Исследовательская статья

Экстракт Lycopus lucidus улучшает состояние при экспериментальном синдроме поликистозных яичников за счет ремоделирования микробиоты кишечника и метаболома

15 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71084

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Gynecology, Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei Province, 2Department of Gynecology, Heilongjiang Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine Science

В этой статье

Краткое содержание

Экстракт ZeLan улучшал эндокринные и метаболические фенотипы у крыс с СПКЯ, индуцированным DHEA. Интегрированное секвенирование 16S рРНК и метаболомика сыворотки показали частичное восстановление альфа-разнообразия кишечной микробиоты, изменение состава микробиома, а также изменения уровней метаболитов, включая стероидные гормоны, желчные кислоты и короткоцепочечные жирные кислоты.

Аннотация

В данном исследовании изучались терапевтические эффекты экстракта ZeLan при синдроме поликистозных яичников (СПКЯ) и оценивалась его связь с ремоделированием микробиоты и метаболома кишечника. Двадцать четыре самки крыс линии Sprague-Dawley были случайным образом разделены на контрольную группу, группу модели СПКЯ, индуцированного дегидроэпиандростероном (DHEA), и группу лечения ZeLan (по n = 8 в каждой). После 28 дней вмешательства уровни гормонов в сыворотке крови измеряли методом ELISA; состав микробиоты кишечника анализировали с помощью секвенирования гена 16S рРНК, а метаболические профили сыворотки характеризовали методом UHPLC-Q-TOF-MS. Для изучения взаимосвязей между микробиотой и метаболомом был проведен корреляционный анализ Спирмена с контролем множественных проверок. ZeLan значительно улучшил фенотипы, связанные с СПКЯ, снизив массу тела, уровень тестостерона (0,92 против 1,85 ng/mL, P < 0,05), соотношение LH/FSH и уровни инсулина по сравнению с группой модели. Секвенирование показало, что ZeLan частично восстановил альфа-разнообразие микробиоты (индекс Шеннона: 5,79 против 4,19) и снизил соотношение Firmicutes к Bacteroidetes. Применение ZeLan было связано с обогащением Lactobacillus и Ruminococcus, а также с более низкой численностью Bacteroides, Prevotella и Escherichia. Метаболомный анализ выявил 52 измененных признака метаболитов, при этом ключевые изменения затронули стероидные гормоны, желчные кислоты, такие как литохолевая кислота, и короткоцепочечные жирные кислоты, такие как масляная кислота. Эти результаты позволяют предположить, что ZeLan облегчает эндокринные и метаболические нарушения, связанные с СПКЯ, и сопровождается ремоделированием микробного состава кишечника и метаболических профилей сыворотки.

Введение

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является одним из наиболее распространенных эндокринных нарушений у женщин репродуктивного возраста; по имеющимся данным, его глобальная распространенность составляет от 6% до 20% в зависимости от используемых диагностических критериев1. Это сложное метаболическое и репродуктивное заболевание характеризуется совокупностью клинических проявлений, включая гиперандрогению, овуляторную дисфункцию и поликистозную морфологию яичников, что в совокупности приводит к значительным репродуктивным, метаболическим и психологическим последствиям2. Помимо непосредственного влияния на фертильность, СПКЯ все чаще признается системным состоянием, связанным с долгосрочными осложнениями для здоровья, включая сахарный диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания и карциному эндометрия, что создает существенную нагрузку как на отдельных пациентов, так и на системы здравоохранения во всем мире3. Патофизиология СПКЯ остается изученной не полностью, хотя общепризнано, что она включает сложные взаимодействия между генетической предрасположенностью, факторами окружающей среды и детерминантами образа жизни, которые приводят к характерным гормональным и метаболическим нарушениям, наблюдаемым у пациентов4.

