Алгоритм анализа формы количественно определяет пространственную морфологию и контекст культуры клеток от 2D до 3D для новых количественных фенотипов

Summary

В этой статье объясняется, как новые морфологические признаки в клетках и органоидах можно количественно оценить с помощью линейного преобразования сжатых полярных координат (LCPC) — пространственного алгоритма, который фиксирует свойства, которые традиционные метрики, такие как площадь, объём и площадь поверхности, не могут зафиксировать. Обсуждаются лучшие практики по ориентации и выравниванию формы.

Abstract

Многочисленные исследования показали, что морфологический фенотип клетки или органоида коррелирует с её восприимчивостью к противораковым препаратам. Однако традиционные методы измерения фенотипа опираются на пространственные метрики, такие как площадь, объём, периметр и интенсивность сигнала, которые работают, но ограничены. Эти подходы не могут измерять многие ключевые признаки пространственного контекста, такие как хиральность — свойство леворукости и правшей. Громкость не может быть использована для регистрации хиральности, потому что левая и правая обувь имеют одинаковую громкость. Хотя пространственный контекст в виде хиральности, направления гравитации и оси полярности интуитивно понятен человеку, традиционные метрики, используемые клеточными биологами, патологами, радиологами и практиками машинного обучения до сих пор не могут отразить эти фундаментальные понятия. Преобразование линейных сжатых полярных координат (LCPC) — это новый алгоритм, способный захватывать пространственный контекст, не похожий ни на одну другую метрику. Преобразование LCPC преобразует двумерный (двумерный) контур в дискретную синусоидальную волну, накладая сетку, которая отслеживает точки пересечения между контуром и линиями сетки. Он превращает контур в последовательность пар дискретных координат, при этом независимая координата (x-координата) соответствует последовательным позициям в двумерном пространстве. Каждая зависимая координата (y-координата) состоит из расстояния между пересечением контура и линии сетки с началом или базовой линией сетки. В виде дискретной синусоидной волны к данным применяется быстрое преобразование Фурье. Таким образом, формы клеток в 2D и 3D-культуре систематически и многомерно представлены, что позволяет проводить надёжную количественную стратификацию и открывать представления о устойчивости к лечению.

Introduction

Трёхмерная (3D) органоидная культура доказала превосходство двумерной (2D) клеточной культуры в имитации биологии in ^{vivo 1,2}. Органоиды стали незаменимыми в исследованиях рака для скрининга эффективного лечения и получения информации о прогрессировании^{болезни} 3,4,5,6. Хотя в биологии рака хорошо известно, что различия в морфологии коррелируют с особым биологическим поведением клеток и тканей, область опирается на традиционные метрики формы, которые ограничены по охватам. В данном исследовании описывается новый пространственный алгоритм, который объективно количественно оценивает тонкие морфологические особенности с беспрецедентной точностью, превосходя традиционные подходы, такие как площадь, объём и площадь поверхности.

Преобразование линеаризованных сжатых полярных координат (LCPC) было изобретено для объективного и количественного описания сложных морфологий, наблюдаемых в гистопатологии тканей, с целью улучшения градации полий толстой^{кишки 7}. Желание затем расширить этот подход для отображения макроскопических пространственных особенностей на основе МРТ в патологиях мозга, таких как биполярное расстройство и болезнь Альцгеймера, привело к дополнениям, которые ещё больше его усилили. В этом исследовании описывается пошаговый протокол и лучшие практики применения двух версий преобразования LCPC: системы параллельной сетки и системы радиальной сетки, обе из которых имеют открытые скрипты и обучающие видео.

Помимо традиционных геометрических методов, существует множество абстракций, которые оказались эффективными для измерения сложных форм клеток и органов. К ним относятся измерения эксцентриситета, наклонности, контраста и куртоза, а также моменты Цернике для фиксации круговости, асимметрии, неровности рёбер и глобальной структуры^{контуров 8,9,10}. Фрактальный анализ также полезен для сведения сложных контуров до скалярных значений, например, Фрактальное измерение, измеряющее неправильность контура, и лакунарность, измеряющее, как гетерогенно нерегулярные промежутки появляются в^{контуре 11,12}. Для измерения текстуры популярен метод матрицы совместимости серого уровня (GLCM) для измерения контраста, энергии, однородности, корреляции и энтропии^13,14. Хотя все эти методы полезны, ни один из них не был разработан для отражания пространственного контекста, такого как направление гравитации, леворукость или праворукость, или расположение центральной опоры, влияющей на направление изменения формы. Кроме того, многие из них дают одно скалярное значение или лишь несколько скалярных значений для представления пространственной информации, поэтому в приведённых исследованиях часто используются их в комбинации для оценки сложных форм.

Преобразование LCPC было разработано для получения множества признаков из одного измерения и для добавления пространственных маркеров, кодирующих пространственный контекст в форму, например, направление гравитации. Ближайший метод к преобразованию^{LCPC 7} был опубликован год^{спустя 15}, разделяя основную идею в качестве отправной точки: применить преобразование Фурье к контурам ячеек для измерения формы в виде частотного спектра. Однако преобразование LCPC было независимо разработано для применения через отдельные сеточные системы, предназначенные для использования в сочетании с знанием пространственного контекста вне измеряемой формы. Кроме того, изобретатель преобразования LCPC объясняет в этой рукописи, что полученный частотный спектр содержит огромные объёмы скрытой пространственной информации. Дополнительный файл 1 содержит подробное обсуждение пространственных контекстов в биологии, которые часто упускаются из виду при использовании упомянутых методов, и того, как преобразование LCPC может быть применено для отражения этого контекста. Для читателей, чьи данные по форме не показывают различий между контрольными и экспериментальными группами, независимо от того, видят ли их глаза разницу в формах, или чьи данные о форме почти не показывают различий, хотя они подозревают, что разница должна быть большей, стоит попробовать преобразование LCPC.

