Созревание в экстракорпоральном состоянии, оплодотворение и культивирование эмбрионов до имплантации мыши

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуры созревания яйцеклетки мышей in vitro , экстракорпорального оплодотворения и последующего посева эмбрионов до стадии бластоцисты.

Аннотация

Созревание яйцеклетки мыши in vitro , в сочетании с экстракорпоральным оплодотворением и последующей культурой эмбрионов, позволяет создавать эмбрионы до имплантации при определённых условиях. Эти процедуры способствуют изучению биологических функций и молекулярных механизмов, лежащих в основе созревания, оплодотворения и раннего развития эмбрионов. Однако успешное применение этого подхода зависит от тщательного обращения с яйцеклетками и сперматозоидами, соответствующих условий культуры и точной оценки прогрессии развития на каждом этапе. Здесь мы описываем методы выделения незрелых кучно-яйцеклеточных комплексов (КОК) из мышиных яичников, созревания яйцеклетки in vitro , экстракорпорального оплодотворения и экстракорпорально культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты. Эти процедуры включают подготовку и уравновесение среды и культурных тарелок, выделение и отбор КОК после вскрытия яичников, сбор сперматозоидов и её емкость, проведение инсеминации в стандартизированных условиях, а затем культивирование эмбрионов для оценки развития. Прогрессия развития оценивается с использованием морфологических критериев, включая формирование мужских и женских пронуклеев, расщепление до двухклеточной стадии и формирование бластоцисты. Этот протокол может быть интегрирован в исследования созревания яйцеклетки и функции материнского фактора, предоставляя ценный инструмент для фундаментальных исследований в области репродуктивной биологии млекопитающих.

Введение

Понимание качества яйцеклетки и их развития жизненно важно для успешного оплодотворения и последующего эмбрионального развития ^1,2. Созревание яйцеклетки требует не только точной сегрегации хромосом во время созревания ядер, но и цитоплазматического созревания, включая перераспределение органелл и накопление материнских мРНК и^{белков 3}. Раннее эмбриональное развитие зависит от мРНК и белков, предоставляемых матерью, а материнские запасы в ооците поддерживают развитие до имплантации. Однако идентичность и функции многих материнских регуляторов эмбриогенеза млекопитающих остаются неполностью^{изученными 4}. Поэтому необходимы дальнейшие систематические исследования для выяснения механизмов, лежащих в основе созревания, оплодотворения и развития эмбрионов яйцеклетки.

Мышь — широко используемая модельная система для исследования развития эмбрионов до имплантации. Зрелость in vitro (IVM) — это сбор незрелых яйцеклетки из яичника и их созревание в контролируемых лабораторных^{условиях 5}. Впоследствии , экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) позволяет зрелым яйцеклеткам быть коинкубированы с емкостью сперматозоидов для получения зигот для ранних эмбриональных исследований. Однако по сравнению с традиционным ЭКО при использовании in vivo-созревших яйцеклетки, яйцеклетки, полученные из IVM, часто демонстрируют более низкие показатели созревания и оплодотворения, а также сниженную способность развития⁶. Эти ограничения в основном объясняются асинхронностью между ядерным и цитоплазматическим созреванием при условиях культуры in vitro. Кроме того, мейотическая стабильность веретена в мышиных ооцитах чувствительна к изменениям pH и температуры во время IVM, а нарушение веретена может способствовать остановке^{созревания 7}. В результате снижение компетентности яйцеклетки, полученных из IVM, остаётся серьёзным барьером, ограничивая эффективное производство эмбрионов для исследований развития и механизации.

Эмбрионы преимплантации мышей также можно получить, собирая in vivo-полученные зиготы и культивируя их in vitro (IVC). In vivo-производные зиготы, собранные из яйцепроводов, служат относительно синхронизированной отправной точкой для экспериментов, сосредоточенных на событиях после^{оплодотворения 8}. Однако созревание яйцеклетки и накопление материнских факторов происходят до оплодотворения in vivo; Таким образом, зиготы, полученные из in vivo, менее подвержены экспериментальной манипуляции состояниями созревания или материнским запасам для оценки их влияния на последующее развитие^{эмбриона 4}. Поэтому оптимизация протоколов IVM и ЭКО, а также внедрение стандартизированных операционных процедур с строгим контролем качества (например, строгий контроль температуры, pH и методов обращения) необходимы для минимизации вариабельности, связанной с процедурами, и защиты компетентности развития яйцеклетки и эмбрионов.