Современные терапевтические подходы при СПКЯ сосредоточены преимущественно на симптоматическом лечении с помощью фармакологических средств, включая оральные контрацептивы для регуляции менструального цикла, метформин для повышения чувствительности к инсулину и антиандрогены для борьбы с гирсутизмом5. Однако эти традиционные методы лечения часто обеспечивают неполное облегчение симптомов и нередко сопровождаются побочными эффектами, которые ограничивают их долгосрочное применение, особенно у женщин, стремящихся к деторождению6. Вследствие этого растет интерес к изучению методов комплементарной и альтернативной медицины, в частности традиционной китайской медицины (ТКМ), которая накопила многовековой эмпирический опыт лечения гинекологических заболеваний с помощью холистических регуляторных механизмов7. Среди многочисленных растительных лекарственных средств, исследуемых при терапии СПКЯ, значительное внимание привлек Lycopus lucidus Turcz. (известный в китайской медицине как ZeLan) благодаря его традиционному применению для улучшения кровообращения, устранения застоя крови и регуляции менструального цикла8. Опубликованные фитохимические исследования показывают, что L. lucidus содержит полифенолы и фракции, богатые флавоноидами, обладающие антиоксидантной и противовоспалительной активностью8,9. Таким образом, в настоящем исследовании в качестве индекса химического контроля качества экстракта использовалось стандартизированное общее содержание флавоноидов, хотя идентификация конкретных активных мономеров, ответственных за регуляцию микробиоты и метаболизма, потребует проведения целевого фитохимического анализа в будущем.

Микробиота кишечника стала рассматриваться как критический регулятор метаболизма и эндокринной функции хозяина, при этом появляется все больше данных, подтверждающих ее роль в патогенезе различных метаболических нарушений, включая СПКЯ10. Концепция оси «кишечник-яичники» была предложена для описания двунаправленной связи между кишечными микроорганизмами и функцией яичников, опосредованной микробными метаболитами, иммунными сигналами и нейроэндокринными путями11. У женщин с СПКЯ последовательно выявляется дисбиоз кишечника, характеризующийся снижением микробного разнообразия, изменением соотношения Firmicutes к Bacteroidetes и уменьшением численности полезных бактерий, таких как виды Lactobacillus и Bifidobacterium12. Считается, что эти микробные нарушения способствуют патофизиологии СПКЯ через несколько механизмов, включая повышение кишечной проницаемости, системное вялотекущее воспаление, а также изменение метаболизма желчных кислот и короткоцепочечных жирных кислот (SCFA), что впоследствии влияет на чувствительность к инсулину и биосинтез андрогенов13. Важно отметить, что вмешательства, направленные на микробиоту кишечника, включая пробиотики, пребиотики и модификацию диеты, показали многообещающие результаты в облегчении симптомов СПКЯ, что подтверждает перспективность оси «кишечник-яичники» в качестве терапевтической мишени14.

Метаболомика, представляющая собой комплексный анализ низкомолекулярных метаболитов в биологических системах, является мощным методом характеристики метаболических нарушений, связанных с патологическими состояниями, а также оценки биохимических эффектов терапевтических вмешательств15. Интеграция секвенирования гена 16S рРНК для профилирования микробиома с нетаргетной метаболомикой позволяет систематически исследовать взаимосвязи между кишечными микробными сообществами и метаболизмом хозяина, что дает представление о взаимодействиях микробиоты и метаболома, которые могут сопровождать как патогенез заболевания, так и ответ на лечение. Несмотря на теоретическое обоснование воздействия на ось «кишечник-яичники» при лечении СПКЯ и традиционное применение ZeLan при гинекологических расстройствах, на сегодняшний день нет исследований, в которых систематически изучалось бы влияние экстракта ZeLan на интерфейс «микробиота кишечника — метаболом» при СПКЯ. Этот пробел в знаниях ограничивает наше понимание связанных с ZeLan биологических реакций и препятствует рациональной оптимизации данного растительного препарата для лечения СПКЯ.