Преобразование LCPC обеспечивает беспрецедентную точность измерения пространственной информации, поскольку представляет формы в нескольких измерениях. В отличие от традиционных методов, таких как площадь и объём, которые дают только одно скалярное значение на фигуру (то есть 25^{см 2}), результаты преобразования LCPC могут давать несколько индексов, каждый из которых коррелирует с разным морфологическим аспектом формы (то есть округлость против резкости углов, гладкость против зубчатости рёбер). Преобразование LCPC описывает двумерную форму путём наложения сетки прямых линий, пересекающих её контур. Каждая система сетки имеет начало координат (рисунок 1) или базовую линию (рисунок 2), по которой измеряется линейное расстояние. См. рисунки 1B и 2B для упрощённых блок-схем, описывающих алгоритм. Обнаруживается каждая точка пересечения между линиями сетки и контуром формы. Расстояние каждого пересечения затем рассчитывается относительно базовой линии или начала координат. Таким образом, преобразование LCPC преобразует двумерные фигуры в последовательность последовательных пар координат x-y. x-координата обозначает положение линии сетки от нуля до бесконечности, а y-координата — расстояние от пересечения до базовой линии или начала координат. В этой форме, которая является дискретной синусоидной волной, затем применяется быстрое преобразование Фурье (FFT) для преобразования данных из «позиционной области» в частотную область. Если x-координата обозначает время, то «область положения» будет эквивалентна «временной области» в стандартных приложениях FFT.

В то время как радиальная сетка измеряет расстояние каждого пересечения от начала радиальной сетки (рисунок 1A), параллельная система всегда измеряет расстояние пересечений относительно воображаемой линии слева от фигуры (рисунок 2A). Открытый скрипт определяет положение этой воображаемой линии, находя самый левый пиксель контура и затем сдвинув 10 пикселей влево от этой позиции. Здесь x-координата этой позиции становится опорной линией, с которой вычисляются все пересечения. Это правило 10 пикселей произвольно, но именно поэтому все контуры, анализируемые открытым скриптом для системы параллельной сетки, должны иметь не менее 15 пикселей белого пространства со всех четырёх сторон.

Для двумерных фигур с складками или несколькими слоями линии сетки могут пересекать контур более одного раза. В этом случае расстояния всех пересечений вдоль линии сетки суммируются в одно значение. Таким образом, каждая линия сетки имеет только одну x-координату и одну y-координату. Это суммирование представлено термином «сжатый» в названии преобразования LCPC. Отображение нелинейной двумерной фигуры в дискретную синусоидную волну обозначается термином «линеаризованный» в названии алгоритма. Наконец, термин «полярные координаты» в названии алгоритма, потому что первой концепцией была радиальная сетка с полярными^{координатами} 7 с углом 180 градусов. Даже после осознания взаимозаменяемости полярных и декартовых координат название алгоритма осталось без изменений. Раздел благодарностей описывает личные причины, которые побудили изобретение и усовершенствование преобразования LCPC.

Протокол 1 был последовательностью получения данных, показанных на рисунке 3B, а протокол 2 — последовательностью получения данных, показанных на рисунке 3C–D. Шаги в этих протоколах реализованы в отдельных скриптах на Python, доступных в репозитории GitHub «Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform^»16. Протокол 1 является примером этапов предварительной обработки для получения «чистой формы» в подготовке к преобразованию LCPC. Протокол 2 — пример этапов предварительной обработки для измерения форм «в масштабе», то есть на их исходных масштабах относительно друг друга.

Сегментацию можно выполнять вручную в программном обеспечении для обработки изображений, таких как Mac Preview или Microsoft Paint, либо с помощью пороговых методов. Если делать это вручную, следует выбрать один из следующих четырёх цветов: синий, зелёный, розовый/пурпурный или красный. Репозиторий GitHub под названием «Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform^»16 содержит папку под названием «color extraction scripts». Эта папка содержит четыре файла Jupyter Notebook с кодом на Python, которые извлекают эти четыре цвета и преобразуют их в синие маски на белом фоне. Этот процесс также можно выполнить, ограничивая пороговый цвет контура в программном обеспечении для обработки изображений, таком как Fiji/ImageJ. Для изображений, содержащих контуры с касающимися границами или перекрывающимися краями (например, диаграмма Венна), их необходимо разделить с помощью программного обеспечения для обработки изображений, чтобы они стали независимыми объектами в составном масковом изображении с несколькими органоидными контурами. Это не относится к изображениям, содержащим только один органоид, или к нескольким органоидам, не соприкасающимся друг с другом.

Protocol

Первичные человеческие клетки, использованные в этом исследовании, были получены и культивированы в соответствии с этическими одобрениями и процедурами информированного согласия, ранее^{сообщавшихся 17}. Представленные здесь изображения были получены из этих одобренных клеточных культур и опубликованы впервые. Образцы тканей были собраны в больнице Brigham and Women's и Калифорнийском университете в Сан-Франциско по протоколам, утверждённым Institutional Review Board (IRB), у пациентов, предоставивших информированное согласие на использование своих тканей в исследованиях, как было описано^{ранее 17}. Для этого исследования не проводилось дополнительного сбора образцов на людях.

1. Извлечение чистой формы двумерных органоидных контуров для преобразования LCPC

1. Сегментируйте внешний край каждого органоида с помощью любого программного обеспечения для обработки изображений, таких как Microsoft Paint, MacOS Preview или Fiji/ImageJ.
2. Выделите контуры органоидов в виде открытых масок в виде синих линий на белом фоне.
3. Изолируйте каждый синий контур на отдельном белом холсте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только если изображение содержит более одного контура.
4. Обрежьте каждый контур так, чтобы с четырёх сторон синего объекта было по одному пикселю.
5. Добавьте 100 пикселей белого пространства со всех четырёх сторон, чтобы создать новые поля.
6. Вращайте объекты так, чтобы максимальная внутренняя длина была горизонтальной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг превращает самую длинную внутреннюю линию внутри каждого объекта в ширину объекта. Для этой цели доступны два сценария. Для замкнутых фигур используйте Jupyter Notebook под названием «Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb». Для открытых форм или форм с несколькими компонентами используйте Jupyter Notebook под названием «Rotate Green Line_v3.ipynb». Инструмент Rotate Green Line содержит видеоурок, который связан в файле ReadMe, находящейся в той же папке, что и файл .ipynb.
7. Обрезайте каждое изображение так, чтобы поля была по одному пикселю со всех четырёх сторон синего объекта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это то же самое, что и шаг 1.4. Однако цель обрезания в этот раз в том, что следующий этап изменения размера меняет размер всего холста, а не только синего объекта на нём. Таким образом, делая синий объект почти такой же ширины и высоты, как сам холст, изменение размера холста до 400 пикселей также увеличивает размер объекта почти до 400 пикселей. Существует Jupyter Notebook под названием «Trim margin to 1-pixel border.ipynb».
8. Измените ширину холста каждого изображения до 400 пикселей, одновременно ограничивая соотношение сторон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе каждый объект имеет одинаковую ширину. Ограничение соотношения сторон предотвращает смещение объекта при изменении размера. Существует Jupyter Notebook под названием «Resize width to 400 pixel, но consate aspect ratio.ipynb».
9. Добавьте 100 пикселей белого пространства со всех четырёх сторон, чтобы создать новые поля.
10. Поворачите каждое изображение на 90 градусов по часовой стрелке или против часовой, чтобы получить максимальную внутреннюю вертикальную длину, что соответствует выбору для всех изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В приведённой выше последовательности чистая форма получается последовательной реализацией шагов 1.6, 1.7, 1.8 и 1.9. Добавление поля в шаге 1.9 необходимо для предотвращения ошибок в скриптах преобразования LCPC, которые будут выполнены дальше, но не участвуют в извлечении чистой формы. Пользователям, желающим измерять фигуры «в масштабе», не обязательно выполнять шаги 1.6, 1.7 и 1.8 в приведённой выше последовательности, хотя им всё равно следует предварительно обработать изображения масок, чтобы достичь оптимальной ориентации перед применением преобразования LCPC.
11. Выполните преобразование LCPC на каждом контуре. Используйте скрипты Python, предусмотренные для метода радиальной^{сетки 18} или метода параллельной^{сетки 19}.

