Методическая статья

Микрофлюидная платформа для исследования микробного осадка оксидов металлов в пористых средах

243 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71047

⸱

12 июня 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой микрофлюидную систему для изучения микробного осаждения минералов оксида марганца. Образование биоминералов измеряется in situ с помощью оптической микроскопии и анализа изображений. Этот подход можно адаптировать для изучения осадков других ярко окрашенных биогенных минералов в пористых средах.

Аннотация

Микроорганизмы часто осаждают наночастицы оксида металла в почвах, осадках и других экологически значимых пористых средах. Однако образование и реактивность оксидов марганца (Mn) и железа (Fe) остаются слабо изученными в физически сложных условиях. Хотя лабораторные системы могут включать пористые среды в качестве субстрата, они требуют разрушительного отбора проб и не поддаются анализу по поровому масштабу. Динамичная, но недоступная природа пористых сред, таким образом, требует способности разрешать микробно опосредованные минеральные осадки на месте и в реальном времени. Для устранения этого разрыва разрабатывается микрофлюидическая платформа для оценки микробного осадка оксидов металлов в пространстве модели. Эта платформа проверена с помощью Mn-окисляющей бактерии Pseudomonas putida GB-1. Развитие биопленки и сопутствующее осадки оксида минёта визуализируются при непрерывном потоке с помощью таймлапс-цветной микроскопии яркого поля. Алгоритм вычитания изображений затем комбинируется с измерениями конечной массы для оценки скорости осадки оксида Mn. Этот подход предоставляет инструмент для систематической проверки того, как микробное осаждение оксидов металлов меняется в ответ на меняющиеся физические и химические условия.

Введение

Минералы оксидных металлов играют критическую роль в биогеохимическомцикле 1. Оксиды марганца (Mn) и железа (Fe) имеют отрицательный заряд при циркумнейтральном pH и легко поглощают катионныеметаллы 2,3,4,5,6,7,8, регулируя доступность микроэлементов и подвижность загрязняющих веществ в ризосфере и гипорейной зоне. Эти минералы влияют на стабильность и разложение органического вещества 9,10,11,12, определяя поглощение углерода растениями и почвенными микробами. В инженерных системах (например, фильтры для очистки воды, построенные водно-болотные угодья) осадки оксида металла напрямую используются для удаления и устранения сопутствующих загрязнителей(13,14,15,16,17). Эти оксиды металлов можно узнать по характерным цветам — от охры до тёмно-коричневогои чёрного 18,19.

Осаждение оксидов металлов обычно облегчается микроорганизмами в процессе, известном какбиоминерализация 20,21,22. Многочисленные бактерии и грибы, окисляющие Mn, синтезируют мультимедные оксидазы и пероксидазы, которые катализируют перенос электронов с Mn(II) на Mn(III) и Mn(IV) в аэробных условиях, что приводит к осадке оксидных минералов Mn(III, IV), похожих набирнессит. Кроме того, разнообразные бактерии, окисляющие Fe, ферментатически окисляют Fe(II) до Fe(III) в окружной нейтральной или кислой среде, ограниченной кислородом, образуя Fe(II, III) (оксигидр)оксиды, включая ферригидридит имагнетит 25,26,27,28. Эти биогенные минералы осаждаются рядом с поверхностью клеток и накапливаются на внеклеточных полимерах, оболочках и других клеточных структурах, образуя микробно-минеральныеассамблажи 2,23,25,27,29,30.

Несмотря на повсеместное распространение биоминерализации Mn и Fe в сложных условиях, поровые инсайты отсутствуют. Поровые пространства структурно разнородны, демонстрируя предпочтительные потоки жидкости и неравномерный перенос реагентов, что определяет распределение биогеохимическихреакций 31, 32, 33, 34, 35. Кроме того, микробная активность может создавать локальные геохимические градиенты, способствующие или ограничивающие биоминерализацию, а колебания химии поровой жидкости (например, pH, растворённый кислород, окислительный потенциал) могут усиливать минеральные осадки или способствоватьрастворению 34,35. Исследования биоминерализации Mn и Fe обычно опираются либо на хорошо смешанные партийные условия30, 36, 37, 38, 39, 40 илистолбцы 41, 42, 43, 44 для количественной оценки кинетике окисления или характеристики биоминеральных осадков. Однако в пакетных экспериментах нет пространственной гетерогенности, присущей пористым системам. Колонны с упакованными гранулированными средами обеспечивают соответствующую физическую архитектуру, но имеют ограниченную полезность, поскольку требуют разрушительного отбора проб в статичные временные точки, что останавливает прогресс эксперимента и предотвращает ненарушенные наблюдения в масштабе пор. Поэтому необходимы новые экспериментальные подходы для изучения микробного осаждения оксидов металлов в пористых средах.

Микрофлюидные системы — это инструмент для изучения биогеохимических реакций на месте и в реальном времени. Микрофлюидные реакторы могут быть изготовлены быстро и с низкой стоимостью с воспроизводимой и настраиваемой геометрией, имитирующей естественные или идеализированные пористые среды45. Полученные устройства являются оптически прозрачными, обеспечивая неразрушительную визуализацию и количественную оценку поровых процессов, включая формированиебиоплёнок 46, 47, 48, 49, развитие горячих точек 50,51, абиотические металлическиеосадки 52,53 и биоминерализациюкальцитов 34,54,55,56. Кроме того, микрофлюидные системы позволяют пользователям контролировать и систематически изменять граничные условия, включая концентрацию металлов, наличие или отсутствие растворённого кислорода и скорость потока жидкости. Наконец, в зависимости от материала подложки реактора, можно получить прямые измерения взаимодействия микробов, минералов и жидкости с помощью рентгена, рамана или инфракраснойспектроскопии 57. Разработка такой платформы на основе микрофлюидики для изучения микробного осадка оксидов металлов открывает путь для новых исследований образования и реакционной активности минеральных фаз Mn или Fe, которые стимулируют циклирование углерода, питательных веществ и загрязнителей в пористых средах.

В этой работе используется биоминерализация Миннесота как пример для количественной оценки микробного осадка оксидов металлов в динамически пористой среде. Следующий протокол демонстрирует, как изготовить и инокулитировать микрофлюидный реактор Pseudomonas putida GB-1 — модельную бактерию, известную окислением Mn(II) до Mn(III, IV) на стационарной фазероста 58,59. С помощью системы управления потоком на основе давления последовательно вводятся питательные вещества и минимальное соляное растворение для стимулирования образования биопленки и индуцирования осадков оксида Mn соответственно. Высококачественные цветные изображения микрофлюидного порового пространства собираются с регулярными временными интервалами, фиксируя цветовой контраст между биопленками P. putida GB-1 и накапливающимися оксидами Mn. В конце каждого эксперимента все оксиды Mn, содержащиеся в реакторе, перевариваются, а общая масса измеряется с помощью индуктивно-связанной масс-спектрометрии плазмы (ICP-MS). Скорость осаждения оксида Mn оценивается как функция времени путём интеграции этих измерений массы концевых точек с алгоритмом вычитания изображений. Этот рабочий процесс легко адаптируется для изучения других организмов или процессов осадки оксида металла в различных условиях окружающей среды.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол делает несколько предположений относительно базовых знаний пользователей и доступных инструментов. Во-первых, пользователи должны либо иметь доступ к чистой комнате и знакомы с процедурами фотолитографии для изготовления микрофлюидной формы, либо приобрести коммерческую форму. Далее пользователям следует ознакомиться с базовыми методами микробиологии, такими как использование асептической техники, подготовка бульонных растворов и нанесение полос на пластины. Пользователям также необходим доступ к автоклаву, микроцентрифуга, инкубатору шейкера и масс-спектрометру. Наконец, пользователи должны хорошо владеть оптической микроскопией и анализом изображений.