Данное исследование было разработано для изучения терапевтической эффективности экстракта ZeLan на модели СПКЯ у крыс, индуцированной DHEA, а также для оценки связанных с этим изменений в микробиоте и метаболоме кишечника с помощью интегрированного секвенирования 16S рРНК и нетаргетного метаболомного анализа. В частности, мы оценивали влияние экстракта ZeLan на фенотипы, связанные с СПКЯ, включая массу тела, уровень тестостерона в сыворотке, соотношение лютеинизирующего гормона к фолликулостимулирующему гормону (LH/FSH) и уровни инсулина; охарактеризовали изменения в составе микробиоты кишечника и альфа-разнообразии после применения ZeLan; выявили дифференциальные признаки метаболитов в сыворотке и обогащенные метаболические пути, связанные с воздействием ZeLan; а также изучили корреляции между конкретными таксонами кишечной микробиоты и ключевыми метаболитами. Преследуя эти цели, мы стремились предоставить ассоциативные мультиомиксные доказательства модуляции оси «кишечник-яичники» при СПКЯ под воздействием ZeLan.

Протокол

Все экспериментальные процедуры в данном исследовании проводились в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (номер одобрения IACUC-2023-0156).

Животные

Самки крыс линии Sprague-Dawley (n = 24, возраст 6 недель, масса тела 180–200 g) были получены из Центра лабораторных животных при профильном учреждении и содержались в контролируемых условиях окружающей среды (температура 22 ± 2°C, влажность 50 ± 10%, 12-часовой цикл свет/темнота) со свободным доступом к стандартному корму для грызунов и очищенной воде. После одного недельного периода акклиматизации животные были случайным образом разделены на три экспериментальные группы (n = 8 в группе): контрольную группу, группу модели СПКЯ и группу терапии ZeLan. Размер выборки был определен на основании предыдущих исследований изменений микробиоты кишечника в моделях СПКЯ; анализ статистической мощности показал, что 8 животных в группе обеспечат 80% мощность для обнаружения 1,5-кратного различия в индексах альфа-разнообразия при α = 0.05.

Создание модели СПКЯ и протокол лечения

Модель СПКЯ была создана с использованием хорошо валидированного протокола, включающего ежедневные подкожные инъекции дегидроэпиандростерона (DHEA; Sigma-Aldrich, USA), растворенного в кунжутном масле, в область затылка в дозе 6 mg/100 g массы тела в течение 21 дня подряд. Контрольные животные получали эквивалентные объемы кунжутного масла в качестве плацебо. Полный график эксперимента включал 7 дней акклиматизации, 21 день индукции модели и 28 дней вмешательства, с финальным отбором проб на 56-й день протокола, включая период акклиматизации (Рисунок 1). Экстракт ZeLan был приготовлен из аутентичного сырья травы Lycopus lucidus Turcz. путем водной экстракции и стандартизирован по содержанию общих флавоноидов на уровне не менее 2,5% методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, которая служила критерием химического контроля качества ботанического экстракта. После завершения этапа создания модели с помощью DHEA крысы в группе ZeLan получали экстракт ZeLan путем перорального зондирования в дозе 200 mg/kg массы тела ежедневно в течение 28 дней подряд, в то время как группы Контроля и Модели получали эквивалентные объемы дистиллированной воды. Доза 200 mg/kg была выбрана в качестве исследовательской фармакологической дозы на основе предыдущего опыта работы с ботаническими экстрактами на животных и предварительных соображений переносимости; формальная оценка зависимости «доза-эффект» не входила в план данного исследования. Масса тела регистрировалась еженедельно на протяжении всего экспериментального периода. В данном дизайне эксперимента успешность создания модели СПКЯ оценивалась с помощью протокола индукции DHEA в сочетании с конечными эндокринными и метаболическими фенотипами, включая массу тела, уровень тестостерона в сыворотке крови, соотношение LH/FSH и уровень инсулина натощак. Гистопатологическое исследование яичников, подсчет фолликулов, количественное определение желтых тел и серийный мониторинг эстрального цикла не включались в качестве конечных точек подтверждения модели, и, следовательно, интерпретация дисфункции яичников основывалась на эндокринных и метаболических показателях, а не на прямой оценке на тканевом уровне.