2. Извлечение масштабной формы двумерных органоидных контуров для преобразования LCPC

ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговый метод извлечения масштабной формы объектов схож с тем, что используется в Протоколе 1 выше. Шаги имеют идентичные названия в обоих протоколах для удобства сопоставления. Пожалуйста, ознакомьтесь с заметками в Протоколе 1 для каждого шага. Главное отличие между чистой формой и формой в масштабе в том, что для правильной формы не требуется шаги 1.6, 1.7 и 1.8, которые являются шагами изменения размера.

1. Сегментируйте внешний край каждого органоида. Используйте вычислительный подход или делайте это вручную с помощью базового программного обеспечения для редактирования изображений, таких как Microsoft Paint, MacOS Preview или Fiji/ImageJ.
2. Извлеките контуры органоидов в виде открытых масок — синих линий на белом холсте. Используйте Fiji/ImageJ для извлечения масок или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
3. Изолируйте каждый синий контур на отдельном белом холсте. Используйте Fiji/ImageJ для извлечения масок или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
4. Обрежьте каждый контур так, чтобы с четырёх сторон синего объекта было по одному пикселю. Используйте Fiji/ImageJ или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
5. Добавьте 100 пикселей белого пространства со всех четырёх сторон, чтобы создать новые поля. Используйте Fiji/ImageJ или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
6. Вращайте каждый контур так, чтобы его самая длинная внутренняя линия была вертикальной. Используйте Fiji/ImageJ или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
7. Выполните преобразование LCPC на каждом контуре. Используйте скрипты Python, предусмотренные для метода радиальной^{сетки 18} или метода параллельной^{сетки 19}.

Results

Радиальная сетчатая преобразование LCPC, применяемое к органоидам рака молочной железы

3D-органоиды и опухоли могут принимать различные формы, некоторые из которых явно отличаются от человеческого глаза, хотя традиционные метрики дают статистически незначительные различия. С другой стороны, органоиды также могут демонстрировать формы, которые кажутся гетерогенными и, следовательно, незначительными для человеческого глаза, скрывая повторяющиеся тонкие морфологии, представляющие отдельные подтипы. Первичные органоиды молочной железы у человека были извлечены из пациенток и посвящены в 3D согласно ранее опубликованному^{протоколу} 17,20,21. Рисунок 3A показывает три морфологические категории, доступные при визуальном осмотре: кистозный фенотип, поликистозный фенотип и плотный поликистозный фенотип. На рисунке 3B показано, что внешние контуры этих органоидов были вручную сегментированы, а их чистая форма была извлечена, что устраняет влияние размера на их форму. Поскольку контуры были круглыми, к чистым формам применялось радиальное преобразование LCPC, за которым следовал PCA. Обратите внимание, что контуры, наложенные на рисунке 3B, были повернуты так, что самая длинная внутренняя линия вертикальна, то есть их ориентации отличаются от исходных изображений. Рисунок 3B показывает точечный график первых двух основных компонентов (PC), а кластеризация K-средних определила три кластера: 0, 1 и 2. Силуэтные оценки (SS) подтвердили вероятное существование двух отдельных кластеров между кластерами 0 против 1 (SS = 0,68) и кластерами 1 против 2 (SS = 0,69), при этом указывая на слабое разделение между кластерами 0 и 2 (SS = 0,27). Несмотря на слабый Silhouette Score между Кластерами 0 и 2, маркировка точок данных чистой формой каждой точки оправдывает, что Кластер 2 представляет собой самый яркий фенотип: сильно асимметричные, некруговые контуры (толщина контуров в данном случае не имеет значения).

Хотя чистая форма устраняет влияние размера на форму, что невозможно при измерении площади и объёма, измерение контуров органоидов в масштабе также открывает интересные выводы. На рисунке 3C показана трёхмерная точечная диаграмма первых трёх ПК, полученная в результате радиального преобразования LCPC, выполненного на контурах при их сегментации от изображений без изменения размера. Этот подход означает, что преобразование LCPC одновременно измеряет форму и размер органоидов. Рисунок 3C показывает, что поликистозные и плотные поликистозные органоиды менее плотно уплотнены по сравнению с кистозными органоидами. Для количественной оценки этого расширения на рисунке 3D показано рассеяние каждого фенотипа в его общем пространстве PCA. Среднее расстояние ближайшего соседа K, KNND, рассчитывается для каждого фенотипа, что позволяет визуально оценить уменьшение плотности точек, переходящих от кистозных органоидов (KNND = 1,061) к поликистозным органоидам (KNND = 1,575) и к плотным поликистозным органоидам (KNND = 2,247); Это снижение плотности точек также может быть интерпретировано как увеличение морфологической гетерогенности внешних контуров. Наконец, для сравнения преобразования LCPC с традиционной метрикой площади на рисунке 3E показано, что хотя существует статистическая значимость между площадью кистозных органоидов и плотными поликистозными органоидами (p = 0,016, тест Уилкоксона с суммой), нет указаний на наличие трёх различных морфологических групп по фенотипам, выявленных с помощью кластеризации K-средних после анализа чистой формы LCPC (рисунок 3B) или что существует возрастающая морфологическая гетерогенность, как показано масштабным анализом LCPC (рисунок 3C–D). Рисунок 3E показывает убывающее рассеяние точек данных, переходящих от кистозных к поликистозным и затем плотным поликистозным органоидам, что противоположно тому, что наблюдается при масштабном анализе LCPC (рисунок 3C), подчёркивая, что пространственная информация, захваченная преобразованием LCPC, отличается от той, что захватывает область.

