-3p, тогда как GAPDH использовали для нормализации NEAT1 и генов плотных контактов. Относительную экспрессию рассчитывали методом 2−ΔΔCt. Последовательности праймеров приведены в Таблице 1.

Анализ жизнеспособности клеток

Клетки Caco-2 в логарифмической фазе роста высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток на лунку. Были сформированы холостая контрольная группа (содержащая только культуральную среду), контрольная группа (необработанные клетки) и экспериментальная группа (клетки Caco-2 при различных условиях воздействия), по 5–6 дубликатных лунок в каждой группе. Клетки распределили по четырем временным точкам: 0, 24, 48 и 72 h. Для каждой временной точки готовили отдельный культуральный планшет, чтобы избежать многократного открытия инкубатора во время измерений. По истечении периода культивирования в каждую лунку, избегая образования пузырьков, добавляли 10 µL раствора CCK-8. Затем культуральный планшет помещали в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂ и инкубировали в темноте в течение 2 h. Оптическую плотность в каждой лунке измеряли сразу после этого при 450 nm с помощью микропланшетного ридера. В конечном итоге жизнеспособность клеток выражали в процентах.

Анализ апоптоза клеток

Степень апоптоза определяли методом проточной цитометрии после окрашивания Annexin V-FITC/PI. Клетки Caco-2 из каждой группы обработки собирали и дважды промывали ледяным PBS. Центрифугирование проводили при 300 × g в течение 5 min при 4 °C. Осадок клеток ресуспендировали в 100 µL 1× связывающего буфера, после чего последовательно добавляли 5 µL Annexin V-FITC и 5 µL PI. После осторожного перемешивания образцы инкубировали в течение 15 min при комнатной температуре в темном месте. Затем добавляли 300 µL 1× связывающего буфера и аккуратно перемешивали суспензию перед переносом в пробирку для проточной цитометрии объемом 5 mL. Анализ образцов методом проточной цитометрии проводили в течение 1 h.

Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER)

Проницаемость оценивали путем измерения значений TEER клеток Caco-223. Клетки Caco-2 высевали в камеры Transwell и культивировали в течение 21 дня до образования плотного монослоя. Для каждого экспериментального условия было проведено шесть независимых биологических повторностей и пять технических повторностей. До и после экспериментального воздействия значения TEER для каждой группы измеряли с помощью измерителя трансмембранного сопротивления, используя электроды, стерилизованные этанолом и уравновешенные PBS. Вкратце, длинный стержень электрода погружали в базалатеральную культуральную среду, а короткий — в апикальную культуральную среду, избегая контакта с фильтрующей мембраной. После стабилизации считывали значение сопротивления (Ω) и повторяли измерения до получения трех согласованных показателей. Сопротивление холостых фильтров Transwell (без клеток) измеряли в тех же условиях, и это значение вычитали из всех экспериментальных показаний. TEER (Ω·cm2) = (сопротивление образца – сопротивление холостой пробы) × эффективная площадь мембраны. Данные представлены как: (экспериментальная группа/контрольная группа) × 100%.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Супернатанты клеток Caco-2 из различных групп обработки собирали после 24 ч культивирования. Уровни провоспалительных цитокинов, включая фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-8 (IL-8) и интерлейкин-1β (IL-1β), измеряли с помощью коммерческих реагентов для ELISA в соответствии с инструкциями производителя. Анализ проводили строго согласно протоколу. Образцы и стандарты вносили в лунки, предварительно покрытые антителами, затем инкубировали и промывали. После этого добавляли биотинилированные детектирующие антитела. После повторной инкубации и промывки добавляли стрептавидин, меченный пероксидазой хрена. В завершение для проявления цвета добавляли субстрат TMB, а реакцию останавливали стоп-раствором. Оптическую плотность каждой лунки измеряли сразу после этого при 450 nm с помощью микропланшетного ридера.

