Связь сывороточной РНК CASC11 с тяжестью травмы и воспалениями при повреждении спинного мозга

Краткое содержание

У пациентов с травмой спинного мозга (ТСМ) повышенная регуляция CASC11 связана с тяжестью травмы. In vitro снижение нагрузки CASC11 облегчало апоптоз и воспаление, что указывает на связь с осью miR-130b-5p/SPP1 . Эти результаты указывают на потенциальную роль CASC11 как кандидата на биомаркеры в патогенезе ТСМ.

Аннотация

Травма спинного мозга (ТСМ) — это тяжёлая травма центральной нервной системы. Это одноцентровое, наблюдательное и in vitro исследование изучало диагностический потенциал CASC11 и его возможный регулирующий механизм при ТСМ с использованием клинических образцов сыворотки и клеточных моделей, стимулируемых липополисахаридами. Уровни CASC11, miR-130b-5p и SPP1 измерялись с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR). Клеточные функции и таргетные связи оценивались с помощью клеточного подсчёта kit-8 (CCK-8), потоковой цитометрии, вестерн-блота, ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA), двухлюциферазного репортёра и РНК-иммунопреципитаций (RIP). CASC11 был сильно экспрессирован в ТСМ и ассоциировался с воспалениям как потенциальным диагностическим биомаркером. В клетках PC-12, обработанных липополисахаридами (LPS), подавление CASC11 снижало подавленную активность клеток, апоптоз и воспаление, что было остановлено ингибитором miR-130b-5p. Эти результаты свидетельствуют о том, что CASC11 связан с тяжестью ТСМ, а данные in vitro указывают на его участие в воспалительных и апоптотических ответах через ось CASC11/miR-130b-5p/SPP1 . Это исследование ограничено его одноцентровой конструкцией и отсутствием валидации in vivo .

Введение

Травма спинного мозга (ТСМ) обозначает временное или постоянное системное заболевание, возникающее вследствие повреждения спинного мозга, вызванного внешними факторами или заболеваниями, приводящим к нарушению моторной, сенсорной, рефлексной и вегетативной нервной системы ^1,2. Пациенты часто сталкиваются с пожизненными физическими функциональными нарушениями и осложнениями, что возлагает значительное страдание и бремя на отдельных людей и семьи. Этиология ТСМ широко классифицируется на травматическое и нетравматическое^{происхождение 3}. Травматические травмы, преимущественно вызванные переломами позвоночника под внешними воздействиеми, такими как дорожно-транспортные происшествия, падения с высоты и спортивные инциденты, представляют собой растущую проблему в клиническом управлении^{SCI 4}. В то же время каскад вторичных повреждений, начавшийся после первичной травмы, особенно нарушение воспалительного ответа и нейронного апоптоза, считаются ключевыми факторами, способствующими постоянному ухудшению неврологической функции. Недавние исследования подчеркнули критическую роль нейровоспаления, регенерации и функционального восстановления в патофизиологии и восстановлении^{ТСМ 5}. В качестве центрального вторичного ответа нейровоспаление играет двойную роль в процессе повреждения и восстановления тканей. Учитывая ограниченную регенеративную способность повреждённого спинного мозга, необходим синергетический терапевтический подход, сочетающий противовоспалительное лечение, трансплантацию клеток, реабилитацию и молекулярные^{вмешательства 6}. Хотя для ТСМ разработано множество диагностических и терапевтических стратегий, современная клиническая практика преимущественно опирается на визуализацию⁷. Однако эти методы ограничены высокими требованиями к современному оборудованию, строгими требованиями к пациентам и значительными финансовыми^{расходами 8}. В результате существует острая и неудовлетворённая потребность в удобном, точном и неинвазивном лабораторном биомаркере. Выявление такого маркера позволит раннее диагностировать ТСМ без нарушения традиционных протоколов лечения, тем самым способствуя разработке более своевременных и эффективных терапевтических вмешательств.

