Микрофлюидная система для моделирования дисфункции эндотелиума при комбинированном физиологическом пульсативном сдвиговом стрессе и осцилляторной гипергликемии

Summary

Здесь мы представляем протокол по изготовлению и эксплуатации микрофлюидной системы, которая подвергает эндотелиальные клетки синхронной осцилляционной гипергликемии и пульсативному сдвиговому стрессу. Этот подход предоставляет физиологически релевантную модель in vitro для изучения дисфункции эндотелиального диабета. Этот протокол позволяет количественно измерять окислительный стресс и ответы эндотелиальных клеток.

Abstract

Эндотелиальная дисфункция при диабетических сосудистых осложнениях включает сложные взаимодействия между метаболическими нарушениями, в частности осцилляторной глюкозой (ОГ) и пульсативным сдвиговым стрессом (ПСС). Хотя эти факторы изучались изолированно, традиционные модели остаются ограниченными статическим высокоуровнем глюкозы или упрощённым ламинарным потоком, не обладая способностью имитировать интегрированную пространственно-временную связь, присутствующую в диабетической сосудистой системе. Используя программируемую микрофлюидную платформу, этот протокол предоставляет ценную платформу для изучения интегрированного эффекта синхронизированной осцилляторной гипергликемии и физиологической ПСС на эндотелиальные клетки. Этот протокол направлен на моделирование эндотелиальной дисфункции при физиологически значимых связанных метаболических и механических условиях. Использование чипа полидиметилсилоксана (PDMS) в сочетании с системой управления под давлением позволяет точно и независимо модулировать волны потока и профили концентрации глюкозы. Гемодинамическая точность системы подтверждается с помощью велосиметрии микрочастиц изображения (Micro-PIV), а клеточный ответ количественно характеризуется мониторингом внутриклеточного уровня реактивных кислородных форм (ROS) и жизнеспособности клеток. Репрезентативные результаты показывают, что физиологическая ПСС эффективно ослабляет окислительное повреждение, вызванное ОГ. Этот эффект демонстрируется снижением внутриклеточного ROS и улучшением жизнеспособности клеток при комбинированных условиях стимуляции. В зависимости от исследовательского вопроса можно корректировать параметры, такие как сдвиговые напряжения, частоты осцилляции глюкозы и геометрии каналов. Этот метод служит универсальным инструментом для механистических исследований механобиологических путей и скрининга лекарств для терапевтических вмешательств при диабетических сосудистых заболеваниях.

Introduction

Эндотелиальная дисфункция — это критическое раннее явление развития диабетических сосудистых осложнений, вызванное как метаболическими нарушениями, так и аномальными гемодинамическими^{силами 1,2}. Уровни OG, а не только устойчивая гипергликемия, всё чаще признаются мощными индукторами окислительного стресса и воспалительных сигналов в эндотелиальных клетках, приводящими к повреждению сосудов и нарушению^{гомеостаза 3,4,5}. Одновременно гемодинамический сдвиговый стресс является основным фактором эндотелиального фенотипа: при физиологических нагрузках PSS способствует выработке оксида азота, антиоксидантной защите и^{сосудистой защите 6,7,8}. Поэтому понимание интегрированных эффектов осцилляторной гипергликемии и гемодинамической стимуляции крайне важно для разъяснения механизмов эндотелиальной дисфункции.