Вестерн-блоттинг

Белки выделяли из клеток Caco-2 после указанных воздействий с использованием буфера RIPA, содержащего ингибиторы протеаз. Концентрацию белка определяли с помощью метода бицинкинонинной кислоты (BCA-тест). В каждую лунку наносили 30 µg белка, который разделяли в 10% SDS-PAGE гелях с последующим переносом на ПВДФ-мембраны. Мембраны блокировали в 5% растворе обезжиренного молока в течение 1 ч при комнатной температуре, затем инкубировали в течение ночи при 4 °C с антителами к ZO-1 (1:1,000), окклюдину (1:500), клаудину-2 (1:1,000) и GAPDH (1:5,000). После промывки мембраны инкубировали с конъюгированными с HRP вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Полосы детектировали методом усиленной хемилюминесценции (ECL), интенсивность полос анализировали с помощью ImageJ. GAPDH использовали в качестве контроля загрузки.

Двойной люциферазный репортерный анализ (DLR)

Потенциальные сайты связывания miR-29b-3p с последовательностью NEAT1 были предсказаны с помощью базы данных ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Впоследствии фрагменты NEAT1, содержащие сайты связывания дикого типа (WT) или мутантные (MUT) сайты, были клонированы в репортерный вектор pmirGLO. Сконструированная рекомбинантная плазмида была совместно трансфицирована в клетки с мимиками miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) или ингибиторами и соответствующими отрицательными контролями (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и определяли активность люциферазы светлячка и люциферазы Renilla с использованием реагента для определения двойной люциферазы. Активность люциферазы Renilla использовали в качестве внутреннего эталона для стандартизации.

Анализ иммунопреципитации РНК (RIP)

Для анализа RIP клетки Caco-2 собирали, промывали PBS и инкубировали на льду в течение 15 мин в 200 µL лизирующего буфера RIP с добавлением ингибиторов протеаз и РНказ. Лизаты клеток центрифугировали при 16,000 × g в течение 10 мин при 4 °C, при этом 10 µL каждого супернатанта оставляли в качестве контрольного образца (input). Для иммунопреципитации 40 µL магнитных бусин Protein A/G перемешивали с 5 µg антител к Ago2 или нормальным IgG в 200 µL промывочного буфера RIP в течение 30 мин при комнатной температуре. После трех промывок 500 µL промывочного буфера RIP 100 µL суспензии бусин объединяли со 100 µL лизата, доводили общий объем до 1 mL промывочным буфером RIP и инкубировали в течение ночи при 4 °C с перемешиванием. Затем бусины промывали пять раз 500 µL промывочного буфера RIP и ресуспендировали в 150 µL того же буфера. Переваривание белков проводили путем добавления 15 µL протеиназы K (20 mg/mL) и 15 µL 10% SDS с последующей инкубацией при 55 °C в течение 30 мин при встряхивании. Супернатант собирали, РНК изолировали с помощью экстракционного реагента и осаждали в течение ночи. Обогащение NEAT1 и miR-29b-3p затем оценивали методом RT-qPCR.

Анализ субклеточной локализации

Клетки Caco-2 разделяли на ядерную и цитоплазматическую фракции с использованием указанного коммерчески доступного реагента для ядерно-цитоплазматического разделения в соответствии с инструкциями производителя. Из этих двух компонентов экстрагировали общую РНК, после чего распределение NEAT1 в ядре и цитоплазме определяли методом RT-qPCR. Калибровку проводили с использованием мРНК U6 (преимущественно ядерной) и GAPDH (преимущественно цитоплазматической) в качестве индикаторов эффективности разделения.

Статистический анализ

Для клинических образцов сыворотки анализ статистической мощности (t-критерий, d = 0.5, α = 0.05, мощность = 0.9) показал, что в каждой группе требуется минимум 86 субъектов. Чтобы учесть возможные непредвиденные обстоятельства в ходе исследования, в каждую группу было включено 116 пациентов для выявления клинически значимых различий. Нормальность распределения данных для непрерывных переменных оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку все непрерывные данные были распределены нормально (P > 0.05), применялся параметрический анализ. Категориальные переменные анализировали с помощью критерия хи-квадрат. Эксперименты на клеточных культурах включали шесть независимых биологических повторностей, по пять технических повторностей для каждой биологической повторности. Данные представлены как среднее значение ± SD. Сравнение двух групп непрерывных переменных проводили с использованием t-критерия Стьюдента, а сравнение нескольких групп анализировали с помощью однофакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки. Статистическая значимость была определена как P < 0.05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспрессия NEAT1 и диагностическая ценность

