Дисфункция кишечного барьера, опосредованная NEAT1 посредством связывания с miR-29b-3p в клетках Caco-2 с повреждением, вызванным липополисахаридом

Краткое содержание

В данном исследовании оценивалась роль NEAT1 как диагностического маркера и регулятора дисфункции кишечного барьера при синдроме раздраженного кишечника с преобладанием диареи. Уровень NEAT1 был повышен в сыворотке крови пациентов; данный некодирующий РНК связывал miR-29b-3p, а его нокдаун улучшал показатели целостности барьера, апоптоза и воспаления в клетках Caco-2, поврежденных липополисахаридом.

Аннотация

Патогенез синдрома раздраженного кишечника с преобладанием диареи (СРК-Д) остается неясным, а доступные методы терапии ограничены. В данном исследовании оценивалась диагностическая значимость NEAT1 при СРК-Д и изучался его потенциальный регуляторный механизм. В исследование было включено 116 пациентов с СРК-Д и 116 здоровых добровольцев из контрольной группы. Уровни NEAT1 и miR-29b-3p в сыворотке крови определяли с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR), а для оценки диагностической ценности использовали ROC-кривые. Для изучения механизмов была создана модель эпителиальных клеток кишечника Caco-2, обработанных липополисахаридом (LPS). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью теста Cell Counting Kit-8 (CCK-8), апоптоз — методом проточной цитометрии, целостность барьера — по трансэпителиальному электрическому сопротивлению (TEER), а уровни мРНК ZO-1, окклюдина и клаудина-2 — методом RT-qPCR. Для подтверждения связи между NEAT1 и miR-29b-3p использовали двухлюциферазный репортерный анализ (DLR) и иммунопреципитацию РНК (RIP). У пациентов с СРК-Д наблюдалась высокая экспрессия NEAT1 и низкая экспрессия miR-29b-3p, при этом их уровни демонстрировали сильную отрицательную корреляцию. Нокдаун NEAT1 в клетках Caco-2, обработанных LPS, приводил к повышению уровня miR-29b-3p, увеличению жизнеспособности клеток и TEER, снижению уровня апоптоза, повышению уровней мРНК ZO-1 и окклюдина, снижению уровня мРНК клаудина-2 и облегчению показателей, связанных с повреждением барьера. В совокупности эти результаты указывают на то, что NEAT1 в сыворотке крови является потенциальным биомаркером СРК-Д, а ось NEAT1/miR-29b-3p может быть задействована в дисфункции кишечного барьера.

Введение

Синдром раздраженного кишечника с преобладанием диареи (СРК-Д) представляет собой распространенное функциональное желудочно-кишечное расстройство, характеризующееся болями в животе, вздутием живота и изменением характера дефекации¹. На данный момент патофизиологический механизм СРК-Д полностью не выяснен². Методы лечения в основном направлены на симптоматическое облегчение, что характеризуется ограниченной эффективностью и высоким уровнем рецидивов³. Считается, что в развитии СРК-Д обычно задействовано взаимодействие множества факторов, таких как нарушение регуляции оси «мозг-кишечник», висцеральная гиперчувствительность, низкоинтенсивное воспаление кишечника и нарушение барьерной функции^4,5. Хотя эти критерии в определенной степени стандартизировали диагностику, они субъективны и могут привести к задержке в постановке диагноза или ошибочной классификации, особенно когда симптомы пациента перекрываются с симптомами воспалительных заболеваний кишечника или других органических заболеваний. В рутинной клинической практике в настоящее время отсутствуют валидированные объективные биомаркеры СРК-Д. Таким образом, поиск новой молекулярной мишени, которая могла бы служить диагностическим маркером и обладать потенциальной терапевтической ценностью, стал насущной потребностью в современной области исследований СРК-Д.

В последние годы длинные некодирующие РНК, являясь ключевыми молекулами эпигенетической регуляции, продемонстрировали большой потенциал в качестве диагностических маркеров и терапевтических мишеней при различных заболеваниях^6,7. Основной причиной СРК с диареей (СРК-Д) является нарушение функции кишечного барьера⁸. Разрушение белков плотных контактов приводит к "синдрому повышенной кишечной проницаемости", что, в свою очередь, активирует слизистый иммунный ответ^9,10. Активация иммунной системы вызывает высвобождение многочисленных провоспалительных факторов, которые могут привести к дисфункции кишечника путем активации иммунно-нервной системы кишечника. Исследования показали, что некоторые lncRNA способны регулировать кишечный эпителиальный барьер^11,12. Было сообщено, что экспрессия NEAT1 повышена в тканях слизистой оболочки толстой кишки у пациентов с колитом¹³. Ингибирование LncRNA NEAT1 может облегчить дисфункцию эпителиальных клеток кишечника (ЭКК) при язвенном колите¹⁴. Однако профиль экспрессии NEAT1 при СРК-Д и его диагностическая ценность до сих пор не были изучены. Более того, NEAT1 может обладать потенциалом в качестве диагностического биомаркера¹⁵. Если NEAT1 аномально экспрессируется в сыворотке крови пациентов с СРК-Д, это могло бы дополнить существующие критерии Рим IV, предоставив инструмент молекулярной диагностики. В то же время профиль экспрессии miRNA также значительно изменяется у пациентов с СРК. Например, снижение экспрессии miR-29b-3p связывают с патогенезом СРК¹⁶. Однако вышестоящие регуляторные механизмы, управляющие экспрессией miR-29b-3p при СРК-Д, остаются совершенно неизученными. В частности, роль NEAT1 как конкурентной эндогенной РНК (ceRNA) для miR-29b-3p в контексте СРК-Д никогда не исследовалась, хотя этот механизм хорошо изучен при других заболеваниях^17,18. Кроме того, в то время как предыдущие исследования были сосредоточены преимущественно на экспрессии на уровне тканей, потенциал циркулирующей NEAT1 в качестве неинвазивного сывороточного биомаркера для диагностики СРК-Д остается совершенно неизвестным.

Мы предполагаем, что lncRNA-NEAT1 может участвовать в регуляции функции кишечного барьера при СРК-Д, выступая в роли ceRNA, которая секвестрирует miR-29b-3p. Исходя из вышеизложенного, целью данной работы является: (1) оценка уровней NEAT1 и miR-29b-3p в сыворотке крови пациентов с СРК-Д и их диагностической значимости; (2) подтверждение прямого связывания между NEAT1 и miR-29b-3p; и (3) выяснение функциональной роли оси NEAT1/miR-29b-3p в регуляции целостности кишечного барьера и воспаления с использованием модели клеток Caco-2, обработанных LPS.