Здесь мы описываем протокол IVM–IVF–IVC, подробно описывающий подготовку среды, выделение и отбор КОК, процедуры IVM и ЭКО, а также культуру эмбрионов in vitro (рисунок 1). Протокол включает практические, специфичные для стадий контрольные точки для рутинного контроля качества, включая экструзию первого полярного тела (PB1), формирование мужских и женских пронуклесов (2PN), расщепление двух клеток и образование бластоцист. Этот протокол обеспечивает воспроизводимое и эффективное создание эмбрионов до имплантации при определённых условиях, поддерживая механистические исследования, оптимизацию культуры и дальнейшее применение в биологии развития и репродукции.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Северо-Западного университета A&F, Китай (номер разрешения: 20230503).

1. Содержание животных

1. Приобретайте диких самок C57BL/6 и самцов DBA/2 и содержать их в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF), с 12-часовым циклом светло-тёмный цикл при температуре 20–22 °C и влажности 55% ± 10%. Обеспечьте корм для размножения и воду ad libitum. Домашние самцы мышей поодиночке (по одному самцу в клетке).

2. Подготовка носителей

1. Для приготовления рабочего раствора ПМСГ с концентрацией 50 МЕ/мл растворите 5000 МЕ сыворотки гонадотропина (ПМСГ) в 100 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (ПБС).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разбейте раствор на 1 мл одноразовых порций и храните их при –20 °C. Разморозьте каждый аликвот при комнатной температуре непосредственно перед использованием.
2. Для приготовления IVM культурной среды добавьте ингредиенты, указанные в таблице 1 , к 100 мл базовой среды Medium 199 (M199). Отрегулируйте pH до 7,3–7,4, затем стерильно фильтруйте среду через фильтр 0,22 мкм в стерильные бутылки. Маркируйте бутылку как «IVM» инициалами, датой изготовления и сроком годности и храните при 4 °C до 1 месяца.
3. Для приготовления раствора с 0,1% (w/v) гиалуронидазы растворите 10 мг гиалуронидазы в 10 мл среды M2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните в одноразовых аликвотах по 1 мл при –20 °C и при тепле до 37 °C перед использованием.

3. Приготовление блюд (рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Скорректируйте количество капель IVM, ЭКО и IVC в соответствии с ожидаемым количеством КОК и эмбрионов, используя 20–30 КОК на 100 мкл для IVM и ЭКО и 20–30 эмбрионов на 100 мкл для культуры эмбрионов.