1. Изготовление и сборка микрофлюидических реакторов

ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидные реакторы, используемые в этом протоколе, разработаны в AutoCAD с геометрией песчанок, адаптированной из Wang и др.55. Каждая форма даёт шесть репликируемых каналов с поровым пространством 15 мм × 10 мм, пористостью 0,41 и объёмом пор 2,3 мкл. За исключением обработки плазмой, реакторы изготавливаются в ламинарном проточном шкафу для поддержания среды с низким содержанием пыли.

  1. Отливайте микрофлюидные каналы в полидиметилсилоксан (PDMS) с помощью мягкой литографии.
    1. В пластиковом стаканчике взвесьте эластомерную основу и отверждающий агент в соотношении 10:1 (здесь 25 г и 2,5 г соответственно).
    2. С помощью пластикового ножа тщательно перемешайте эластомерную основу и отверждающее вещество в течение 10 минут.
    3. Дегазируйте PDMS в чашке с помощью вакуумного осушителя в течение 1 часа, чтобы удалить пузырьки воздуха.
    4. Залить PDMS в форму и дегазировать 30 минут, чтобы удалить остатки воздуха.
    5. Поставьте форму на горячую плиту и затвердейте 3 часа при 95 °C.
    6. После затвердевания и охлаждения используйте скальпель, чтобы вырезать PDMS и снять его из формы.
    7. На режущем коврике разрежьте шесть микрофлюидных каналов лезвием бритвы, оставляя по краям 2–3 мм по краю каждого канала. Пробуйте входные и выходные отверстия в каждом канале с помощью биопсийного пуансона.
    8. Накройте обе стороны каждого микрофлюидного канала полосой прозрачной ленты, чтобы предотвратить скопление пыли, и храните в чашке Петри толщиной 100 мм.
  2. За день до эксперимента соберите финальный микрофлюидный реактор с воздушной плазмой.
    1. Снимите прозрачную ленту из одного микрофлюидного канала, затем прополосните PDMS и стеклянную крышку с 70% этанолом и высушите с помощью сжатого азота.
      ВНИМАНИЕ: Этанол горючий. Обращайтесь и храните в соответствии с требованиями безопасности.
    2. Поместите микрофлюидный канал и крышку лицом вверх в плазменный очиститель. Эвакуируйте камеру на 1 минуту, затем примените плазму на 1 минуту (18 Вт и ~0,5 торр).
    3. Удалите микрофлюидный канал и крышку из очистителя плазмы и положите крышку на PDMS, аккуратно постукивая для обеспечения сцепления. Собранный реактор храните в чашке Петри толщиной 100 мм на ночь.

2. Микрофлюидическая система управления потоком

ПРИМЕЧАНИЕ: Модульная система от Elveflow используется для обеспечения последовательного впрыска жидкости с минимальными нарушениями давления и расхода. Компоненты системы включают воздушный компрессор, регулятор потока, распределительный клапан, датчик расхода, стойку резервуара жидкости (для конических трубок объемом 15 мл) и программное обеспечение Elveflow Smart Interface (ESI) (рисунок 1). Другие системы управления потоком, такие как шприцовые насосы, могут использоваться как в режиме инфузии, так и в режиме отмены, с выделенными шприцами или резервуарами для каждого впускающего раствора и клапаном с низким мертвым объёмом для последовательного впрыска жидкости через одну трубку. Однако следует проявлять осторожность с помощью шприцев с насосами, чтобы минимизировать колебания давления, которые могут вытеснить биопленки.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Система управления потоком и геометрия микрофлюидического реактора. Экспериментальная система состоит из контроллера потока (1), соединённого пневматической трубкой (2) с стойкой резервуара жидкости (3) распределительного клапана для последовательного вкачения растечной среды (GMMn) и солевой раствора (SSMn) (4) датчика потока (5), подключённого к регулятору потока для обеспечения обратной связи в реальном времени и регулировки потока; (6) трубки PEEK с малым внутренним диаметром для обеспечения гидросопротивления, (7) пузырькового ловуна (8) выше по течению от микрофлюидного реактора (9). Схема системы не масштабируется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Настройте и откалибруйте всё оборудование согласно инструкции производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стойка с резервуаром жидкости, распределительный клапан и датчик расхода установлены внутри специально изготовленного микроскопа инкубатора для поддержания эксперимента при температуре 30 °C.
  2. Установите регулятор давления компрессора на 3 бара и подключите выход компрессора к входу регулятора потока с помощью пневматической полиуретановой трубки.
  3. Подключите гидрофобный фильтр к выходу регулятора потока, чтобы предотвратить обратный поток жидкости, затем подключите регулятор потока к двум входным портам стойки резервуара жидкости с помощью пневматической полиэфирной полиуретановой трубки с помощью коллектора и колючых адаптеров.
  4. Соедините стойку резервуара жидкости, распределительный клапан и датчик расхода с трубками следующим образом, используя фланжелесные фитинги для труб наружного диаметра 1/16 дюйма, если не указано иное.
    1. Подключите два выходных порта стойки резервуара жидкости к первым двум входным портам распределительного клапана с помощью 80 см трубы с внутренним диаметром 1/32 дюйма (ID) из политетрафторетилена (PTFE).
    2. Подключите выходной порт распределительного клапана к входному порту датчика потока с помощью 15 см трубки ID PTFE диаметром 500 мкм и адаптерного фитинга.
    3. Подключите 60 см трубки с идентификацией полиэфирного кетона (PEEK) диаметром 63,5 мкм к выходному порту датчика потока с помощью адаптерного фитинга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, требующих разных скоростей расхода, корректируйте длину трубы PEEK по мере необходимости, чтобы обеспечить достаточное гидротехническое сопротивление для стабильности потока.
    4. Подключите трубку PEEK к 10 см трубы ID PTFE диаметром 500 мкм с помощью соединительного фитинга.
    5. Подключите трубку PTFE к входному отверстию микрофлюидного пузырькового ловушка, оснащённого мембранным фильтром PTFE (поровый размер ~10 мкм).
    6. Прикрепите 75 см трубки ID PTFE диаметром 200 мкм к выходному порту ловушки пузырьков, чтобы создать обратное давление и эффективно удалять пузырьки. Эта трубка будет крепиться к входному отверстию микрофлюидного реактора.
  5. Перед каждым экспериментом стерилизуйте систему управления потоком со всеми трубками и оборудованием, соединёнными путём промывки раствора отбеливателя 1% на три раза больше объёма системы (~4 часа на одну трубку при 7,0 мкл·мин-1), затем стерильной ультрачистой воды на тот же срок.
  6. Между экспериментами очищайте систему управления потоком следующим образом.
    1. Промывайте распределительный клапан и датчик расхода, промывая 100% изопропанол и стерильную ультрачистую воду, чтобы предотвратить накопление остатков или осадков.
      ВНИМАНИЕ: Изопропанол горючий. Обращайтесь и храните в соответствии с требованиями безопасности.
    2. Автоклав — ловушку-пузырь.
    3. После каждого эксперимента заменяйте мембранный фильтр с пузырьковыми ловушками и трубку PTFE диаметром 200 мкм ID, чтобы предотвратить засорение (мембранный фильтр) или бактериальную колонизацию (трубку).