Традиционные модели in vitro, которые часто опираются на статические условия высокого уровня глюкозы или упрощённый ламинарный поток, не воспроизводят сложное, динамическое взаимодействие между метаболическими и механическими сигналами, присутствующие in^{vivo 9,10,11}. Хотя животные модели отражают системные аспекты диабета, им не хватает клеточного разрешения, необходимого для анализа сигналов в контролируемых^{микроэкологических условиях 12}. Микрофлюидные технологии предлагают эффективную альтернативу, обеспечивая точное пространственно-временное управление биохимическими и биомеханическими стимулами в физиологически значимых^{геометриях 13} и способствовали значительным недавним достижениям в различных инновационных биомедицинских^{приложениях 14,15}. Например, Чен и ^др.16 разработали микрофлюидное устройство с пространственным и височным сдвигом стенок и сигнальной системой АТФ для изучения внутриклеточной динамики Ca²⁺ в эндотелиальных клетках. Ю и ^др.11 разработали гемодинамическую микрофлюидную систему чипа для обнаружения клеточных ответов при различных сочетаниях физиологического ПСС и высоких концентраций глюкозы. Хотя эти системы использовались для изучения эндотелиальных реакций на сдвиговый стресс или однофакторные метаболические нарушения, немногие успешно интегрировали как осцилляции глюкозы, так и PSS в одну систему. Поэтому стандартизированный, воспроизводимый протокол, синхронизирующий оба фактора в контролируемой микрофлюидной среде, по-прежнему отсутствует.

Этот метод устраняет этот пробел, создавая воспроизводимую микрофлюидную систему, способную обеспечивать связанные OG и PSS. Основная цель этого подхода — моделировать окислительный стресс, нарушенную жизнеспособность клеток и механобиологические ответы, лежащие в основе эндотелиальной дисфункции, физиологически значимым образом. В отличие от статических культур или традиционных камер перфузии, этот подход улучшает существующие модели, позволяя одновременно и контролируемо модулировать как метаболические, так и механические стимулы, более близко приближаясь к диабетической сосудистой микросреде. Кроме того, система совместима с визуализацией живых клеток, мониторингом в реальном времени и молекулярным анализом, что делает её подходящей для широкого спектра применений, включая механистические исследования, моделирование заболеваний и скрининг лекарств на эндотелиальные функции и повреждения.

Protocol

Этическое заявление:

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, устройства и программное обеспечение, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Изготовление микрофлюидных чипов

1. Используйте программное обеспечение для автоматизированного проектирования (CAD) для проектирования структуры микрофлюидического чипа (W x L x H = 2 мм x 30 мм x 0,1 мм, рисунок 1A) и изготовления основной формы SU-8 через коммерческую компанию.
2. Смешайте затвердительный агент PDMS и преполимер в соотношении 10:1 по весу в чистой чашке для смешивания и энергично перемешивайте вручную в течение 5 минут.
3. Поместите контейнер в вакуумную камеру при температуре -0,08 МПа минимум на 15 минут, чтобы удалить воздушные пузырьки, застрявшие в процессе смешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ускорить удаление пузырьков и предотвратить переполнение, временно выпустите камеру под атмосферное давление, чтобы лопнуть крупные пузырьки, а затем немедленно восстановить вакуум. Повторяйте этот цикл вентиляции 2–3 раза, пока объёмная смесь не станет полностью прозрачной и не освободится от макроскопических пузырьков.
4. Вылейте PDMS на пластину, установленную в стеклянной чашке Петри.
5. Дегаз PDMS выливался на пластину в десикаторе ещё на 15 минут, чтобы удалить возможные пузырьки, которые могли образоваться во время литья.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если какие-либо упрямые микропузырьки остаются застрявшими рядом с основной формой СУ-8, аккуратно сдуйте их к краю или лопните с помощью ручного резинового воздуходувателя. Полное удаление воздушных пузырьков крайне важно для предотвращения структурных дефектов микроканалов.
6. Поместите чашку Петри с плесенью и полимером в горячую духовку, выровненную на 80 °C на 2 часа.
   ВНИМАНИЕ: Используйте термостойкие перчатки при работе с горячими материалами
7. Аккуратно отдирайте затвердевшую полимерную плиту из основной формы с помощью скальпеля.
8. Используйте инструмент для пробивания сердечника (например, диаметром 1,2 мм), чтобы создать входные и выходные отверстия на определённых концах канала полимерной плиты.
9. Очистите стеклянную накладку и узорчатую поверхность полимерной плиты клейкой лентой.
   ТОЧКА ПАУЗЫ: Отвергнутые и пробитые пластины PDMS можно хранить в чистом контейнере (например, в герметичной чашке Петри) при комнатной температуре в течение нескольких недель перед плазменной обработкой и склеиванием.
10. Обработайте как полимерную плиту, так и стеклянную крышку плазменным очистителем с мощностью 65 Вт под комнатным воздухом в течение 60 секунд.
11. Немедленно выровняйте лицевой панель полимерного канала с обработанной стороной стеклянного покрытия.
12. Аккуратно нажмите, чтобы создать постоянный, закрытый микрофлюидный канал.