Сбор и обработка образцов

Образцы (сыворотка крови и фекалии) были собраны у всех трех групп (n = 8 в группе) для последующего биохимического анализа, анализа микробиоты и метаболомного анализа. Финальный сбор образцов проводили утром после ночного голодания для снижения вариабельности, связанной с циркадными ритмами и кормлением. Образцы крови собирали из брюшной аорты под воздействием анестезии и центрифугировали при 3,000 × g в течение 15 минут при 4°C для получения сыворотки, которую затем разделяли на аликвоты и хранили при -80°C до проведения гормонального и метаболомного анализов. Свежие образцы фекалий собирали непосредственно из слепой кишки в стерильные криопробирки в асептических условиях; образцы транспортировали на сухом льду, подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте в течение 10 минут после сбора и хранили при -80°C до проведения секвенирования гена 16S рРНК.

Измерение уровней гормонов в сыворотке крови

Концентрации тестостерона, лютеинизирующего гормона (LH), фолликулостимулирующего гормона (FSH) и инсулина в сыворотке крови определяли с помощью имеющихся в продаже наборов для иммуноферментного анализа (ELISA) (Cusabio Biotech, Ухань, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Отношение LH/FSH рассчитывали как комплексный показатель дисбаланса гонадотропинов, характерного для СПКЯ. Все образцы анализировали в дублетах; измерения с коэффициентом вариации дублетов более 15% повторяли. Коэффициенты вариации внутри серии и между сериями анализов должны были оставаться ниже 10% и 15% соответственно. Потенциальные выбросы проверяли по исходным записям и данным о работе анализа; ни одно значение не было исключено только на статистических основаниях без документально подтвержденной технической причины.

Секвенирование гена 16S рРНК и биоинформатический анализ

Общая бактериальная геномная ДНК была экстрагирована из содержимого слепой кишки с использованием набора QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Качество и количество ДНК оценивали с помощью спектрофотометрии NanoDrop и электрофореза в агарозном геле; экстракты ДНК хранились при -80°C до момента конструирования библиотек. Гипервариабельные участки V3-V4 гена 16S рРНК амплифицировали с использованием универсальных праймеров 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') и 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') с адаптерными последовательностями Illumina. Библиотеки ампликонов конструировали, очищали, количественно определяли, объединяли в эквимолярных концентрациях и секвенировали на платформе Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Пекин, Китай) с использованием парноконцевых чтений по 250 bp.

Необработанные данные секвенирования обрабатывали с помощью конвейера QIIME2 (версия 2022.2). Парно-концевые чтения подвергали демультиплексированию, объединению и фильтрации по качеству с пороговым значением показателя Phred не менее 20, после чего обрабатывали с помощью DADA2 для удаления химерных последовательностей и генерации вариантов последовательностей ампликонов (ASV). Таксономическую классификацию проводили по эталонной базе данных SILVA 138 с использованием наивного байесовского классификатора. Для оценки разнообразия и богатства внутри образцов рассчитывали показатели альфа-разнообразия, включая индекс Шеннона, индекс Симпсона и оценку Chao1. Данные о глубине секвенирования, включая сводные данные по чтениям, таблицы обилия ASV, покрытие Гуда и файлы кривых разрежения, рассматривали как часть набора данных микробиома, описанного в разделе «Доступность данных». Линейный дискриминантный анализ размера эффекта (LEfSe) использовали для выявления таксонов, ассоциированных с заболеванием, при сравнении групп Control и Model с пороговым значением LDA > 2.0 и P < 0.05; обращение эффекта под действием ZeLan оценивали путем сравнения направления сдвигов обилия таксонов в группе ZeLan относительно группы Model.