По сравнению с группой здорового контроля (HC), уровни экспрессии NEAT1 у пациентов с СРК-Д были заметно выше (P < 0.0001; Рисунок 1A). Площадь под кривой (AUC) для NEAT1, определенная по ROC-кривой (рабочей характеристике приемника), составила 0,867 (95% ДИ: 0,821–0,913). Специфичность составила 75,9%, а чувствительность — 84,5% (Рисунок 1B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

СРК-Д является распространенным функциональным заболеванием желудочно-кишечного тракта. Его патологический механизм до конца не выяснен. В последние годы lncRNA, являясь ключевыми молекулами эпигенетической регуляции, продемонстрировали большой потенциал в области диагностики и лечения заболеваний. LncRNA NEAT1 изучалась при различных патологиях, таких как колоректальный рак24, глиома25 и инфаркт миокарда26. Многочисленные исследования показ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Нет данных

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
планшеты на 24 лункиCorningCLS3524Для посева клеток
96-луночные планшетыCorningCLS3599Для посева клеток в анализах CCK-8
Набор для определения апоптоза Annexin V-FITC/PIInvitrogenV13242Для определения скорости апоптоза
Моноклональное антитело к AGO2Proteintech67934-1-IgДля иммунопреципитации РНК-комплексов, связанных с Ago2
Антитело к клаудину-2Invitrogen32-5600Первичные антитела, разведение 1:1000
антитела к GAPDHТехнологии клеточной сигнализации5174Первичные антитела, разведение 1:5000; контроль загрузки
Антитела к IgG человекаProteintech10284-1-APИспользуется в качестве отрицательного контроля для анализа RIP
Антитела к окклудинуAbcamab31721Первичные антитела, разведение 1:500
антитела к ZO-1Proteintech21773-1-APПервичные антитела, разведение 1:1000
Клетки Caco-2SUNNCELLSNL-068Для создания моделей кишечного эпителиального барьера
набор CCK-8SolarbioCA1210Набор для анализа пролиферации клеток
ХлороформSigma-AldrichC2432Для разделения фаз при экстракции РНК
среда DMEMGibco11965092Для культивирования клеток
Набор для двухлюциферазного репортерного анализаThermoFisher16186Для определения люциферазной активности
Набор для ИФА (для IL-1)β)R&R&D SystemsDY201Для детектирования целевых белков в супернатантах культур клеток
Набор для ИФА (на ИЛ-6)R&D SystemsD6050BДля детектирования целевых белков в супернатантах культур клеток
Набор для ИФА (для ИЛ-8)R&D SystemsNBP3-28022Для обнаружения целевых белков в супернатантах культур клеток
набор для ИФА (для TNF-α)R&R&D SystemsDTA00DДля определения целевых белков в супернатантах культур клеток
Субстрат для усиленной хемилюминесценции (ECL)Thermo Fisher32106Для визуализации белковых полос
Этанол (75%)Sigma-Aldrich459844Для промывки осадка РНК
FBS (фетальная бычья сыворотка)Gibco10099141Для культивирования клеток
Проточный цитометрBeckman CoulterB53002Для определения уровня апоптоза
Вторичные антитела, конъюгированные с HRPТехнологии клеточной сигнализации7074Катализировать генерацию хемилюминесцентного сигнала из субстратов ECL
ИзопропанолSigma-Aldrich1133502500Для осаждения РНК
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015Реагент для трансфекции
Липополисахарид (ЛПС)Sigma-AldrichL2880Для создания индуцированной клеточной модели
Считыватель микропланшетовBioTekЭпоха 2Для определения оптической плотности образцов в 96-луночных планшетах
Микроспектрофотометр NanodropThermo ScientificND-2000CДля определения концентрации и чистоты РНК
Обезжиренное сухое молокоCoolaberCN7861Для блокировки мембран (5% раствор)
Набор PARISThermo FisherAM1921Для фракционирования ядер и цитоплазмы
Пенициллин–СтрептомицинGibco15140122Для обеспечения устойчивости растущих клеток к контаминации
Набор для определения концентрации белка Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225Для определения концентрации белков
вектор pmirGLO для двухлюциферазного анализаPromegaE1330Вектор с двойным люциферазным репортерным геном
Набор реагентов PrimeScript RT Reagent KitTakaraRR047AДля обратной транскрипции РНК в кДНК
ПВДФ-мембранаMilliporeIPVH00010Для переноса белков после SDS-PAGE
Прибор для количественной ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекциейApplied Biosystems4365464Для детекции целевых генов
буфер для лизиса RIPA (с ингибиторами протеаз)Thermo Fisher89901Для экстракции общего белка из клеток
Набор для иммунопреципитации РНК-связывающих белковSigma-Aldrich17-701Анализ иммунопреципитации РНК-связывающих белков (RIP) с использованием магнитных бус с белком A/G
Реагенты для SDS-PAGE (10% гель)TargetMolC0189Для разделения белков по молекулярной массе
мастер-микс SYBR GreenThermo Fisher4309155Для использования в ПЦР-тестировании
Измеритель TEER (вольт-омметр)MilliporeMERS00002Измеритель трансмембранного сопротивления для определения целостности монослоя
Камеры TranswellCorning CostarCLS3413Для культивирования клеточных монослоев и измерения TEER
реагент TRIzolInvitrogen15596026CNДля экстракции тотальной РНК