Протокол

Включение пациентов

Все участники предоставили письменное информированное согласие после полного ознакомления с содержанием исследования. Комитет по этике Народной больницы нового района Пудун города Шанхая рассмотрел и утвердил данный протокол исследования (№ 2024k007). Размер выборки был рассчитан с помощью G*Power: был выбран t-критерий, и статистический тест был разработан для выявления различий между двумя независимыми выборками. При величине эффекта d = 0.5, α = 0.05 и мощности 0.9 расчеты показали, что в каждую группу должно быть включено не менее 86 испытуемых. Чтобы учесть возможные непредвиденные обстоятельства в ходе исследования, в каждую группу было включено по 116 пациентов. В качестве экспериментальной группы в исследование были включены в общей сложности 116 пациентов с СРК-Д, обратившихся в Народную больницу нового района Пудун города Шанхая в период с июля 2024 по июль 2025 года. Критерии включения были следующими: (1) СРК-Д, соответствующий диагностическим критериям Рим IV; (2) данные колоноскопии, указывающие на отсутствие органических поражений слизистой оболочки. Критерии исключения: (1) пациенты с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), колоректальным раком и т. д.; (2) пациенты с сахарным диабетом; (3) пациенты с недавно перенесенными операциями на брюшной полости; и (4) пациенты с тяжелой сердечной, печеночной или почечной недостаточностью. Одновременно с этим в качестве контрольной группы были набраны 116 здоровых добровольцев, соответствующих демографическим характеристикам пациентов, таким как возраст и пол. Было подтверждено, что у здоровых controls отсутствовал анамнез хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта или соответствующие клинические симптомы. У всех испытуемых было взято пять миллилитров периферической венозной крови. Затем супернатант был перенесен в ультранизкотемпературный холодильник при -80 °C для криоконсервации перед последующей экстракцией RNA.

Каждый участник в течение 10 дней заполнял опросник для регистрации следующих клинических проявлений: (а) оценка выраженности боли в животе по 10-балльной визуально-аналоговой шкале; (б) частота возникновения болей в животе в период исследования (количество дней с болями); (в) частота дефекации (максимальное количество стульев в сутки); (г) Бристольская шкала формы кала для оценки характеристик стула. Эмоциональное состояние испытуемых оценивали с помощью Госпитальной шкалы тревоги и депрессии (HADS).

Культивирование и моделирование клеток

Клетки Caco-2 регулярно культивировали в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина, в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. Линия клеток Caco-2 спонтанно дифференцируется в поляризованный монослой клеток с плотными контактами и микроворсинками, проявляя морфологические и функциональные характеристики, сходные с характеристиками зрелых эпителиальных клеток кишечника. LPS вызывает воспалительную реакцию и нарушает плотные контакты в эпителии кишечника, увеличивая его проницаемость — процесс, в значительной степени схожий с патологическими признаками СРК-Д. Кроме того, учитывая, что клетки Caco-2, обработанные LPS, широко использовались в предыдущих исследованиях^19,20,21 для моделирования воспаления и нарушения барьерной функции, связанных с СРК, для создания модели СРК-Д in vitro в данной работе была выбрана обработка клеток Caco-2 липополисахаридом (LPS). Когда клетки достигали примерно 80% конфлюэнтности, культуральную среду заменяли на полную среду, содержащую 5 µg/ml LPS²², и стимулировали клетки в течение 24 h. В качестве контрольной группы использовали клетки, культивируемые обычным способом без добавления LPS.

Трансфекция клеток

Для исследования роли NEAT1 и miR-29b-3p в клетках Caco-2 была проведена трансфекция клеток Caco-2. Клетки разделили на шесть групп следующим образом: 1. контрольная группа (без обработки); 2. группа LPS; 3. группа LPS + si-NC; 4. группа LPS + si-NEAT1; 5. группа LPS + si-NEAT1 + ингибитор NC; и 6. группа LPS + si-NEAT1 + ингибитор miR-29b-3p. Были разработаны и синтезированы две малые интерферирующие РНК (si-NEAT1), нацеленные на NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) и si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). В качестве отрицательного контроля использовали siRNA с нецелевой случайной последовательностью (si-NC). Одновременно с этим были синтезированы ингибитор miR-29b-3p и соответствующий отрицательный контроль. Ингибитор miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Отрицательный контроль: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Клетки Caco-2 высевали в 24-луночные планшеты и трансфицировали после достижения конфлюэнтности 60–70% в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, 1,25 µL siRNA разводили в 25 µL среды с пониженным содержанием сыворотки для достижения конечной концентрации siRNA 50 nM. Для ингибирования miRNA 2 µL ингибитора miR-29b-3p или его негативного контроля разводили в 25 µL среды с пониженным содержанием сыворотки до конечной концентрации 100 nM. Отдельно 1,5 µL реагента для трансфекции смешивали с 25 µL среды с пониженным содержанием сыворотки. Затем разведенную siRNA (или ингибитор/негативный контроль) смешивали с разведенным реагентом для трансфекции для формирования трансфекционного комплекса, который добавляли к клеткам по каплям. Через шесть часов после трансфекции смесь для трансфекции заменяли свежей полной средой, и клетки инкубировали еще 48 h перед проведением последующих функциональных анализов. Эффективность нокаута или ингибирования подтверждали методом RT-qPCR перед дальнейшими экспериментами.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-кПЦР)

Общую РНК выделяли из образцов сыворотки и клеток Caco-2, подвергнутых указанным воздействиям. Кратко: каждый образец лизировали 1 mL реагента для экстракции РНК и смешивали с 200 µL хлороформа. После центрифугирования при 12,000 × g в течение 15 min при 4 °C верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку, смешивали с 500 µL изопропанола и выдерживали при −20 °C в течение 30 min. Затем образцы центрифугировали при 12,000 × g в течение 10 min при 4 °C. Полученный осадок РНК дважды промывали 75% этанолом, высушивали на воздухе и ресуспендировали в 20 µL воды, свободной от РНКаз. Выход и чистоту РНК измеряли с помощью микроспектрофотометра; использовали только образцы со значениями A₂₆₀/A₂₈₀ в диапазоне 1.8–2.0. РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК согласно протоколу производителя. Для детекции NEAT1, ZO-1, occludin, claudin-2, и GAPDH использовали 1 µg общей РНК на каждую реакцию обратной транскрипции объемом 20 µL, содержащую 1× буфер для ОТ, 0.5 mM dNTPs, 0.5 µM олиго(dT)-праймер, 200 U обратной транскриптазы и воду, свободную от РНКаз. Реакцию проводили при 37 °C в течение 15 min с последующей инактивацией фермента при 85 °C в течение 5 s.