Тот же подход применяется к отдельным двумерным фигурам на рисунке 3 и дополнительном рисунке 1 также применяется к контурам клеток в 2D-культуре: одноклеточные (например, эритроциты) или кластеры клеток (например, в мазках шейки матки). Пилотные исследования для каждого из этих случаев описаны в видео: анализ формы мозговых органоидов с разной степенью складки по внешнему^{контуру 22}; Анализ формы альвеол лёгких in situ, те же принципы можно применить для анализа двумерной клеточной^{культуры 23}; анализ формы шейной ткани по мазкам Пап-анализа, при котором одновременно количественно измеряются контуры ядра и мембраны клетки с помощью радиальной сетки преобразования^{LCPC 24}; анализ формы эритроцитов, инфицированных малярией, и клеток, прилегающих к инфицированным^{клеткам, но сами не инфицированы 25}; Анализ формы эритроцитов, поражённых серповидноклеточной^{анемии 26}.

Параллельная система сетки для измерения плотности или текстуры как индекса пространственной информации

Пространственная информация включает в себя больше, чем обычные понятия формы, такие как квадратность, округлость и кривизна, поскольку она охватывает такие понятия, как текстура и плотность. Сложные трубчатые сети, такие как кровеносные сосуды, или ветвляющиеся сети, например цитоскелетные филаменты, не вписываются в понятие формы в том же смысле, что и наша геометрическая интуиция форм, таких как круги и многоугольники. Однако плотность и текстура — очень полезные понятия пространственной информации для понимания структуры и функций клеток, органоидов и опухолей. При количественной оценке сложных сетей в флуоресцентной визуализации клеточные биологи измеряют такие характеристики, как средняя интенсивность сигнала внутри изображения или процент от общей площади изображения, содержащего сигнал. Эти подходы признают, что пространственная информация — это не только то, что описывается в геометрических мотивах.

Схема сосудистых сетей в тканях, опухолях и органах на чипе сложно определить традиционными геометрическими мотивами, но выигрывает от интерпретации как текстура и плотность. Сосудистое ремоделирование в развитии опухолей и устойчивость к лечению — хорошо известная особенность рака (рассмотрено в²⁷ году). Были проанализированы гистопатологические срезы 458 первичных нейробластических^{опухолей 28}, характеризующих плотность, размер и форму всех сосудов и сосудистых сегментов. Они обнаружили, что кровеносные сосуды у пациентов с низкими прогностическими факторами были крупнее, более многочисленными и имеют более неправильную форму по сравнению с опухолями благоприятной когорты. Интересно, что термин «сосуды, инкапсулирующие кластеры опухоли» (VETC)²⁹, был введён для описания схемы кровеносных сосудов, окружающих кластеры мелких опухолей внутри крупной гепатоцеллюлярной карциномы и связанных с более высокой скоростью метастазирования и рецидивов. Та же группа, введшая этот термин, позже установила, что VETC-положительная гепатоцеллюлярная карцинома коррелирует с положительным ответом на лечение ингибитором киназы^{Sorafenib 30}. Таким образом, способность количественно оценивать сосудистые паттерны крайне важна для прогноза и понимания механизмов резистентности.

Для количественной оценки плотных сетей трубок, островков и ветвей система параллельной сетки преобразования LCPC полезна для измерения того, что можно назвать плотностью текстуры, а не формы. В качестве примера того, как параллельный сетчатый преобразование LCPC может это делать, на рисунке 4A показаны кардиальные микрососудистые паттерны из исследования сердечных сосудов³¹: на невооруженный глаз объективно и количественно различать закономерности между инфарктированными участками и участками в области, удалённых от места повреждения, очень сложно. Извлекая маску кровеносных сосудов (рисунок 4A, шаг 1) и применяя параллельную сетку преобразования LCPC, можно наблюдать количественные различия. Во-первых, для повышения чистоты данных каждое изображение обрезалось кругом одинакового диаметра, который был центрирован в центре квадратного изображения (рисунок 4A, шаг 2), что гарантирует, что каждое изображение имеет одинаковую высоту и ширину независимо от поворотов. Далее обрезанные изображения поворачиваются так, чтобы основная ось сосудов (красные двойные стрелки на рисунке 4A, шаг 1) была вертикальной (рисунок 4A, шаг 3). Затем по окружности изображения наносится синяя линия, чтобы обеспечить одинаковый диаметр синих пикселей (рисунок 4A, шаг 4). Шаги 3 и 4 выполнялись с помощью программного обеспечения Fiji/ImageJ (версия 2.14.0). Наконец, применяется параллельное преобразование сетки LCPC (рисунок 4A, шаг 5). Анализ результатов с помощью PCA и построение графика первых трёх ПК показывает, что инфарктированные области группируются отдельно от удалённых областей (рисунок 4B). Расчёты расстояния фаски (CD) количественно оценивают визуальные закономерности, демонстрируемые графиками. Через 1 день после повреждения инфарктированное место проявляет сосудистый узор, более далёкий от базального состояния (базальный против 1Day_infarct: CD = 83,89), чем неповреждённый участок (базальное против 1Day_remote: CD = 53,95). Через 1 день после травмы неповреждённый удалённый участок ближе к месту повреждения (1Day_remote против 1Day_infarcxt: CD = 34,48), чем к базальному заболеванию. Через 3 дня после травмы сосудистые паттерны повреждённого участка и сопутствующего неповреждённого удаленного участка демонстрируют резкое отклонение от базального состояния и друг от друга (базальное против 3Days_Infarct: CD = 240,63; Базальный против 3Days_Remote: CD = 67,28; 3Days_Remote против 3Days_Infarct: CD = 168,35). Очень интересно, что через 7 дней после травмы сосудистые узоры повреждённого участка и неповреждённого удалённого участка занимают трёхмерное пространство, примерно ортогональное базальному состоянию, при этом выравниваясь друг с другом на расстоянии, которое ближе, чем на 1-й день после травмы (CD = 24,76 на 7-й день против 34,48 в первый день). Данные свидетельствуют о двух вещах: (1) по мере заживления сосудистый рисунок повреждённого и неповреждённого удаленного участка принимает паттерны, отличающиеся от базального состояния; (2) Программа реконструкции, активируемая на пострадавшем месте, также вызывает аналогичные морфологические изменения в связанных с ними неповреждённых отдалённых участках.