Нетаргетный метаболомный анализ

Метаболомный профиль сыворотки крови был получен с помощью ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрией (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, США). Образцы сыворотки (100 μL) смешивали с 400 μL холодного метанола:ацетонитрила (1:1, v/v), содержащего внутренние стандарты, перемешивали на вортексе и инкубировали при -20°C в течение 1 часа для осаждения белков. После центрифугирования при 14,000 × g в течение 15 минут супернатанты высушивали в потоке азота и восстанавливали в 100 μL ацетонитрила:воды (1:1, v/v) для последующего анализа. Хроматографическое разделение проводили на колонке ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) при температуре 40°C, используя в качестве подвижной фазы A воду, содержащую 0.1% муравьиной кислоты, и в качестве подвижной фазы B ацетонитрил, содержащий 0.1% муравьиной кислоты, при скорости потока 0.30 mL/min. Для разделения метаболитов использовали программу градиента с увеличением доли органической фазы от 5% до 95% с последующей промывкой и реэквилибрацией колонки. Данные масс-спектрометрии регистрировали как в режиме положительной, так и в режиме отрицательной ионизации электрораспылением в диапазоне m/z 50–1200; параметры источника включали: напряжение на капилляре 3.5 kV, поток осушающего газа 10 L/min, температура осушающего газа 325°C, давление распылителя 35 psi и напряжение фрагментатора 120 V.

Файлы с необработанными данными были конвертированы в формат mzXML и обработаны с использованием пакета XCMS в среде R для детектирования пиков, выравнивания времени удерживания и интегрирования площади пиков. Для мониторинга стабильности прибора в аналитическую последовательность на разных этапах были включены образцы контроля качества, приготовленные путем объединения равных аликвот всех экстрактов сыворотки. Признаки с избыточным количеством пропущенных значений или нестабильной воспроизводимостью в контрольных образцах были удалены перед статистическим моделированием. Идентификация метаболитов проводилась путем сопоставления точной массы, времени удерживания и паттернов MS/MS-фрагментации с данными Human Metabolome Database (HMDB), METLIN и внутренними спектральными библиотеками. Многомерный статистический анализ выполняли с помощью MetaboAnalyst 5.0. Признаки метаболитов, отобранные для последующего представления, приоритизировались на основе комбинированного критерия, включающего вклад в многомерную дискриминацию, направление изменения кратности (fold-change) и статистическую значимость; значения P были скорректированы с использованием метода Бенджамини-Хохберга для учета множественного тестирования. Полная аннотированная таблица результатов, содержащая 52 признака метаболитов, представлена в Supplementary Table 1. Анализ обогащения метаболических путей проводили с использованием базы данных Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Статистический анализ

Весь статистический анализ был выполнен с использованием программы SPSS версии 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) и программного обеспечения R (версия 4.2.1). Непрерывные данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD); перед проведением инференциального анализа нормальность распределения данных оценивали с помощью теста Шапиро-Уилка. Для данных с нормальным распределением для сравнения нескольких групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки; для данных без нормального распределения применяли критерий Краскела-Уоллиса с последующим апостериорным тестом Данна. Корреляции между таксонами кишечных микробов и метаболитами сыворотки оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена и визуализировали в виде иерархически кластеризованных тепловых карт. P-значения корреляций корректировали для множественного тестирования с помощью метода контроля ложных открытий Бенджамини-Хохберга; интерпретировались только те корреляции, которые были согласованны по направлению и статистически значимы. Двустороннее P-значение < 0.05 считалось статистически значимым, если не был указан скорректированный порог P-значения.

