Исследовательская статья

Экзосомы плацентарного происхождения смягчают индуцированный гипоксией апоптоз трофобласта и прогрессирование воспаления через SASH1

34 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71083

⸱

18 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, The Fourth Hospital of Shijiazhuang

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Белок 1, содержащий домены SAM и SH3 (SASH1), идентифицирован как ключевой регулятор апоптоза трофобласта и воспаления при преэклампсии (ПЭ). Экзосомы плацентарного происхождения (P-EXOS) смягчают повреждения, вызванные гипоксией, путем подавления экспрессии SASH1. Эти результаты раскрывают новый механизм патогенеза ПЭ и позволяют рассматривать SASH1 в качестве потенциальной терапевтической мишени.

Аннотация

SASH1 представляет собой сигнальный адаптерный белок, участвующий в росте клеток, апоптозе и иммунной регуляции, и все чаще становится объектом изучения в опухолевых и иммунных клетках. Новые данные свидетельствуют о том, что SASH1 играет важную роль в воспалительных реакциях и клеточном гомеостазе — процессах, тесно связанных с развитием преэклампсии (ПЭ). Данное исследование было направлено на определение того, способствует ли SASH1 апоптозу трофобласта и воспалительным реакциям при ПЭ, и оказывают ли P-EXOS защитный эффект посредством регуляции SASH1. В ходе исследования были проанализированы три транскриптомных набора данных, связанных с ПЭ (GSE75010, GSE10588 и GSE60438), для выявления общих дифференциально экспрессируемых генов (DEG) с последующим анализом обогащения по Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Далее были применены алгоритмы машинного обучения для отбора ключевых генов-кандидатов, а данные секвенирования РНК единичных клеток использовались для характеристики клеточной гетерогенности в тканях плаценты и определения паттернов экспрессии, специфичных для конкретных типов клеток. SASH1 был идентифицирован как консенсусный ген-кандидат и был значимо повышен в клетках трофобласта из образцов с ПЭ. In vitro была создана модель клеток трофобласта HTR-8/SVneo, подвергнутых воздействию гипоксии, в сочетании с нокдауном SASH1, гиперэкспрессией SASH1 и кокультивированием с P-EXOS. Функциональные эксперименты показали, что нокдаун SASH1 значительно подавлял индуцированный гипоксией апоптоз трофобласта и снижал секрецию провоспалительных цитокинов, включая IL-6, IL-1β и TNF-α, тогда как гиперэкспрессия SASH1 стимулировала апоптоз и воспалительные реакции. Кроме того, обработка P-EXOS заметно снижала экспрессию SASH1 как на уровне мРНК, так и на белковом уровне, и ослабляла повреждение трофобласта, вызванное гипоксией, в то время как гиперэкспрессия SASH1 в значительной степени нивелировала эти защитные эффекты. В совокупности эти результаты указывают на то, что SASH1 играет критическую роль в апоптозе трофобласта и воспалительных реакциях при ПЭ. P-EXOS может облегчать повреждение трофобласта, вызванное гипоксией, путем подавления экспрессии SASH1, что дает новое понимание молекулярных механизмов и потенциальных терапевтических мишеней при ПЭ.

Введение

Преэклампсия (ПЭ) представляет собой специфическое для беременности мультисистемное расстройство, которое обычно возникает после 20-й недели гестации и клинически характеризуется гипертензией, протеинурией и полиорганной недостаточностью. Она остается одной из основных причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности во всем мире1. Несмотря на постоянные успехи в клиническом ведении пациентов, окончательным методом лечения ПЭ по-прежнему является родоразрешение с извлечением плаценты, что подчеркивает неполное понимание ее патогенеза и острую необходимость в выявлении новых молекулярных и клеточных механизмов, а также потенциальных терапевтических мишеней2,3.

Адекватная инвазия трофобласта и содействие нормальному развитию плаценты являются критическими механизмами, лежащими в основе патогенеза ПЭ4. При нормальной беременности клетки трофобласта инвазируют в децидуальную оболочку матки и перестраивают спиральные артерии для создания кровотока с низким сопротивлением и высокой пропускной способностью. Нарушение инвазии и миграции клеток трофобласта приводит к снижению плацентарной перфузии, что создает стойкую среду с гипоксией и окислительным стрессом. Гипоксия напрямую влияет на апоптоз клеток, а аберрантный выброс провоспалительных медиаторов нарушает гомеостаз на материнско-плодном интерфейсе, что еще больше усугубляет дисфункцию плаценты5. Воспаление также является важным фактором развития ПЭ. Было обнаружено, что уровни IL-17, IL-6 и TNF-α значительно повышены в плаценте и периферической крови пациентов с ПЭ6. Гипоксия и воспаление взаимно усиливают друг друга, формируя порочный круг, который усиливает системное воспаление, вызывает повреждение эндотелия и способствует развитию аномалий плаценты. Молекулярные сети, регулирующие апоптоз трофобласта и воспалительные реакции, остаются в значительной степени неизвестными.

SASH1 является представителем семейства внутриклеточных скаффолд-белков SLy/SASH1, который функционирует как сигнальный адаптер7. SASH1 в основном характеризуется как опухолевый супрессор, который ингибирует эпителиально-мезенхимальный переход (EMT), миграцию и инвазию клеток посредством взаимодействия с такими сигнальными партнерами, как CRKL и путь PI3K-Akt-mTOR8,9. Помимо функций подавления опухолевого роста, новые данные свидетельствуют о том, что SASH1 участвует в воспалительной сигнализации и иммунной регуляции7. Однако экспрессия и функция SASH1 в плаценте, особенно в контексте биологии трофобласта и преэклампсии (PE), не были изучены.

Экзосомы стали важными клеточными медиаторами и все чаще изучаются в контексте беременности10. Экзосомы транспортируют различные биоактивные грузы, включая белки, липиды и некодирующие РНК, для модуляции функций клеток-реципиентов. Растущее число данных свидетельствует о том, что P-EXOS играют критическую роль в иммунной регуляции во время беременности, а их активность и содержимое значительно изменяются при PE, что потенциально усиливает воспалительное состояние11. Экзосомы также были вовлечены в регуляцию окислительного стресса12 и ангиогенеза13, что может оказывать благотворное воздействие при осложнениях, связанных с беременностью. Однако их молекулярные мишени и механизмы действия при PE остаются изученными не полностью.

Была выдвинута гипотеза о том, что экспрессия SASH1 нарушена в плаценте при преэклампсии (ПЭ), и что данный белок функционирует как ключевой драйвер апоптоза трофобласта и воспалительных реакций, а P-EXOS могут оказывать защитное действие против повреждения трофобласта путем модуляции экспрессии SASH1. Для проверки этой гипотезы был проведен интегративный анализ нескольких транскриптомных наборов данных по ПЭ и данных секвенирования РНК единичных клеток с применением многоалгоритмического машинного обучения для идентификации ключевых генов-кандидатов. С использованием модели клеток трофобласта HTR-8/SVneo, подвергнутых воздействию гипоксии, и экспериментов по интервенции на основе экзосом была изучена функциональная роль SASH1 в дисфункции трофобласта и терапевтический потенциал P-EXOS при ПЭ.

Протокол

Заявление об этике

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Четвертой больницы города Шицзячжуан (номер одобрения 20200031). До сбора образцов от всех доноров плацентарной ткани было получено письменное информированное согласие. Все процедуры с участием людей проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией. Полный список реагентов, расходных материалов, оборудования и программного обеспечения, использованных в данном протоколе, приведен в Таблице материалов.