2. Подготовка и посев эндотелиальных клеток

1. Поместите связанный микрофлюидный чип в стеклянную бутылку с боронизированной водой, наполненную деионизированной водой, и стерилизуйте автоклавом при 121 °C и 15 psi в течение 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время автоклавирования погрузите чип в воду для выравнивания давления и предотвращения деформации микроканалов PDMS. Это также помогает удалять задержанные пузырьки воздуха и подготовляет каналы к последующему вводу жидкости.
   ТОЧКА ПАУЗЫ: Стерилизованные микрофлюидные чипы можно безопасно хранить в герметичной стеклянной бутылке при комнатной температуре до нескольких недель, пока они не понадобятся для посева клеток.
2. Поместите стерилизованный чип в мешок диаметром 60 мм, наполненную смесью 1:1 фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и низкоглюкозного Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
3. Введите 100 мкг·^мл-1 фибронектина в канал с помощью шприца на 1 мл и инкубирайте при 37 °C в течение 4 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что микрофлюидный чип расположен ниже уровня жидкости. Подключите адаптерный шланг к игле шприца, наполните шланг жидкостью и введите его ниже уровня жидкости, подключите вход и затем введите, чтобы пузырьки не проникли.
4. Добавьте 24,5 мМ D-маннитола к низкоглюкозному ДМЭМ (5,5 мМ глюкозы) для повышения осмотического давления. Добавьте 5 мМ D-глюкозы к высокоглюкозной DMEM (25 мМ глюкозы) к итоговым 30 мМ глюкозы. Сделайте среднюю среднюю и высокоглюкозную (HG) культурную среду с высоким содержанием глюкозы (HG), дополненные 20% плодовой бычьей сывороткой (FBS), 1% пенициллином/стрептомицином (P/S) соответственно.
5. Тёплые 1× PBS, трипсин, NG и HG культурные средства в водяной бане при 37 °C. Изберите эндотелиальные клетки человеческой пуповиной вены (HUVEC) из культивирующей чашки при совпадении 90%. Отсоедините клетки раствором трипсина-EDTA 0,25% и инкубируем при 37 °C в течение 30 секунд. Посчитайте собранные клетки и отрегулируйте концентрацию на 1 x 10⁶ клеток/мл в НГ среде и HG среде соответственно.
6. Введите 100 мкл суспензии клетки в входной порт микрофлюидного чипа с помощью шприца объёмом 1 мл, используя NG среду для контрольной группы и HG-среду для экспериментальной группы. Поместите микрофлюидные чипы в увлажнённый инкубатор при 37 °C с 5%_CO2 в течение 48 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте клеткам прилипать не менее 4 часов перед дальнейшей обработкой. Вручную чередуйте две культурные среды каждые 2 часа, чтобы стимулировать колебательную гипергликемию во время статической фазы культуры. Поддерживайте клетки на уровне глюкозы 5,5 мМ на ночь, чтобы имитировать состояние in vivo (рисунок 1B).