В качестве ориентира для универсальности преобразования LCPC были рассчитаны традиционные метрики процентной площади (рисунок 5A) и общего периметра (рисунок 5B) кровеносных сосудов. Хотя площадь и периметр показывают изменения между точками временного хода, они не дают согласованного количественного определения различных пространственных расположений сосудов. Площадь и периметр — это абстракции, которые могут представлять множество различных сосудистых структур и поэтому не информируют о том, как пространственное расположение сосудов меняется в зависимости от условий лечения и времени лечения. При n = 3 для каждой группы t-тест и тест Уилкоксона ненадёжны. Дельта Клиффа непараметрична и хорошо показывает сдвиг в размере эффекта. Основное различие, выявляемое при измерении процентной площади кровеносных сосудов, — это между базальным состоянием и 7-дневными временными точками; По общему периметру кровеносных сосудов различия — между базальными и 1-дневными, а базальными — 7-дневными. Однако площадь и периметр не дают признаков различий между инфарктированными участками и их неповреждёнными отдалёнными участками, что очень удивительно, учитывая, что инфарктированное место было намеренно повреждено. Именно здесь проявляется универсальность преобразования LCPC по сравнению с традиционными метриками. Для каждого образца результаты FFT в рамках преобразования LCPC дают набор величин, связанных с набором частот. Величины каждого диапазона частот можно усреднить и затем сравнить между группами лечения (дополнительный рисунок 1). Это позволяет просто оценить, какие частотные группы демонстрируют наибольшие различия между группами лечения. На рисунке 5C показаны шесть бункеров, которые демонстрируют явные различия в размерах эффекта между различными группами лечения, особенно между инфарктированными участками и их связанными неповреждёнными удаленными участками, при этом в районах и периметре не было различий. Независимые значения в этих шести бинах дают несколько индексов, показывающих количественные различия между условиями лечения. Интересно, что схема между группами для Бин 1 результатов преобразования LCPC схожа с результатом, полученным при измерении общего периметра. Однако другие показатели выявляют количественные различия, скрытые как по площади, так и по периметру. Индексы, уникальные для базального состояния: бин 49, бин 56, бин 21. Индексы, уникальные для групп первого дня: Бин 1, Бин 6, Бин 49. Индексы, уникальные для групп третьего дня: Бин 6, Бин 112, Бин 49. Индексы, уникальные для групп 7-го дня: Бин 6, Бин 49, Бин 112. Эти данные подчёркивают универсальность и точность преобразования LCPC по сравнению с традиционными подходами площади и периметра.