Сбор данных

Данные RNA-seq были получены из базы данных GEO. Наборы данных включали GSE75010, который содержит данные экспрессии генов 157 плацент с ПЭ и 173 плацент без ПЭ (N = 330). GSE10588 содержит данные экспрессии генов 26 нормальных плацент и 17 плацент с тяжелой формой ПЭ (N = 43). GSE60438 содержит данные профилирования транскриптома decidua basalis пациенток с преэклампсией и при нормотензивной беременности (N = 125). Данные транскриптома отдельных клеток были получены из набора данных GEO GSE183338. Он включает образцы отдельных ядер из ворсин хориона/материнско-плодного интерфейса при ПЭ и здоровой беременности.

Анализ дифференциально экспрессируемых генов (DEG)

Сначала были предварительно обработаны и нормализованы наборы данных GSE75010, GSE10588 и GSE60438, содержащие дифференциально экспрессируемые гены (ДЭГ), связанные с преэклампсией. Затем, на основе информации о группировке образцов, был проведен дифференциальный анализ с использованием пакета R «limma»14. Были отобраны гены со значениями p < 0.05 и |log2FC| > 0.5. Графики «вулкан» для ДЭГ были построены с помощью пакета R ggplot2. Тепловые карты для 20 наиболее значимых ДЭГ были созданы с использованием пакета R pheatmap. Впоследствии было определено пересечение ДЭГ, выбранных из трех наборов данных, и для генов-кандидатов была построена сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) с использованием онлайн-платформы STRING при значении показателя взаимодействия ≥0.15. Затем из этой PPI-сети были определены 20 основных (хабовых) генов на основе степени их связности, ранжированной с помощью программного обеспечения Cytoscape. Результаты PPI-сети были визуализированы с помощью Cytoscape или STRING.

Анализ обогащения

Анализ обогащения генов был выполнен с использованием пакетов ClusterProfiler и DOSE в сочетании с веб-сайтом Metascape. Базы данных были получены из GO и KEGG. Анализ обогащения проводили с помощью функции «EnrichGO». Пути с p < 0.05 считались статистически значимо обогащенными. Результаты обогащения были визуализированы с помощью пакетов «ggplot2» и «ggpubr».

Машинное обучение

Для выявления надежных и биологически значимых дифференциально экспрессируемых генов (ДЕГ), связанных с преэклампсией (ПЭ), был проведен анализ отбора признаков с использованием нескольких моделей машинного обучения на основе общедоступного набора данных транскриптома GSE60438 (платформа: GPL6884). Этот набор данных содержит профили экспрессии образцов базальной оболочки плаценты, собранных при кесаревом сечении у женщин с преэклампсией и при нормотензивной беременности. Предварительно отфильтрованные ДЕГ были стандартизированы, а матрица экспрессии вместе с соответствующей информацией о клинических группах была использована в качестве входных данных для четырех различных алгоритмов машинного обучения с целью снижения систематической ошибки модели и повышения стабильности отбора признаков.

Четыре алгоритма применялись одновременно, без определенной последовательности. LASSO выполнялся с использованием пакета «glmnet» для проведения регрессионного анализа и выбора значимых генов-признаков. К функции потерь был добавлен член регуляризации L1, который сводит к нулю коэффициенты менее важных признаков, обеспечивая тем самым отбор признаков. SVM-RFE был реализован с помощью пакета «e1071» для построения метода опорных векторов с рекурсивным исключением признаков. Сначала с помощью SVM обучался классификатор, после чего наименее информативные признаки итеративно удалялись на основе весов признаков, что позволило получить оптимальный набор признаков. XGBoost применялся с использованием пакета «xgboost» для построения множества деревьев решений. Каждое дерево подстраивалось под остатки предыдущего дерева, а взвешенные результаты суммировались для получения окончательного прогноза. Boruta выполнялся с помощью пакета «randomForest», генерируя теневые признаки, которые конкурировали с реальными признаками при обучении случайного леса. Были сохранены признаки, значения важности которых существенно превышали уровень случайного шума.

Анализ данных транскриптома отдельных клеток

Данные транскриптома отдельных клеток были получены из базы данных GEO, а матрица сырых подсчетов была извлечена из набора GSE183338. Матрица подсчетов была импортирована с помощью функции «Read10X» пакета Seurat и преобразована в формат dgCMatrix. Отдельные объекты были объединены в один общий объект с помощью функции «merge», а метки клеток были сделаны уникальными с помощью «RenameCells». Клетки низкого качества фильтровались на основе следующих критериев: гены, экспрессируемые менее чем в трех клетках, были удалены, а клетки, экспрессирующие менее 200 генов, исключены. Клетки, прошедшие контроль качества, были нормализованы, и были определены высоковариабельные гены. Глобальная масштабирующая нормализация была выполнена с использованием «LogNormalize» (scale factor = 10,000), высоковариабельные гены (n = 2,000) были выбраны с помощью «FindVariableFeatures», а данные были масштабированы с помощью «ScaleData». Был проведен анализ главных компонентов высоковариабельных признаков, и были сохранены 30 главных компонентов. Эффекты батча между образцами были скорректированы методом Harmony. Визуализация и снижение размерности клеток были выполнены с помощью UMAP. Графы общих ближайших соседей были построены с помощью «FindNeighbors» и «FindClusters» на основе алгоритма Louvain. Параметр разрешения в «FindClusters» был оптимизирован в диапазоне от 0,1 до 1. Дерево кластеризации было визуализировано с помощью функции «clustree», и для определения клеточных кластеров было выбрано разрешение 0,9. Потенциальные дублеты были удалены с помощью алгоритма Scrublet. Аннотация клеточных кластеров проводилась путем идентификации дифференциально экспрессируемых маркерных генов с использованием функции «FindAllMarkers». Применялся непараметрический критерий суммы рангов Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Идентичность клеток определялась на основе поверхностных маркеров, соответствующей литературы и базы данных классификации клеток Cell Classification Database15.

Культура клеток

Клетки линии трофобласта HTR-8/SVneo культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Гипоксические условия создавали путем культивирования клеток при 1% O₂, 5% CO₂ и 94% N₂ в течение 24 h; контрольные образцы в условиях нормоксии содержали при 20% O₂ и 5% CO₂16. Все процедуры по культивированию клеток следует проводить в боксе биологической безопасности II класса с использованием асептических методов. Отработанные питательные среды, реагенты для трансфекции и клеточные отходы должны утилизироваться в соответствии с внутренними правилами биобезопасности учреждения.

Трансфекция клеток

Были синтезированы плазмиды, содержащие sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 и OE-NC. Клетки HTR-8/SVneo высевали в шестилуночные планшеты с плотностью 5 × 105 клеток на лунку. Затем клетки трансфицировали 2 µg плазмиды sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 или OE-NC на лунку с использованием реагента для трансфекции согласно инструкциям производителя. Вкратце, плазмидную ДНК и реагент P3000 разводили в Opti-MEM, смешивали с Lipofectamine 3000, который предварительно разводили в Opti-MEM, инкубировали в течение 15 min при комнатной температуре и добавляли к клеткам при достижении конфлюентности 70–80%. Через сорок восемь часов после трансфекции экспрессию SASH1 оценивали с помощью RT-qPCR и вестерн-блоттинга. Целевые последовательности shRNA, использованные для нокдауна SASH1, приведены в Дополнительной таблице 1.

Количественная ПЦР в реальном времени

Общую РНК экстрагировали из клеток HTR-8/SVneo и подвергли обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции при 42 °C в течение 30 мин, с последующим нагревом до 85 °C в течение 5 мин. Количественную ПЦР в реальном времени (qPCR) проводили с использованием мастер-микса SYBR Green при следующих условиях циклирования: 95 °C в течение 10 мин, затем 40 циклов: 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин. Относительный уровень экспрессии мРНК рассчитывали методом ΔΔCt, используя β-actin в качестве внутреннего контроля. Последовательности праймеров, использованных в данном эксперименте, приведены в Дополнительной таблице 2.