3. Динамическая настройка стимуляции

1. Заполните два резервуара по 100 мл соответственно NG и HG культурными средами и подключите их к соответствующим каналам программируемой системы управления давлением.
2. Соедините резервуары, двухпозиционный трёхклапанный магнитный клапан и микрофлюидный чип с помощью силиконовых трубок.
3. Используйте разъёмы из нержавеющей стали диаметром 1,3 мм диаметром 90° для подключения входных и выходных портов чипа PDMS к трубке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно стерилизуйте резервуары объёмом 100 мл, силиконовые трубки и соединители из нержавеющей стали в автоклаве высокого давления и высокой температуры.
4. Рассчитайте расход (Q), необходимый для достижения целевой PSS (τ). Используйте формулу τ = (6μQ)/(wh²), где μ вязкости w — ширина канала, а h — высота канала.
5. Установите целевую физиологическую PSS (τ = 10 ± 2 dyn·^cm-2, 1 Hz), которая соответствует рассчитанной скорости потока 200 ± 40 мкл·^мин-1.
6. Запрограммируйте программируемый воздушный насос на генерацию синусоидальной волны для поддержания PSS. Запрограммируйте контроллер клапана на переключение каналов каждые 5 минут, чтобы создать квадратно-волновую осцилляцию глюкозы во время динамической стимуляции.
7. Запустите программируемую насосную систему для совместной подачи OG и PSS в течение 30 минут.

4. Micro-PIV для проверки полей потока

1. Подготовьте NG и HG среду с концентрацией флуоресцентных микрочастиц с объемом 0,05% (1 мкм). Убедитесь, что частицы равномерно распределены и свободны от агрегации.
2. Поставьте чистый, без клеток микрофлюидный чип (идентичный тому, что использовался в экспериментах с клетками) на стадию инвертированного флуоресцентного микроскопа.
3. Соедините все компоненты системы (рисунок 1C).
   1. Подключите источник давления к контроллеру давления.
   2. Подключите контроллер давления к контроллеру клапана, который подключён к компьютеру для автоматического управления сигналами давления.
   3. Соедините выходы контроллера давления с резервуарами HG и NG через отдельные трубочные линии.
   4. Подключите оба резервуара к клапану давления 3/2, который переключается между HG и NG средами согласно запрограммированному протоколу осцилляционного глюкозного сигнала.
   5. Соедините выход клапана давления 3/2 с входом микрофлюидного чипа через трубку.
   6. Подключите выход микрофлюидного чипа к отходному резервуару.
   7. Разместите микрофлюидный чип на стадии микроскопа для съёмки живых клеток на протяжении всего эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все соединения труб надёжны и не имеют протечек перед началом потока.
4. Запускайте высокоскоростную камеру (работающую на частоте 15 Гц в режиме двойного кадра) после стабилизации потока, чтобы захватить последовательные пары изображений текущих микрочастиц. Установите точную временную задержку (Δt) между двумя кадрами каждой пары в 80 мкс.
5. Захватывайте изображения для региона интереса (ROI) внутри канала. Выберите ROI в центре прямого канала (рисунок 2A), на равном расстоянии от входа и выхода, чтобы избежать конечных эффектов и обеспечить репрезентативные измерения расхода.
6. Обрабатывайте полученные пары изображений с помощью программного обеспечения для анализа PIV. Используйте адаптивный многопроходный алгоритм перекрёстной корреляции, начиная с начальной области дознания 64 × 64 пикселя и уточняя до конечной площади 16 × 16 пикселей с шагом сетки 8 × 8 пикселей, чтобы определить вектор смещения (Δx) частиц между двумя кадрами.
7. Вычислите вектор скорости (v) для каждой области опроса по формуле v = Δx / Δt.

5. Сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественно оценить жизнеспособность и функцию клеток с помощью набора Calcein-AM/йодид пропидия (PI) и флуоресцентного зонд с живыми клетками окислительного стресса для проверки повреждений, вызванных флуктуацией глюкозы, и оценки эффекта костимуляции.