Результаты

Влияние экстракта ZeLan на клинические фенотипы СПКЯ

Введение DHEA индуцировало у крыс эндокринные и метаболические фенотипы, подобные СПКЯ, о чем свидетельствует значительное увеличение массы тела, концентрации тестостерона в сыворотке крови, соотношения LH/FSH и уровней инсулина натощак по сравнению с контрольной группой (все P < 0.05). Оценка распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка подтвердила применимость параметрического анализа для основных показателей массы тела и уровней гормонов, обобщенных в Таблице 1. Лечение экстрактом ZeLan в течение 28 дней значительно уменьшило эти метаболические и гормональные нарушения. Масса тела регистрировалась в конце периода лечения на 56-й день протокола, включая 7-дневный период акклиматизации. Как показано в Таблице 1, масса тела в группе Model (291.12 ± 15.35 g) была существенно выше, чем в группе Control (227.45 ± 10.12 g, P < 0.05), в то время как лечение ZeLan значительно снизило массу тела до 245.25 ± 10.21 g (P < 0.05 по сравнению с группой Model). Уровни тестостерона в сыворотке крови были заметно повышены у крыс с моделью СПКЯ (1.85 ± 0.21 ng/mL) по сравнению с контролем (0.51 ± 0.05 ng/mL), а применение ZeLan снизило уровень тестостерона до 0.92 ± 0.12 ng/mL. Соотношение LH/FSH было значительно увеличено в группе Model (3.28 ± 0.25) относительно группы Control (1.25 ± 0.11) и частично нормализовалось при лечении ZeLan (1.85 ± 0.15). Уровни инсулина натощак были повышены у животных с моделью (28.95 ± 2.35 mIU/L против 12.55 ± 1.12 mIU/L в контроле) и значительно снизились после введения ZeLan (18.82 ± 1.55 mIU/L) (Рисунок 2). Эти результаты подтвердили успешное создание эндокринно-метаболического фенотипа, подобного СПКЯ; однако гистопатология яичников, подсчет фолликулов, анализ желтого тела и мониторинг эстрального цикла в данном исследовании не проводились.

Экстракт ZeLan восстановил альфа-разнообразие микробиоты кишечника

Анализ показателей альфа-разнообразия выявил существенные изменения в структуре микробного сообщества кишечника, связанные с СПКЯ и его лечением. Как показано в Таблице 2 и на Рисунке 3, индекс разнообразия Шеннона был значительно ниже у крыс с моделью СПКЯ (4,19 ± 0,35), чем в группе здорового контроля (6,51 ± 0,28; P < 0,05), что указывает на снижение микробного альфа-разнообразия при данном заболевании. Лечение ZeLan частично восстановило микробное разнообразие: индекс Шеннона увеличился до 5,79 ± 0,26 (P < 0,05 по сравнению с группой Model). Аналогичные результаты наблюдались для индекса Симпсона, который снизился с 0,98 ± 0,01 в контроле до 0,82 ± 0,03 у животных с моделью заболевания и восстановился до 0,93 ± 0,02 после применения ZeLan. Оценщик Chao1, отражающий видовое богатство, продемонстрировал схожую динамику: индукция СПКЯ существенно снизила значение Chao1 с 1215,3 ± 45,4 до 665,8 ± 52,1, в то время как лечение ZeLan увеличило богатство до 963,5 ± 38,6. В совокупности эти данные указывают на то, что СПКЯ сопровождается дисбиозом кишечника, характеризующимся снижением альфа-разнообразия и видового богатства, и что экстракт ZeLan может частично восстановить структуру микробного сообщества до профиля, близкого к контрольному.

Изменения в составе микробиоты кишечника

Таксономическое профилирование на уровне типа выявило отчетливые различия в составе между экспериментальными группами. Как показано на рисунке 4, Firmicutes и Bacteroidetes были доминирующими типами во всех группах, в совокупности составляя более 85% всего бактериального сообщества. В группе Model наблюдалось существенно повышенное содержание Firmicutes (примерно 75%) в сочетании с пониженной долей Bacteroidetes (примерно 15%) по сравнению с контрольной группой (Firmicutes примерно 40%, Bacteroidetes примерно 45%), что привело к заметному увеличению соотношения Firmicutes к Bacteroidetes (F/B), характерного для метаболического дисбиоза. Терапия ZeLan модулировала этот дисбаланс, снизив содержание Firmicutes примерно до 52% и увеличив долю Bacteroidetes примерно до 35%, тем самым частично нормализовав соотношение F/B до уровней, близких к контрольным.