Ссылки

  1. Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
  2. Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
  3. Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
  4. Lenoir M, Wienke J, Fardao-Beyler F, Roese N. An 8-week course of Bifidobacterium longum 35624 is associated with a reduction in the symptoms of irritable bowel syndrome. Probiotics Antimicrob Proteins. 2025;17(1):315-27.
  5. Tao E, et al. Early life stress induces irritable bowel syndrome from childhood to adulthood in mice. Front Microbiol. 2023;14:1255525.
  6. Biswas S, et al. Expressions of serum lncRNAs in diabetic retinopathy: a potential diagnostic tool. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:851967.
  7. Li W, et al. Functional roles of non-coding RNAs in panvascular diseases. J Vis Exp. 2025;(226).
  8. Shin SY, et al. The effect of phloroglucinol in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Neurogastroenterol Motil. 2020;26(1):117-27.
  9. Yang S, et al. Ginseng-derived nanoparticles alleviate inflammatory bowel disease via the TLR4/MAPK and p62/Nrf2/Keap1 pathways. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):48.
  10. Zhang J, et al. Role of the gut microbiota in complications after ischemic stroke. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1334581.
  11. Chen S, et al. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier. Biomed Res Int. 2021;2021:2294942.
  12. Lu Q, et al. The role of long noncoding RNAs in intestinal health and diseases: a focus on the intestinal barrier. Biomolecules. 2023;13(11):1674.
  13. Li F, et al. Knockdown of long non-coding RNA NEAT1 relieves inflammation of ulcerative colitis by regulating the miR-603/FGF9 pathway. Exp Ther Med. 2022;23(2):131.
  14. Ni S, Liu Y, Zhong J, Shen Y. Inhibition of lncRNA NEAT1 alleviates intestinal epithelial cells dysfunction in ulcerative colitis by maintaining the homeostasis of the glucose metabolism through the miR-410-3p-LDHA axis. Bioengineered. 2022;13(4):8961-71.
  15. Aparicio P, et al. Serum lncRNAs NEAT1, PVT1 and H19 as novel biomarkers for sarcopenia diagnosis and treatment response. Noncoding RNA Res. 2025;14:166-76.
  16. Martínez C, et al. miR-16 and miR-125b are involved in barrier function dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in the jejunum in IBS with diarrhoea. Gut. 2017;66(9):1537-8.
  17. Che F, et al. Lnc NEAT1/miR-29b-3p/Sp1 form a positive feedback loop and modulate bortezomib resistance in human multiple myeloma cells. Eur J Pharmacol. 2021;891:173752.
  18. Zhang Y, et al. LncRNA NEAT1/miR-29b-3p/BMP1 axis promotes osteogenic differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Pathol Res Pract. 2019;215(3):525-31.
  19. Ludidi S, et al. The intestinal barrier in irritable bowel syndrome: subtype-specific effects of the systemic compartment in an in vitro model. PLoS One. 2015;10(5).
  20. Fan Z, et al. Investigation of the biomarkers and mechanism based on endoplasmic reticulum stress in irritable bowel syndrome. Arab J Gastroenterol. 2025;26(4):337-46.
  21. Zhang H, Xiong Z, He Y, Su H, Jiao Y. Cimifugin improves intestinal barrier dysfunction by upregulating SIRT1 to regulate the NRF2/HO-1 signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(3):2897-908.
  22. Zhang Y, et al. Decreased expression of microRNA-510 in intestinal tissue contributes to post-infectious irritable bowel syndrome via targeting PRDX1. Am J Transl Res. 2019;11(12):7385-97.