Количественную ПЦР проводили с использованием кДНК в качестве матрицы с помощью системы ПЦР в реальном времени на основе SYBR Green. Уровни экспрессии NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, и claudin-2 измеряли с использованием ген-специфических праймеров. U6 служил референсным геном для miR-29b-3p, тогда как GAPDH использовали для нормализации NEAT1 и генов плотных контактов. Относительную экспрессию рассчитывали методом 2−ΔΔCt. Последовательности праймеров приведены в Таблице 1.

Анализ жизнеспособности клеток

Клетки Caco-2 в логарифмической фазе роста высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 10⁴ клеток на лунку. Были сформированы холостая контрольная группа (содержащая только культуральную среду), контрольная группа (необработанные клетки) и экспериментальная группа (клетки Caco-2 при различных условиях воздействия), по 5–6 дубликатных лунок в каждой группе. Клетки распределили по четырем временным точкам: 0, 24, 48 и 72 h. Для каждой временной точки готовили отдельный культуральный планшет, чтобы избежать многократного открытия инкубатора во время измерений. По истечении периода культивирования в каждую лунку, избегая образования пузырьков, добавляли 10 µL раствора CCK-8. Затем культуральный планшет помещали в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂ и инкубировали в темноте в течение 2 h. Оптическую плотность в каждой лунке измеряли сразу после этого при 450 nm с помощью микропланшетного ридера. В конечном итоге жизнеспособность клеток выражали в процентах.

Анализ апоптоза клеток

Степень апоптоза определяли методом проточной цитометрии после окрашивания Annexin V-FITC/PI. Клетки Caco-2 из каждой группы обработки собирали и дважды промывали ледяным PBS. Центрифугирование проводили при 300 × g в течение 5 min при 4 °C. Осадок клеток ресуспендировали в 100 µL 1× связывающего буфера, после чего последовательно добавляли 5 µL Annexin V-FITC и 5 µL PI. После осторожного перемешивания образцы инкубировали в течение 15 min при комнатной температуре в темном месте. Затем добавляли 300 µL 1× связывающего буфера и аккуратно перемешивали суспензию перед переносом в пробирку для проточной цитометрии объемом 5 mL. Анализ образцов методом проточной цитометрии проводили в течение 1 h.

Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER)

Проницаемость оценивали путем измерения значений TEER клеток Caco-2²³. Клетки Caco-2 высевали в камеры Transwell и культивировали в течение 21 дня до образования плотного монослоя. Для каждого экспериментального условия было проведено шесть независимых биологических повторностей и пять технических повторностей. До и после экспериментального воздействия значения TEER для каждой группы измеряли с помощью измерителя трансмембранного сопротивления, используя электроды, стерилизованные этанолом и уравновешенные PBS. Вкратце, длинный стержень электрода погружали в базалатеральную культуральную среду, а короткий — в апикальную культуральную среду, избегая контакта с фильтрующей мембраной. После стабилизации считывали значение сопротивления (Ω) и повторяли измерения до получения трех согласованных показателей. Сопротивление холостых фильтров Transwell (без клеток) измеряли в тех же условиях, и это значение вычитали из всех экспериментальных показаний. TEER (Ω·cm²) = (сопротивление образца – сопротивление холостой пробы) × эффективная площадь мембраны. Данные представлены как: (экспериментальная группа/контрольная группа) × 100%.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Супернатанты клеток Caco-2 из различных групп обработки собирали после 24 ч культивирования. Уровни провоспалительных цитокинов, включая фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-8 (IL-8) и интерлейкин-1β (IL-1β), измеряли с помощью коммерческих реагентов для ELISA в соответствии с инструкциями производителя. Анализ проводили строго согласно протоколу. Образцы и стандарты вносили в лунки, предварительно покрытые антителами, затем инкубировали и промывали. После этого добавляли биотинилированные детектирующие антитела. После повторной инкубации и промывки добавляли стрептавидин, меченный пероксидазой хрена. В завершение для проявления цвета добавляли субстрат TMB, а реакцию останавливали стоп-раствором. Оптическую плотность каждой лунки измеряли сразу после этого при 450 nm с помощью микропланшетного ридера.

Вестерн-блоттинг

Белки выделяли из клеток Caco-2 после указанных воздействий с использованием буфера RIPA, содержащего ингибиторы протеаз. Концентрацию белка определяли с помощью метода бицинкинонинной кислоты (BCA-тест). В каждую лунку наносили 30 µg белка, который разделяли в 10% SDS-PAGE гелях с последующим переносом на ПВДФ-мембраны. Мембраны блокировали в 5% растворе обезжиренного молока в течение 1 ч при комнатной температуре, затем инкубировали в течение ночи при 4 °C с антителами к ZO-1 (1:1,000), окклюдину (1:500), клаудину-2 (1:1,000) и GAPDH (1:5,000). После промывки мембраны инкубировали с конъюгированными с HRP вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Полосы детектировали методом усиленной хемилюминесценции (ECL), интенсивность полос анализировали с помощью ImageJ. GAPDH использовали в качестве контроля загрузки.

Двойной люциферазный репортерный анализ (DLR)

Потенциальные сайты связывания miR-29b-3p с последовательностью NEAT1 были предсказаны с помощью базы данных ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Впоследствии фрагменты NEAT1, содержащие сайты связывания дикого типа (WT) или мутантные (MUT) сайты, были клонированы в репортерный вектор pmirGLO. Сконструированная рекомбинантная плазмида была совместно трансфицирована в клетки с мимиками miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) или ингибиторами и соответствующими отрицательными контролями (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и определяли активность люциферазы светлячка и люциферазы Renilla с использованием реагента для определения двойной люциферазы. Активность люциферазы Renilla использовали в качестве внутреннего эталона для стандартизации.

Анализ иммунопреципитации РНК (RIP)

Для анализа RIP клетки Caco-2 собирали, промывали PBS и инкубировали на льду в течение 15 мин в 200 µL лизирующего буфера RIP с добавлением ингибиторов протеаз и РНказ. Лизаты клеток центрифугировали при 16,000 × g в течение 10 мин при 4 °C, при этом 10 µL каждого супернатанта оставляли в качестве контрольного образца (input). Для иммунопреципитации 40 µL магнитных бусин Protein A/G перемешивали с 5 µg антител к Ago2 или нормальным IgG в 200 µL промывочного буфера RIP в течение 30 мин при комнатной температуре. После трех промывок 500 µL промывочного буфера RIP 100 µL суспензии бусин объединяли со 100 µL лизата, доводили общий объем до 1 mL промывочным буфером RIP и инкубировали в течение ночи при 4 °C с перемешиванием. Затем бусины промывали пять раз 500 µL промывочного буфера RIP и ресуспендировали в 150 µL того же буфера. Переваривание белков проводили путем добавления 15 µL протеиназы K (20 mg/mL) и 15 µL 10% SDS с последующей инкубацией при 55 °C в течение 30 мин при встряхивании. Супернатант собирали, РНК изолировали с помощью экстракционного реагента и осаждали в течение ночи. Обогащение NEAT1 и miR-29b-3p затем оценивали методом RT-qPCR.