3. Экспериментальные медиа и решения

  1. Приготовьте жидкую среду бульона Luria (LB, формула Миллера), автоклавировав 2,5% порошок LB в сверхчистой воде при 121 °C в течение 20 минут. Для тарелок ЛБ агар автоклав 2,5% порошок LB и 1,5% агара в ультрачистой воде при 121 °C в течение 20 минут, затем залить в чаши Петри диаметром 100 мм (~20 мл на чашу) и дать остыть до твёрдого стана.
  2. Из фильтрованных растворов, приготовленных с использованием Американского химического общества (ACS) или бактериологических реагентов в сверхчистой воде, получите по 30 мл каждого из следующих веществ. Соляной раствор и состав почвенной среды для роста адаптированы из Gehin и др.59.
    1. Приготовить сольный раствор без Mn(II) (SS0): 0,4 мМ CaCl2·2H2O, 0,25 мМ MgSO4·7H2O, 0,25 мМ Na2HPO4·2H2O, 0,15 мМ KH2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 μM FeCl3·6H2O и 40 μM EDTA с pH 6,5 при 1M NaOH), Буфер HEPES 10 мМ (скорректирован до pH 7,0 при 1M NaOH), 5 мМ (NH 4)2SO4 и следовые металлы (40 нМ CuSO4·5H2O, 273 нМ ZnSO4·7H2O, 84 нМ CoCl2·6H2O, 53,7 нМ Na2MoO4·2H2O) в стерильной ультрачистой воде.
    2. Приготовьте сольный раствор с Mn(II) (SSMn): То же самое, что и SS0 с добавлением 50 мкмMnCl 2·4H2O.
    3. Подготовить почву для роста без Mn(II) (GM0): То же самое, что и SS0 с 1,5 г· Экстракт дрожжей L-1 и 1,5 г· Добавлена L-1 казаминиокислота.
    4. Подготовьте почву для роста с Mn(II) (GMMn): То же самое, что и GM0 с добавлением 50 мкмMnCl 2,4H 2O.
      ВНИМАНИЕ: Соляные растворы и среда для роста содержат металлы, представляющие как вредные для здоровья, так и для окружающей среды. Обращайтесь и храните в соответствии с требованиями безопасности.
  3. Приготовьте кислотный раствор, содержащий 40 мМ щавелевой кислоты и 2% азотной кислоты в сверхчистой воде для переваривания оксидов Mn внутри микрофлюидного реактора.
    ВНИМАНИЕ: Щавелевая и азотная кислота — коррозийные, а азотная кислота — сильный окислитель. Обращайтесь и храните в соответствии с требованиями безопасности.
  4. Приготовьте раствор азотной кислоты 1% в сверхчистой воде для разбавления образца ICP-MS.

4. Бактериальное культивирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальное культивирование проводится асептической техникой на столе с использованием горелки Бунзена. Материалы стерильны, если не указано иное. Длительность инкубации специфична для P. putida GB-1 и может потребовать корректировки для других микроорганизмов.

  1. Из приклада при температуре -80 °C следуйте P. putida GB-1 на пластине ЛБ агар. Инкубировать пластину примерно 20 часов при 30 °C для роста бактериальных колоний.
  2. Вечером перед экспериментом добавьте 10 мл LB среды в коническую трубку объёмом 50 мл и инокулируйте одной пластинной колонией. Инкубировать прекультуру LB в шейкерном инкубаторе при 30 °C и 180 об/мин в течение 16 часов, чтобы перейти в стационарную фазу.
  3. После 16 часов инкубации аликвот 1 мл LB предварительно культивировать в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл и центрифугировать в течение 1 минуты при 8 000 x г для гранулирования бактерий.
  4. Промыйте аликвот три раза, чтобы удалить отработанную LB-среду, выбросив супернатант, снова суспензировав клеточную гранулу в 1 мл SS0 и центрифугируя в течение 1 минуты при 8 000 x g. Последнюю гранулу повторно суспензировать в 1 мл SS0.
  5. Измерьте оптическую плотность (OD 600) суспензии промытой ячейки в нестерильной кювете с помощью плотностометра ячеек. ОжидаемыйOD 600 для P. putida GB-1 составляет 3,6–3,8 на этом этапе, поэтому требуется как минимум пятикратное разбавление в SS0 .
  6. Инокулятируйте 20 мл GM0 с суспензией с промытой ячейкой до начальногоOD 600 0,01 в колбу Erlenmeyer объемом 50 мл. Инкубировать при 30 °C и 180 об/мин в течение 6 часов, чтобы достичь средней экспоненциальной фазы.

5. Эксперимент по биоминерализации

  1. Утром в день эксперимента запустите систему управления потоком.
    1. Предварительно нагрейте инкубатор микроскопа до 30 °C.
    2. Залить 10 мл GMMn и SSMn в две конические трубки по 15 мл и подключить трубки к стойке резервуара жидкости. Промыть SSMn примерно в три раза больше объёма системы (~4 часа при 7,0 мкл·мин-1), затем GMMn на тот же срок.
  2. Насыщайте подготовленный микрофлюидный реактор через 5 часов после инокуляции среднеэкспоненциальной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Насыщение и инокуляция реактора выполняются асептической техникой на столе с использованием горелки Бунзена. Материалы стерильны, если не указано иное.
    1. Дегаз реактора в вакуумном сушителе в течение 20 минут.
    2. Во время дегазации реактора втяните 1–2 мл SS0 в пластиковый шприц объемом 3 мл, затем прикрепите иглу с тупым наконечником и 20 см трубки ID Tygon диаметром 0,02 дюйма. Нажимайте на поршень шприца, пока трубка полностью не насытится.
    3. Вынимите реактор из десикатора, затем прикрепите трубку к отверстию выхода реактора с помощью наклонного пинцета и вручную насыщайте реактор шприцом, пока не образуется капля на входном отверстии.
    4. Подключите 20 см трубы ID Tygon диаметром 0,02 дюйма к входному отверстию реактора. Продолжайте подавать SSMn в реактор, пока не будут удалены все воздушные пузырьки (200–300 мкл).
  3. Подготовьте инокулюм реактора и инокулируйте микрофлюидный реактор.
    1. Удалите среднеэкспоненциальную культуру из инкубатора шейкера через 6 часов после инокуляции и измеритеOD 600. ОжидаемыйOD 600 на этом этапе составляет 1,6–1,8, поэтому рекомендуется разбавлять в SS0 в 4 раза.
    2. Разведите среднеэкспоненциальную культуру в 2 мл SSMn до начальногоOD 600 0,005 в микроцентрифуге объемом 2 мл. Переверните трубку несколько раз для смешивания.
    3. Поместите впускную трубку реактора в трубку микроцентрифуга, убедившись, что капля жидкости соприкасается с инокулюмом, чтобы предотвратить попадание воздуха в трубку. Частично закройте микроцентрифугу и закрепите крышку лентой, чтобы предотвратить загрязнение.
    4. Забирайте 4–5 млSS Mn в стеклянный газонепроницаемый шприц объемом 5 мл, чтобы смочить ствол, затем доливайте, пока в шприце не останется 0,5 мл. Загрузите шприц в насос для шприца.
    5. Вынимите иглу из пластикового шприца и прикрепите её к стеклянному шприцу, стараясь не задержать воздух в втулке иглы.
    6. Инокуляция реактора шприцовым насосом, забирая инокулюм в реактор на 20 минут при расходе 8,33 мкл·мин-1 (~70 поровых объёмов).
    7. После прививки выключите насос для шприца и дайте бактериям осесть и прикрепиться в течение 1 часа без потока.
    8. Через час вынимите шприц из насоса, но оставьте его подключённым к выходной трубке.
  4. Подключите инокуленный микрофлюидный реактор к системе управления потоком.
    1. Переместите реактор и шприц с стола в инкубатор микроскопа.
    2. На этапе микроскопа снимите впускную трубку из реактора.
    3. Аккуратно нажмите на поршень шприца, чтобы создать каплю на входном отверстии реактора.
    4. Ручное согнение трубы PTFE из системы управления потоком под прямым углом (~1 см от конца трубы) так, чтобы она была перпендикулярно поверхности PDMS, минимизируя боковые силы и проникновение воздуха в входное отверстие реактора.
    5. Окуньте конец трубки PTFE в раствор диакрилата 1% полиэтиленгликоля (PEG-DA), чтобы увлажнить гидрофобную трубку наружу. Убедитесь, что капля GMMN на конце трубки PTFE и прикрепите трубку к входному отверстию реактора.
    6. Отсоедините шприц и поместите выходную трубку в нестерильную микроцентрифугную трубку объемом 5 мл для сбора стоков реактора.
    7. Установите расход на 1,33 мкл·мин-1 в программном обеспечении системы управления потоком. Создано программу по поставкеГМ Миннесота на 15 часов (~500 объёмов пор) для стимулирования образования биопленки, затем SSMn на 28,5 часа (~1 000 объёмов пор) для индуцирования биоминерализации Миннесота.
  5. Установьте микрофлюидный реактор в вставку для микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Специально изготовленная ультрафиолетовая система облучения (UVC), прикреплённая к вставке микроскопа, используется для предотвращения нежелательного роста бактерий и выпадения минералов вне микрофлюидного порового пространства (см. рисунок 2). Эта конструкция адаптирована из Ramos et al.60 и может управляться с помощью автоматизированной программы. См. Fadely и др. 61 для подробностей.
    1. Разместите образцовую раму под реактором для устойчивости, затем жёстко закрепите раму и реактор в вставке ступени, обеспечивая их полную иммобилизацию.
    2. Прикрепите трубку PTFE к вставке ступени с помощью ленты, чтобы предотвратить отсоединение трубы от входного отверстия реактора.
    3. Выровняйте UVC-рычаги на расстоянии 3 мм от края порового пространства на входной стороне и 2 мм с выходной стороны, чтобы минимизировать рассеяние ультрафиолетового света и повреждения биопленки в поровом пространстве.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное выравнивание UVC приведёт к минимальному или вовсе отсутствию накопления биомассы в области входа реактора (рисунок 3A). Выравнивание UVC-рычагов слишком далеко от края входа порового пространства (рисунок 3B) или отсутствие облучения (рисунок 3C) приводит к минеральному осадку выше порового пространства.
    4. Составьте программу облучения реакторов. Обработайте области входа и выхода реактора в течение 5 минут при t = 0 ч, чтобы инактивировать бактерии, отложенные во время инокуляции, затем обработать выходную область только 5 минут при t = 17,5 часа, чтобы инактивировать оставшиеся биопленки.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Индивидуально построенная система ультрафиолетового C (UVC) облучения для микрофлюидических реакторов. (A). Вид сверху на систему, установленную на вставке для микроскопа, показывает подвижные руки (синие) с прикреплёнными светодиодными массивами UVC (LED) (жёлтые прямоугольники) и микрофлюидный реактор, установленный на образцовой раме (маленький серый прямоугольник). (B). Нижний вид системы показывает светодиоды UVC (бежевые квадраты), встроенные в подвижные рычаги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Влияние ультрафиолетового облучения на входную область микрофлюидного реактора. (A). Входная зона реактора с 5-минутной обработкой UVC при t = 0 ч, что показывает правильное выравнивание для полного удаления нежелательных биопленок. (B). Область входа реактора с неправильно выровненным UVC-массиводом, что оставляло остаточные биопленки в входном отверстии и за пределами порового пространства, позволяя оксидам минёга осадиться вверх по потоку. (C). Входная зона реактора без обработки УФ-фильтром, что приводит к обширному росту биопленок и минеральному осадку. Серое затенение определяет поровое пространство. Шкала — 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Оптическая таймлапс-микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для изображения ярких цветов используется инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп Nikon Ti2 Eclipse с цифровой камерой (2304 x 2304 пикселя на поле зрения), движком белого света, 4x объективом (1,62 мкм·пиксель-1) и программным обеспечением NIS Elements. Также подходят другие оптические микроскопы, способные к цветной визуализации. Использование цветной визуализации улучшает чувствительность к низкой массе оксидов Mn. Если автоматизация таймлапса невозможна, пользователи могут собирать изображения вручную и обрабатывать их в виде временных рядов.