Метод вестерн-блоттинга

Общий белок экстрагировали из клеток HTR-8/SVneo с использованием лизирующего буфера. Лизаты клеток собирали, инкубировали на льду и центрифугировали при 12,000 × g в течение 30 мин при 4 °C для удаления нерастворимых остатков. Концентрацию белка определяли с помощью спектрофотометра. Равные количества белка (50 µg) разделяли методом SDS-PAGE с последующим переносом на ПВДФ-мембраны. Мембраны блокировали 5% раствором обезжиренного молока и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 °C. После промывки мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами, а полосы белков визуализировали с помощью системы усиленной хемилюминесцентной детекции.

Для детекции белков использовали первичные антитела к SASH1 и β-актину. Соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) — козьи антитела против кроличьих и мышиных — применялись для визуализации. β-актин использовали в качестве внутреннего контроля нагрузки для обеспечения равного количества белка в пробах. Интенсивность белковых полос измеряли и количественно определяли с помощью программного обеспечения ImageJ.

Выделение P-EXOS

P-EXOS выделяли из ткани ворсин плаценты, полученной из дононорских плацент здоровых женщин после планового кесарева сечения. Ткань ворсин плаценты тщательно промывали стерильным PBS, измельчали на фрагменты размером примерно 1 mm3 и культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, обедненной экзосомами, при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 48 ч. Кондиционированную среду подвергали дифференциальному центрифугированию следующим образом: 300 × g в течение 10 мин для удаления клеток и тканевого детрита; 2,000 × g в течение 20 мин для удаления клеточного детрита; и 10,000 × g в течение 30 мин для удаления микровезикул; все этапы проводили при 4 °C. Полученный супернатант подвергали ультрацентрифугированию при 120,000 × g в течение 70 мин при 4 °C для осаждения экзосом. Осадок один раз промывали PBS и повторно центрифугировали при 120,000 × g в течение 70 мин при 4 °C. Конечный осадок ресуспендировали в PBS. Изолированные экзосомы характеризовали с помощью вестерн-блот-анализа на маркеры экзосом (PLAP, CD63 и TSG101, с использованием GM130 в качестве отрицательного контроля), а затем исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии для анализа морфологии.

Эксперимент по клеточному поглощению P-EXOS

Для подтверждения интернализации P-EXOS клетками экзосомы были флуоресцентно помечены липофильным мембранным красителем PKH67 согласно протоколу производителя. Кратко: P-EXOS инкубировали с PKH67 (4 µM) в разбавителе Diluent C в течение 5 мин при комнатной температуре, после чего реакцию останавливали добавлением равного объема 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Помеченные экзосомы повторно выделяли методом ультрацентрифугирования (120,000 × g, 70 мин, 4 °C) для удаления несвязанного красителя. Затем помеченные PKH67 P-EXOS (50 µg/mL) добавляли к клеткам HTR-8/SVneo и совместно инкубировали в течение 24 ч в условиях нормоксии или гипоксии (1% O₂). После этого клетки трижды промывали PBS, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 мин, а ядра контрастировали DAPI (1 µg/mL). Интернализацию экзосом, помеченных PKH67, визуализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM; возбуждение 490 nm, эмиссия 502 nm). Для функциональных экспериментов по совместному культивированию клетки HTR-8/SVneo обрабатывали P-EXOS в концентрации 50 µg/mL (в белковом эквиваленте) в полной среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, обедненной экзосомами, в условиях гипоксии (1% O₂) в течение 24 ч.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Собрали супернатанты культур клеток и измерили уровни IL-6, IL-1β и TNF-α с помощью соответствующих наборов ИФА (ELISA kit) для IL-6, IL-1β и TNF-α согласно инструкциям производителей. Оптическую плотность при 450 nm измеряли с помощью микропланшетного ридера, а фактические концентрации рассчитывали по стандартным кривым.

Метод TUNEL (терминальный дезоксинуклеотидилтрансферазоподобный метод маркировки концов разрывов dUTP)

Апоптотические клетки выявляли с помощью набора для анализа TUNEL в соответствии с инструкциями производителя. Кратко: клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре, пермеабилизировали 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин на льду и инкубировали с реакционной смесью TUNEL в течение 60 мин при 37 °C в темноте. Ядра контрастировали красителем DAPI, а TUNEL-положительные клетки визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа и количественно оценивали, подсчитывая процент TUNEL-положительных клеток как минимум в пяти случайно выбранных полях обзора для каждого образца.

Статистический анализ

Все данные были проанализированы с использованием программ R и GraphPad Prism. Непрерывные переменные представлены как среднее значение ±SD. Сравнение двух групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента, тогда как сравнение нескольких групп осуществляли с помощью однофакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки. Статистическую значимость категориальных переменных оценивали с помощью критерия хи-квадрат или точного теста Фишера. Если не указано иное, корреляция между молекулами рассчитывалась с помощью корреляционного анализа Спирмена. Эксперименты по характеристике экзосом проводились с использованием P-EXOS, выделенных от трех независимых доноров плаценты. Эксперименты на клеточных моделях выполняли в трех независимых биологических повторах, представляющих собой независимые эксперименты, проведенные в разное время на клетках HTR-8/SVneo разных пассажей, при этом в каждом повторе использовались P-EXOS, выделенные от разных доноров плаценты. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Транскриптомный анализ здоровых пациентов и пациентов с ПЭ

Для анализа различий в экспрессии генов между контрольной группой (Normal) и пациентами с преэклампсией (PE) использовали пакет R limma для выявления дифференциально экспрессируемых генов в объединенных наборах данных. Всего было выявлено 89 дифференциально экспрессируемых генов (DEG) (p < 0.05 и |log2FC| > 0.5), из которых 69 генов имели повышенную экспрессию, а 20 — пониженную для GSE75010 (Рисунок 1A). Было обнаружено 2 097 дифференциально экспрессируемых генов, из которых 1 121 с повышенной экспрессией и 976 с пониженной экспрессией (Рисунок 1B). Для набора данных GSE60438 было выявлено 7 633 DEG, включая 3 371 ген с повышенной экспрессией и 4 262 гена с пониженной экспрессией (Рисунок 1C). Значительные различия в количестве DEG в трех наборах данных, вероятно, отражают различия в размере выборки, происхождении тканей (ворсины плаценты в сравнении с децидуальной оболочкой базиса) и классификации степени тяжести PE, что дополнительно подчеркивает ценность поиска пересечений между наборами данных для выявления стабильных общих DEG.