  23. Li BR, et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. J Vis Exp. 2018;(140).
  24. Zhang M, et al. The lncRNA NEAT1 activates Wnt/β-catenin signaling and promotes colorectal cancer progression via interacting with DDX5. J Hematol Oncol. 2018;11(1):113.
  25. Liang J, Liu C, Xu D, Xie K, Li A. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1. J Transl Med. 2022;20(1):80.
  26. Yu Q, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis. Exp Cell Res. 2024;442(2):114217.
  27. Gong Z, Zhang Y, Jiang Y, Chen P, Ji J. LncRNA NEAT1 targets miR-342-3p/CUL4B to inhibit the proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma cells. J Oncol. 2022;2022:8145129.
  28. Han M, et al. LncRNA NEAT1 protects uremic toxin-induced intestinal epithelial barrier injury by regulating miR-122-5p/Occludin axis. PLoS One. 2025;20(5).
  29. Cui J, Wang J, Lv Y, Xu D. LncRNA NEAT1 regulates infantile pneumonia by sponging miR-146b. Mol Biotechnol. 2021;63(8):694-701.
  30. Xiao P, et al. LncRNA NEAT1 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis via targeting miR-543/PLA2G4A axis. Hum Cell. 2021;34(1):60-75.
  31. Wu X, et al. Aberrant expressions of circulating lncRNA NEAT1 and microRNA-125a are linked with Th2 cells and symptom severity in pediatric allergic rhinitis. J Clin Lab Anal. 2022;36(3).
  32. Wang K, Liu Y, Chai Y. NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 axis regulates macrophage polarization and inflammation in sepsis models. J Vis Exp. 2026;(227).
  33. Tojo González R, et al. Síndrome de intestino irritable: papel de la microbiota y probióticos [Irritable bowel syndrome; gut microbiota and probiotic therapy]. Nutr Hosp. 2015;31(Suppl 1):83-8.
  34. Hwang HJ, et al. Ferulic acid as a protective antioxidant of human intestinal epithelial cells. Antioxidants (Basel). 2022;11(8):1448.
  35. Wu Y, et al. Probiotics (Lactobacillus plantarum HNU082) supplementation relieves ulcerative colitis by affecting intestinal barrier functions, immunity-related gene expression, gut microbiota, and metabolic pathways in mice. Microbiol Spectr. 2022;10(6).
  36. Kuo WT, et al. The tight junction protein ZO-1 is dispensable for barrier function but critical for effective mucosal repair. Gastroenterology. 2021;161(6):1924-39.
  37. Furuse M, et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol. 1993;123(6 Pt 2):1777-88.
  38. Wang Z, et al. Binding of Trichinella spiralis C-type lectin with syndecan-1 on intestinal epithelial cells mediates larval invasion of intestinal epithelium. Vet Res. 2023;54(1):86.
  39. Kaya İslamoğlu ZG, Unal M, Küçük A. Atopic dermatitis in adults and irritable bowel syndrome: a cross-sectional study. Indian J Dermatol. 2019;64(5):355-9.
  40. Ma C, et al. LncRNA PTS-1 protects against osteoarthritis through the miR-8085/E2F2 axis. J Inflamm Res. 2025;18:347-66.
  41. Tong Y, Zhou Z, Tang J, Feng Q. miR-29b-3p inhibits the inflammation injury in human umbilical vein endothelial cells by regulating SEC23A. Biochem Genet. 2022;60(6):2000-14.
  42. Li Z, et al. miR-29b-3p protects cardiomyocytes against endotoxin-induced apoptosis and inflammatory response through targeting FOXO3A. Cell Signal. 2020;74:109716.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

NEAT1
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.