1. Приготовьте соответствующее количество антенн для сбора ооцитов диаметром 35 мм, каждая из которых содержит 2 мл среды M2 с добавлением 0,2 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX). Используйте одну чашу для прокола яичников и сбора КОК (одна чашка на две самки), а другую — для мытья КОК. Перед использованием разогрейте посуду до 37 °C.
2. Готовьте блюда IVM.
   1. В блюде диаметром 60 мм приготовьте пять капель IVM среды по 100 мкл для мытья (маркируйте блюдо как «IVM wash»).
   2. В отдельной чаше диаметром 60 мм приготовьте несколько капель IVM для выдержки несколько капель 100 мкл среды IVM (маркируйте блюдо как «IVM»).
   3. Аккуратно добавьте достаточное количество минерального масла, чтобы покрыть капли, и уравновесьте чаши при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 не менее 2 часов перед началом сбора яйцеклетки.
3. Готовьте блюда для ЭКО.
   1. В чашке диаметром 60 мм приготовьте одну или две капли 300 мкл предварительно уравновешенной среды для культуры эмбриона для высвобождения и капацитации сперматозоидов (маркируйте блюдо как «Capacitation Sperm»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая капля капсулы подготовляется как резерв на случай недостаточной подвижности сперматозоидов в первой капли, необходимо взять и установить новый образец сперматозоида из эпидидимальной клетки или скорректировать концентрацию сперматозоидов перед оплодотворением.
   2. Приготовьте две отдельные тарелки по 60 мм, каждая из которых содержит пять капель предварительно уравновешенного посевного материала по 100 мкл для мытья (маркируйте блюдо как «ЭКО-мойка»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну чашу «ЭКО» для мытья КОК, созревших в IVM, перед оплодотворением, а другую — для мытья предполагаемых зигот после совместной инкубации, чтобы удалить кучевые клетки и остаточные сперматозоиды.
   3. В отдельной чаше диаметром 60 мм приготовьте несколько капель 100 мкл предварительно уравновешенного эмбрионального материала для оплодотворения (маркируйте блюдо как «ЭКО»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда предварительной культуры эмбрионов используется как для капацитации, так и для оплодотворения сперматозоидов с целью поддержания стабильных условий во время подготовки и оплодотворения.
   4. Аккуратно добавьте достаточно минерального масла, чтобы покрыть капли, и уравновесьте чаши при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 не менее 12 часов перед началом процедуры капацитации сперматозоидов.
4. Приготовьте блюда с IVC.
   1. В чашке диаметром 60 мм приготовьте пять капель 100 мкл предварительно уравновешенного медиа для культуры эмбрионов для промывки эмбрионов (маркируйте блюдо как «IVC wash»).
   2. В отдельной чашке диаметром 60 мм приготовьте несколько капель 100 мкл предварительно уравновешенного эмбрионального материала для культуры эмбрионов (маркируйте блюдо как «IVC»).
   3. Аккуратно добавьте достаточное количество минерального масла, чтобы покрыть капли, и уравновесьте чаши при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 не менее 12 часов перед началом культуры эмбрионов.

4. Сбор яичников

1. Введите 10 МЕ PMSG внутрибрюшно самкам C57BL/6 в возрасте 8–10 недель.
2. Через 48 часов после инъекции ПМСР усыпить мышь путем вывиха шейки матки и положить её в лежащее положение. Распылите живот 70% этанолом, чтобы смочить шерсть и предотвратить её попадание в брюшную полость.
3. С помощью тонких ножниц для вскрытия сделайте небольшой разрез нижней части живота и аккуратно откройте кожу в перчатках, чтобы открыть брюшинную оболочку.
4. Откройте брюшинную оболочку и аккуратно отодвините кишечник в сторону. Найдите рог матки и следуйте за ним к яичнику. Определите яичник рядом с почкой, обычно окружённый жировой подушечкой.
5. Используйте тонкие ножницы для вскрытия, чтобы отделить яичник от рога матки, а также удалить избыточную соединительную ткань и жир.
6. Немедленно перенесите яичники в предварительно нагретую среду M2 с добавлением IBMX. Повторите процедуру, чтобы собрать контралатеральный яичник и перенести его в ту же чашку.
7. Поместите тарелку под стереомикроскоп и приступите к проколу фолликулов и анализу КОК.