Анализ субклеточной локализации

Клетки Caco-2 разделяли на ядерную и цитоплазматическую фракции с использованием указанного коммерчески доступного реагента для ядерно-цитоплазматического разделения в соответствии с инструкциями производителя. Из этих двух компонентов экстрагировали общую РНК, после чего распределение NEAT1 в ядре и цитоплазме определяли методом RT-qPCR. Калибровку проводили с использованием мРНК U6 (преимущественно ядерной) и GAPDH (преимущественно цитоплазматической) в качестве индикаторов эффективности разделения.

Статистический анализ

Для клинических образцов сыворотки анализ статистической мощности (t-критерий, d = 0.5, α = 0.05, мощность = 0.9) показал, что в каждой группе требуется минимум 86 субъектов. Чтобы учесть возможные непредвиденные обстоятельства в ходе исследования, в каждую группу было включено 116 пациентов для выявления клинически значимых различий. Нормальность распределения данных для непрерывных переменных оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку все непрерывные данные были распределены нормально (P > 0.05), применялся параметрический анализ. Категориальные переменные анализировали с помощью критерия хи-квадрат. Эксперименты на клеточных культурах включали шесть независимых биологических повторностей, по пять технических повторностей для каждой биологической повторности. Данные представлены как среднее значение ± SD. Сравнение двух групп непрерывных переменных проводили с использованием t-критерия Стьюдента, а сравнение нескольких групп анализировали с помощью однофакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки. Статистическая значимость была определена как P < 0.05.

Результаты

Экспрессия NEAT1 и диагностическая ценность

По сравнению с группой здорового контроля (HC), уровни экспрессии NEAT1 у пациентов с СРК-Д были заметно выше (P < 0.0001; Рисунок 1A). Площадь под кривой (AUC) для NEAT1, согласно ROC-кривой (рабочей характеристике приемника), составила 0.867 (95% ДИ: 0.821–0.913). Специфичность составила 75.9%, а чувствительность — 84.5% (Рисунок 1B). Это позволяет предположить, что аномальная экспрессия NEAT1 в сыворотке крови пациентов с СРК-Д может служить новым диагностическим биомаркером данного заболевания.

Кроме того, были compared клинические данные пациентов в группах здоровых лиц и лиц с СРК-Д. Результаты показали отсутствие значимых различий между двумя группами по возрасту, полу и другим характеристикам (P > 0.05). Однако наблюдались значимые различия по показателям HADS, частоте дефекации и форме стула (P < 0.0001, Таблица 2). Что касается частоты абдоминальных болей, 69 пациентов испытывали симптомы ≥ 5 дней, что составило 59,48% случаев. Относительно интенсивности абдоминальных болей, у 72 пациентов балл был ≥ 5, что составило 62,07% (Таблица 2). Это означает, что пациенты с СРК-Д четко отличимы от контрольной группы по своим симптомам. Учитывая клиническую связь между повышенным уровнем NEAT1 и симптомами СРК-Д, далее мы исследовали функциональное влияние NEAT1 на целостность кишечного барьера, используя модель клеток Caco-2, обработанных LPS.

Влияние низких уровней NEAT1 на повреждение кишечного барьера и воспалительные реакции в клетках Caco-2, обработанных LPS

Для моделирования дисфункции кишечного барьера и вялотекущего воспаления, наблюдаемых при СРК-Д, мы обработали клетки Caco-2 LPS. При добавлении LPS к клеткам уровни NEAT1 повышались по сравнению с контрольной группой. После трансфекции si-NEAT1 уровень NEAT1 заметно снизился по сравнению с группой LPS + si-NC (P < 0.0001, Рисунок 2A). Обработка LPS снижала жизнеспособность клеток и увеличивала апоптоз относительно контрольной группы. После нокдауна NEAT1 жизнеспособность клеток увеличилась, а уровень апоптоза снизился по сравнению с группой LPS + si-NC (P < 0.001; Рисунок 2B,C). После нокдауна NEAT1 сниженный под действием LPS показатель TEER был значительно восстановлен (P < 0.0001, Рисунок 2D). LPS снижал экспрессию мРНК ZO-1 и окклюдина и повышал экспрессию клаудина-2 относительно контролей, в то время как нокдаун NEAT1 обращал эти изменения (P < 0.001, Рисунок 2E-G). Обработка LPS может вызвать воспалительный ответ в клетках. Уровни провоспалительных факторов TNF-α, IL-6, IL-8 и IL-1β в клетках были выше, чем в контрольной группе. После нокдауна NEAT1 содержание провоспалительных факторов в клетках значительно снизилось по сравнению с группой si-NC (P < 0.0001, Рисунок 3A-D). Это позволяет предположить, что низкие уровни NEAT1 уменьшают вызванную LPS дисфункцию кишечного барьера и воспалительные реакции, и что NEAT1 может способствовать прогрессированию СРК-Д.

Прямое связывание NEAT1 и его влияние на miR-29b-3p в клетках Caco-2

В клетках Caco-2 NEAT1 локализуется преимущественно в цитоплазме (Рисунок 4A). Сайты связывания NEAT1 и miR-29b-3p были предсказаны с помощью базы данных ENCORI. На основании этого мы разработали последовательности WT-NEAT1 и MUT-NEAT1 (Рисунок 4B). Результаты эксперимента DLR показали, что миметики miR-29b-3p снижали ферментативную активность WT-NEAT1 по сравнению с контролем миметиков (mimic NC), тогда как его ингибиторы повышали её по сравнению с контролем ингибиторов (inhibitor NC). Напротив, ни одно из воздействий не оказало влияния на MUT-NEAT1 (P < 0.0001, Рисунок 4C). Анализ RIP показал, что NEAT1 и miR-29b-3p присутствовали в значительно большем количестве во фракции анти-Ago2 по сравнению с группой анти-IgG, что указывает на специфическое взаимодействие между ними (P < 0.0001, Рисунок 4D). Эти результаты свидетельствуют о том, что NEAT1 специфически связывается с miR-29b-3p. В то же время уровень miR-29b-3p был заметно снижен у пациентов с СРК-Д по сравнению с группой здорового контроля (HC) (P < 0.0001, Рисунок 4E). AUC её ROC-кривой составила 0.856 (95% CI: 0.808–0.905) при чувствительности 89.7% и специфичности 71.6% (Рисунок 4F). Корреляционный анализ Пирсона выявил обратную корреляцию между уровнями NEAT1 и экспрессией miR-29b-3p (r = -0.744, P < 0.0001, Рисунок 4G).