Для выявления бактериальных таксонов, которые отличали группу контроля от модельной группы и, таким образом, определяли связанную с заболеванием микробную сигнатуру, был использован анализ LEfSe. Как показано на рисунке 5, на уровне рода в группе модели СПКЯ наблюдалось значительное повышение численности Bacteroides (показатель LDA > 3.5), Prevotella (показатель LDA > 3.0) и Escherichia (показатель LDA > 2.5), которые в целом ранее ассоциировались с метаболической дисфункцией и воспалением. Напротив, в контрольной группе наблюдалось обогащение полезными родами, включая Lactobacillus (показатель LDA > 3.0) и Ruminococcus (показатель LDA > 2.5), которые признаны за их роль в поддержании целостности кишечного барьера и выработке полезных метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты. Группа ZeLan не была представлена в виде отдельного класса LEfSe на рисунке 5, поскольку данный анализ был сосредоточен на таксонах, отличающих болезнь от здоровья; эффекты, связанные с ZeLan, интерпретировались на основе сдвигов численности в сторону профиля контрольной группы и корреляций между микробиомом и метаболомом.

Метаболомное профилирование и идентификация дифференциальных метаболитов

Нетаргетный метаболомный анализ выявил значительные метаболические нарушения, связанные с СПКЯ и его лечением экстрактом ZeLan. График «вулкан» на рисунке 6 демонстрирует распределение признаков метаболитов между группами Model и Control, где повышенные и пониженные уровни признаков выделены по направлению кратности изменения (fold-change) и статистической значимости. В общей таблице отчетности по метаболомике для сравнения групп Model и Control было сохранено в общей сложности 52 аннотированных признака метаболитов. Полный список, включающий название метаболита, идентификатор HMDB, биохимический класс, log2 кратности изменения, значение P и направление регуляции, представлен в Дополнительной таблице 1. В таблице 3 приведены репрезентативные аннотированные метаболиты, имеющие высокую биологическую значимость для СПКЯ.

В таблице 3 обобщены репрезентативные ключевые дифференциальные метаболиты с высокими значениями VIP и биологической значимостью для патофизиологии СПКЯ. Стеридные гормоны, включая тестостерон (VIP = 2.56, P < 0.001) и андростендион (VIP = 2.34, P < 0.001), были значительно повышены у животных с моделью СПКЯ, что согласуется с гиперандрогенным состоянием, характерным для данного заболевания. Метаболизм жирных кислот также был нарушен: наблюдалось значимое увеличение уровней пальмитиновой кислоты (VIP = 2.12) и арахидоновой кислоты (VIP = 1.89), при этом провоспалительный липидный медиатор простагландин E2 также был повышен (VIP = 2.05). Напротив, метаболиты, связанные с полезной активностью кишечной микробиоты, были снижены у животных с СПКЯ: значительно decreased литохолевая кислота, вторичная желчная кислота, образующаяся в результате микробной биотрансформации (VIP = 2.45), так же как и короткоцепочечная жирная кислота масляная кислота (VIP = 2.21). Кроме того, в группе Model наблюдалось снижение уровней янтарной кислоты и незаменимой аминокислоты L-триптофана, что указывает на нарушение микробной ферментации и изменение метаболизма аминокислот.

Анализ обогащения путей KEGG

Анализ обогащения путей с использованием базы данных KEGG выявил несколько метаболических путей в сыворотке крови, которые были значительно нарушены при СПКЯ и модулировались лечением ZeLan. Как показано на Рисунке 7, наиболее значимым обогащенным путем оказался биосинтез стероидных гормонов (Rich Factor = 0.80, P < 0.01), что согласуется с гиперандрогенным фенотипом СПКЯ. Путь стероидогенеза в яичниках также продемонстрировал высокую степень обогащения (Rich Factor = 0.75, P < 0.01), что отражает роль измененного синтеза андрогенов в дисфункции яичников. Биосинтез первичных желчных кислот показал значительное обогащение (Rich Factor = 0.62, P < 0.02), что указывает на нарушение энтерогепатической циркуляции желчных кислот, которое может быть связано с изменениями в микробиоте кишечника. Метаболизм арахидоновой кислоты (Rich Factor = 0.56, P < 0.03) и путь инсулинорезистентности (Rich Factor = 0.40, P < 0.04) также были значительно обогащены, что подтверждает наличие воспалительных и метаболических нарушений, характерных для СПКЯ. Путь биосинтеза жирных кислот показал умеренное обогащение (Rich Factor = 0.30), что предполагает участие дисрегуляции липидного обмена.