Длинная некодирующая РНК (lncRNA) представляет собой основную категорию функциональных РНК-молекул, которые, несмотря на отсутствие потенциала кодирования белков, являются неотъемлемой частью широкого спектра биологических функций, включая регуляцию воспаления и^{апоптоз 9}. LncРНК действуют как молекулярные губки для микроРНК (миРНК), тем самым эффективно препятствуя их связыванию и заглушая их целевые^{мРНК 10}. Например, lncRNA MAGI2-AS3 опосредует miR-223-3p, ускоряя заживление^{переломов 11}. Таргетирование сети lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 представляет собой перспективный терапевтический подход для улучшения восстановления при^{ТСМ 12}. CASC11, характеризующийся транскриптом 872 п.п., расположенным на хромосоме 8q24.21, признаётся молекулой с дисрегуляцией экспрессии в различных видах рака человека¹³. CASC11 демонстрирует положительную экспрессию у пациентов с постменопаузальным остеопорозом и способен различать поражённых людей от здоровых^{контрольных групп 14}. Кроме того, CASC11 демонстрирует схожий паттерн апрегуляции и терапевтический потенциал у пациентов с^{переломами 15}. Исходя из этих данных, CASC11 может регулировать воспалительные реакции и активность клеток. Несмотря на эти выводы, паттерн экспрессии и биологическая роль CASC11 при ТСМ остаются полностью неизвестными. Учитывая, что гипервоспаление и апоптоз являются основными факторами вторичного ТСМ, мы предположили, что CASC11 может быть кандидатом в качестве биомаркера и регуляторного фактора при ТСМ. В этом исследовании изучалась клиническая ассоциация и биомаркерный потенциал CASC11 при ТСМ, анализируя когорты пациентов и модели клеток in vitro (рисунок 1). Кроме того, мы исследовали возможный молекулярный механизм CASC11, включая его потенциальную роль в модулировании воспалительного ответа после ТСМ.

Протокол

Набор предметов

Пациенты с острой травмой спинного мозга (n = 300), проходившие лечение в больнице с января 2023 по май 2025 года, были отобраны и классифицированы в группу с полной травмой спинного мозга (КСК) (степень A, n = 98), группу с неполной травмой спинного мозга (ISCI) (степени B, C и D; n = 95) и группу нормальной неврологической функции (NNF) (степень E, n = 107) согласно шкале нарушения травм позвоночника (классификация AIS). У пациентов группы NNF радиологические признаки ТСМ, такие как отёк, контузия или компрессия, были подтверждены магнитно-резонансной томографией (МРТ), но сенсорных или моторных дефицитов не выявлено. Ещё 90 здоровых участников, набранных в тот же период, были отобраны в контрольную группу. Критерии включения: (1) диагноз ТСМ, подтверждённый с помощью визуализации (МРТ или КТ), в соответствии с установленными клиническими рекомендациями по^{ведению 16}; (2) травма, полученная в течение 24 часов до госпитализации; и (3) взрослых участников с полными клиническими данными. Критерии исключения были: (1) история предыдущих операций, связанных с переломом или ТСМ; (2) тяжёлая ишемическая болезнь сердца или значительная болезнь сердечно-легочных; (3) острая тяжёлая черепно-мозговая травма; и (4) злокачественные опухоли, сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания или иммунные заболевания. Одобрение этого исследования было получено Этическим комитетом Четвёртой народной больницы Шэньчжэня, а также информированное согласие участников. Процедуры, использованные в этом исследовании, соответствовали положениям Хельсинкской декларации.

Коллекция образцов

Венозные образцы крови (5 мл) были собраны у участников при поступлении с помощью сывороточных сепараторных трубок в течение 24 часов после травмы. Кровь давали свертываться при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего центрифугировали при 3 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Супернатантная сыворотка была аккуратно отделена, алицитирована в микропробирки без РНазы и хранена при -80 °C до дальнейшего анализа.

Культивирование клеток и индукция LPS

Клетки феохромоцитомы крыс (PC-12) и мышиные микроглиальные клетки (BV-2) были культивированы в модифицированной среде Eagle от Dulbecco с добавлением 10% плодовой бычий сыворотки при 37 °C. Для установления моделей воспалительных повреждений in vitro клетки PC-12 и BV-2 подвергались воздействию липополисахарида (LPS) в концентрациях 0, 1, 5 и 10 мкг/мл в течение 12^{ч. 17}. Каждая концентрация была протестирована в трёх независимых биологических репликах.