1. Жизнеспособность клеток
   1. Подготовьте рабочее решение Calcein-AM/PI в соответствии с инструкциями производителя на экспериментальной точке.
      ВНИМАНИЕ: ПИ — известный мутаген и предполагаемый канцероген, который инкалируется в ДНК. Обращайтесь с ней с максимальной осторожностью. Носите перчатки и держите руки в специально отведённом безопасном рабочем пространстве.
   2. Промывайте канал один раз PBS и вводите в канал рабочий раствор Calcein-AM/PI. Инкубировать устройство при 37 °C с 5%_CO2 в течение 30 минут в темноте.
   3. Немедленно зафиксируйте флуоресцентные изображения окрашенных клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с объективом 10× объектива. Используйте фильтр FITC (Green) для кальцеина-AM и фильтр TRITC или Rhodamine (Red) для PI.
2. Измерить внутриклеточную ROS
   1. Приготовьте рабочий раствор для флуоресцентного зонд с живыми клетками окислительного стресса (см. таблицу материалов) в концентрации, указанной производителем (5 мкм) в PBS.
      ВНИМАНИЕ: Флуоресцентные зонды и их стандартные растворители (например, DMSO) могут быть токсичными и способствовать всасыванию опасных веществ через кожу. Носите перчатки и держите руки в специально отведённом безопасном рабочем пространстве.
   2. Промыть канал PBS три раза и ввести раствор флуоресцентного зонда с живыми клетками в канал. Инкубировать чип при 37 °C с 5% CO2 в течение 30 минут в темноте.
   3. Промите канал PBS три раза, чтобы удалить неограниченный зонд. Немедленно захватывайте флуоресцентные изображения с помощью фильтра Far-Red (возбуждение 640 нм, излучение 665 нм) через объектив 20× с абсолютно одинаковыми параметрами экспозиции для всех групп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенная интенсивность флуоресценции указывает на более высокие уровни ROS.

6. Анализ данных

ТОЧКА ПАУЗЫ: После того как все необработанные флуоресцентные и высокоскоростные изображения с камеры будут собраны и надежно сохранены на жёстком диске, последующей обработкой изображений, количественным анализом и статистическими сравнениями можно приостановить и выполнить в любое позднее время.

1. Количественная оценка жизнеспособности клетки
   1. Откройте полученные изображения Calcein-AM (зелёный) и PI (красный) в ImageJ (см. таблицу материалов). Вручную регулируйте порог для каждого канала, чтобы отличать флуоресцентные сигналы от фона. Используйте функцию счётчика ячеек для подсчёта флуоресцентных ячеек, корректируя минимальный размер ячейки в зависимости от наблюдаемого размера, и подсчитывайте количество живых (N_живых) и мёртвых (N_{мёртвых}) клеток в нескольких полях зрения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: N_Live — это количество клеток с кальцеином-AM-положительными (зелёными), N_Dead — количество PI-положительных (красных) клеток.
   2. Вычислите процент живых ячеек (N_Live / (N_Live + N_Dead) x 100%) для каждого экспериментального состояния с помощью программного обеспечения для электронных таблиц. Вычислите среднее и стандартное отклонение по нескольким полям зрения с помощью программного обеспечения для статистического анализа для сравнения групп.
2. Количественная оценка внутриклеточного РОС
   1. Перетащить выбранное изображение в ImageJ. Установите масштаб, калибруя размер пикселя с помощью метаданных микроскопа (или известной опорной сетки): Анализ | Задайте масштаб.
   2. Удалите неспецифический одинаковый фоновый сигнал со всего изображения с помощью функции фонового вычитания: Process | Вычтите фон.
   3. Вручную настройте пороговый ползунок для сегментации и определите внутриклеточный сигнал ROS: Изображение | Корректируйте | Порог. После установки порога используйте Analyze | Задайте значения Измерения так, чтобы выбрать значение Площадь и Среднее серое. Установите минимальный размер ячейки в соответствии с наблюдаемым размером ячейки и измерите среднюю интенсивность сегментированного сигнала внутри монослойной ячейки ROI: Анализ | Анализируйте частицы.
   4. Указывайте уровень ROS для каждого экспериментального условия как средние значения измеренных значений (например, средней интенсивности), полученных как минимум из трёх случайно выбранных полей обзора на чип.
3. Проведение статистических сравнений
   1. Вводите количественные результаты (процент жизнеспособности и среднюю интенсивность ROS) в программное обеспечение для анализа данных и построения графиков (см. Таблицу материалов).
   2. Определите статистическую значимость, сравнивая экспериментальные группы с контрольной группой с помощью двухстороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым следует пост-хок тест Тьюки с уровнем значимости p = 0,05. Используйте программное обеспечение для анализа и генерации графиков с полосами ошибок, отражающими стандартное отклонение (SD).