Влияние низкого уровня NEAT1 на повреждение кишечного барьера в клетках Caco-2, обработанных LPS, и уровни miR-29b-3p

В клетках Caco-2, обработанных LPS, экспрессия miR-29b-3p была заметно снижена по сравнению с контрольной группой. Трансфекция si-NEAT1 повышала уровни miR-29b-3p, тогда как трансфекция ингибитором miR-29b-3p снова приводила к снижению уровней miR-29b-3p (P < 0.0001, Рисунок 5A). Нокдаун NEAT1 повышал жизнеспособность клеток и снижал уровень апоптоза, и эти эффекты нивелировались ингибитором miR-29b-3p (P < 0.01, Рисунок 5B,C). Снижение TEER, индуцированное LPS, восстанавливалось при нокдауне NEAT1, и это восстановление снова блокировалось ингибитором miR-29b-3p (P < 0.0001, Рисунок 5D). Обработка LPS приводила к снижению экспрессии мРНК ZO-1 и окклюдина и повышению экспрессии мРНК клаудина-2 по сравнению с контрольной группой. После нокдауна NEAT1 уровни miR-29b-3p повысились, уровни мРНК ZO-1 и окклюдина выросли, а уровни мРНК клаудина-2 снизились по сравнению с группой LPS + si-NC. После ингибирования miR-29b-3p уровни мРНК ZO-1 и окклюдина снизились, а уровни мРНК клаудина-2 повысились по сравнению с группой LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC (P < 0.001, Рисунок 5E-G). NEAT1 (преимущественно цитоплазматический подтип NEAT1_1) действует как «губка» для miR-29b-3p. Нокдаун NEAT1 высвобождает miR-29b-3p, тем самым косвенно повышая экспрессию ZO-1 и окклюдина и снижая экспрессию клаудина-2, что уменьшает вызванное LPS нарушение барьерной функции. Эти результаты позволяют предположить, что в данной модели miR-29b-3p положительно регулирует экспрессию ZO-1 и окклюдина и отрицательно регулирует экспрессию клаудина-2, и что эффекты нокдауна NEAT1 опосредованы, по крайней мере частично, miR-29b-3p.

Далее мы исследовали уровни экспрессии белков плотных контактов с помощью вестерн-блот-анализа. Как показано на рисунке 5H, нокдаун NEAT1 привел к увеличению экспрессии ZO-1 и окклюдина, сниженной под действием LPS, и подавлению экспрессии клаудина-2 по сравнению с группой LPS + si-NC. Однако котрансфекция с ингибитором miR-29b-3p ослабила защитный эффект нокдауна NEAT1 по сравнению с группой LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. Эти результаты подтверждают вывод о том, что нокдаун NEAT1 восстанавливает экспрессию белков плотных контактов, по крайней мере частично за счет ап-регуляции miR-29b-3p, тем самым улучшая функцию кишечного барьера.

Влияние низкого уровня NEAT1 на воспаление кишечника в клетках Caco-2, обработанных LPS, и экспрессию miR-29b-3p

В клетках Caco-2, обработанных LPS, LPS вызывал воспалительную реакцию. Уровни провоспалительных факторов TNF-α, IL-6, IL-8 и IL-1β были значительно выше, чем в контрольной группе. После нокдауна NEAT1 уровни miR-29b-3p увеличились, в то время как уровни провоспалительных факторов значительно снизились по сравнению с si-NC. После ингибирования miR-29b-3p уровни воспалительных факторов снова возросли (P < 0.0001, Рисунок 6A-D). Таким образом, нокдаун NEAT1 подавляет высвобождение воспалительных цитокинов, по крайней мере частично, путем ап-регуляции miR-29b-3p.

Эти результаты указывают на то, что уровни NEAT1 аномально повышены в сыворотке крови пациентов с СРК-Д и что NEAT1 обладает высоким значением AUC для дифференциации пациентов с СРК-Д от здорового контроля. С точки зрения механизмов, NEAT1 напрямую связывает и секвестрирует miR-29b-3p в цитоплазме. В клеточных моделях и экспериментах по функциональному спасению нокдаун NEAT1 приводил к увеличению экспрессии miR-29b-3p, улучшению выживаемости клеток и TEER, снижению апоптоза и ослаблению высвобождения провоспалительных цитокинов. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что NEAT1 отрицательно регулирует целостность кишечного барьера путем ингибирования miR-29b-3p, и позволяют предположить, что воздействие на NEAT1 может стать потенциальной диагностической и терапевтической стратегией при СРК-Д.

Доступность данных:

Исходные данные, лежащие в основе рисунков и таблиц, представлены в Дополнительном файле 1 (таблица с исходными данными) и Дополнительном файле 2 (неотредактированные изображения вестерн-блоттинга).