Рисунок 1: Описание системы радиальной сетки преобразования LCPC. (A) Шаг 1: Интересующая форма сегментируется и извлекается в синюю маску. Шаг 2: Для маски определяется ограничивающий квадрат (то есть самый маленький прямоугольник, обгортающий и касающийся объекта со всех четырёх сторон). На маску накладывается система радиальных сеточных линий, начинающихся от центра ограничивающего рамки. Решение выбрать центр ограничивающего рамки вместо центроида объекта в качестве начала было произвольным. Шаг 3: Расстояние каждого пересечения между сеткой и формой рассчитывается относительно начала координат. Линии сетки с несколькими пересечениями суммируют все эти расстояния пересечения в одно значение для этой линии. Шаг 4: БПФ применяется для преобразования данных с Шага 3 в частотный график — статическое многомерное представление (Шаг 5) формы из Шага 1. Шаг 6: Скалярное значение можно создать из шага 5 с помощью индекса. См. рисунок 10 для обсуждения типов индексов для расчёта. (B) Блок-схема, показывающая упрощённое описание шагов преобразования LCPC для системы радиальной сетки. (C) Примеры тем форм, для которых оптимальна радиальная сетка. Фигуры рисовались в Microsoft PowerPoint. Эти изображения созданы авторами и не требуют лицензии на публикацию или авторских прав. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Описание параллельной сетки системы преобразования LCPC. (A) Шаг 1: Интересующая форма вручную сегментируется и извлекается в виде бинарной маски. Шаг 2: На фигуру накладывается параллельная сетка, которая поворачивается так, что основание становится горизонтальным. Шаг 3: Расстояние каждого пересечения между сеткой и формой рассчитывается относительно базовой линии. Линии сетки с несколькими пересечениями суммируют все эти расстояния пересечения в одно значение для этой линии. Шаг 4: FFT применяется для преобразования данных с Шага 3 в частотный график — статическое многомерное представление фигуры на Шаге 1. Шаг 6: Скалярное значение можно создать из шага 5 с помощью индекса. См. рисунок 10 для обсуждения типов индексов для расчёта. (B) Блок-схема, дающая упрощённое описание шагов преобразования LCPC для параллельной сетки. (C) Примеры форм тем, для которых оптимальна параллельная сетка. Фигуры рисовались в Microsoft PowerPoint. Эти изображения созданы авторами и не требуют лицензии на публикацию или авторских прав. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Трансформация LCPC объективно выявляет морфологические подтипы органоидов рака молочной железы. (A) Первичные органоиды человеческой молочной железы были получены, как ранее^{сообщалось в 17, 20, 21}и как описано в Дополнительном файле 1. Можно было наблюдать и классифицировать три фенотипа на основе визуального осмотра: кистозный, поликистозный и плотный поликистоз. Шкала = 50 мкм. (B) Внешние контуры органоидов были вручную сегментированы (дополнительный рисунок 2; критерии описаны в дополнительном файле 1), и была получена чистая форма этих контуров. Обратите внимание, что все контуры на диаграмме повернуты так, чтобы самая длинная внутренняя линия была вертикальной; поэтому они не совпадают с их первоначальной ориентацией. Затем применялось преобразование радиальной сетки LCPC, и результаты анализировались с помощью PCA. Кластеризация K-средних идентифицировала три кластера (0, 1 и 2), и были рассчитаны Silhouette Scores (SS) для подтверждения их существования. Кластер 0 против 1, SS: 0,68; Кластер 0 против 2, SS: 0.27; Кластер 1 против 2, SS: 0,69. (C) Внешние контуры органоидов также измерялись с помощью преобразования радиальной сетки LCPC на их масштабных формах, то есть по формам, которые они выглядят на изображениях относительно друг друга, без какого-либо изменения размера. Вставка увеличена, чтобы показать более свободное упакование поликистозных и плотных поликистозных органоидов по сравнению с кистозными органоидами. Для B и C: Зелёный = кистозный, Фиолетовый = поликистозный, Жёлтый = плотный поликистоз. (D) Первые три значения PC отображаются для каждого фенотипа отдельно, и средний KNND рассчитывается так, чтобы показать, что кистозный фенотип наиболее плотно упакован, тогда как поликистозные и плотные поликистозные фенотипы имеют меньшую плотность (то есть большую гетерогенность). Хотя они построены отдельно, все три фенотипа разделяют одно и то же пространство PCA. Для кистозного фенотипа средний KNND рассчитывался с вложения, поскольку выбросы, присутствующие только в этом фенотипе, искажают расчёт. Средние KNND: кистозные — 1,061; Поликистоз — 1,575; Плотный поликистоз — 2,247. (E) Квадратные графики площади органоидов показывают уменьшающееся рассеяние точек данных от кистозных до поликистозных и плотных поликистозных органоидов, что противоположно тому, что наблюдается в масштабном анализе LCPC (рисунок 3C), подчёркивая, что пространственная информация, зафиксированная преобразованием LCPC, отличается от той, что захватывает область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Измерение плотности текстуры с помощью параллельного преобразования сетки LCPC. (A) Фотомикроскопии микрососудистой ткани сердца ранее были получены в другом^{исследовании 31,32}. Изображения не воспроизводятся из этих исследований как таковые; вместо этого они представляют собой новые виды, созданные из того же оригинального набора данных 3D-изображения, сообщенных^{в 31} году и предоставленном Gkontra. Хотя набор данных уже публиковался ранее, конкретные изображения, показанные здесь, опубликованы впервые. Изображения с удалённых объектов, которые не пострадали в любой момент времени, не показываются. Шаг 1: Генерируется двумерная маска, определяется общая ось выравнивания сосудов (красная двойная стрелка). Шаг 2: Получается круглая область с центром в середине изображения, чтобы заставить каждое изображение иметь одинаковую высоту после того, как изображение будет вращено в разную степень на следующем этапе (вращение квадратных изображений в разной степени изменяет высоту изображения в зависимости от степени вращения). Шаг 3: Каждое изображение вращается так, чтобы общая ось выравнивания, определённая на первом этапе, была вертикальной. Шаг 4: Вокруг каждого изображения наносится однородная синяя рамка, чтобы обеспечить одинаковый диаметр, поскольку изображения с меньшей плотностью могут быть короче (например: см. «7 дней после инфаркта миокарда» на шаге 3). Шаг 5: Применяется параллельное преобразование сетки LCPC. (B) Точечные графики первых трёх ПК выхода параллельного преобразования сетки LCPC (фиолетовый — базальное состояние, зелёный — инфарктный участок, жёлтый — неповреждённый участок, удалённый от инфарктированного участка). См. раздел с результатами для расчёта расстояния фаски в каждой временной точке между тремя условиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Преобразование LCPC измеряет элементы, скрытые в зоне и периметре. Для сравнения с традиционными метрами формы измерялись (A) процентная площадь и (B) общий периметр сосудистых сетей. (C) Чтобы показать точность, которую можно получить результатом преобразования LCPC, сравнивались значения отдельных частотных бинов, полученных в результате FFT (дополнительный рисунок 1). В качестве индексов для объективной количественной оценки различий между группами лечения были выбраны шесть частотных групп. Для всех панелей, из-за ограниченного размера выборки каждой группы (n = 3), была рассчитана непараметрическая дельта Клиффа для размера эффекта вместо p-значения из теста Уилкоксона на сумму ранга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Важность систематического ориентирования фигур для извлечения чистых данных. (A) Пример одинаковых форм, которые являются зеркальными отражениями друг друга, и как параллельная сетка определяет их уникальную ориентацию, что приводит к разным результатам. (B) Пример того, как перевернуть Форму 2 по горизонтали, чтобы её ориентация теперь совпадала с Формой 1 и стала более справедливым сравнением с Формой 1. В этой конфигурации параллельное преобразование LCPC даёт одинаковые результаты как для формы 1, так и для формы 2. Такое изменение ориентации должно происходить только при отсутствии пространственного контекста, который бы указывал на то, что Форма 2 не следует изменять. (C) Пример четырёх вариантов объектов, похожих на число «3», некоторые из которых обращены в неправильную сторону. (D) Пример того, как ориентировать каждый объект для максимизации чистоты данных, полученных при параллельном преобразовании сетки LCPC. (E) Пример измерения более широкой выпуклости элементов в панели C на основе тех же правил ориентации, что и для панели D. (F) Пример измерения больших ламп элементов в панели C с сохранением их выравнивания, как в панели D. Мотивация сохранения правил выравнивания в панели D — разобрать вклад пространственной информации в более широком выпуклости относительно вклада более узкой выпуклости в эти правила. См. дополнительный рисунок 3 для спектров FFT, связанных с C–F. Изображения в форматах A–B — это иконки из Microsoft PowerPoint. Фигуры на C-F были нарисованы в Microsoft PowerPoint. Эти изображения созданы авторами и не требуют лицензии на публикацию или авторских прав. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Неспособность традиционных метрик формы фиксировать очевидный контекст .(A) Серия галочок имеет ту же форму, но увеличивается слева направо. В этой серии площадь каждой галочки отличается, при этом концепция формы остаётся прежней: то есть стиль галочки остаются одинаково. (B) Квадрат поворачивается вокруг своего центра на 45 градусов, пока его форма не превратится в то, что люди называют ромбом. Хотя концепция формы квадрата сильно отличается от ромба, промежуточные вращения субъективно интерпретируются как «наклонные квадраты» или «наклонные ромбы». Преобразование LCPC может объективно и точно измерить разность на каждом этапе этого ряда. Фигуры рисовались в Microsoft PowerPoint. Эти изображения созданы авторами и не требуют лицензии на публикацию или авторских прав. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Объяснение чистой формы и формы в масштабе. Измерение объектов «в масштабе» означает измерение их формы относительно их исходных размеров относительно друг друга. «Чистая форма», напротив, означает измерение формы разных объектов на схожем масштабе, что устраняет влияние размера на саму форму. Важно найти объективный способ изменения размера сравниваемых объектов. Самая длинная внутренняя линия часто является оптимальным выбором (Шаг 1). Оба объекта вращаются так, что самая длинная внутренняя линия становится горизонтальной (шаг 2). В этом случае два объекта также вращаются так, чтобы вдавленная сторона была обращена вниз. Далее ширина каждого объекта, которая теперь равна самой длинной внутренней линии каждого объекта, изменяется до 400 пикселей, при этом соотношение сторон ограничивается, чтобы избежать смещения объектов (Шаг 3). Наконец, необязательно повернуть объекты с измененным размером на 90 градусов (шаг 4) (в данном случае против часовой стрелки) перед применением преобразования LCPC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9: Пример пространственных маркеров для исследований рака. (A) Гипотетический пример миграции клеток в двумерной культуре путём расширения ламеллиподий в направлении миграции. В контексте миграционной морфологии эпителиальных клеток наиболее логично ориентировать контур каждой ячейки так, чтобы самая длинная внутренняя линия, совпадающая с осью миграции, была вертикальной, для захвата пространственного контекста. (B) Гипотетические примеры опухолей или предраковых поражений, которые растут внутри оболочки, не меняющей форму. Поражение растёт из стебля, который является центральной опорной структурой. По мере роста или усыхания поражения его контур смещается к внутренней стенке оболочки или от неё. Пунктирные линии представляют собой рациональный и объективный способ определить, какую часть оболочки следует обводить (оранжевая линия), чтобы добавлять не слишком мало и не слишком много дополнительной информации. (C) Вариант 1 показывает параллельное преобразование сетки LCPC, применённое к контуру поражений без контекста расположения оболочки. Вариант 2 показывает то же самое, но с участием пространственного контекста расположения оболочки. Например, красные точки обозначают пересечения между сеткой (чёрная стрелка, зелёная линия) и контуром. Вариант 2 приводит к тому, что каждая линия сетки образует четвёртое пересечение, которого нет в Варианте 1, что количественно добавляет пространственный контекст к результату Варианта 2, полностью отсутствующего в Варианте 1. Фигуры рисовались в Microsoft PowerPoint. Эти изображения созданы авторами и не требуют лицензии на публикацию или авторских прав. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 10: Гипотетические результаты FFT и распространённые индексы, которые можно из них вывести. (A) Отображается частотный график, полученный из FFT двух гипотетических фигур. Поскольку величины в бинах 3 и 4 демонстрируют противоположную тенденцию, отношение между этими двумя бинами будет хорошим показателем, отражающим разницу между этими двумя формами. Красные и зелёные пунктирные линии представляют собой другие частотные блоки, которые можно использовать для получения хороших индексов. (B) Гистограмма двух гипотетических форм, профили FFT которых демонстрируют поэтапную тенденцию убывания как представление их морфологических различий. (C) Гистограмма двух гипотетических форм, профили FFT которых наиболее различаются в центральной области вдоль диапазона частотных бинов. (D) Примеры гипотетических морфологических признаков, которые могут давать индексы, коррелирующие с их наличием. Фигуры рисовались в Microsoft PowerPoint. Эти изображения созданы авторами и не требуют лицензии на публикацию или авторских прав. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Графики с коробочными усами, сравнивающие величины различных частотных бинов по результатам преобразования LCPC сосудистых сетей. Преобразование LCPC сосудистых сетей, показанное на рисунках 4 и 5 , даёт набор частотных бинов и их величин, представляющих каждое изображение. Для сравнения всех групп обработки используются графики с коробочными усиками величин в каждом контейнере, чтобы определить, какой контейнер лучше всего служит индексом для стратификации текстуры и плотности, измеряемой с помощью преобразования LCPC. Каждый график box-whisker состоит из n = 3 независимых изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Пример сегментированных органоидов опухолей молочной железы. Органоиды вручную сегментировались экспертом, который регулярно культивировал их и рассматривал под микроскопией. На рисунке показаны примеры сегментированных органоидных контуров. Шкала для всех микроскопических изображений составляет 50 мкм. Первичные человеческие клетки, использованные в этом исследовании, были получены и культивированы по этическим одобрениям, а также зарегистрированы процедуры информированного^{согласия 21}. Представленные здесь изображения взяты из этих одобренных клеточных культур и опубликованы впервые. Дополнительный сбор человеческих образцов не проводился. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Спектры FFT для форм на рисунке 6. Результаты FFT для фигур на рисунке 6 приведены здесь, чтобы читатели могли понять влияние изменения ориентации формы на их пространственную информацию. Левый столбец графиков имеет неизменные оси y, а правый столбец — усечённые оси, чтобы можно визуализировать меньшие значения бинов. (A) Спектры из параллельной сетки LCPC преобразуют четыре фигуры на рисунке 6C по мере их отображения, что означает отсутствие переориентации. (B) Спектры из параллельного преобразования сетки LCPC фигур на рисунке 6D, которые были переориентированы, как описано в тексте. (C) Спектры из параллельного преобразования LCPC фигур на рисунке 6E. (D) Спектры из параллельного преобразования LCPC фигур на рисунке 6F для сравнения с изображениями на рисунке 6E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Подробная информация о лучших практиках для трансформации LCPC. Этот дополнительный файл содержит обширное обсуждение лучших практик и дополнительные методологические заметки. План документа таков: Раздел 1 — Пространственный контекст, который не могут передать область, объём, периметр и шероховатость. Раздел 2 — Лучшие практики использования преобразования LCPC и интерпретации результатов. Раздел 3 — Понять природную полярность природы для максимизации преобразования LCPC. Раздел 4 — Интерпретация спектров БПФ, возникающих в результате преобразования LCPC. Раздел 5 — Как ориентировать фигуры перед их измерением с помощью преобразования LCPC. Раздел 6 — Что такое «Чистая форма» против «В масштабе»? Раздел 7 — Методологические заметки по статистическим методам. Раздел 8 — Методологические заметки по культивированию клеток и сегментации органоидов. Раздел 9 — Параметры FFT для тех, кто кодирует собственное преобразование LCPC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Как и в любом вычислительном инструменте, качество вывода зависит от того, соответствуют ли входные данные ожидаемым правилам, вокруг которых был спроектирован инструмент. Следующие правила следует соблюдать и использовать в качестве проверки качества при использовании предоставленных скриптов на Python. Во-первых, убедитесь, что открытые маски имеют синие линии на белом фоне. Синий был произвольным решением и не имеет значения, но скрипты, выполняющие преобразование LCPC, были написаны для поиска синих пикселей на белом фоне. Во-вторых, не запускайте скрипты преобразования LCPC на изображениях с белым пространством менее 10 пикселей по всем четырём сторонам. Смотрите это видео для объяснения причины: «Параметр толщины поля — как подготовить контуры ^{формы»33}. В-третьих, этот скрипт предполагает, что контуры вашего объекта — это синие пиксели на белом фоне. Толщина линии должна составлять от 5 до 10 пикселей. Смотрите это видео для объяснения почему: «Параметр толщины линии — как подготовить контуры формы^»34. В-четвёртых, не запускайте скрипты преобразования LCPC на пустых изображениях. Это приведёт к ошибке в скрипте. В-пятых, не запускайте скрипты преобразования LCPC на изображениях, которые состоят лишь из крупинки мусора. Это приведёт к ошибке, поскольку сетчатая система может не обнаружить точку и, следовательно, попытаться проанализировать пустое изображение. В-шестых, не запускайте скрипты преобразования LCPC на изображениях, содержащих частицы нежелательного мусора. Обломки изменят высоту и ширину открытого маскового объекта, что приводит к неточные результаты. В-седьмых, посмотрите это видео, чтобы понять, почему важно понимать масштаб ваших объектов перед их анализом с помощью преобразования LCPC: «Параметр масштаба — как подготовить контуры формы^»35.