  1. Для высококачественных изображений выполните следующие шаги выравнивания и коррекции:
    1. Для обеспечения равномерного освещения вручную регулируйте развал-сход Кёлера согласно инструкциям производителя.
    2. Оптимизируйте освещение яркого поля, чтобы предотвратить недонасыщение или перенасыщение изображения (Fusion Pad > Color > Auto Brightness и Fusion Pad > Color > Auto White).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего оптимизировать освещение яркого поля только один раз на реакторе, который уже содержит биопленки и оксиды Mn, а затем применять одинаковое время экспозиции и цветовой баланс для всех последующих экспериментов для равномерного освещения. Здесь используется освещение длиной 5 мс: красный — 97,58%, зелёный — 44,76%, синий — 100%.
    3. Чтобы избежать артефактов в квилтинге при получении сшитых изображений микрофлюидного порового пространства, примените коррекцию затенения (Acquire > Shadeding Correction Panel).
  2. Установите центральную координату сшитого изображения (ND Acquisition > XY).
  3. Настройте область сканирования сшитого изображения (здесь 5 x 4 поля обзора) и примените перекрытие 1% (ND Acquisition > Large Image).
  4. Настройте получение цветных ярких изображений с помощью 4x объектива (ND Acquisition > λ).
  5. Настройте частоту визуализации с интервалами в 1 час на 15 часов (фаза роста) и 0,5 часа на 28,5 часа (фаза минерализации) (НД > время), затем запустите программу таймлапса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность фаз роста и минерализации специфична для P. putida GB-1 и может быть регулирована по мере необходимости для других микроорганизмов.
  6. Когда эксперимент завершится, экспортируйте изображения в формате тегированного изображения (TIFF) (макропанель > экспорт изображений в TIFF).

7. Кислотное расщепление и измерение массы Mn

ПРИМЕЧАНИЕ: ICP-MS используется для измерения массы Mn, сохраняемой в микрофлюидическом реакторе, но также приемлемы другие приборы, такие как оптические эмиссионные спектрометры (ICP-OES). Если аналитическое оборудование отсутствует, образцы, переваренные кислотой, могут быть отправлены в коммерческую лабораторию.

  1. В конце эксперимента вынимите реактор из вставки микроскопа и отсоедините входную и выходную трубку.
  2. Вытащите 1,5 мл кислотного раствора в стеклянный газонепроницаемый шприц объёмом 5 мл (отдельно от инокуляционного шприца). Прикрепите к шприцу иглу с тупым наконечником и 20 см трубки ID PTFE диаметром 1/32 дюйма и вручную впустите кислоту, пока на конце трубки не образуется капля.
  3. На столе загрузите шприц в шприцовый насос и подключите трубку к входному отверстию реактора, стараясь не задерживать пузырьки воздуха, которые могут помешать кислотному раствору проникнуть во все поры. Подключите 30 см 1/32-дюймовой ID PTFE-трубки к выходному отверстию реактора и вставьте конец выходной трубки в микроцентрифугную трубку объемом 2 мл.
  4. Ввести кислотный раствор в реактор на 10 минут при расходе 100 мкл·мин-1.
  5. После инъекции кислотного раствора отсоедините иглу с тупым наконечником от стеклянного шприца. Наполните пластиковый шприц объемом 10 мл воздухом и подключите к игле с тупым концем, затем вручную выпустите весь воздух из шприца, чтобы оставшуюся кислоту слили из реактора и трубки в микроцентрифугную трубку объемом 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя небольшой объём кислотного раствора может оставаться в поровом пространстве после впрыска воздуха, он незначительен относительно общего объема впрыскивания. Пользователи с геометрией с низкой пористостью могут рассмотреть возможность промывки дополнительных объёмов воздуха для удаления жидких пленок и остаточной кислоты из плохо связанных пор.
  6. Разведите переваренный образец в 1% азотной кислоты согласно калибровочному диапазону ICP-MS. Здесь подготовьте разбавление в 100 раз (общий объём 5 мл) в конической трубке объемом 15 мл.
  7. Измерьте концентрацию Mn в разбавленной образце с помощью ICP-MS. Корректируйте измеренную концентрацию с учетом коэффициента разбавления и общего объёма образца, чтобы определить массу, сохранившуюся в реакторе.

8. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: MATLAB рекомендуется из-за встроенных функций анализа изображений, которые включены в текст. Однако для выполнения аналогичных анализов могут использоваться и другие инструменты, такие как ImageJ или библиотеки анализа изображений Python. Ключевые шаги анализа изображений показаны на рисунке 4. Все скрипты анализа изображений предоставляются в виде дополнительных файлов (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3).

figure-protocol-4
Рисунок 4: Рабочий процесс вычитания изображения для выделения осадков оксида Mn. Из цветных ярких изображений с таймлапсом был выявлен эталонный образ (tref) (1), который убрал интенсивность подлежащих стационарных фазовых биопленок со всех последующих изображений временных точек (tn) (2) Были сгенерированы бинарные маски общей сложности (3) и умножены как на tref (4), так и на соответствующий tn (5) для захвата объема биопленки и биоминералов. Наконец, маскированные TN вычитались из маскированного трефа (6). Полученные матрицы, скорректированные интенсивностью, количественно оценивают уменьшение интенсивности (a.u.) из-за накопления оксида Mn на каждом пикселе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Загрузите в рабочее пространство высокое разрешение TIFF с геометрией микрофлюидного порового пространства (экспортированную из AutoCAD) для использования в качестве маски зерна (imread).
  2. Выпрямьте и регистрируйте цветовые изображения яркого поля, чтобы эффективно применить маску зерна.
    1. Сгенерируйте регистрационный бинар первого изображения временной точки (t = 0 h).
      1. Загрузите цветной яркий TIFF в рабочее пространство (непрочитанное).
      2. Обрежьте изображение чуть больше размера порового пространства (imcrop).
      3. Сделайте изображение резким для улучшения разрешения границ зерен (imfirmen).
      4. Бинаризуйте изображение с помощью адаптивного порога, который отдаёт приоритет тёмным чертам (rgb2gray, adaptthresh с полярностью переднего плана = «темно» и чувствительностью с регулировкой по необходимости, имбинаризировать, некомплементировать).
      5. Заполните зерна полученной регистрационной бинарной формы, чтобы получить твёрдые объекты (заполнение с указано «отверстиями»). Обратите внимание, что не все зерна могут быть заполнены.
      6. Размывайте регистрационный бинарный файл по мере необходимости, чтобы убрать фоновый шум, затем расширяйте, чтобы заменить потерянные пиксели на краях зерен (imerode, imdilate).
    2. Используйте алгоритм регистрации масштабно-инвариантного преобразования признаков (SIFT) для вычисления матрицы трансформации, необходимой для выравнивания регистрационного бинарного объекта с маской зерна (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d с transform type = "affine").
    3. Примените эту матрицу преобразования к регистрационному бинарному изображению и первому изображению временной точки, затем наложите на них зернистую маску для оценки соответствия (imwarp, imshowpair).
    4. Если плохое выравнивание сохраняется после регистрации SIFT, применяйте локальную регистрацию по мере необходимости (cpselect, fitgeotform2d с типом преобразования = "lwm", imwarp).
    5. Обрезайте зарегистрированное изображение и маску зерна по мере необходимости, чтобы убрать артефакты регистрации по краям матрицы, затем измените размер до размера порового пространства (15 мм x 10 мм) (высечение, изменение размера).
    6. Прокрутите все цветные изображения с ярким полем, чтобы применить одинаковую регистрацию (имварп).
  3. Визуально определите эталонное изображение (ссылка, панель 1 на рисунке 4), когда биопленки впервые входят в стационарную фазу, что определяется как отсутствие постоянного движения или роста (здесь t = 18,5 ч).
  4. Бинаризуйте каждое изображение временной точки (tn, панель 2 на рисунке 4) (rgb2gray, adaptthresh с полярностью на переднем плане = «темно» и чувствительностью с регулировкой по необходимости, имбинаризировать, имкомплементировать) так, чтобы биопленко-биоминеральные ассамбляжи = 1, а зерна и пустые поры = 0. Умножьте каждую маску временной точки на инвертированную зернистую маску (имкомплемент), чтобы удалить остаточные границы зерен.
  5. Умножьте tn на соответствующую маску временной точки (панель 3 на рисунке 4), чтобы выделить интересующую область биопленки и биоминералов (панель 5 на рисунке 4), затем умножьте tref на каждую маску временной точки, чтобы выделить одну и ту же область (панель 4 на рисунке 4).
  6. Вычтите все маскированныеt n измаскированного t-ссылки , чтобы количественно оценить уменьшение интенсивности пикселей, связанное с накоплением оксида Mn в каждую момент времени (вычитание), затем преобразите в составные матрицы с корректировкой интенсивности (rgb2gray, панель 6 на рисунке 4).
  7. Для оценки пространственного распределения минералов по поровому пространству (a.u.) суммируем вдоль столбцов (сумма с размерностью = 1) каждой матрицы, скорректированной по интенсивности.
  8. Для оценки скорости осадки оксида Mn со временем (мкг·ч-1):
    1. Суммируем каждую матрицу, скорректированную по интенсивности (сумма с размерностью = «все»), чтобы количественно оценить суммарную скорректированную интенсивность в каждом моменте времени.
    2. Разделите общую скорректированную интенсивность в каждой точке времени на общую скорректированную интенсивность в конечном точке времени так, чтобы конечная точка времени = 1 и все предыдущие значения были дробными. Масштабируйте до μg, умножая на Mn массу, измеренную с ICP-MS.
    3. Возьмём производную по времени, разделив увеличение массы (мкг) между последовательными временными точками (diff) на интервал времени между изображениями (0,5 ч).

Результаты

Этот протокол предоставляет экспериментальную платформу для пространственно-временной визуализации формирования биопленки и биоминерализации Мин. Цветные яркие изображения показали, что биопленки P. putida GB-1 равномерно распределялись по микрофлюидному поровому пространству в момент t = 18,5 ч до начала осадки оксида Mn (рисунок 5A). Впоследствии оксиды Mn преимущественно накапливались на входной стороне порового пространства, ближайшей к источнику Mn(II) (рисунок 5B). Разница между эталонным изображением и последующим временными точками изображения выявила изолированный вклад оксидных осадков Mn в общую интенсивность изображения (рисунок 5C) и позволила количественно оценить наблюдаемый градиент реакторного масштаба в накоплении минералов (рисунок 5D). На уровне биопленки этот подход к вычитанию изображения зафиксировал постепенное осаждение оксидов минегии на поверхности биопленки и накопление минералов на краях биопленок при контакте с поровой жидкостью (рисунок 6).

Протокол дополнительно предоставляет рабочий процесс для оценки кинетики осадки оксида Мин-оксида на основе вычитания изображений и измерений ICP-MS. Тройные микрофлюидные реакторы содержали 4,29 ± 0,22 мкг Мн на момент финального экспериментального времени. Кислотное расщепление содержимого реактора ранее было проверено с помощью синхротронных измерений массы оксида Mn и оказалось менее 18%ошибкой 61. Поэтому матрицы, скорректированные интенсивностью, были масштабированы до этой конечной массы. В результате оценочная скорость осадков оксида Mn была немонотонной, резко увеличиваясь между t = 19,5 ч и t = 21 ч, затем достигая пика в 0,29 ± 0,04 мкг·ч-1 и постепенно замедляясь до t = 43,5 ч (рисунок 7). Следует отметить, что этот расчет скорости не учитывает наночастицы оксидов Mn ниже разрешения оптического микроскопа или массу оксидов, потерянную из-за транспортировки в течение эксперимента, которая, как ожидается, будет минимальной. Таким образом, этот подход использует доступные микроскопические методы для полуколичественной оценки временных тенденций в кинетике биоминерализации.