RT-qPCR

Общая РНК была выделена из образцов с помощью протокола экстракции фенол-хлороформа, после чего следовала осаждение изопропанолом. Чистота РНК оценивалась с помощью спектрофотометрии, а для дальнейшего анализа использовались образцы с соотношением_{A 260/280 нм} в диапазоне 1,8–2,1. РНК была обратно транскрипирована в кДНК согласно протоколу комплекта обратной транскрипции, а полученная кДНК использовалась в качестве шаблона для реакций RT-qPCR с помощью премикса SYBR Green на ПЦР-инструменте. Глицералдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) использовалась в качестве эталонного гена для мРНК CASC11 и SPP1 , а малая ядерная РНК (U6) — в качестве эталонного гена для miR-130b-5p. Для образцов сыворотки синтетический cel-miR-39 был добавлен в сыворотку перед экстракцией РНК для контроля вариаций в восстановлении РНК. Капсюли были следующие: CASC11 вперёд 5'-ACCCTATGGAGAACCGAGAC-3' и реверс 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'; miR-130b-5p вперёд 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' и обратно 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; и SPP1 мРНК вперёд 5'-GTTAAACAGGCTGATTGG-3' и обратно 5'-CATGGTCATCATCATCTTCA-3'. Экспрессия была рассчитана методом ^2-ΔΔCt . Каждая реакция RT-qPCR проводилась в трёхкратных технических репликах с тремя биологическими репликатами.

Трансфекция

Заглушающие CASC11 (si-CASC11), мимик/ингибитор miR-130b-5p, плазмида сверхэкспрессии SPP1 (ov-SPP1) и их соответствующие отрицательные контроли (NC) были синтезированы и трансфектированы в клетки PC-12 и BV-2 с использованием трансфекционного реагента. Эффективность трансфекции оценивалась через 48 часов после трансфекции в трёхэкзальных биологических репликах.

Анализ на пролиферацию и апоптоз

Для анализа жизнеспособности клеток клетки посеяли в пластины с 96 лунками по 5 × 10³ клеток на каждую скважину и культивировали в течение 24 часов для возможности прикрепления. После этой инкубации в каждую скважину подавали по 10 мкл реагента CCK-8, после чего следовала инкубация в течение 2 часов при 37 °C. Оптическая плотность затем фиксировалась на 450 нм с помощью считывателя микропластин. Для обнаружения апоптоза клетки отделяли трипсином, дважды промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и подвешивали в связывающем буфере до конечной концентрации 1 ×^{10 6} клеток на колодцу. Затем 100 мкл суспензии помещали в проточную цитометрическую трубку на 5 мл, после чего добавляли 5 мкл раствора окрашивания Annexin V-FITC и 5 мкл пропидиев-йодида (PI). Образцы аккуратно смешивали и держали 15 минут при комнатной температуре, защищённую от света. Связывающий буфер затем добавлялся к окончательному дополнительному объёму в 400 мкл на пробирку, а апоптотические клетки были количественно измерены с помощью потоковой цитометрии. Все условия были проанализированы с использованием трёх технических репликат в трёх независимых биологических экспериментах.

Анализ активности двойной люциферазы

Последующие цели CASC11 и miR-130b-5p были предсказаны с помощью биоинформатических сайтов (lncRNASNP2 и TargetScan). Фрагменты, содержащие комплементарные последовательности дикого типа (wt) или мутантные (mut) комплементарные последовательности, были синтезированы и клонированы в вектор двойной люциферазы репортера для построения плазмид-репортеров wt и mut. Клетки PC-12 были засеяны и котрансфектированы с мимиком/ингибитором miR-130b-5p и сконструированными плазмидами wt/mut с использованием липидного трансфекционного реагента. Через 48 часов активность люциферазы была количественно измерена для оценки взаимодействия. Каждая группа состояла из трёх технических и трёх биологических репликат.

Анализ иммунопреципитации РНК (RIP)

RIP проводился с использованием набора для иммунопреципитации белков, связывающего РНК. Клетки лизировали с помощью буфера лизиса и инкубировали с антителами против Ago2 или нормальным антителом к IgG. РНК-белковые комплексы обогащались с помощью магнитных шариков. После промывки связанные белки удалялись, а иммунопреципитанная РНК выделялась. Уровни обогащения CASC11 и miR-130b-5p были количественно оценены с помощью RT-qPCR. Каждая группа состояла из трёх технических и трёх биологических репликат.

Вестерн блот

Белковые лизаты были получены из клеток PC-12 и BV-2 с использованием буфера лизиса клеток, а общее содержание белка измерялось с помощью анализа BCA. Для каждого образца 30 мкг белка загружалось на 12% гели SDS-PAGE и передавалось на мембраны PVDF после электрофоретического разделения. Мембраны блокировались на 2 часа при комнатной температуре в 5% обезжиренном молоке, разбавленном в TBST, а затем инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против Bcl-2, Bax, расщепленной каспазы-3 и GAPDH при разбавлении 1:1 000. После промывки мембраны инкубировали вторичными антителами, конъюгированными с HRP, в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые сигналы анализировались с помощью программного обеспечения для анализа изображений, а плотность полос использовалась для оценки экспрессии белков, связанных с апоптозом. Эксперименты Western Blot включали три биологических репликатов, по три технических реплики для каждой группы.