Одна из самых удивительных особенностей преобразования LCPC — его способность захватывать пространственный контекст. Биология полна пространственного контекста, который критически важен для понимания природы. Например, эпителиальные клетки имеют апикально-базальную^{полярность} 36,37,38,39. Кроме того, направление гравитации, изменённое в условиях микрогравитации, оказывает значительное влияние как на физиологию^{астронавтов 40,41}, так и на морфологию раковых^клеток 42,43,44. Наконец, in situ пренеоплазия и неоплазия могут вырасти в люмены через стебль, который служит центральной опорой и обеспечивает доступ к кровоснабжению. Поэтому, когда эти поражения регрессируют, они регрессируют как от люминальной полости, так и к стеблю^45,46. Поскольку преобразование LCPC было спроектировано для этого, оно очень чувствительно к пространственному контексту и может вводить дополнительную гетерогенность, если пользователь не будет внимателен. Рисунок 6 описывает, как систематически ориентировать фигуры перед применением преобразования LCPC. Рисунок 7 показывает, что традиционная геометрия не может измерить понятия форм, которые очевидны человеку. Рисунок 8 показывает схему, которая визуализирует разницу между измерением чистой формы и формы в масштабе. Рисунок 9 показывает, что пространственный контекст часто упускается из виду при количественной оценке форм в двумерной культуре, гистологии и двумерных срезах из 3D-изображения. Обратите внимание, что из-за ограниченного пространства дополнительный файл 1 содержит подробное обсуждение рисунков 6 и 7 в разделе 5, а также рисунков 8 и рисунка 9 в разделе 6.