5. Сбор и культура COC

1. Под стереомикроскопом аккуратно проколите видимые антральные фолликулы стерильной иглой шприца для выделения КОК в среде M2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе яйцеклетки стадии GV у мышей предпочтительно проколывают видимо крупные антральные фолликулы на поверхности яичника, которые обычно выглядят выпуклыми и полупрозрачными с прозрачной антральной полостью.
2. Используя тонко вытянутую стеклянную пипетку Pasteur, соберите выделенные КОК и переложите их в чистую чашу диаметром 35 мм с предварительно нагретым M2-материалом и дополненным IBMX.
3. Промывайте КОК последовательно в чистую область 35-мм антенны по мере необходимости, чтобы удалить отделившиеся гранулезные клетки и тканевые остатки, оставляя мусор при каждом переносе (см. рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только КОК с тремя или более компактными слоями кучевых клеток и равномерно гранулированной цитоплазмой без свободных пространств для последующих^{шагов 9,10}. Оголенные GV-яйцеклетки и частично замкнутые кучевой кучевой GV яйцеклетки исключены из этого протокола. В наших экспериментальных условиях в среднем на самку было получено 26 незрелых КОК.
4. После удаления мусора переложите КОК в моющуюся чашу IVM и последовательно промывайте их через пять капель промывки IVM объемом 100 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время переноса минимизируйте объём переноса, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение между каплями.
5. Переливайте промытые КОК в капли IVM объёмом 100 мкл (20–30 COC на каплю) и культивируйте при 37 °C в 5% CO₂ в течение 14 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте, промывайте и переносите КОК в среду IVM с минимальными задержками для поддержания потенциала развития.
6. (По желанию) После IVM кратко инкубировать КОК в гиалуронидазе 1 мг/мл и аккуратно пипетировать их микропипеткой, пока кучевые клетки не будут полностью удалены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничивайте воздействие гиалуронидазы не более чем 3 минуты, так как длительное воздействие может повредить яйцеклетки.
7. (По желанию) Обнажённые яйцеклетки промывайте в свежей среде M2 на нагретой стадии, затем оценивайте созревание яйцеклетки под стереомикроскопом.
8. (По желанию) Яйцеклетки с экструдированным первым полярным телом считаются зрелыми и находящимися на стадии метафазы II (MII). Вычислите скорость созревания как количество яйцеклетки с экструдированным первым полярным телом, делённое на общее количество посяленных ооцитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 5.6–5.8 используются для оценки созревания яйцеклетки после IVM путём удаления назначенной оценки группы до оценки PB1. Эти шаги не требуются для КОК, которые сразу переходят к ЭКО.

6. Сбор и подготовка спермы

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается сбор и емкация свежей спермы. Перед оплодотворением свежевыпущенные сперматозоиды должны быть инкубированы в предварительно уравновешенной среде для культуры эмбрионов при температуре 37 °C в течение 1 часа для обеспечения емкости.

1. Усыпить одного зрелого самца мыши DBA/2 (10–16 недель) и удалить её эпидидимиды хвоста, избегая как можно большего количества жира, крови и тканевой жидкости (рисунок 4).
2. Для каждого мужчины перенесите оба эпидидимида хвоста в каплю 300 мкл предварительно уравновешенной G-ЭКО среды для высвобождения сперматозоидов и капацитации.
3. Иммобилизуйте кауду-эпидидимис с помощью щипцов, сделайте пять-семь разрезов в хвостовой части стерильной иглой шприца и аккуратно сжайте ткань, чтобы выпустить концентрированную сперматозоид.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оценивайте подвижность сперматозоидов и продолжайте только тогда, когда большинство сперматозоидов демонстрируют прогрессивную подвижность (PR), определяемую как активное движение вперёд, а не непрогрессивную подвижность (NP) или^{неподвижность 11}.
4. Инкубировать чашу при 37 °C при 5% CO₂ в течение 1 часа, чтобы обеспечить капацитацию сперматозоидов.

7. Экстракорпоральное оплодотворение

1. После 14 часов IVM промывайте КОК последовательно через пять капель 100 мкл среды для промывания ЭКО, а затем перемещите промытые КОК в капли для оплодотворения ЭКО (20–30 КОК на каплю 100 мкл).
2. Предварительно инкубировать тарелку с КОК при 37 °C в 5%_CO2 в течение 30 минут перед оплодотворением.
3. После ёмкости определите концентрацию сперматозоидов с помощью гемоцитометра.
4. Исходя из концентрации сперматозоидов, рассчитывайте необходимый объём инокулума и добавляйте емкость сперматозоидов к каждой капле ЭКО, чтобы получить итоговую концентрацию 4 ×^{10 5} –1 × 10⁶ сперматозоидов/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления сперматозоидов убедитесь, что подвижные сперматозоиды присутствуют в каждой капли оплодотворения.
5. Инкубировать тарелки для ЭКО, содержащие КОК и сперматозоиды, при 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ в течение 4–6 часов.