Функциональный анализ обогащения дифференциально экспрессируемых генов (ДЕГ)

Для систематической идентификации ключевых дифференциально экспрессируемых генов (DEG), связанных с преэклампсией (PE), был проведен анализ диаграмм Венна для DEG из наборов данных PE GSE75010, GSE10588 и GSE60438, в результате чего было выявлено 56 общих DEG (Рисунок 2A). Для этих 56 общих DEG была построена сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) с использованием онлайн-платформы STRING (показатель взаимодействия ≥0.15), после чего 20 основных хаб-генов были определены на основе степени их связности в сети и ранжированы с помощью программного обеспечения Cytoscape (Рисунок 2B). На основе этих генов также был проведен анализ обогащения GO для изучения потенциальных функций в категориях биологических процессов (BP), клеточных компонентов (CC) и молекулярных функций (MF) (Рисунок 2C). DEG, вероятнее всего, были обогащены в процессах секреции гормонов и регуляции сигналинга трансмембранных серин/треониновых киназ-рецепторов. Что касается клеточной локализации, гены в основном были сосредоточены в фокальных адгезиях, контактах клетка-субстрат, а также в ряде генов, связанных с везикулами и лизосомами. Среди молекулярных функций обогащенными терминами оказались пролилгидроксилазная активность, гормональная активность и трансмембранный транспорт липид-связанных молекул. Эти результаты позволяют предположить, что DEG могут играть важную роль в сигналинге клеток плаценты, взаимодействии клеток с матриксом и поддержании функций, связанных с эндокринной системой. В то же время было обнаружено, что анализ обогащения путей KEGG показал наибольшее обогащение DEG во взаимодействиях цитокин-цитокиновый рецептор, взаимодействиях молекул клеточной адгезии, а также в сигнальных путях TGF-β и HIF-1 (Рисунок 2D). Обогащение определенными вирус-ассоциированными терминами (например, вирусы гепатита, вирус Эбола), вероятно, отражает неспецифическое перекрытие с общими иммунорегуляторными генами, а не прямую биологическую связь с PE; поэтому основной интерпретационный акцент сделан на путях, связанных с воспалением, адгезией и гипоксией. Эти пути связаны с воспалительным ответом, адгезивно-опосредованной передачей сигналов и сигналингом, связанным с гипоксией, и могут влиять на прогрессирование PE, изменяя иммуновоспалительный статус и межклеточную коммуникацию в микроокружении плаценты.

Машинное обучение идентифицирует SASH1 как ключевой ген при преэклампсии

Для идентификации ключевых прогностических генов для отбора признаков были применены четыре метода машинного обучения. Регрессия LASSO с перекрестной проверкой показала, что модель достигает минимальной ошибки перекрестной проверки при log(λ.min) = -3.8075. Гены с ненулевыми коэффициентами при данном значении λ были выбраны в качестве ключевых признаков, определенных с помощью LASSO (Рисунок 3A–B). Алгоритм Boruta оценивает значимость признаков путем сравнения с теневыми признаками (shadow features). Гены, значения значимости которых превышали shadowMax, были помечены как Confirmed («Подтвержденные») и рассмотрены как ключевые гены-кандидаты, тогда как гены со значениями значимости ниже shadowMin были помечены как Rejected («Отклоненные») и признаны не вносящими существенного вклада. Гены между этими двумя порогами были помечены как Tentative («Предположительные»), что указывает на потенциальную, но неопределенную значимость (Рисунок 3C). Анализ SVM-RFE продемонстрировал, что при сохранении 40–50 признаков точность перекрестной проверки достигала самого высокого или близкого к нему уровня, что свидетельствует об оптимальной прогностической способности при таком масштабе признаков (Рисунок 3D). Умеренная точность перекрестной проверки (~0.6) указывает на то, что ни один алгоритм не показал оптимальных результатов для данного набора данных; поэтому для повышения надежности отбора признаков была принята стратегия пересечения результатов нескольких алгоритмов. XGBoost количественно определил относительную значимость генов с использованием значений Gain, выявив таким образом признаки с наибольшим вкладом в прогноз модели (Рисунок 3E). Анализ пересечений по диаграмме Венна результатов четырех методов выявил SASH1 как единственный перекрывающийся ген. Несмотря на то, что алгоритмом Boruta ген SASH1 был классифицирован как Tentative, его последовательный выбор тремя другими алгоритмами подтверждает его назначение в качестве консенсусного гена-кандидата (Рисунок 3F).

Одноклеточный анализ

Были исследованы клеточная гетерогенность и молекулярные процессы в тканях плаценты при преэклампсии (PE). Клетки проходили фильтрацию по качеству на основе количества детектированных генов, количества прочтений РНК и процента экспрессии митохондриальных генов. Низкокачественные клетки (менее 200 детектированных генов или более 20% митохондриального генетического контента) были удалены для получения высококачественной одноклеточной выборки для последующего анализа. Метрики контроля качества и идентификация высоковариабельных генов представлены на Supplementary Figure 1A–B. После нормализации и определения высоковариабельных генов был проведен анализ главных компонент (PCA) с использованием 2000 наиболее вариабельных генов; значимые главные компоненты были определены с помощью анализа JackStraw и анализа ElbowPlot (Supplementary Figure 2A–B).

На основе главных компонентов был использован метод однообразного аппроксимированного многообразия и проекции (UMAP) для снижения размерности и проведения неконтролируемой кластеризации, в результате чего все клетки были разделены на 22 кластера, что подчеркивает высокую клеточную гетерогенность плацентарной ткани (Рисунок 4A). Путем изучения экспрессии специфических для кластеров маркерных генов и визуализации дифференциально экспрессируемых генов (DEGs) на тепловой карте (Рисунок 4B), каждый кластер был аннотирован на основе канонического маркера и снова спроецирован на вложение UMAP (Рисунок 4C). Таким образом были идентифицированы основные популяции клеток плаценты, включая B-клетки/плазматические клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты/стромальные клетки, макрофаги/дендритные клетки, натуральные киллеры, T-клетки и клетки трофобласта. Сравнение контрольной группы и группы с преэклампсией (PE) показывает, что несколько типов клеток имеют значительное изменение относительного распределения в плацентах при PE, что указывает на ремоделирование микроокружения плаценты (Рисунок 4D).

Происхождение ткани и статус заболевания использовались для отслеживания клеток на одном и том же UMAP-вложении в зависимости от источника ткани (децидуальная оболочка по сравнению с ворсинами) и группы заболевания (контроль по сравнению с PE) (Рисунок 4E). Распределение количества клеток было частично разделено по происхождению ткани, в то время как клетки из разных групп заболеваний были сильно взаимосвязаны. Это позволяет предположить, что PE не вызывает существенной перестройки всей транскриптомной структуры, но может оказывать влияние на отдельные популяции клеток или на определенные молекулярные признаки. Экспрессия SASH1 была нанесена на UMAP для изучения ее распределения среди популяций клеток плаценты (Рисунок 4F–G). SASH1 демонстрирует выраженную клеточно-специфическую экспрессию с заметными различиями между популяциями децидуальных клеток и клеток ворсин. Статистическое сравнение экспрессии SASH1 между группами PE и контроля в различных типах клеток (критерий суммы рангов Вилкоксона) выявило значимые различия в нескольких популяциях клеток плаценты, при этом наиболее выраженное повышение наблюдалось в клетках трофобласта из образцов с PE (Рисунок 4H). Этот результат предоставляет доказательства на уровне отдельных клеток того, что дисрегуляция SASH1 особенно выражена в компартменте трофобласта, что обосновывает использование клеточной линии трофобласта HTR-8/SVneo для последующих функциональных экспериментов.

Нокдаун SASH1 ингибирует индуцированный гипоксией апоптоз трофобласта и воспалительные реакции

Для подтверждения результатов биоинформатического прогнозирования была создана модель клеток трофобласта, связанная с ПЭ, в условиях гипоксии (1% O2). Для оценки экспрессии SASH1 были проведены анализы методом кПЦР и вестерн-блоттинга (Рисунок 5A–B). По сравнению с клетками HTR-8/SVneo в условиях нормоксии, в клетках, подвергнутых воздействию гипоксии, наблюдалось значительное повышение уровней экспрессии мРНК и белка SASH1, что обеспечило предварительное экспериментальное подтверждение биоинформатических данных. Чтобы оценить влияние нокдауна SASH1 на патологические процессы, связанные с ПЭ, в клетках HTR-8/SVneo, подвергнутых гипоксии, была осуществлена сайленсинг-супрессия SASH1. Количественная ПЦР и вестерн-блоттинг (Рисунок 5C–D) показали, что экспрессия SASH1 была значительно снижена во всех группах sh-SASH1 по сравнению с группой sh-NC. Среди них sh-SASH1#3 продемонстрировала наивысшую эффективность нокдауна и, следовательно, была выбрана для последующих экспериментов. Окрашивание TUNEL и ИФА проводились в трех условиях: нормоксический контроль (Normal), гипоксия с отрицательным контролем shRNA (Hypoxia + sh-NC) и гипоксия с нокдауном SASH1 (Hypoxia + sh-SASH1). По сравнению с группой Normal, в группе Hypoxia + sh-NC наблюдалось значительное усиление апоптоза и повышение секреции провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и TNF-α, что подтвердило повреждение трофобласта, индуцированное гипоксией. Нокдаун SASH1 заметно ослабил эти эффекты, снизив уровень апоптоза (Рисунок 5E) и уровень цитокинов (Рисунок 5F) до значений, близких к группе Normal, что указывает на то, что нокдаун SASH1 может в значительной степени нивелировать индуцированный гипоксией апоптоз трофобласта и воспалительные реакции. Для дальнейшего установления причинно-следственной роли SASH1 были проведены эксперименты по усилению функции. кПЦР и вестерн-блоттинг подтвердили успешную гиперэкспрессию SASH1 в клетках HTR-8/SVneo (Рисунок 5G–H). В условиях нормоксии гиперэкспрессия SASH1 (OE-SASH1) значительно увеличила апоптоз трофобласта и секрецию провоспалительных цитокинов по сравнению с группой OE-NC, воспроизводя фенотип, индуцированный гипоксией (Рисунок 5I–J). В совокупности данные о потере и усилении функции доказывают, что SASH1 является и необходимым, и достаточным фактором для запуска апоптоза трофобласта и воспалительных реакций, что подтверждает его причинную роль в патологии, связанной с ПЭ.

P-EXOS подавляет индуцированный гипоксией апоптоз трофобласта и воспалительные реакции путем модуляции SASH1

Считается, что P-EXOS обладают потенциальной терапевтической ценностью при ПЭ. В данном исследовании биоинформатический анализ показал, что SASH1 связан с сигнальными путями, относящимися к экзосомам (согласно анализу обогащения GO и KEGG, Рисунок 2C–D), что позволило нам выдвинуть гипотезу о том, что P-EXOS могут оказывать защитный эффект при ПЭ путем регуляции SASH1. Перед функциональными исследованиями была проведена характеристика изолированных P-EXOS. Вестерн-блот-анализ подтвердил наличие маркерных белков экзосом PLAP, CD63 и TSG101 при отсутствии детектируемой экспрессии маркера аппарата Гольджи GM130, что свидетельствует о высокой чистоте изолированных везикул. Просвечивающая электронная микроскопия дополнительно выявила типичные чашеобразные везикулярные структуры (Рисунок 6A–B). Чтобы проверить, могут ли P-EXOS эффективно интернализироваться клетками-мишенями, было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание для оценки клеточного захвата P-EXOS. По сравнению с контрольной группой, клетки HTR-8/SVneo, обработанные P-EXOS, демонстрировали выраженные сигналы колокализации на совмещенных изображениях, что указывает на эффективную интернализацию P-EXOS клетками HTR-8/SVneo (Рисунок 6C).

Впоследствии клетки HTR-8/SVneo подвергали совместному культивированию с P-EXOS в условиях гипоксии. Как количественная ПЦР, так и вестерн-блоттинг показали выраженное снижение уровней мРНК и белка SASH1 в группе, обработанной P-EXOS, по сравнению с контролем (Рисунок 6D–E), что стало первичным доказательством регуляторного взаимодействия между P-EXOS и SASH1. В соответствии с этими молекулярными изменениями, окрашивание методом TUNEL выявило существенное ослабление индуцированного гипоксией апоптоза в клетках HTR-8/SVneo после обработки P-EXOS (Рисунок 6F). В то же время анализ методом ELISA продемонстрировал заметное снижение секреции провоспалительных цитокинов, включая IL-6, IL-1β и TNF-α (Рисунок 6G).

Чтобы определить, зависят ли защитные эффекты P-EXOS механистически от супрессии SASH1, в условиях гипоксии был проведен эксперимент по рескью (восстановлению функции). Клетки с гиперэкспрессией SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) сравнивали с клетками отрицательного контроля (OE-NC + P-EXOS). Гиперэкспрессия SASH1 значительно нивелировала защитные эффекты P-EXOS, о чем свидетельствовали усиление апоптоза (Рисунок 6H>) и повышенная секреция провоспалительных цитокинов (Рисунок 6I>) по сравнению с группой OE-NC + P-EXOS. Эти результаты демонстрируют, что защитный эффект P-EXOS опосредован конкретно через супрессию SASH1, а не через параллельные пути, что подчеркивает терапевтический потенциал P-EXOS при преэклампсии (PE).

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Наборы данных, подтверждающие результаты данного исследования, находятся в открытом доступе и были получены из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под номерами доступа GSE75010, GSE10588, GSE60438 и GSE183338. Аннотирование типов клеток проводилось с использованием базы данных Cell Classification Database (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). Необрезанные изображения вестерн-блоттинга и все остальные необработанные экспериментальные данные, подтверждающие результаты данного исследования, представлены в папке Supplementary Raw Data.

Диаграммы вулкан (volcano plot) и тепловые карты демонстрируют результаты анализа экспрессии генов в различных наборах данных.
Рисунок 1: Идентификация дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) в тканях плаценты и децидуальной оболочке при преэклампсии (ПЭ) в трех независимых наборах данных. (A) Диаграмма вулкан ДЭГ между 157 образцами плаценты при ПЭ и 173 образцами плаценты без ПЭ из объединенного набора данных GSE75010. (B) Диаграмма вулкан ДЭГ между образцами плаценты при тяжелой ПЭ (n = 17) и нормальными образцами плаценты (n = 26) из набора данных GSE10588. (C) Диаграмма вулкан ДЭГ между образцами децидуальной оболочки при ПЭ и контрольными образцами децидуальной оболочки при нормальном артериальном давлении из набора данных GSE60438. ДЭГ были идентифицированы при p < 0.05 и |log2FC| > 0.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграмма Венна, сетевой граф, хордовые диаграммы; анализ экспрессии генов, картирование белковых взаимодействий.
Рисунок 2: Функциональный обогатительный анализ и анализ PPI общих DEG, связанных с преэклампсией. (A) Диаграмма Венна DEG, выявленных из наборов данных GSE75010, GSE10588 и GSE60438, связанных с PE. (B) Сеть PPI 20 основных хабовых генов, отобранных из 56 общих DEG на основе степени связности и ранжированных с помощью программного обеспечения Cytoscape (показатель взаимодействия STRING ≥0.15). (C) Результаты анализа обогащения GO и KEGG для общих DEG, представленные в виде столбчатых диаграмм. (D) Результаты анализа обогащения GO и KEGG для общих DEG, представленные в виде хордовых диаграмм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Методы отбора генов; результаты LASSO, XGBoost, SVM, Boruta; графики сравнительного анализа данных.
Рисунок 3: Скрининг потенциальных хаб-генов, связанных с преэклампсией, на основе машинного обучения. (A) Регрессионный анализ LASSO, демонстрирующий профили коэффициентов потенциальных генов. (B) Выбор оптимального параметра регуляризации (λ) при помощи регрессии LASSO с использованием кросс-валидации. (C) Алгоритм Boruta. (D) Анализ SVM-RFE. (E) Алгоритм XGBoost. (F) Диаграмма Венна, показывающая пересечение потенциальных генов, выявленных алгоритмами LASSO, Boruta, SVM-RFE и XGBoost. Сокращения: LASSO = оператор наименьшего абсолютного сжатия и отбора; SVM-RFE = рекурсивное исключение признаков методом опорных векторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграмма кластеризации UMAP и тепловая карта экспрессии генов, демонстрирующие анализ и распределение данных по типам клеток.
Рисунок 4: Транскриптомный анализ отдельных клеток выявляет специфичные для типов клеток паттерны экспрессии SASH1 при преэклампсии. (A) Кластеризация UMAP набора данных отдельных клеток. (B) Анализ аннотации пяти основных маркеров набора данных транскриптома отдельных клеток при ПЭ GSE183338. (C) Аннотация субпопуляций клеток. (D) Столбчатая диаграмма, показывающая распределение пропорций клеток в контрольных образцах и образцах с ПЭ. (E) График UMAP, раскрашенный по происхождению ткани (децидуальная оболочка и ворсины) и статусу заболевания (контроль и ПЭ). (F) График UMAP, показывающий экспрессию SASH1 в популяциях клеток плаценты, сгруппированных по происхождению ткани (децидуальная оболочка и ворсины). (G) График UMAP, показывающий экспрессию SASH1 в популяциях клеток плаценты, сгруппированных по статусу заболевания (контроль и ПЭ). (H) Скрипичный график, показывающий распределение экспрессии SASH1 в различных типах клеток плаценты. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Сокращения: UMAP = равномерное многомерное аппроксимирование и проекция; ns = статистически не значимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Экспрессия SASH1 при гипоксии; анализ белков с помощью вестерн-блоттинга; графики экспрессии генов/белков.
Рисунок 5: SASH1 регулирует индуцированный гипоксией апоптоз и воспаление трофобласта. (A) Анализ экспрессии мРНК SASH1 методом кПЦР и денситометрическое определение уровней белка SASH1 в клетках HTR-8/SVneo в нормальных условиях и при гипоксии. (B) Репрезентативные изображения вестерн-блоттинга, соответствующие денситометрическим данным, показанным на (A). (C) Анализ экспрессии мРНК SASH1 методом кПЦР и денситометрическое определение уровней белка SASH1 в клетках HTR-8/SVneo, подвергнутых воздействию гипоксии и трансфецированных конструктами sh-NC или sh-SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 и sh-SASH1#3). (D) Репрезентативные изображения вестерн-блоттинга, соответствующие денситометрическим данным, показанным на (C). (E) Окрашивание методом TUNEL клеток HTR-8/SVneo в группах Normal, Hypoxia + sh-NC и Hypoxia + sh-SASH1(#3). Масштабная линейка = 20 µm. (F) Анализ провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNF-α) методом ИФА в группах Normal, Hypoxia + sh-NC и Hypoxia + sh-SASH1(#3). (G) Анализ экспрессии мРНК SASH1 методом кПЦР и денситометрическое определение уровней белка SASH1 в клетках HTR-8/SVneo, трансфецированных конструктами OE-NC или OE-SASH1. (H) Репрезентативные изображения вестерн-блоттинга, соответствующие денситометрическим данным, показанным на (G). (I) Окрашивание методом TUNEL клеток HTR-8/SVneo в группах Normal + OE-NC и Normal + OE-SASH1. Масштабная линейка = 20 µm. (J) Анализ провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNF-α) методом ИФА в группах Normal + OE-NC и Normal + OE-SASH1. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Данные представлены как среднее значение ± SD по трем независимым биологическим повторностям (n = 3). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Вестерн-блоттинг, ПЭМ-изображение и флуоресцентная микроскопия для оценки влияния P-EXO на уровни белков и апоптоз.
Рисунок 6: P-EXOS облегчают вызванное гипоксией повреждение трофобласта путем подавления SASH1. (A) Вестерн-блот анализ маркерных белков P-EXOS PLAP, CD63 и TSG101, где GM130 служит отрицательным контролем. (B) Анализ морфологии P-EXOS с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Масштабный отрезок = 1.0 µm. (C) Изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, демонстрирующие поглощение меченных PKH67 P-EXOS (зеленый) клетками HTR-8/SVneo (красный). Ядра были контр-окрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок = 20 µm. (D) Анализ экспрессии мРНК SASH1 методом кПЦР и денситометрическая количественная оценка уровней белка SASH1 в клетках HTR-8/SVneo в группах Control и P-EXOS. (E) Репрезентативные изображения вестерн-блоттинга, соответствующие денситометрическим данным, показанным на (D). (F) TUNEL-окрашивание клеток HTR-8/SVneo в группах Control и P-EXOS. Масштабный отрезок = 20 µm. (G) ELISA-анализ воспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNF-α) в клетках HTR-8/SVneo, подвергнутых воздействию гипоксии, в группах Control и P-EXOS. (H) TUNEL-окрашивание клеток HTR-8/SVneo в группах OE-NC + P-EXOS и OE-SASH1 + P-EXOS. Масштабный отрезок = 20 µm. (I) ELISA-анализ воспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNF-α) в клетках HTR-8/SVneo, подвергнутых воздействию гипоксии, в группах OE-NC + P-EXOS и OE-SASH1 + P-EXOS. Сокращения: P-EXOS = экзосомы плацентарного происхождения; TEM = просвечивающая электронная микроскопия; PLAP = плацентарная щелочная фосфатаза; TSG101 = ген предрасположенности к опухолям 101. *p < 0.05; **p < 0.01. Данные представлены как среднее значение ±SD по трем независимым биологическим повторностям (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Контроль качества данных scRNA-seq. (A) Скрипичный график уровней экспрессии генов после контроля качества. (B) График вариабельных признаков, демонстрирующий высоковариабельные гены, выявленные после контроля качества.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Определение статистически значимых главных компонент для кластеризации единичных клеток. (A) Точечный график JackStraw, используемый для идентификации статистически значимых главных компонент. (B) Точечный график «локоть» (Elbow plot), показывающий долю дисперсии, объяснимую главными компонентами.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Мишеневые последовательности shRNA, использованные для нокдауна SASH1. Мишеневые последовательности shRNA (5′–3′) для отрицательного контроля (sh-NC) и трех конструктов, нацеленных на SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 и sh-SASH1#3), использованных для сайленсинга гена.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Последовательности праймеров, использованных для количественной ПЦР. Последовательности прямых и обратных праймеров (5′–3′) для SASH1 и β-actin (внутренний контрольный образец), использованные в анализе qPCR.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данном исследовании с помощью комплексного транскриптомного анализа, секвенирования единичных клеток и многоалгоритмического машинного обучения был определен SASH1 как ключевой ген, экспрессия которого нарушена при преэклампсии (ПЭ). Такой подход особенно актуален, учитывая отсутствие доступных методов таргетной терапии ПЭ17. Было продемонстрировано, что экспрессия SASH1 значительно повышена в гипоксических клетках трофобласта и специфически увеличена в компартменте трофобласта в плацентах при ПЭ с разрешением на уровне единичных клеток. С помощью экспериментов по потере и усилению функции было установлено, что SASH1 является и необходимым, и достаточным фактором для запуска апоптоза трофобласта и секреции провоспалительных цитокинов. Кроме того, лечение P-EXOS ослабляло вызванное гипоксией повреждение трофобласта, и этот защитный эффект нивелировался при гиперэкспрессии SASH1, что подтверждает: цитопротекторное действие, опосредованное P-EXOS, механистически зависит от подавления SASH1.

Кроме того, при преэклампсии (ПЭ) наблюдались изменения в пропорциях нескольких типов клеток плаценты, включая B-клетки/плазматические клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты/стромальные клетки, макрофаги/дендритные клетки, NK-клетки, T-клетки и трофобластные клетки. Эти данные свидетельствуют о том, что микроокружение плаценты при ПЭ подвергается существенному ремоделированию. Такое воспалительное микроокружение не только усугубляет дисфункцию трофобласта, но и может ускорять прогрессирование заболевания посредством взаимодействий между иммунными клетками и внеклеточным матриксом18. Более того, недавно было установлено, что внеклеточные ловушки нейтрофилов (NETs) способствуют усилению воспаления плаценты при ПЭ19. Считается, что SASH1 играет важную роль в развитии ПЭ благодаря своему участию в воспалительной сигнализации, адгезии клеток и процессах, связанных с гипоксией. В данном исследовании профили экспрессии генов были извлечены из образцов плаценты пациенток с ПЭ и при нормотензивной беременности с использованием пакета limma, а для отбора признаков применялись несколько алгоритмов машинного обучения — LASSO-регрессия, SVM-RFE, XGBoost и Boruta. Во всех алгоритмах SASH1 последовательно определялся как консенсусный ген-кандидат. На уровне отдельных клеток SASH1 демонстрировал специфическую для каждого типа клеток экспрессию в различных популяциях клеток плаценты и сохранял повышенный уровень экспрессии в образцах при ПЭ, при этом наиболее выраженная разница наблюдалась в трофобластных клетках, что позволяет предположить, что он может оказывать различные функциональные эффекты в разных клеточных контекстах плаценты.

SASH1 представляет собой сигнальный адаптерный белок, который, согласно имеющимся данным, участвует в различных биологических процессах, включая миграцию и инвазию клеток, эпителиально-мезенхимальный переход и регуляцию стресс-индуцированной передачи сигналов8,9. Для изучения функциональной роли SASH1 в патологии, связанной с преэклампсией (ПЭ), была создана модель трофобласта, индуцированная гипоксией, с использованием клеток HTR-8/SVneo. Наши результаты показали, что воздействие гипоксии значительно повышало экспрессию SASH1, тогда как нокдаун SASH1 заметно ослаблял вызванный гипоксией апоптоз и снижал секрецию провоспалительных цитокинов, включая IL-1β, IL-6 и TNF-α. Напротив, сверхэкспрессии SASH1 в условиях нормоксии было достаточно для воспроизведения фенотипа, индуцированного гипоксией, что подтверждает причинно-следственную роль SASH1 в повреждении трофобласта. Эти данные позволяют предположить, что SASH1 может негативно регулировать функциональное состояние трофобласта путем модуляции воспалительных реакций. Учитывая, что трофобласты являются основным источником плацентарных воспалительных медиаторов20, аберрантная экспрессия SASH1 может служить критической молекулярной основой для усиления воспаления при ПЭ. Примечательно, что проапоптотические и провоспалительные функции SASH1, наблюдаемые в клетках трофобласта, контрастируют с его канонической опухоль-супрессорной ролью в раковых клетках, где он обычно ингибирует ЭМП и миграцию8,9. Эта контекстно-зависимая функциональная дуальность может отражать специфические для типа клеток различия в партнерах по взаимодействию с SASH1 и нижележащих сигнальных сетях, что требует дальнейшего изучения.

Экзосомы признаны важными медиаторами межклеточной коммуникации и вовлечены в патогенез преэклампсии (ПЭ)21. В частности, экзосомы плаценты (P-EXOS) могут играть важную роль в иммунной регуляции при нормальном течении беременности, например, в поддержании материнско-плодного иммунного толеранса, что может обеспечивать защиту от ПЭ22. В данном исследовании биоинформатический анализ выявил связь между SASH1 и сигнальными путями, связанными с экзосомами, что послужило основанием для дальнейшего изучения роли P-EXOS в регуляции функции трофобласта. Эксперименты по совместному культивированию показали, что воздействие P-EXOS значительно снижало уровни мРНК и белка SASH1 в клетках трофобласта, подвергнутых гипоксии, и заметно ослабляло индуцированный гипоксией апоптоз и воспалительные реакции. Важно отметить, что сверхэкспрессия SASH1 нивелировала эти защитные эффекты, подтверждая, что цитопротекция, опосредованная P-EXOS, механистически зависит от супрессии SASH1, а не осуществляется через параллельные пути.

Молекулярные механизмы, посредством которых P-EXOS подавляют экспрессию SASH1, еще предстоит выяснить. Известно, что P-EXOS переносят разнообразные биоактивные грузы, включая микроРНК, белки и липиды, которые могут модулировать экспрессию генов в клетках-реципиентах10. Одной из возможностей является то, что P-EXOS доставляют специфические мРНК, которые прямо или косвенно воздействуют на SASH1. В качестве альтернативы P-EXOS могут модулировать вышестоящие сигнальные пути — такие как NF-κB или PI3K-Akt — которые сходятся на транскрипционной регуляции SASH1. Учитывая, что SASH1 вовлечен в путь PI3K-Akt-mTOR в раковых клетках8, вполне вероятно, что опосредованная экзосомами модуляция этой оси может способствовать снижению экспрессии SASH1 в клетках трофобласта. Для детального анализа точного молекулярного каскада, через который P-EXOS регулируют экспрессию SASH1, потребуются будущие исследования с использованием секвенирования содержимого экзосом и ингибиторов специфических путей.

В данном исследовании транскриптомное профилирование было интегрировано с секвенированием РНК единичных клеток для изучения молекулярных изменений в плацентарной ткани при преэклампсии (ПЭ). Было показано, что SASH1 играет ключевую роль в индуцированном гипоксией апоптозе трофобласта и воспалительных реакциях, и что P-EXOS могут оказывать защитный эффект, подавляя экспрессию SASH1, что дает новое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе ПЭ, и предлагает потенциальную терапевтическую стратегию. Однако данное исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, функциональные результаты были в основном получены на бессмертной клеточной линии трофобласта HTR-8/SVneo; необходима валидация на первичных клетках трофобласта. Во-вторых, экспрессия белка SASH1 не была подтверждена в клинических образцах плаценты при ПЭ методом иммуногистохимии, что ограничивает трансляционную интерпретацию результатов и должно быть рассмотрено в будущих исследованиях. В-третьих, классификатор SVM-RFE показал умеренную точность перекрестной проверки (~0,6), что отражает присущую набору данных гетерогенность; для разработки более надежных диагностических моделей потребуются более крупные независимые когорты. В-четвертых, точный молекулярный механизм, посредством которого P-EXOS подавляют экспрессию SASH1, остается неясным. В-пятых, при определении SASH1 методом вестерн-блоттинга наблюдались неспецифические полосы окрашивания, что может быть связано с субоптимальной специфичностью антител. Антитело, использованное в этом эксперименте, является поликлональным, которое обычно демонстрирует более низкую специфичность при иммунодетекции по сравнению с моноклональными антителами. Тем не менее, эти неспецифические полосы не влияют на результаты анализа белка SASH1 или выводы данного исследования. Для дальнейшего выяснения функциональной роли оси P-EXOS-SASH1 при ПЭ и оценки ее трансляционного потенциала необходимы будущие исследования, включающие эксперименты in vivo, анализ клинических образцов и характеристику экзосомального содержимого.

Раскрытие информации

В данном исследовании отсутствует конфликт интересов.

Благодарности

Данное исследование было профинансировано в рамках Ключевой программы медицинских научных исследований Комиссии здравоохранения провинции Хэбэй, Китай (№ 20210075).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Среда RPMI-1640Gibco11875085
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco16140071
FBS, обедненная экзосомамиSystem BiosciencesEXO-FBS-50A-1
Пенициллин/стрептомицинThermo Fisher Scientific, CN15140122
Реагент для трансфекции Lipofectamine 3000 (с реагентом P3000)Thermo Fisher Scientific, CNL3000150
Среда Opti-MEM с пониженным содержанием сывороткиThermo Fisher Scientific, CN31985070
Плазмида SASH1 shRNA (HuSH)origeneTL301836
Экспрессионная плазмида SASH1 ORForigeneRC218866
Контрольный пустой векторorigenePS100001
Набор для обратной транскрипцииThermo Fisher Scientific, CN4368814
Мастер-микс PowerUp SYBR GreenThermo Fisher Scientific, CNA46110
Праймеры к SASH1Sangon BiotechСинтезированы на заказ
Праймеры к β-актинуSangon BiotechСинтезированы на заказ
Буфер для лизиса клетокBeyotimeP0013B
Спектрофотометр NanoDropThermo Fisher Scientific, CNNanoDrop Ultra
Мембрана PVDFThermo Fisher Scientific, CN88518
Антитела к SASH1ABclonalA15248
Антитела к β-актинуAbcamab6276
Вторичные антитела (козьи анти-кроличьи/анти-мышиные), конъюгированные с HRPBeyotimeA0208
Программное обеспечение ImageJNIH (общественное достояние)ImageJ
Набор PKH67 для флуоресцентного мечения клеток (включая разбавитель C)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CNMINI67
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN10711454001
DAPIBeyotimeC1002
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM)LeicaLeica TCS SP8
Набор Quantikine ELISA для определения IL-6 человекаR&D SystemsD6050B
Набор DuoSet ELISA для определения IL-1β/IL-1F2 человекаR&D SystemsDY201
Набор Quantikine ELISA для определения TNF-α человекаR&D SystemsDTA00D
Считыватель микропланшетовThermo ScientificMultiskan FC
Набор для detekции гибели клеток in situ (набор для анализа TUNEL)Roche11684795910
Triton X-100BeyotimeP0096
Параформальдегид (4%)BeyotimeP0099
Флуоресцентный микроскопOlympusBX53
Центрифуга с охлаждением (макс. 12 000 × g)EppendorfEppendorf 5430 R
Ультрацентрифуга (макс. 120 000 × g)Beckman CoulterOptima MAX-XP
Программное обеспечение RThe R Foundationv4.2.1
GraphPad PrismGraphPad Softwarev10.0
Seurat (пакет R)Satija Lab (открытый исходный код)v4.0.4
Harmony (пакет R, коррекция пакетного эффекта)Открытый исходный кодv1.2.0
Scrublet (пакет Python, детекция дуплетов)Открытый исходный кодv0.2.3
clustree (пакет R)Открытый исходный кодv0.5.1
glmnet (пакет R, LASSO)Открытый исходный кодv4.1.8
e1071 (пакет R, SVM-RFE)Открытый исходный кодv1.7-14
xgboost (пакет R)Открытый исходный кодv1.7.7.1
randomForest (пакет R, Boruta)Открытый исходный кодv4.7-1.1
База данных Gene Expression Omnibus (GEO)NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
База данных STRINGstring-db.orghttps://www.string-db.org/
Metascapemetascape.orghttps://metascape.org/
Программное обеспечение CytoscapeCytoscape Consortiumv3.10.4
ggplot2 (пакет R)Открытый исходный кодv3.5.1
limma (пакет R)Открытый исходный кодv3.58.1
pheatmap (пакет R)Открытый исходный кодv1.0.12
ClusterProfiler (пакет R)Открытый исходный кодv4.8.3
DOSE (пакет R)Открытый исходный кодv3.28.2
ggpubr (пакет R)Открытый исходный кодv0.6.0

Ссылки

  1. Malik A, Jee B, Gupta SK. Preeclampsia: Disease biology and burden, its management strategies with reference to India. Pregnancy Hypertens. 2019;15:23-31.
  2. Vitoratos N, Hassiakos D, Iavazzo C. Molecular mechanisms of preeclampsia. J Pregnancy. 2012;2012:298343.
  3. Battarbee AN, et al. Chronic hypertension in pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 2020;222(6):532-41.
  4. Torres-Torres J, et al. A Narrative Review on the Pathophysiology of Preeclampsia. Int J Mol Sci. 2024;25(14).
  5. Xu Y, et al. DOCK1 deficiency drives placental trophoblast cell dysfunction by influencing inflammation and oxidative stress, hallmarks of preeclampsia. Hypertens Res. 2024;47(12):3434-46.
  6. Harmon AC, et al. The role of inflammation in the pathology of preeclampsia. Clin Sci (Lond). 2016;130(6):409-19.
  7. Jaufmann J, et al. The emerging and diverse roles of the SLy/SASH1-protein family in health and disease: Overview of three multifunctional proteins. Faseb J. 2021;35(4):e21470.
  8. Li S, et al. The downregulation of SASH1 expression promotes breast cancer occurrence and invasion, accompanied by the activation of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Sci Rep. 2024;14(1):21914.
  9. Franke FC, et al. The Tumor Suppressor SASH1 Interacts With the Signal Adaptor CRKL to Inhibit Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019;7(1):33-53.
  10. Zhang J, et al. Extracellular vesicles in normal pregnancy and pregnancy-related diseases. J Cell Mol Med. 2020;24(8):4377-88.
  11. David M, Maharaj N. The immune-modulatory dynamics of exosomes in preeclampsia. Arch Gynecol Obstet. 2025;311(6):1477-87.
  12. Gu M, et al. Preeclampsia impedes fetal kidney development by delivering placenta-derived exosomes to glomerular endothelial cells. Cell Commun Signal. 2023;21(1):336.
  13. Jiang X, et al. Downregulated miR-199a-3p in Preeclamptic Placenta-derived Exosomes from Cord Blood Hinders VEGF-induced Fetal Glomerular Dysplasia Through Inhibiting Akt1(S473) Phosphorylation via Targeting PHLPP2. Stem Cell Rev Rep. 2025;21(8):2693-710.
  14. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  15. Wang X, et al. High expression of THY1 in gallbladder fibroblasts promotes the formation and progression of gallstones. Research Square [Preprint]. 2025. Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-7276422/v1. doi:10.21203/rs.3.rs-7276422/v1.
  16. Sha M, et al. Extracellular vesicles derived from hypoxic HTR-8/SVneo trophoblast inhibit endothelial cell functions through the miR-150-3p /CHPF pathway. Placenta. 2023;138:21-32.
  17. Ma'ayeh M, Costantine MM. Prevention of preeclampsia. Semin Fetal Neonatal Med. 2020;25(5):101123.
  18. Mandalà M. Oxidative Stress and Inflammation in Uterine-Vascular Adaptation During Pregnancy. Antioxidants (Basel). 2025;14(9).
  19. Lu Y, et al. NETs exacerbate placental inflammation and injury through high mobility group protein B1 during preeclampsia. Placenta. 2025;159:131-9.
  20. Raghupathy R. Cytokines as key players in the pathophysiology of preeclampsia. Med Princ Pract. 2013;22 Suppl 1(Suppl 1):8-19.
  21. Esfandyari S, et al. Exosomes as Biomarkers for Female Reproductive Diseases Diagnosis and Therapy. Int J Mol Sci. 2021;22(4).
  22. Pillay P, Moodley K, Moodley J, Mackraj I. Placenta-derived exosomes: potential biomarkers of preeclampsia. Int J Nanomedicine. 2017;12:8009-23.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SASH1

Похожие статьи