Поскольку БПФ генерирует многомерные спектральные данные, важно, чтобы пользователь привык получать индексы из повторяющихся паттернов в спектрах. Хотя в этой рукописи преобразование LCPC упоминается как включающее шаг применения FFT, фактическое преобразование LCPC происходит до шага FFT (рисунок 1A–B шаг 4, рисунок 2A–B шаг 3). Однако применение FFT выявляет объективные, систематические данные из частотной области выхода преобразования LCPC. Таким образом, преобразование LCPC было бы менее эффективным без включения FFT в качестве финального шага. В преобразовании LCPC FFT приводит к серии бинов и их величин, все из которых являются статическим многомерным представлением контурного входа на шаге 1. Аналогией статического многомерного представления информации является девятизначный телефонный номер, обозначающий телефонный канал связи человека в Соединённых Штатах. Хотя они негромоздки по сравнению с масштабными представлениями форм (такими как 85 см в длину, 56 градусов в ширину и т.д.), многомерные данные содержат гораздо больше информации для извлечения инсайтов. Рисунок 10 показывает несколько спектральных паттернов, наблюдаемых при применении преобразования LCPC, и способы вывода индексов из них. Раздел 4 Дополнительного файла 1 более подробно рассматривает Рисунок 10 .

Частотная область преобразования LCPC выявляет объективные и количественные особенности двумерной формы, которые невозмутимым глазом невозможно легко увидеть. Очень тонкие различия в кривизне, зазубренности и извилистости можно надёжно количественно оценить. Однако после выявления морфологических подтипов с помощью этого метода можно наблюдать визуально различимые темы, коррелирующие с количественными различиями. Эта особенность делает преобразование LCPC интерпретируемым как метод извлечения пространственной информации для моделей машинного обучения (ML) и делает сами полученные модели машинного обучения более интерпретируемыми. Хотя нейронные сети являются мощным методом машинного обучения, их результаты часто не интерпретируются человеком, что является серьёзной проблемой для области медицинского искусственного интеллекта (ИИ). Врачи неохотно применяют модель машинного обучения для клинических решений, если не понимают, почему модель принимает ошибки. Кроме того, если ни один человек не понимает, почему или как модель приняла предвзятое решение, исправление этого становится невыполнимым.

Стоит добавить к обсуждению измерения плотности текстуры (рисунки 4 и 5), что человеческий глаз легко путается оптическими иллюзиями или беспорядочными узорами. Хаотичное расположение сложных паттернов часто интерпретируется как случайное, неизмеримое или не заслуживает измерения. Преобразование LCPC может измерять воспроизводимые, объективные, количественные различия в, казалось бы, случайных паттернах. Однако, если пользователь не обучен не вводиться в заблуждение хаотичными, беспорядочными закономерностями природы, маскирующейся под случайность, не будет предприниматься попытка измерить это расстройство для выявления предсказуемых закономерностей. Предсказуемые закономерности ясно свидетельствуют о том, что система не является полностью случайной. Преобразование LCPC было изобретено для измерения форм, которые немного отличаются или немыслимо отличаются от невооружённого глаза. Поскольку многие морфологии в природе демонстрируют незначительные различия, которые больше похожи на бессмысленную хаотичную гетерогенность, чем на предсказуемые подтипы беспорядков — каждый из которых коррелирует с различными биологическими функциями — была разработана следующая концептуальная концепция «Четырёхшагов» для использования в сочетании с преобразованием LCPC. Во-первых, сопротивляйтесь идее, что сложная система случайна. Во-вторых, назовём хаотическую гетерогенность «беспорядком», а затем найдём тип порядка, который может служить рациональным эталонным условием. Предположите, что расстройство отклоняется от референса. В-третьих, найдите способ объективно измерить эталон паттерна, например, преобразование LCPC. В-четвёртых, примените тот же объективный метод к измерению того, что считается беспорядком в системе.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook