Целью данного исследования было выявление ключевых активных компонентов Coptis chinensis и выяснение их действия в лечении церебрального паралича (ЦП) с помощью аффинитной ультрафильтрации и экспериментальной проверки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Целью данного исследования было выявление ключевых активных компонентов Coptis chinensis и выяснение их действия в лечении церебрального паралича (ЦП) с помощью аффинитной ультрафильтрации и экспериментальной проверки.
Целью данного исследования было выявление ключевых активных компонентов Coptis chinensis и выяснение механизмов его действия при вмешательстве при церебральном параличе (ЦП) с помощью аффинитной ультрафильтрации. Используя ацетилхолинэстеразу (AChE) в качестве мишени, коптизин был выделен из экстракта C. chinensis как компонента с самой сильной способностью связывания, который демонстрировал скорость связывания 21,9% и значительную ингибирующую активность in vitro (IC₅₀ = 3,24 мкг/мл). Симуляции молекулярного стыковки и молекулярной динамики показали, что коптизин может стабильно связываться с активным карманом AChE. Впоследствии были проведены верификационные эксперименты на неонатальной крысе с гипоксично-ишемическим повреждением мозга (HIBD). Результаты показали, что вмешательство с коптизином (10 мг/кг) значительно улучшало пространственное обучение и нарушения памяти у модельных животных, увеличивало кровоток в повреждённом полушарии, облегчало патологическое повреждение мозговых тканей и подавляло аномальную активацию АХГ в мозге. В итоге это исследование объединило технологию аффинитной ультрафильтрации и подтвердило, что коптизин, обнаруженный из экстракта C. chinensis, может ингибировать AChE и оказывать нейропротекторные эффекты, а также улучшать кровоток в мозге. Он служит ключевой материальной основой для C. chinensis , способного смягчить нейрологические дефициты, похожие на CP, тем самым предоставляя кандидаты в молекулы и научные доказательства для разработки родственных лекарств.
Церебральный паралич (ДЦП) — это постоянный синдром, вызванный непрогрессирующим повреждением развивающегося мозга плодов или младенцев, характеризующийся преимущественно моторной дисфункцией и аномалиями осанки. Хотя сейчас доступно несколько клинических методов лечения ДЦП, по-прежнему не хватает идеальных препаратов, способных фундаментально восстановить неврологические дефициты с минимальными побочными эффектами. В отличие от химически синтезированных препаратов, которые обычно действуют на отдельных мишенях и обладают относительно высокой потенциальной токсичностью, традиционные китайские лекарства (ТКМ), обладающие преимуществами многокомпонентной, многоцелевой и целостной регуляцией, а также благоприятными профилями безопасности, демонстрируемыми в долгосрочной клинической практике, предоставляют новые знания и резервуар кандидатов на лекарства для лечения сложных заболеваниймозга. 1, 2,3,4,5,6. Таким образом, изучение высокоэффективных и низкотоксичных химических компонентов ТКМ имеет значительное научное и клиническоезначение 7.
Среди сложных патологических механизмов церебрального паралича ключевую роль играет холинергическая дисфункция нервнойсистемы 8,9. Ацетилхолинэстераза (AChE) — это ключевой фермент, гидролизующий нейромедиатор ацетилхолин (ACh). Чрезмерно высокая активность этого фермента приводит к истощению ACh, нарушает передачу холинергических сигналов и, следовательно, усугубляет моторный контроль и когнитивные нарушения. Таким образом, AChE стал важной и хорошо зарекомендовавшейся мишени для разработки нейропротекторных средств. Ингибирование активности AChE для повышения уровня ACh в синаптической щели признано одной из эффективных стратегий для смягчения неврологических дефицитов, связанных с CP. В контексте гипоксично-ишемического повреждения мозга нарушение холинергической нейротрансмиссии может ещё больше усугублять дисфункцию нейронов, тем самым способствуя развитию моторных и когнитивных нарушений, характерных для ДЦП. Поэтому AChE был выбран в этом исследовании не только как классическая нейрофункциональная мишень, но и как механистически значимая точка входа для скрининга биоактивных соединений с потенциальным анти-ДП эффектом.
Современные исследования показали, что лекарственные растения обладают широким спектром фармакологических значений. Как классическая традиционная китайская медицина для очистки тепла и сушки влаги, Coptis chinensis представляет собой сложную систему, богатую различными изохинолиновым алкалоидами. Помимо известного берберина, он также содержит ряд компонентов со схожей структурой и разнообразными фармакологическими свойствами, таких как коптизин, эпиберберин, пальматин иятроризин 10. Эти алкалоиды вместе составляют материальную основу фармакологических эффектов C. chinensis. Предыдущие исследования показали, что C. chinensis и его алкалоиды обладают противовоспалительными, антиоксидантными и потенциально нейропротекторными свойствами. Однако, учитывая такую сложную систему компонентов, традиционные методы исследования трудно быстро и точно определить ключевые активные компоненты, напрямую нацеленные на AChE, что значительно ограничивает глубокое разъяснение механизмов, лежащих в основе влияния C. chinensis на повреждениемозга 11.
По сравнению с традиционной активно-ориентированной изоляцией, которая обычно требует повторного фракционирования, тестирования биоактивности и очистки, а также может привести к потере или пренебрежению соединений с низким содержанием, но с высокой аффинностью, аффинитная ультрафильтрация позволяет быстро отбирать лиганды, связывающие мишень, непосредственно из сложных смесей. Эта техника позволяет эффективно и быстро «выловить» активные лиганды, которые связываются с конкретными целями (например, AChE) непосредственно из многокомпонентных экстрактов сырого сырья ТКМ. Он особенно подходит для систем с множеством алкалоидных компонентов, таких как C. chinensis, что позволяет точно определить эффективные компоненты, непосредственно взаимодействующие с целью из сложнойсмеси 12. В сочетании с вычислительными подходами, включая молекулярное стыкованное соединение и молекулярно-динамические симуляции, он может интуитивно предсказывать режим связывания, типы взаимодействия и сложную стабильность между компонентами и целевые белки на атомном уровне, предоставляя надёжные теоретические доказательства и механистические объяснения результатов экспериментальногоскрининга 13.
Основываясь на вышеуказанном предыстории, в этом исследовании выдвигается следующая научная гипотеза: среди различных алкалоидов, присутствующих в C. chinensis, существуют активные компоненты, способные специфически ингибировать AChE, и именно эти компоненты являются материальной основой для его потенциального противоцеребрального параличного эффекта. Для подтверждения этой гипотезы мы интегрировали современные методы скрининга с фармакологическими методами валидации: во-первых, используя AChE в качестве мишени, была применена технология аффинной ультрафильтрации для быстрого отбора потенциальных ингибиторов из мультиалкалоидного экстракта C. chinensis; Кроме того, для уточнения механизма связывания на атомном уровне использовались моделирование молекулярного стыковки и молекулярной динамики; Наконец, были проведены эксперименты на животных in vivo для подтверждения улучшения влияния скрининговых компонентов на поведение, патологию мозговых тканей и активность AChE у крыс с ДЦП.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все процедуры по защите животных и экспериментальные процедуры были утверждены Комитетом по этике благополучия лабораторных животных Первой народной больницы Зуньи (Этический No 2025-2-362). В период моделирования и обработки ежедневно фиксировались состояние тела и выживаемость животных.
Приготовление экстракта C. chinensis
В этом исследовании был использован экстрактор ускоренного растворителя для ускоренного извлечения н-бутанола из лекарственных материалов C. chinensis . В общей сложности 1 г сушёного порошка C. chinensis был точно взвешен и помещён в экстракционные клетки по 40 мл соответственно. Металлические прокладки и стекловолокнистые фильтрующие мембраны последовательно размещались над и под экстракционной ячейкой для фильтрации образца, а образец оборачивался кварцевым песком. Во время извлечения температура и давление устанавливались на уровне 90 °C и 100 бар соответственно. Ускоренный экстракт собирался, а экстракционный растворитель испарялся до сухости с помощью ротационного испарителя для получения высушенных экстрактов разных полярных фракций. Метанол: вода (50:50, v/v) был выбран в качестве растворителя для восстановления. Экстракт фильтровали через микропористую мембрану диаметром 0,45 мкм и хранили при температуре 4 °C. До обнаружения образца была изучена тормозная активность растворителя для восстановления заготовки на AChE. Результаты показали, что его тормозящее действие незначительно, что указывает на то, что выбор растворителя для восстановления в этом эксперименте не повлиял бы на результаты эксперимента.
Анализ ингибирования ацетилхолинэстеразы
Эксперимент проводился на пластине с 96 лунками. Сначала был добавлен PBS, затем последовательные образцы AChE (0,1 U/mL) и C. chinensis . После инкубации при 37 °C в течение 10 минут были добавлены хромогенный раствор 5,5′-дитиобис (2-нитробензойная кислота) (DTNB) (2,5 ммоль/мл) и субстрат ATChI (10 ммоль/мл). Смесь инкубировала при 37 °C ещё 10 минут, после чего реакция завершалась добавлением 60 мкл 1% додецилсульфата натрия (SDS). Поглощение измерялось на уровне 405 нм. Каждый образец C. chinensis был собран из 4 групп: контрольная группа a: PBS (120 мкл), раствор AChE (20 мкл), раствор DTNB (40 мкл), раствор ATChI (40 мкл) и раствор SDS (60 мкл) последовательно; Пустая контрольная группа b: PBS (120 мкл), раствор DTNB (40 мкл), раствор ATChI (40 мкл) и раствор SDS (80 мкл); Группа образцов c: PBS (80 мкл), экстракт C. chinensis (20 мкл), раствор AChE (20 мкл), раствор DTNB (40 мкл), раствор ATChI (40 мкл) и раствор SDS (60 мкл); Пробная пустая группа d: PBS (100 мкл), экстракт C. chinensis (20 мкл), раствор DTNB (40 мкл), раствор ATChI (40 мкл) и раствор SDS (60 мкл). В качестве положительного контроля использовался хуперзин А с начальной концентрацией примерно 2,5 мг/мл. Начальная концентрация экстракта фракции n-бутанол составляла около 1 мг/мл. И хуперзин А, и образцы были разбавлены с градиентом 60%. Скорость ингибирования рассчитывалась по следующей формуле: скорость ингибирования (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%, где a, b, c и d представляют значения поглощения контрольной группы a, пустой контрольной группы b, группы выборки c и пустой группы d соответственно.
Скорость ингибитора при каждой тестируемой концентрации рассчитывалась по описанной выше формуле. Затем были построены кривые концентрации и ингибирования путём отображения скорости торможения с логарифмом концентрации соединения. Значения IC20, IC50 и IC80 были рассчитаны с помощью нелинейного регрессионного фитинга с помощью программного обеспечения GraphPad Prism на основе подогнанных кривых концентрации–отклик и определялись как концентрации, необходимые для получения 20%, 50% и 80% ингибирования активности AChE соответственно.
Ультрафильтрационный анализ на аффинность
Была проведена аффинная ультрафильтрация для скрининга соединений, связывающих AChE, из экстракта C. chinensis . Кратко, в качестве активного фермента использовался раствор AChE (0,1 U/mL в PBS, pH 7,4). Инактивированный контроль фермента был подготовлен путём нагрева того же раствора AChE в кипяточной водяной бане в течение 10 минут. Для каждой реакции 200 мкл раствора экстракта C. chinensis смешивалось с 200 мкл активного или инактивированного раствора AChE и инкубировалось при 37 °C в течение 30 минут. После инкубации смесь перемещалась в ультрафильтрационную центрифугу мощностью 30 кДа и центрифугировала при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Удержанный фермент-лиганд комплекс был промыт три раза 200 мкл PBS при тех же условиях центрифугирования для удаления несвязанных компонентов. Впоследствии было добавлено 200 мкл 90% метанола для диссоциации и элюирования лигандов, связанных с AChE, после чего следовала инкубация в течение 10 минут и центрифугирование при 12 000 × г в течение 10 минут. Элуат был собран, отфильтрован и проанализирован с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Соединения, обогащённые активной ферментной группой относительно инактивированного контроля фермента, рассматривались как потенциальные компоненты, связывающие AChE. 14.
Анализ ВЭЖХ основных метаболитов алкалоидов
Хроматографический анализ проводился с использованием системы ВЭЖХ, оснащённой четвертичным насосом, автосэмплером, колонной печью и ультрафиолетово-видимым (UV-Vis) детектором. Разделение осуществлялось на хроматографической колонке C18 (250 × 4,6 мм, 5 мкм), поддерживаемой при 25 °C. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила (A) и раствора аммония бикарбоната 30 ммоль/л, содержащего 0,7% аммиака и 0,25% триэтиламина (B), подаваемого при расходе 1,0 мл/мин. Программа градиентного элюирования была следующей: 0–15 мин, 90–75% B; 15–25 мин, 75%–70% B; 25–50 мин, 70%–55% B. Объём впрыска составлял 5 мкл, а обнаружение ультрафиолета осуществлялось на 270 нм.
Для количественного анализа основных алкалоидов C. chinensis каждый образец (0,02 г) тщательно взвешивался и ультразвуково экстракцировал с помощью 10 мл раствора соляной кислоты-метанола (1:100, v/v) в течение 30 минут. После фильтрации потеря веса компенсировалась тем же экстракционным растворителем, что и исходный вес, а окончательный раствор фильтровался через мембрану диаметром 0,45 мкм перед анализом ВЭЖХ. Восемь аутентичных эталонных стандартов, включая магнофлорин, глауцин, ятроризин, колумбамин, эпиберберин, коптизин, пальматин и берберин, были проанализированы в тех же хроматографических условиях. Для этих анализируемых были построены калибровочные кривые с использованием эталонных решений. Поскольку уровни количества и реакции детекторов восьми алкалоидов значительно различались, диапазон калибровки для каждого анализируемого препарата был индивидуально оптимизирован на основе литературных отчётов и предварительных экспериментов, а не применялся одинаковый вариант разбавления для всех соединений. Таким образом, соотношения высокой и низкой концентрации линейных диапазонов не должны были быть одинаковыми между восьмью анализированными веществами. Пределы обнаружения (LOD) и пределы количественной оценки (LOQ) оценивались при соотношении сигнал/шум примерно 3 и 10 соответственно.
Для анализа элуатов аффинности ультрафильтрации лиганды, отделённые от AChE после ультрафильтрации, собирались в ходе повторных экспериментов и концентрировались перед анализом ВЭЖХ для обеспечения достаточной интенсивности сигнала для обнаружения. Концентрированные элюаты затем анализировались с использованием тех же условий ВЭЖХ, что и описано выше. Хроматографические пики в элуатах были определены путём целенаправленного сравнения с восемью подлинными эталонными стандартами и хроматографическим профилем экстракта C. chinensis , полученным при идентичных аналитических условиях. Поэтому данный анализ был предназначен не для нового структурного выяснения неизвестных соединений, а для целенаправленного определения того, обогащены ли известные основные алкалоиды C. chinensis активным ферментом по сравнению с контролем инактивированного фермента.
Молекулярный стыковочный анализ
В настоящем исследовании анализ докинга был сосредоточен на коптизине, поскольку он был признан лучшим компонентом, связывающим AChE, с помощью аффинной ультрафильтрации, а также показал самую сильную ингибирующую активность in vitro среди основных алкалоидов. Кристаллы белка были извлечены из Банка данных белков (PDB). Белковые кристаллы с сокристаллизованными лигандами были выбраны в качестве конечных состыковочных рецепторов, а все целевые кристаллы белка были получены от человека. Файл рецептора открывался с помощью программного обеспечения PyMOL, а файлы рецептора и лиганда отделялись и сохранялись; рецептор открывался с помощью программного обеспечения MGLTools, затем удаляли молекулы воды, добавляли атомы водорода и заряды, объединяли неполярные атомы водорода, рассчитывали локальные атомные заряды и т.д., а затем сохраняли в формате PDBQT; файл лиганда открывался с помощью программного обеспечения MGLTools, добавлялись атомы водорода и заряды, которые сохранялись в формате pdbqt; Поле сетки было открыто, расстояние установлено на 1.000, количество точек сетки было установлено, центральные координаты коробки выбраны согласно ко-кристаллизованному лиганду и сохранены в файлеGPF 15,16.
Структуры химических компонентов были впервые собраны из базы данных SciFinder и сохранены в формате cdx; каждая молекулярная трёхмерная структура отображалась с помощью модуля ChemBio3D Ultra, оптимизация энергии выполнялась с помощью силового поля MM2, сохранялась в формате mol2, а параметры заряда были удалены. С помощью AutoDock файл формата mol2 открывался с помощью программного обеспечения MGLTools, в лиганд добавлялись атомы водорода и заряды, наблюдались вращающиеся химические связи и сохранялись в формате pdbqt. Модель AutoDock Vina (версия 1.2.5) была применена для оценки молекулярного стыковки.
Симуляционный анализ молекулярной динамики
Программное обеспечение Gaussian 16 и GaussView 6 использовалось для оптимизации структуры лигандов. После импорта mol2-файла структуры лиганда в GaussView 6 тип задачи был установлен как Optimization, состояние целевой молекулы выбрано как Основное состояние, метод расчёта — теория функционала плотности (DFT), мультипликатность спина по умолчанию была установлена как Default Spin, используемый функционал — B3LYP, модель растворителя — IEFPCM, А растворителем была вода. После завершения оптимизации молекулярной структуры для преобразования сгенерированного файла chk в fch-файл, который затем импортировался в программное обеспечение Multiwfn для расчёта RESP-заряда лиганда.
После расчёта заряда RESP сгенерированный файл chg импортировался в программное обеспечение sobtop_1.0 (dev5) для создания файла топологии лиганда, необходимого для моделирования молекулярной динамики. Симуляция молекулярной динамики проводилась с использованием программного обеспечения GROMACS 2019.6 с силовым полем AMBER99. Структурные файлы белковой и малой молекулы были импортированы в программное обеспечение, была установлена триклиническая коробка с периодической границей 1,0 нм, а для заполнения использовалась водная модель TIP3P. Для расчёта дальних электростатических взаимодействий использовался метод Particle Mesh Ewald (PME), а команда gmx geion применялась для введения соответствующего количества ионов натрия и хлоридов, чтобы нейтрализовать заряд всей системы. Симуляция проводилась при постоянной температуре 298 К и стандартном атмосферном давлении 100 кПа. Для минимизации энергии был реализован метод самого крутого спуска (крутой). Команды gmx grompp и gmx mdrun использовались для выполнения 10 000 шагов равновесия NVT (изотермально-изохорный ансамбль) и NPT (изотермально-изобарный ансамбль), при этом температурная и давления были установлены соответственно 0,1 пс и 0,5 пс, а продолжительность равновесного моделирования составляла 100 пс. После достижения равновесия временной шаг устанавливался на 2 fs, и на комплексе проводилась молекулярно-динамическая симуляция на 10 нс, при этом данные о траектории сохранялись каждые 2 пс. Производственный цикл в 10 нс был выбран как исследовательская длительность моделирования для краткосрочной динамической оценки состыкованного комплекса коптизин–AChE, а не исчерпывающего конформационного отбора проб. Эта настройка использовалась для оценки того, сможет ли пристыкованный комплекс поддерживать относительно стабильный режим связывания со временем. Команды gmx rms, gmx rmsf, gmx gyrate и gmx hbonds дополнительно использовались для расчёта корневого среднего квадрата (RMSD), корневой среднеквадратичной флуктуации (RMSF), радиуса вращения белка, водородных связей и площади поверхности, доступной для растворителя. QTgrace использовался для визуализации результатов.
Проверка экспериментов на животных
Были отобраны восемнадцать здоровых неонатальных крыс Спраг-Доули (SD) (7 дней после родов) любого пола. Все экспериментальные животные содержались в специализированном экспериментальном центре животных, свободных от патогенов (SPF). Это учреждение было оснащено строгой системой барьеров, которая могла эффективно предотвращать проникновение микроорганизмов и паразитов. Параметры окружающей среды жилой комнаты автоматически контролировались и регулировались центральной системой управления: температура 22 ± 2 °C, относительная влажность 55% ± 10%, световой цикл — 12 часов — свет/12 часов тёмный цикл. Для моделирования патологических и поведенческих характеристик ЦПР использовалась неонатальная модель гипоксичемного-ишемического повреждения мозга (HIBD), модифицированная классическим методом Райса-Ваннуччи.
Кратко, детёныши крыс на 7-й день после родов были анестезиированы с дозой 2–3% изофлурана для стимуляции и 1–2% для поддержания. После достаточной анестезии был сделан разрез шейки матки по средней линии, а левая общая сонная артерия была аккуратно выделена и навсегда связана. Затем разрез нашивали, и щенкам давали восстанавливаться на грелке в течение 1 часа. Впоследствии детёныши в модельной и коптизиновой группах подвергались воздействию гипоксии в камере с 8% O₂, сбалансированной с 92% N₂, в течение 2 часов при 37 °C, чтобы вызвать гипоксично-ишемическое повреждение мозга. Животные, оперируемые с помощью искусственной операции, подвергались той же анестезии и хирургическому воздействию без перевязки сонной артерии или гипоксического лечения. После гипоксии щенков возвращали к их матерям и ежедневно контролировали на предмет общего состояния, выживаемости и пищевого поведения в течение экспериментального периода.
Экспериментальные крысы были случайным образом разделены на 3 группы: фиктивная группа: только левая общая сонная артерия была отделена без перевязки или лечения гипоксией, а равное количество растворителя вводилось после операции; Модельная группа: была проведена операция по моделированию гипоксично-ишемического повреждения мозга, при этом после операции вводили равный объём растворителя; Группа коптизина: после моделирования коптизин (10 мг/кг) вводился методом гаважа. Доза коптизина (10 мг/кг) была выбрана как доза in vivo на основе ранее опубликованных исследований in vivo/фармакокинетики коптизина17. Препараты вводились один раз в день в фиксированное время в течение 14 последовательных дней вмешательства.
Обнаружение индикаторов животных
Тестовое оборудование для водного лабиринта Моррис (MWM) состояло из большого круглого водного бассейна (диаметр примерно 150 см) с явными визуальными ориентирами на стенке бассейна. Вода в бассейне была стратификацирована до непрозрачного молочно-белого цвета, а температура воды контролировалась на уровне 23 ± 1 °C. В целевом квадранте была размещена прозрачная платформа, погруженная на 1–2 см ниже поверхности воды. Тренировки проводились 4 раза в день: животных помещали в воду лицом к стене бассейна из четырёх разных входов на стену, а также фиксировалось время, необходимое животным, чтобы найти и забраться на скрытую платформу от входа в воду, а именно «задержку побега». Каждая тренировка была ограничена 60 секундами. Если животное находило платформу в течение 60 секунд, ему разрешалось оставаться на ней 15 секунд для консолидации памяти. Если животное не находили, его аккуратно направляли на платформу и позволяли оставаться там 15 секунд. После 7 дней обучения скрытая платформа была убрана. Животных помещали в воду с точки входа напротив оригинальной платформы и позволяли свободно плавать в течение 60 секунд, а траектория плавания записывалась с помощью видеосистемы. С помощью теста MWM фиксировались такие показатели, как средняя задержка выхода, время, проведённое в целевом квадранте, и количество пересечений над исходной позицией платформы.
Для лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI): после анестезии крыс фиксировали на стереотаксичном приборе, а череп оставался открытым и оставался влажным. Лазерная система измерения кровотока использовалась для непрерывного сбора необработанных изображений в течение 30 секунд непосредственно над черепом. Профессиональное программное обеспечение было использовано для преобразования пространственно-временно изменяющегося контраста спекла в карту распределения перфузионной единицы кровотока в мозге (PU). Для количественного анализа в каждом изображении в экспонируемом ипсилатеральном полушарии выбирался ручно определенный ROI корковой коры и видимые анатомические ориентиры, а среднее значение перфузии внутри этого ROI использовалось для межгруппового сравнения.
Были собраны ткани мозга, а также добавлен предварительно охлаждённый PBS в зависимости от соотношения веса и объёма. Механическая гомогенизация проводилась на льду, затем центрифугирование при 8000 × г при 4 °C в течение 10–15 минут, после чего супернатант собирался для испытаний. Ткани мозга быстро помещали в 4% параформальдегид для фиксации более 24 часов с целью поддержания морфологии тканей. Окрашивание гематоксилин-эозином (HE) проводилось с помощью операций, таких как обезвоживание, очищение и внедрение парафина, а степень повреждения мозга наблюдалась под оптическим микроскопом.
Для измерения активности AChE кора головного мозга из повреждённого (ипсилатерального) полушария была собрана и гомогенизирована согласно инструкциям производителя. Образцы тканей были гомогенизированы в экстракционном буфере и центрифугированы при 8000 × г в течение 10 минут при 4 °C, после чего супернатант был собран для анализа. Активность AChE была определена с помощью коммерческого набора для анализа активности ацетилхолинэстеразы (микропластинчат/колориметрический метод). Этот анализ основан на гидролизе ацетилхолина AChE, затем реакции с DTNB для получения хромогенного продукта, а поглощение измерялось на 412 нм для расчёта активности фермента. Поскольку этот набор является колориметрическим анализом на основе активности ферментов, а не обычным набором для квантифицирующего антиген-ферментно-связанного иммуносутонного анализа (ELISA), производитель не предоставил стандартный диапазон обнаружения и аналитическую чувствительность. В данном исследовании измеренные значения активности AChE в корковой ткани составляли примерно в диапазоне 25–80 нмоль/мин/мг белка.
Статистический анализ
Все экспериментальные данные были выражены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) и анализировались с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Сравнения между группами проводились с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым последовал тест множественных сравнений Тьюки. Для теста водного лабиринта Морриса итоговый результат тренировки и параметры пробного испытания были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA, после чего последовал тест с множественными сравнениями Тьюки. Значение P < 0,05 считалось статистическизначимым 18. Корреляция между перфузией кровотока в мозге при ROI и активностью AChE в ипсилатеральной коре головного мозга была проанализирована с помощью корреляционного анализа Пирсона. Значение P < 0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Анализ химических компонентов экстракта C. chinensis
Алкалоиды являются основными накопленными компонентами, а также основными активными компонентами лекарственных материалов C. chinensis . В этом исследовании хроматографическая технология была использована для анализа основных химических компонентов C. chinensis (рисунок 1A). Как показано в таблице 1, все восемь аналитов демонстрировали хорошую...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В настоящее время разработаны различные методы и технологии для профилактики и лечения заболеваниймозга 20,21,22. В этом исследовании была внедрена интегрированная стратегия скрининга in vitro, вычислительной симуляции и верификации in vivo для систематического уточнения материальной основы и многоцелевого механизма C. chinensis в улучшении симптомов, похожих на церебр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.
Эта работа была поддержана проектом Zunyi Science and Technology Plan (Zunshi Kehe Support HZ (2020) No 110).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) (DTNB) | CATO Research Chemicals Inc. | 416046844 | Испытание ингибирования ацетилхолинэстеразы |
| Ацетилхолинэстераза (АЧЭ) | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd | C1682 | Испытание ингибирования ацетилхолинэстеразы |
| Иодид ацетилтиохолина (АТЧИ) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 1037408 | Испытание ингибирования ацетилхолинэстеразы |
| Ацетонитрيل | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162577 | Мобильная фаза жидкостной хроматографии |
| AutoDock Vina | AutoDock | Версия 1.2.5 | |
| Стандарт берберина | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | 110713-201814 | Анализ химического состава |
| Стандарт колумбамин | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180712 | Анализ химического состава |
| Стандарт коптизина | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Анализ химического состава |
| Ускоренный экстрактор растворителей E-916 | Büchi Labortechnik AG, Switzerland | E916-008 | Экстракция фракции n-бутанола |
| Стандарт эпиберберина | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Анализ химического состава |
| Муравьиная кислота | Thermo Fisher Scientific Inc | 1270563 | Мобильная фаза жидкостной хроматографии |
| GaussView 6 | Gaussian | https://gaussian.com/gaussview6/ | |
| Стандарт глауцина | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180615 | Анализ химического состава |
| Стандарт ятрорризина | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180607 | Анализ химического состава |
| Стандарт магнофлорина | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180205 | Анализ химического состава |
| Метанол | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162578 | Мобильная фаза жидкостной хроматографии |
| Микропористая мембрана | Millipore Filter Company | 2139547 | Фильтрация экстрактов |
| Стандарт пальматина | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180226 | Анализ химического состава |
| Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| PyMOL | PyMOL | https://pymol.org/ | |
| Углекислый натрий | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 15138805 | Испытание ингибирования ацетилхолинэстеразы |
| Додецисульфат натрия (ДНС) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 11019349 | Испытание ингибирования ацетилхолинэстеразы |