Рисунок 1. Экспрессия и диагностическая значимость NEAT1 у пациентов с СРК-Д. (A) Уровни экспрессии NEAT1 в сыворотке крови здорового контроля (HC, n = 116) и пациентов с СРК-Д (n = 116), определенные методом RT-qPCR; (B) ROC-анализ NEAT1 для дифференциации пациентов с СРК-Д от здорового контроля. Данные представлены как среднее значение ± SD (n = 116 в группе). **** P < 0.0001. Сокращения: СРК-Д = синдром раздраженного кишечника с диареей; ROC = рабочая характеристика приемника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Влияние NEAT1 на повреждение кишечного барьера в клетках Caco-2, вызванное LPS. (A) Трансфекция si-NEAT1 снижает уровни NEAT1, индуцированные LPS; (B) Жизнеспособность клеток, измеренная с помощью теста CCK-8 через 0, 24, 48 и 72 ч. Нокдаун NEAT1 повышает жизнеспособность клеток; (C) Уровень апоптоза, определенный методом проточной цитометрии с окрашиванием Annexin V-FITC/PI. Сайленсинг NEAT1 снижает уровень апоптоза; (D) Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER), измеренное в монослоях Caco-2. Ингибирование NEAT1 увеличивает клеточное TEER; (E-G) Уровни экспрессии мРНК (E) ZO-1, (F) окклюдина и (G) клаудина-2, измеренные методом RT-qPCR. Сайленсинг NEAT1 повышает экспрессию мРНК ZO-1 и окклюдина, снижает уровни мРНК клаудина-2. Данные представлены как среднее значение ± SD по результатам шести независимых экспериментов (n = 6 в группе). *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS по сравнению с контролем, LPS + si-NEAT1 по сравнению с LPS + si-NC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Влияние нокдауна NEAT1 на индуцированный LPS выброс провоспалительных цитокинов в клетках Caco-2. (A-D) Концентрации (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 и (D) IL-1β в супернатантах клеточных культур, измеренные с помощью ELISA. Нокдаун NEAT1 снижает индуцированные LPS уровни TNF-α, IL-6, IL-8 и IL-1β. Данные представлены как среднее ± SD по шести независимым экспериментам (n = 6 в группе). **** P < 0.0001, LPS по сравнению с контролем, LPS + si-NEAT1 по сравнению с LPS + si-NC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Рисунок 4. Прямое связывание NEAT1 и ассоциация с miR-29b-3p. (A) Субклеточная локализация NEAT1 в клетках Caco-2, определенная путем ядерно-цитоплазматического фракционирования (U6: ядерный контроль, GAPDH: цитоплазматический контроль). NEAT1 локализуется преимущественно в цитоплазме; (B) Предсказанные последовательности связывания WT и MUT для NEAT1 с miR-29b-3p из базы данных ENCORI; (C) Анализ DLR подтвердил связь между NEAT1 и miR-29b-3p; (D) RIP подтвердил связь между NEAT1 и miR-29b-3p. Данные на A, C и D представлены как среднее ± SD по результатам шести независимых экспериментов (n = 6 в группе). (E) Уровни экспрессии miR-29b-3p в сыворотке крови у здоровых добровольцев (HC, n = 116) и пациентов с СРК-Д (n = 116); (F) ROC-кривая для miR-29b-3p для дифференциации пациентов с СРК-Д от здорового контроля; (G) Корреляционный анализ Пирсона между уровнями NEAT1 и miR-29b-3p у пациентов с СРК-Д. NEAT1 отрицательно коррелировал с экспрессией miR-29b-3p (r = -0.744, P < 0.0001). Данные на E представлены как среднее ± SD (n = 116 в группе). **** P < 0.0001. Сокращения: WT = дикий тип; MUT = мутантный; DLR = двухлюциферазный репортерный анализ; RIP = РНК-иммунопреципитация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5. Влияние нокдауна NEAT1 на функцию кишечного барьера в клетках Caco-2, обработанных LPS, и на miR-29b-3p. (A) Нокдаун NEAT1 повышает уровни miR-29b-3p, в то время как трансфекция ингибиторами miR-29b-3p снижает экспрессию miR-29b-3p. (B) Жизнеспособность клеток, измеренная с помощью анализа CCK-8. Низкие уровни NEAT1 повышают жизнеспособность клеток за счет увеличения miR-29b-3p; (C) Степень апоптоза, определенная методом проточной цитометрии. Низкие уровни NEAT1 снижают скорость апоптоза за счет увеличения miR-29b-3p; (D) Низкие уровни NEAT1 повышают TEER клеток за счет повышения уровня miR-29b-3p; (E-G) Экспрессия мРНК (E) ZO-1, (F) окклюдина и (G) клаудина-2. Низкие уровни NEAT1 повышают экспрессию ZO-1 и окклюдина и снижают экспрессию мРНК клаудина-2 за счет усиления miR-29b-3p. (H) Репрезентативные изображения вестерн-блоттинга, показывающие экспрессию белков ZO-1, окклюдина, клаудина-2 и GAPDH при указанных условиях обработки. Данные представлены как среднее ± SD по шести независимым экспериментам (n = 6 в группе). ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS против контроля, LPS + si-NEAT1 против LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-ингибитор против LPS + si-NEAT1 + ингибитор NC. Сокращения: miR-ингибитор = ингибитор miR-29b-3p; TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6. Влияние нокдауна NEAT1 на воспаление в клетках Caco-2, обработанных LPS, и на miR-29b-3p. (A-D) Концентрации (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 и (D) IL-1β в супернатантах клеточных культур, измеренные методом ELISA. Низкие уровни NEAT1 снижают содержание TNF-α, IL-6, IL-8 и IL-1β в супернатанте клеток за счет повышения уровня miR-29b-3p. Данные представлены как среднее значение ± SD по шести независимым экспериментам (n = 6 на группу). **** P < 0.0001, LPS против контроля, LPS + si-NEAT1 против LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-ингибитор против LPS + si-NEAT1 + ингибитор NC. Сокращение: miR-ингибитор = ингибитор miR-29b-3p. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ген	Последовательность праймера
NEAT1 прямой (праймер)	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
обратный праймер NEAT1	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
прямой праймер ZO-1	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3’′
реверс ZO-1	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Прямой праймер к окклюдину	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Обратный перевод окклюдина	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Прямой праймер к клаудину-2	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Реверсивный праймер к Claudin-2	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
прямой праймер к miR-29b-3p	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
обратный праймер для miR-29b-3p	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
прямой праймер к GAPDH	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
реверс-праймер к GAPDH	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
прямой праймер U6	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 реверсный праймер	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Таблица 1: Последовательности праймеров.

Показатель	Контрольная группа (N=116)	Группа СРК-Д (N=116)	P
Возраст, лет
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
Пол
Мужской	64	66	0.895
Женский	52	50
Курение
НЕТ	58	53	0.599
ДА	58	63
Употребление алкоголя
НЕТ	63	58	0.599
ДА	53	58
HADS, балл
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
Частота дефекации, кол-во/день
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
Консистенция стула, Бристольская шкала
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
Частота абдоминальных болей, кол-во дней
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
Интенсивность абдоминальных болей, балл
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

Таблица 2: Сравнение демографических и клинических характеристик здоровых лиц из контрольной группы и пациентов с СРК-Д. Значения представлены в виде количества участников для каждой группы (n = 116/группа). Межгрупповые различия оценивались с помощью критерия хи-квадрат. Сокращения: HADS = госпитальная шкала тревоги и депрессии; СРК-Д = синдром раздраженного кишечника с диареей.

Дополнительный файл 1: Исходные данные, лежащие в основе рисунков и таблиц. Этот файл содержит исходные численные данные, использованные для получения количественных результатов, представленных на Рисунке 1, Рисунке 2, Рисунке 3, Рисунке 4, Рисунке 5 и Рисунке 6, а также демографические и клинические данные, обобщенные в Таблице 2.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Неотредактированные изображения вестерн-блоттинга. Данный файл содержит неотредактированные изображения вестерн-блоттинга для ZO-1, окклюдина, клаудина-2 и GAPDH, соответствующие репрезентативной панели вестерн-блоттинга, представленной на Рисунке 5H.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

СРК-Д является распространенным функциональным заболеванием желудочно-кишечного тракта. Его патологический механизм до конца не выяснен. В последние годы lncRNA, являясь ключевыми молекулами эпигенетической регуляции, продемонстрировали большой потенциал в области диагностики и лечения заболеваний. LncRNA NEAT1 изучалась при различных патологиях, таких как колоректальный рак²⁴, глиома²⁵ и инфаркт миокарда²⁶. Многочисленные исследования показали, что NEAT1 участвует в регуляции воспалительных ответов¹³, пролиферации клеток²⁷ и целостности кишечного барьера²⁸. Однако специфическая экспрессия NEAT1 при СРК-Д, ее клиническая значимость и лежащие в основе СРК-Д регуляторные механизмы еще не были подробно изучены.

NEAT1 экспрессируется повышенно при различных воспалительных состояниях, таких как пневмония²⁹, остеоартрит³⁰, ринит³¹ и сепсис³². Наши результаты согласуются с данными, опубликованными в этих исследованиях: экспрессия NEAT1 значительно повышена у пациентов с СРК-Д. Это позволяет предположить, что данная длинная некодирующая РНК может быть связана с развитием СРК-Д. В настоящее время диагностика СРК-Д опирается преимущественно на симптоматические критерии Rome IV, и объективные лабораторные биомаркеры отсутствуют. Хотя эти критерии доказали свою эффективность в исследованиях и во многих клинических условиях, они все же имеют ограничения, включая субъективность, перекрытие симптомов с другими заболеваниями и задержки в диагностике. Дальнейший анализ ROC-кривых показывает, что NEAT1 обладает относительно высокой диагностической ценностью для пациентов с СРК-Д. Уровни экспрессии NEAT1 в сыворотке крови эффективно позволяют отличить пациентов с СРК-Д от здорового контроля, при этом AUC составляет 0,867 с высокой чувствительностью и специфичностью. Это свидетельствует о том, что NEAT1 является перспективным инструментом для дополнения критериев Rome IV при диагностике или в качестве нового диагностического маркера СРК-Д. Например, пациенты с хроническими болями в животе и изменением характера дефекации, у которых наблюдается повышенный уровень NEAT1, могут быть обследованы с большей уверенностью, если результаты анализа биомаркера будут рассматриваться вместе с критериями Rome IV. Это способствует раннему началу таргетной терапии симптомов и позволяет избежать ненужных инвазивных обследований. И наоборот, для пациентов с нормальными результатами биомаркеров, но соответствующих критериям Rome IV, требуется более тщательный мониторинг для исключения других органических заболеваний. Таким образом, ожидается, что внедрение этих биомаркеров в клиническую практику повысит точность и эффективность диагностики, хотя все еще требуется проспективная валидация в клинических условиях.

Клинические симптомы, наблюдаемые у пациентов с СРК-Д, могут быть связаны с нарушением функции кишечного барьера³³. Эта функция преимущественно опосредована структурой плотных контактов (ПК) между эпителиальными клетками кишечника, в которой важную роль играют белки ZO-1 и окклюдин^34,35. ZO-1 участвует в поддержании механического барьера и проницаемости слизистого эпителия³⁶. Окклюдин в основном отвечает за формирование плотных контактов между клетками, которые имеют решающее значение для поддержания их барьерной функции³⁷. Белок плотных контактов клаудин-2, помимо прочих функций, играет важную роль в формировании обходных поровых каналов между клетками³⁸. У пациентов с СРК-Д уровни ZO-1 и окклюдина обычно снижены, уровень клаудина-2 повышен, кишечный барьер поврежден, а проницаемость увеличена. В данном исследовании было обнаружено, что нокдаун NEAT1 увеличивал TEER в клеточной модели in vitro, что подтверждает повреждающее действие NEAT1 на кишечный барьер в данной модели. На молекулярном уровне ингибирование экспрессии NEAT1 привело к значительному восстановлению уровней экспрессии мРНК ключевых белков плотных контактов ZO-1 и окклюдина, в то время как экспрессия клаудина-2 снизилась. Это позволяет предположить, что NEAT1 может негативно регулировать экспрессию белков плотных контактов, нарушая физический барьер эпителия кишечника и повышая его проницаемость. В конечном итоге это может привести к феномену «синдрома дырявого кишечника». Кроме того, низкоинтенсивное воспаление, широко распространенное при СРК-Д, является важным фактором, усугубляющим повреждение барьера³⁹. Многочисленные исследования подтвердили, что lncRNA могут выступать в качестве ключевых регуляторных узлов в путях воспалительной сигнализации⁴⁰. Наши результаты согласуются с этим. Нокдаун NEAT1 значительно снижает высвобождение провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-6, IL-8 и IL-1β, индуцированных LPS. Это очень похоже на роль NEAT1 как провоспалительной lncRNA в других моделях воспаления, что указывает на возможность существования при СРК-Д порочного круга «воспаление — повреждение барьера — воспаление», в котором NEAT1 играет важную роль.

МикроРНК (мРНК) представляют собой еще один важный класс факторов, участвующих в регуляции заболеваний. miR-29b-3p низко экспрессируется при различных клеточных воспалительных реакциях, индуцированных LPS^41,42. В соответствии с большинством исследований, мы обнаружили, что уровни miR-29b-3p были заметно снижены в сыворотке крови пациентов с СРК-Д и демонстрировали сильную отрицательную корреляцию с повышением экспрессии NEAT1. Далее мы показали, что в данной модели NEAT1 напрямую связывается с miR-29b-3p и выступает в роли «губки» для этой мРНК в цитоплазме. Эксперимент по функциональному восстановлению дополнительно показал, что NEAT1 влияет на жизнеспособность и апоптоз клеток Caco-2, а также на уровни мРНК ZO-1, occludin, and claudin-2, по крайней мере частично через miR-29b-3p, и в конечном итоге влияет на целостность кишечного барьера. Примечательно, что наши данные указывают на то, что в контексте дисфункции кишечного барьера, связанной с СРК, уровни miR-29b-3p положительно коррелируют с уровнями ZO-1 и окклюдина. Эта положительная регуляция может быть непрямой; например, miR-29b-3p может подавлять транскрипцию белков плотных контактов, воздействуя на их транскрипционные репрессоры, тем самым снимая репрессию и стимулируя экспрессию ZO-1 и окклюдина. Эта гипотеза также подтверждается предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что miR-29b-3p играет защитную роль при воспалительных состояниях, воздействуя на негативные регуляторы барьерной функции⁴².

Однако для завершения построения сети ceRNA требуется дальнейшее изучение целевых генов, посредством которых miR-29b-3p регулирует экспрессию мРНК ZO-1 и окклюдина, что является ограничением нашего текущего исследования. Кроме того, наше исследование имеет и другие недостатки: во-первых, это было одноцентровое исследование с относительно небольшой выборкой (было включено всего 116 пациентов с IBS-D). Клиническая диагностическая значимость NEAT1 все еще нуждается в дополнительном подтверждении в ходе крупномасштабных многоцентровых проспективных когортных исследований. Во-вторых, данная работа основана преимущественно на анализе клинических ассоциаций и клеточных моделях in vitro. В будущем потребуются модели на животных для подтверждения роли этой оси in vivo. В-третьих, специфическая сеть нижележащих генов-мишеней miR-29b-3p, участвующих в патогенезе IBS-D, еще не была полностью выяснена. Будущие исследования должны быть сосредоточены на: (1) подтверждении диагностической значимости NEAT1 и miR-29b-3p у пациентов с IBS-C и IBS-M; (2) тестировании терапевтической эффективности вмешательств, направленных на NEAT1, на животных моделях; и (3) выяснении точного молекулярного механизма, с помощью которого miR-29b-3p регулирует белки плотных контактов. Такие усилия будут способствовать клиническому внедрению наших результатов.

В заключение следует отметить, что NEAT1 высоко экспрессируется у пациентов с СРК-Д и обладает высокой диагностической ценностью в данной когорте. Низкие уровни NEAT1 могут способствовать жизнеспособности клеток, снижать апоптоз, уменьшать повреждение кишечного барьера и подавлять воспалительные реакции путем повышения уровней miR-29b-3p в клетках Caco-2, обработанных LPS. Ось NEAT1/miR-29b-3p открывает новые перспективы в понимании сложных патофизиологических механизмов СРК-Д. NEAT1 может служить потенциальным диагностическим биомаркером СРК-Д, а ось NEAT1/miR-29b-3p может представлять собой потенциальную терапевтическую мишень при данном заболевании.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
планшеты на 24 лунки	Corning	CLS3524	Для посева клеток
96-луночные планшеты	Corning	CLS3599	Для посева клеток в анализах CCK-8
Набор для определения апоптоза Annexin V-FITC/PI	Invitrogen	V13242	Для определения скорости апоптоза
Моноклональное антитело к AGO2	Proteintech	67934-1-Ig	Для иммунопреципитации РНК-комплексов, связанных с Ago2
Антитело к клаудину-2	Invitrogen	32-5600	Первичные антитела, разведение 1:1000
антитела к GAPDH	Технологии клеточной сигнализации	5174	Первичные антитела, разведение 1:5000; контроль загрузки
Антитела к IgG человека	Proteintech	10284-1-AP	Используется в качестве отрицательного контроля для анализа RIP
Антитела к окклудину	Abcam	ab31721	Первичные антитела, разведение 1:500
антитела к ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Первичные антитела, разведение 1:1000
Клетки Caco-2	SUNNCELL	SNL-068	Для создания моделей кишечного эпителиального барьера
набор CCK-8	Solarbio	CA1210	Набор для анализа пролиферации клеток
Хлороформ	Sigma-Aldrich	C2432	Для разделения фаз при экстракции РНК
среда DMEM	Gibco	11965092	Для культивирования клеток
Набор для двухлюциферазного репортерного анализа	ThermoFisher	16186	Для определения люциферазной активности
Набор для ИФА (для IL-1)β)	R&R&D Systems	DY201	Для детектирования целевых белков в супернатантах культур клеток
Набор для ИФА (на ИЛ-6)	R&D Systems	D6050B	Для детектирования целевых белков в супернатантах культур клеток
Набор для ИФА (для ИЛ-8)	R&D Systems	NBP3-28022	Для обнаружения целевых белков в супернатантах культур клеток
набор для ИФА (для TNF-α)	R&R&D Systems	DTA00D	Для определения целевых белков в супернатантах культур клеток
Субстрат для усиленной хемилюминесценции (ECL)	Thermo Fisher	32106	Для визуализации белковых полос
Этанол (75%)	Sigma-Aldrich	459844	Для промывки осадка РНК
FBS (фетальная бычья сыворотка)	Gibco	10099141	Для культивирования клеток
Проточный цитометр	Beckman Coulter	B53002	Для определения уровня апоптоза
Вторичные антитела, конъюгированные с HRP	Технологии клеточной сигнализации	7074	Катализировать генерацию хемилюминесцентного сигнала из субстратов ECL
Изопропанол	Sigma-Aldrich	1133502500	Для осаждения РНК
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	Реагент для трансфекции
Липополисахарид (ЛПС)	Sigma-Aldrich	L2880	Для создания индуцированной клеточной модели
Считыватель микропланшетов	BioTek	Эпоха 2	Для определения оптической плотности образцов в 96-луночных планшетах
Микроспектрофотометр Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000C	Для определения концентрации и чистоты РНК
Обезжиренное сухое молоко	Coolaber	CN7861	Для блокировки мембран (5% раствор)
Набор PARIS	Thermo Fisher	AM1921	Для фракционирования ядер и цитоплазмы
Пенициллин–Стрептомицин	Gibco	15140122	Для обеспечения устойчивости растущих клеток к контаминации
Набор для определения концентрации белка Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225	Для определения концентрации белков
вектор pmirGLO для двухлюциферазного анализа	Promega	E1330	Вектор с двойным люциферазным репортерным геном
Набор реагентов PrimeScript RT Reagent Kit	Takara	RR047A	Для обратной транскрипции РНК в кДНК
ПВДФ-мембрана	Millipore	IPVH00010	Для переноса белков после SDS-PAGE
Прибор для количественной ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией	Applied Biosystems	4365464	Для детекции целевых генов
буфер для лизиса RIPA (с ингибиторами протеаз)	Thermo Fisher	89901	Для экстракции общего белка из клеток
Набор для иммунопреципитации РНК-связывающих белков	Sigma-Aldrich	17-701	Анализ иммунопреципитации РНК-связывающих белков (RIP) с использованием магнитных бус с белком A/G
Реагенты для SDS-PAGE (10% гель)	TargetMol	C0189	Для разделения белков по молекулярной массе
мастер-микс SYBR Green	Thermo Fisher	4309155	Для использования в ПЦР-тестировании
Измеритель TEER (вольт-омметр)	Millipore	MERS00002	Измеритель трансмембранного сопротивления для определения целостности монослоя
Камеры Transwell	Corning Costar	CLS3413	Для культивирования клеточных монослоев и измерения TEER
реагент TRIzol	Invitrogen	15596026CN	Для экстракции тотальной РНК