figure-results-1
Рисунок 5: Распределение биопленок и оксидов миномёта на уровне реактора. (A). Цветное изображение яркого поля биопленок P. putida GB-1 в микрофлюидном поровом пространстве в начале стационарной фазы (t = 18,5 ч,t ref). (B). Цветное яркое изображение оксида Mn осаждается на и вокруг биопленок P. putida GB-1 в финальном экспериментальном времени (t = 43,5 ч). (C). Корректированная по интенсивности матрица накопления минералов в финальном экспериментальном времени (t = 43,5 ч), с зернами, показанными серым, а порами — белым. Масштабная планка — 1 мм (D). Одномерное пространственное распределение общей скорректированной интенсивности от входа (слева) до выходной (справа) стороны порового пространства (t = 43,5 ч). Сплошная линия представляет собой скользящее среднее 1 мм вдоль порового пространства от входа до выхода, усредненное по тройным экспериментам, а затенение отражает стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 6: Накопление оксида миноксида в биопленке. (A). Выберите цветные изображения ярких полей представителей биопленок P. putida GB-1. Оксиды марганца были обнаружены сначала как изменение цвета с серого на коричневый на поверхностях биопленки (показано при t = 20 h и t = 21 h), а затем как накопление тёмно-коричневых осадков на краях биопленки (показано при t = 33 h и t = 43 h). (B). Матрицы накопления минералов с коррекцией интенсивности с зернами тёмно-серого цвета, порами белого цвета и подлежащими биопленками светло-серого цвета. Шкала — 150 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 7: Оценка скорости осадки оксида Миннесота со временем. Скорость (μg·h-1) количественно определялась путём перемасштабирования общей скорректированной интенсивности в каждой точке времени до конечной Mn массы, измеренной с помощью ICP-MS, а затем взятия производной по времени. Маркеры представляют среднее по трёхкратным экспериментам, а затенение — стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: Step1_ImageRegistration.m.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Step2_ImageSubtraction.m.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Step3_Figures.m.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Эта экспериментальная платформа предоставляет уникальные возможности для изучения пространственно-временной динамики биогеохимических процессов в пористых средах, свободных от артефактов, препятствующих получению высокоточных данных. Этот подход особенно подходит для биоминерализации Mn и Fe, которые образуют минеральные осадки с характерными оттенками охры, коричневого и чёрного оттенков, которые можно легко сегментировать с помощью оптической микроскопии и анализа изображений. Используя биоминерализацию Миннесоты в качестве примера, можно оценить закономерности и скорость осадков минералов на месте с высоким пространственным и временным разрешением.

Ряд аспектов этого протокола позволил собирать воспроизводимые измерения биогеохимических превращений. Во-первых, использование последовательного клапана с низким мёртвым объёмом облегчало эксперименты с несколькими жидкостями без нарушения биопленок в микрофлюидном поровом пространстве. Такая схема сохраняла первоначальное пространственное распределение биопленки, предотвращая скачки давления, которые могут привести к отслоению или смещению биоплёнок при смещении инъекционных жидкостей, что может происходить с другими инструментами, такими как шприцовые насосы. Этот компонент дополнительно предоставляет пользователю гибкость для настройки геохимических условий, наложенных на местные микроорганизмы. Наконец, благодаря сохранению начального распределения биопленки, эта система позволяет пользователю систематически проверять, как разные морфологии биопленки или количество биомассы влияют на распределение и скорость осадков оксида минера.

Во-вторых, снижение образования и интрузии пузырьков в микрофлюидном поровом пространстве позволило проводить многодневные эксперименты, фиксирующие экологически значимые временные масштабы биоминерализации Миннесоты. Пузырьки, являющиеся распространённой и часто неизбежной проблемой в длительных экспериментах при температуревыше комнатной температуры выше 62,63, могут фрагментировать и блокировать отдельные поры, перенаправлять поток жидкости и нарушать ход реакции. Чтобы предотвратить задержку пузырьков в поровом пространстве, реактор был полностью насыщен до инокуляции. Чтобы минимизировать попадание пузырьков через систему управления потоком, инкубатор микроскопа был установлен на 30 °C задолго до начала эксперимента, а несколько объёмов инфуентного раствора промывались перед подключением инокулента реактора. Этот этап удалял захваченный воздух из трубок и фитингов и минимизировал риск выделения жидкости во время эксперимента. В систему управления течением также был интегрирован пузырьковый ловушечник для захвата остатков пузырьков, с трубкой ID PTFE длиной 200 мкм, прикреплённой к выходу сифона для увеличения сопротивления и повышения эффективности удаления пузырей. Наконец, чтобы предотвратить задержку или утечку воздуха на границе между входящей трубой и входным отверстием реактора, все соединения были выполнены с помощью капель жидкости на обоих концах трубы и в пробитом отверстии, гидрофобная трубка PTFE была покрыта 1% PEG-DA, а конец вставленной трубки оставался перпендикулярным поверхности PDMS на протяжении всего эксперимента.

В-третьих, внедрение специально разработанной системы UVC облучения в экспериментальную платформу сохраняло определённое геохимическое граничное условие и воспроизводимо ограничивало биоминерализацию Миннега в микрофлюидном поровом пространстве. Пилотные эксперименты показали, что посторонние биопленки в области входа реактора осаждали оксиды Mn выше порового пространства, что ограничивало доступность Mn(II). Кратковременное облучение входных и выходных зон реактора с правильным выравниванием после периода отсадки без потока предотвращало развитие биопленки у первоначально отложенных бактерий. Непрерывный однонаправленный поток жидкости предотвратил повторную колонизацию входной зоны реактора после первоначальной обработки УФ-фильтром. Облучение выходной зоны реактора на t = 17,5 ч до начала стационарной фазы и видимого осадка оксида миньёна минимизировало количество накопления минералов ниже по течению порового пространства. Это позволило напрямую сравнивать данные цветных ярких изображений с массой, переваренной и измеренной с помощью ICP-MS.

Сочетание измерений вычитания изображений и массы конечной точки предоставило полуколичественный метод оценки кинетики осадки оксида Мин-оксида in situ. Однако важно отметить, что интенсивность пикселей перестаёт быть прямо пропорциональна массе оксида Mn при очень высокой минеральной плотности из-за ограниченной чувствительности камеры к темнымцветам 61. Оценку этого нелинейного поведения можно улучшить, проводя кислотно-расщепляющие образцы в определённые временные моменты и сравнивая переваренную массу с исходной массой, масштабированной по итоговой экспериментальной точке времени. Если требуется точное количественное определение массы минерала, пользователи могут разработать калибровочную кривую с использованием образцов минералов известной интенсивности и массы, что ранее было продемонстрировано в Fadely et al.61, или проводить прямые измерения с помощью рентгеновской флуоресценции на основе синхротрон.

Представленная здесь микрофлюидная платформа может быть применена для изучения процессов биоминерализации в различных условиях окружающей среды. Хотя репрезентативные эксперименты были оптимизированы для P. putida GB-1, эта схема может использоваться для систематического тестирования различных влиятельных химий растворов (например, концентрация Mn или Fe, источник углерода, наличие сопутствующих металлов), расхода, температуры или наличие микробного консорциума. Специфические кислые или субоксические условия, такие как благоприятные для бактерий, окисляющих Fe, можно смоделировать путём снижения влияющего pH или покрытия PDMS кислородопроницаемым полимером. Понимание микробного контроля биоминерализации можно получить путём внедрения репортерных штаммов слияния генов и отслеживания результативной оптическойфлуоресценции 59,64. Микрофлюидные реакторы можно перепроектировать для моделирования различных пористых сред, изменяя распределение размеров частиц, форму частиц или пористость, либо с помощью функционализации PDMS для имитации поверхностного заряда глинистых частиц или естественного органического вещества. С дополнительными модификациями (например, заменой стеклянной подложки реактора на пластик) реакторы могут поддерживать прямые спектроскопические измерения степени окисления металла, минералогии, органо-минеральных ассоциаций, а также сорбции или совместного осаджения вторичных металлов. Наконец, эту экспериментальную платформу можно расширить для изучения осаждения других металлических биоминералов (например, фосфатов, карбонатов, сульфидов), при условии, что их оптические свойства достаточно различимы для сегментации изображения. Таким образом, этот протокол предоставляет основу для всестороннего изучения биоминерализации и взаимодействия микробов, минералов и жидкости в соответствующих пористых средах.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

Этот проект был поддержан Центром био-опосредованной и био-вдохновлённой геотехники Национального научного фонда США (ERC-1449501), Швейцарским национальным научным фондом (200021_188546) и Национальным научным фондом США (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). Часть этого исследования была проведена в Центре нано- и микропроизводства Калифорнийского университета в Дэвисе (CNM2). Мы благодарим Стивена Лусеро и Технологическую литейную компанию UC Davis за разработку и изготовление инкубатора микроскопа и системы UVC-облучения. Мы также благодарим доктора Юзе Ванга и доктора Джейсона ДеДжонга за предоставленную геометрию пористых сред, используемую для изготовления микрофлюидных реакторов, а также доктора Аруниму Бхаттачарджи, доктора Ноа Гоши, доктора Грегори Джирарди и доктора Хьехёна Кима за полезные обсуждения и/или обучение по фотолитографии и мягкой литографии. Наконец, мы благодарим доктора Гайтана Гехина, доктора Тоню Куль, доктора Филиппо Миле и доктора Чарльза Грэдди за ценные обсуждения экспериментального проектирования и анализа изображений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Адаптерное крепление (Elveflow, 6-40 на 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Используется для интерфейса между датчиком потока и безфланцевыми арматурами.
Агар (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Используется для заливки пластинок для насеивания замороженных запасов.
Компрессор воздуха (Jun-Air)ElveflowKCP-110Используется для повышения давления в регуляторе потока.
Сульфат аммония ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Используется для экспериментальных сред и растворов.
Угловые пинцетыTDI International7-SAИспользуется для крепления трубопровода к микросистемному реактору.
Программное обеспечение AutoCADAutodesk--Используется для проектирования геометрии микросистемного реактора.
АвтоклавSteris--Используется для стерилизации материалов и жидкостей.
ВесыMettler ToledoME2002TИспользуется для взвешивания основы эластомерного ПДМС и отвердителя.
Переходник с шероховатостью (1/4-28 поворотный на 3/32-дюймовый с шероховатостью)ElveflowKFI-06Используется для подключения полиэфирного полиуретана к магистрали и стойке для емкости жидкости.
Пробник для биопсии (Rapid-Core, диаметр 1,2 мм)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25Используется для пробивки входных/выходно-входных отверстий в микросистемных каналах ПДМС.
Белая кухонная хлорная вода (Chlorox)ULINES-19719Используется для стерилизации системы управления потоком. Разбавляется до 1% в ультрачистой воде.
Тупая игла (Jensen Global, 21 калибра)QSourceJG21-10HPX-J004Используется для соединения трубопровода с шприцами. Стерилизуется путем стерилизации в автоклаве в течение 30 мин.
Горелка БунзенаHumboldtH-5970Используется для поддержания стерильной рабочей области эксперимента.
Дигидрофосфат кальция (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Используется для экспериментальных сред и растворов.
Касамино кислоты (Fisher BioReagents, кислотный казеиновый пептон)Fisher ScientificBP1424Используется для экспериментальных сред.
Метрический плотность-метр (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Используется для измерения OD600 культур бактерий.
Прозрачный скотч (Scotch Magic)ULINES-10223Используется, чтобы предотвратить прилипание пыли к микросистемным каналам ПДМС.
Гексагидрат хлорида кобальта (II) (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Используется для экспериментальных сред и растворов.
Сжатый азотAirgasNIUHP300Используется для сушки компонентов микросистемного реактора.
Коническая пробирка (Falcon, объем 15 мл, полипропилен)Fisher Scientific14-959-49BИспользуется для подающих растворов и образцов ICP-MS. Предварительно стерилизован.
Коническая пробирка (Falcon, объем 50 мл, полипропилен)Fisher Scientific14-432-22Используется для предкультуры LB. Предварительно стерилизован.
Сульфат меди (II) пентагидрат (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Используется для экспериментальных сред и растворов.
Резиновое полотноULINES-18543Используется для разрезания микросистемных каналов ПДМС и пробивки входных/выходно-входных отверстий.
Кювета (Fisherbrand, объем 1,5 мл, полистирол)Fisher Scientific14-955-127Используется для измерения OD600 культур бактерий.
Цифровая камера (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Используется для съемки мультифокальных изображений микросистемных экспериментов.
Распределительный клапан (MUX)ElveflowMUX-D-12Используется для последовательного впрыска нескольких жидкостей.
Программное обеспечение Elveflow Smart Interface (ESI)Elveflow--Используется для управления скоростью/давлением обратной связи между регулятором потока и датчиком потока и выполнения переключения распределительного клапана.
Колба Эрленмейера (Fisherbrand, объем 50 мл)Fisher ScientificFB50050Используется для культуры в средней экспоненциальной фазе. Стерилизуется путем стерилизации в автоклаве в течение 30 мин.

Ссылки

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
  4. Holguera, J. G., Etui, I. D., Jensen, L. H. S., Peña, J. Contaminant loading and competitive access of Pb, Zn and Mn(III) to vacancy sites in biogenic MnO₂. Chem Geol. 502, 76-87 (2018).
  5. Peña, J., et al. Mechanisms of nickel sorption by a bacteriogenic birnessite. Geochim Cosmochim Acta. 74, 3076-3089 (2010).
  6. Toner, B., Manceau, A., Webb, S. M., Sposito, G. Zinc sorption to biogenic hexagonal-birnessite particles within a hydrated bacterial biofilm. Geochim Cosmochim Acta. 70, 27-43 (2006).
  7. Castro, L., Blázquez, M. L., González, F., Muñoz, J. A., Ballester, A. Heavy metal adsorption using biogenic iron compounds. Hydrometallurgy. 179, 44-51 (2018).
  8. Whitaker, A. H., Duckworth, O. W. Cu, Pb, and Zn sorption to biogenic iron (oxyhydr)oxides formed in circumneutral environments. Soil Syst. 2, 18 (2018).
  9. Brüggenwirth, L., et al. Interactions of manganese oxides with natural dissolved organic matter: implications for soil organic carbon cycling. Geochim Cosmochim Acta. 366, 182-200 (2024).
  10. Li, H., Santos, F., Butler, K., Herndon, E. A critical review on the multiple roles of manganese in stabilizing and destabilizing soil organic matter. Environ Sci Technol. 55, 12136-12152 (2021).
  11. Li, Q., Hu, W., Li, L., Li, Y. Interactions between organic matter and Fe oxides at soil micro-interfaces: quantification, associations, and influencing factors. Sci Total Environ. 855, 158710 (2023).
  12. Song, X., et al. Towards a better understanding of the role of Fe cycling in soil for carbon stabilization and degradation. Carbon Res. 1, 5 (2022).
  13. Hennebel, T., De Gusseme, B., Boon, N., Verstraete, W. Biogenic metals in advanced water treatment. Trends Biotechnol. 27, 90-98 (2009).
  14. Marsidi, N., Abu Hasan, H., Sheikh Abdullah, S. R. A review of biological aerated filters for iron and manganese ions removal in water treatment. J Water Process Eng. 23, 1-12 (2018).
  15. Li, Y., Xu, Z., Ma, H., Hursthouse, A. S. Removal of manganese(II) from acid mine wastewater: a review. Water. 11, 2493 (2019).
  16. Li, S., et al. Biomineralization mediated by iron-oxidizing microorganisms. Minerals. 15, 868 (2025).
  17. Skousen, J., et al. Review of passive systems for acid mine drainage treatment. Mine Water Environ. 36, 133-153 (2017).
  18. Post, J. E. Manganese oxide minerals: crystal structures and economic and environmental significance. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 3447-3454 (1999).
  19. Cornell, R. M., Schwertmann, U. . The iron oxides: structure, properties, reactions, occurrences and uses. , (2003).
  20. Cosmidis, J., Benzerara, K. Why do microbes make minerals?. C R Geosci. 354, 1-39 (2022).
  21. Ehrlich, H., Bailey, E., Wysokowski, M., Jesionowski, T. Forced biomineralization: a review. Biomimetics. 6, 46 (2021).
  22. Hoffmann, T. D., Reeksting, B. J., Gebhard, S. Bacteria-induced mineral precipitation: a mechanistic review. Microbiology. 167, 001049 (2021).
  23. Hansel, C. M., Learman, D. R., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of manganese. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  24. Tebo, B. M., Johnson, H. A., McCarthy, J. K., Templeton, A. S. Geomicrobiology of manganese(II) oxidation. Trends Microbiol. 13, 421-428 (2005).
  25. Kappler, A., Emerson, D., Gralnick, J. A., Roden, E. E., Muehe, E. M., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of iron. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  26. Emerson, D., Fleming, E. J., McBeth, J. M. Iron-oxidizing bacteria: an environmental and genomic perspective. Annu Rev Microbiol. 64, 561-583 (2010).
  27. Fortin, D., Langley, S. Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals. Earth Sci Rev. 72, 1-19 (2005).
  28. Konhauser, K. O. Bacterial iron biomineralisation in nature. FEMS Microbiol Rev. 20, 315-326 (1997).
  29. Toner, B., et al. Spatially resolved characterization of biogenic manganese oxide production. Appl Environ Microbiol. 71, 1300-1310 (2005).
  30. Miot, J., et al. Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol. 75, 5586-5591 (2009).
  31. Bottero, S., Storck, T., Heimovaara, T. J., van Loosdrecht, M. C. M., Enzien, M. V., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29, 1069-1086 (2013).
  32. Dentz, M., Le Borgne, T., Englert, A., Bijeljic, B. Mixing, spreading and reaction in heterogeneous media: a brief review. J Contam Hydrol. 120-121, 1-17 (2011).
  33. Gerke, H. H. Preferential flow descriptions for structured soils. J Plant Nutr Soil Sci. 169, 382-400 (2006).
  34. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Rev Environ Sci Biotechnol. 21, 27-52 (2022).
  35. Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30, 1505-1527 (2007).
  36. Toyoda, K., Tebo, B. M. The effect of Ca2+ ions and ionic strength on Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 101, 1-11 (2013).
  37. Toyoda, K., Tebo, B. M. Kinetics of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 189, 58-69 (2016).
  38. Learman, D. R., Wankel, S. D., Webb, S. M., Martinez, N., Madden, A. S., et al. Coupled biotic–abiotic Mn(II) oxidation pathway mediates the formation and structural evolution of biogenic Mn oxides. Geochim Cosmochim Acta. 75, 6048-6063 (2011).
  39. Bargar, J. R., et al. Biotic and abiotic products of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. strain SG-1. Am Mineral. 90, 143-154 (2005).
  40. Mao, Q., Qin, W., Yan, B., Luo, L. Ferrous iron oxidation efficiency and kinetics by indigenous iron-oxidizing bacteria in acid mine drainage. Environ Technol Innov. 36, 103785 (2024).
  41. Farnsworth, C. E., Voegelin, A., Hering, J. G. Manganese oxidation induced by water table fluctuations in a sand column. Environ Sci Technol. 46, 277-284 (2012).
  42. Haukelidsaeter, S., et al. Efficient chemical and microbial removal of iron and manganese in a rapid sand filter and impact of regular backwash. Appl Geochem. 162, 105904 (2024).
  43. Li, C., et al. Immobilization of iron- and manganese-oxidizing bacteria with a biofilm-forming bacterium for effective removal of iron and manganese from groundwater. Bioresour Technol. 220, 76-84 (2016).
  44. Breda, I. L., Søborg, D. A., Ramsay, L., Roslev, P. Manganese removal processes during start-up of inoculated and non-inoculated drinking water biofilters. Water Qual Res J. 54, 47-56 (2019).
  45. Zhu, X., Wang, K., Yan, H., Liu, C., Zhu, X., et al. Microfluidics as an emerging platform for exploring soil environmental processes: a critical review. Environ Sci Technol. 56, 711-731 (2022).
  46. Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., de Anna, P., Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. ISME J. 13, 1700-1710 (2019).
  47. Aufrecht, J. A., Fowlkes, J. D., Bible, A. N., Morrell-Falvey, J., Doktycz, M. J., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14, e0218316 (2019).
  48. Kurz, D. L., et al. Competition between growth and shear stress drives intermittency in preferential flow paths in porous medium biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A. 119, e2122202119 (2022).
  49. Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. Morphogenesis of biofilms in porous media and control on hydrodynamics. Environ Sci Technol. 57, 5666-5677 (2023).
  50. Borer, B., Tecon, R., Or, D. Spatial organization of bacterial populations in response to oxygen and carbon counter-gradients in pore networks. Nat Commun. 9, 769 (2018).
  51. Ceriotti, G., Borisov, S. M., Berg, J. S., de Anna, P. Morphology and size of bacterial colonies control anoxic microenvironment formation in porous media. Environ Sci Technol. 56, 17471-17480 (2022).
  52. Park, S., Anggraini, T. M., Chung, J., Kang, P. K., Lee, S. Microfluidic pore model study of precipitates induced by pore-scale mixing of an iron sulfate solution with simulated groundwater. Chemosphere. 271, 129857 (2021).
  53. Wielinski, J., et al. Spatiotemporal mineral phase evolution and arsenic retention in microfluidic models of zerovalent iron-based water treatment. Environ Sci Technol. 56, 13696-13708 (2022).
  54. Elmaloglou, A., et al. Microfluidic study in a meter-long reactive path reveals how structural heterogeneity shapes MICP-induced biocementation. Sci Rep. 12, 19553 (2022).
  55. Wang, Y., Soga, K., DeJong, J. T., Kabla, A. J. A microfluidic chip and its use in characterising particle-scale behaviour of microbial-induced calcium carbonate precipitation. Géotechnique. 69, 1086-1094 (2019).
  56. Wang, Y., et al. Microscale investigations of temperature-dependent microbially induced carbonate precipitation in the range 4–50 °C. Acta Geotech. 18, 2239-2261 (2023).
  57. Pucetaite, M., Ohlsson, P., Persson, P., Hammer, E. Shining new light into soil systems: spectroscopy in microfluidic soil chips reveals microbial biogeochemistry. Soil Biol Biochem. 153, 108078 (2021).
  58. Geszvain, K., McCarthy, J. K., Tebo, B. M. Elimination of manganese(II,III) oxidation in Pseudomonas putida GB-1 by a double knockout of two putative multicopper oxidase genes. Appl Environ Microbiol. 79, 357-366 (2013).
  59. Gehin, G., et al. Population-level control of two manganese oxidases expands the niche for bacterial manganese biomineralization. NPJ Biofilms Microbiomes. 11, 1-12 (2025).
  60. Ramos, G., Toulouze, C., Rima, M., Liot, O., Duru, P., et al. Ultraviolet control of bacterial biofilms in microfluidic chips. Biomicrofluidics. 17, 024107 (2023).
  61. Fadely, E. C., et al. Enhanced manganese oxidation at the biofilm–fluid interface drives pore-scale patterns in mineral precipitation. Environ Sci Technol. 60, 654-663 (2026).
  62. Lochovsky, C., Yasotharan, S., Günther, A. Bubbles no more: in-plane trapping and removal of bubbles in microfluidic devices. Lab Chip. 12, 595-601 (2012).
  63. Pereiro, I., Khartchenko, A. F., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: a guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19, 2296-2314 (2019).
  64. Gehin, G., et al. Pseudomonas putida coordinates the expression of two manganese oxidases and optimizes manganese oxide precipitation in response to aqueous Mn(II). Environ Sci Technol. 59, 13777-13786 (2025).

Перепечатки и разрешения

Теги

Pseudomonas putida
Микрофлюидная платформа для исследования микробного осадка оксидов металлов в пористых средах
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.