Results

Микро-ПИВ валидация поля потока в микрофлюидическом канале
Рисунок 1D даёт обзор микрофлюидной платформы, используемой для изучения эндотелиальных ответов на связанную метаболическую и механическую стимуляцию. Система интегрирует микрофлюидический чип с прямым каналом PDMS с модулем управления потоком под давлением, что позволяет применять OG условия вместе с физиологическим PSS. Была использована программируемая стратегия переключения к...

Discussion

Описанная здесь микрофлюидная система предоставляет надёжную и физиологически значимую платформу для изучения интегрированного влияния OG и PSS на функцию эндотелиальных клеток. Основное преимущество этого метода заключается в его способности точно контролировать и отделять механические и биохимические стимулы в рамках определённой микросреды. В отличие от традиционных статических культур, в которых нет гемодинамических сил, или животных моделей, часто скрывающих клеточную

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% трипсин-ЭДТА	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Диссоциация клеток
Шприц 1 мл	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1мл	Введение жидкости
Культуральный стаканчик 60 мм	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Культура клеток
Угольник из нержавеющей стали 90°	Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd.	1,3 мм	Адаптер уплотнительного устройства
Программное обеспечение AutoCAD	Autodesk	RRID:SCR_014981	Программное обеспечение для компьютерного проектирования
Борозданое стеклянное колба	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Двухпроходное 100мл	Резервуар
Набор кальцеина-АМ/ПИ	Beyotime	byt-c2015	Окрашивание
Клеточный инкубатор	ESCO	Esco CelMate	Культура клеток
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Окрашивание
D-глюкоза	Sigma Aldrich	47249	Глюкоза
D-маннит	Macklin	M813423	Баланс осмотического давления
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	Программное обеспечение для анализа PIV
Фетальный сывороточный альбумин (FBS)	Gibco	14190-094	Среда
Фибронектин	Sigma Aldrich	F-2006	Адгезия клеток
Флуоресцентные микрочастицы	Thermo Scientific	G0100	Микро-PIV
Стеклянная предметная крышка	Citotest Scientific Co.,Ltd.	#1	Микрофлюидная схема
DMEM с высоким содержанием глюкозы	Solarbio	12100	Среда
Высокоскоростная камера	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Микро-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Программное обеспечение для обработки изображений
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Olympus	IX73	Жизнеспособность клеток
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Olympus	IX83	Наблюдение и получение
DMEM с низким содержанием глюкозы	Solarbio	31600	Среда
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	Программное обеспечение для анализа данных и построения графиков
PDMS	Dow lnc.	184	Микрофлюидная схема
Пенициллин/стрептомицин (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Среда
Фосфатный буферный раствор (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Культура клеток
Плазменный очищатель	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Микрофлюидная схема
Программируемая система управления давлением	Elvesys	OB1 MK4	Управление потоком
Силиконовый шланг	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1мм*3мм
Основная матрица SU-8	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Микрофлюидная схема
Распределитель клапана	Elvesys	MUX Wire V3	Управление потоком