ЭЛИЗА

Концентрации воспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6 в сыворотке пациента, а также в супернатантах клеток PC-12 и BV-2 были количественно измерены с помощью наборов ELISA согласно инструкциям производителя. Образцы инкубировали в заранее покрытых колодцах, а для дальнейшей инкубации добавлялись антитела к обнаружению. Были добавлены и инкубированы конъюгаты ферментов. После промывки добавлялись субстраты для проявления цвета, и реакции прекращались. Поглощение измерялось на 450 нм с помощью считывателя микропластин и преобразовано в концентрации воспалительных факторов на основе предоставленной стандартной кривой. Каждый анализ на ИФА проводился в трёхкратных технических репликах в трёх независимых биологических репликах.

Статистический анализ

Непрерывные переменные были представлены как средние ± стандартного отклонения (SD), а категориальные переменные — как числа и проценты (n, %). Сравнения между двумя группами проводились с помощью t-теста Студента. Для сравнений с участием более двух групп применялся односторонний анализ дисперсии (ANOVA), за которым следовал пост-хок тест Тьюки. Способность CASC11 различать клинические группы была оценена с помощью анализа операционных характеристик приемника (ROC). Связи между двумя переменными были изучены с помощью корреляционного анализа Пирсона. Для клеточных экспериментов каждая группа содержала три независимых биологических репликатов, и каждое измерение повторялось в трёх технических репликациях. Статистическая значимость была определена как P < 0,05.

Результаты

Основные данные участников

Исходные характеристики пациентов в группах Контрольная, NNF, ISCI и CSCI представлены в Таблице 1. Статистический анализ не выявил значимых межгрупповых различий по переменным, таким как пол, возраст, индекс массы тела (ИМТ), этиология травмы и время травмы (P > 0,05). Были отмечены значительные различия между четырьмя группами по продолжительности пребывания, степени ASIA и концентрации пр...

Обсуждение

ТСМ — это разрушительное заболевание центральной нервной системы, которое часто приводит к значительным нарушениям чувствительности, моторного контроля и автономной функции, что значительно снижает качество жизни пациента и долгосрочный прогноз¹⁸. Пациенты могут проявлять функциональные нарушения и сенсорную потерю после травмы позвоночника, и для оценки возникновения^{ТСМ 19} могут применяться исследования визуализации (например, МРТ). Начало...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BCA protein assay kit	Yeasen, China	P0010
CCK-8 solution	Sigma-Aldrich, USA	96992
Dual-luciferase reporter vector	Promega, USA	E133A	вектор pmirGLO
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	ATCC, Manassas, VA, USA	30-2002
ELISA kit for IL-1β	R&D Systems, USA	DY401
ELISA kit for IL-6	R&D Systems, USA	HS600B
ELISA kit for TNF-α	R&D Systems, USA	DTA00C
Fetal bovine serum	Gibco, Grand Island, NY, USA	10099141
Flow cytometer	BD FACSCalibur, USA	FACS101
Image analysis software	NIH, Bethesda, MD, USA	version 1.44p	программное обеспечение ImageJ
Isopropanol	Beijing Chemical Factory, China	32064
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	L3000008	Lipofectamine 3000
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich, USA	L2880
Lysis buffer	Beyotime, China	P0013D	буфер RIPA
Microplate reader	Reagen, China	RNE90002
PC-12 and BV-2 cells	ATCC, Manassas, USA
Phenol-chloroform reagent	Thermo, USA	15596026	реагент Trizol
Reverse transcription kit	Takara, Japan	RR047A	PrimeScript RT Kit
RNA-binding protein immunoprecipitation kit	Millipore, USA	17-700	Magna RIP Kit
RNase-free microtubes	Axygen, Corning, NY, USA	MCT-150-C-S
Serum separator tubes	Terumo, Tokyo, Japan	VP-AS109K60
Statistical analysis software	San Diego, USA	version 9.0	GraphPad Prism
SYBR Green premix	Takara, Japan	RR420A	SYBR Premix Ex Taq