8. Культура эмбрионов

1. После 4–6 часов инкубации используйте тонко вытянутую стеклянную пипетку Пастера с внутренним диаметром немного больше яйцеклетки, чтобы аспирировать предполагаемые зиготы в минимальном объёме и перенесите их в капли для промывания ЭКО.
2. Промывайте предполагаемые зиготы последовательно через пять капель для промывания ЭКО, аккуратно пипетируя внутри каждой капли, чтобы удалить избыток спермы и остатков (рисунок 5).
3. Перенесите вымытые зиготы в контейнер для IVC и последовательно промывайте их через пять капель предварительно подогреного эмбрионального медиа, минимизируя перенос среды для ЭКО.
4. Поместить предполагаемые зиготы в капли для культуры эмбриона и культивировать при 37 °C при 5% CO₂ (20–30 эмбрионов на каплю 100 мкл).
5. Через 6–8 часов после оплодотворения оценивайте оплодотворение под стереомикроскопом, обнаружив наличие мужских и женских пронуклеусов, и отбрасывайте яйцеклетки, сохраняющие только одно полярное тело и не показывающие видимых пронуклеусов.
6. Через 24 часа после оплодотворения посчитайте количество двухклеточных эмбрионов и рассчитайте скорость двухклеточного распределения как (двухклеточные эмбрионы / оплодотворенные яйцеклетки).
7. После подсчёта удалять и выбросить раздвоенные эмбрионы и продолжать культивировать оставшиеся расщепленные эмбрионы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эмбрионы могут быть витрификация, перенесены самкам-реципиентам или поддерживаться в культуре до стадии бластоцисты.
8. Продолжайте культивировать эмбрионы в тех же условиях инкубации до 96 часов после оплодотворения (HPI). Оценка образования бластоцисты при 96 HPI на основе морфологических критериев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этот период дальнейшие изменения средних размеров не требуются. Нормальная бластоциста определяется наличием видимой полости бластокоэля, чётко выраженной внутренней массы клеток и целостного слоя трофэктодермы.

Результаты

С помощью этого протокола КОК мышей последовательно обрабатывались через созревание in vitro , экстракорпоральное оплодотворение и последующую культуру эмбрионов in vitro , что привело к воспроизводимому образованию эмбрионов до имплантации и развитию стадии бластоцисты в описанных условиях. После 14 часов ВМ КОК обычно демонстрировали расширение кучевой кости и сохраняющуюся морфологию яйцеклетки. Мейотическое созревание яйцеклетки количественно измерялось пут...

Обсуждение

Этот протокол предусматривает стандартизированную процедуру созревания яйцеклетки мышей in vitro, экстракорпорального оплодотворения и культуры с использованием незрелых КОК, что позволяет воспроизводить и оценивать эмбрионы до имплантации на стадии бластоцисты при определённых условиях in vitro. Во многих исследованиях результаты IVM зависят от лабораторно специфических различий в среде, времени инкубации и обработке, что может снижать способность раз...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
35 мм чаша Петри	Thermo Fisher Scientific	150255
60 мм чаша Петри	Thermo Fisher Scientific	150270
Белок сыворотки быка	Sigma-Aldrich	A8806
Питание для разведения (корм для разведения грызунов)	Keao Xieli (Пекин, Китай)	N/A
Инкубатор CO2	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-глюкоза	Sigma-Aldrich	G7021
Одноразовый пастеровский пипет	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Эпидермальный фактор роста	Gibco	PHG0313
Тонкие секущие ножницы	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Пинцет с тонким концом	Rhino	SW14
Фолликулостимулирующий гормон	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(предравновешенная) среда для культивирования эмбрионов
Гемоцитометр	Millicell	MDH-4N1
Гиалуронидаза	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Изобутил-1-метилксантин)	Selleck	S5836
Заменитель сыворотки KnockOut	Gibco	A3181501
L-Цистин	Sigma-Aldrich	C7352
Лютинизирующий гормон	Millipore	869003
Среда M2	Sigma-Aldrich	M7167
Среда 199	Gibco	11150-059
Микропипетка	Gilson	F167350
Минеральное масло	Sigma-Aldrich	M8410
Фосфатнобуферный раствор	Gibco	20012027
Гонадотропин беременной кобылы	Второй гормонный завод Нинбо (Нинбо, Китай)	N/A
Пируват натрия	Sigma-Aldrich	P4562
Стерегемикроскон	Olympus	SZX10
Стерильные бутылки со средой	Nalgene	46600-586
Стерильная игла для шприца	BD Biosciences	309623	1 мл, 27G1/2
Фильтр для шприца	Millipore	SLGP033R
Термоплата	Tokai Hit	TPi-SZX2X