Корреляционный анализ микробиома и метаболома

Для оценки функциональных взаимосвязей между составом микробиоты кишечника и метаболическими изменениями был проведен корреляционный анализ Спирмена с контролем частоты ложноположительных результатов (FDR) между бактериальными родами с дифференциальным обилием и ключевыми метаболитами. Тепловая карта корреляций с иерархической кластеризацией, представленная на рисунке 8 , выявляет отчетливые паттерны ассоциаций между микробиотой и метаболомом. Полезные бактерии, включая Lactobacillus и Ruminococcus, продемонстрировали сильную положительную корреляцию с литохолевой кислотой (r = 0.72 и 0.68 соответственно) и масляной кислотой (r = 0.65 и 0.60 соответственно), в то время как с тестостероном (r = -0.75 и -0.80) и андростендионом (r = -0.68 и -0.72) наблюдалась отрицательная корреляция. Эти результаты позволяют предположить, что полезные бактерии, выявленные в ходе таксономического анализа, были связаны с метаболитами андрогенов и метаболической активностью, относящейся к SCFA.

Напротив, роды Bacteroides, Prevotella и Escherichia, ассоциированные с СПКЯ, продемонстрировали противоположные паттерны корреляции. Эти бактерии положительно коррелировали с тестостероном (r = 0.85, 0.82 и 0.60 соответственно), андростендионом (r = 0.78, 0.75 и 0.55) и пальмитиновой кислотой (r = 0.65, 0.60 и 0.45), при этом наблюдалась отрицательная корреляция с полезными метаболитами, включая литохолевую и масляную кислоты. Такие паттерны корреляции подтверждают функциональные связи между конкретными таксонами кишечной микробиоты и метаболическими нарушениями, характерными для СПКЯ, однако они не устанавливают прямой причинно-следственной связи.

Доступность данных:

Наборы данных, полученные и проанализированные в ходе данного исследования, включают метаданные образцов, исходные данные по фенотипу, показатели альфа-разнообразия 16S, сводные данные по обилию на уровне типов, результаты дифференциального анализа бактериальных таксонов, таблицы дифференциального анализа метаболома, результаты по репрезентативным метаболитам, результаты обогащения путей KEGG и матрицу корреляции микробиоты и метаболитов. Эти исходные данные представлены в прилагаемом Дополнительном файле 1. Обработанный набор данных по дифференциальным метаболитам представлен в Дополнительной таблице 1.

Схема временной шкалы эксперимента, показывающая контрольную группу, группу модели и группу ZeLan с инъекциями DHEA, а также сбор образцов.
Рисунок 1: Дизайн эксперимента и график лечения. Схематическая иллюстрация рабочего процесса эксперимента, включающая 7-дневный период акклиматизации, 21-дневный период инъекций DHEA или плацебо, 28-дневное лечение экстрактом ZeLan или плацебо и итоговый сбор образцов сыворотки крови и фекалий на 56-й день протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграммы размаха для уровней тестостерона в сыворотке крови, соотношения ЛГ/ФСГ и массы тела; сравнение контрольной, модельной групп и группы ZeLan.
Рисунок 2: Влияние экстракта ZeLan на эндокринные и метаболические показатели. Диаграммы размаха, демонстрирующие (A) концентрацию тестостерона в сыворотке крови, (B) соотношение ЛГ/ФСГ и (C) массу тела в контрольной, модельной и опытной группах (ZeLan) после периода вмешательства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграмма размаха для сравнения индекса Шеннона; группы Control, Model и ZeLan; результаты анализа разнообразия.
Рисунок 3: Альфа-разнообразие микробиоты кишечника. Сравнение индекса разнообразия Шеннона в группах Control, Model и ZeLan, иллюстрирующее различия в альфа-разнообразии микробиоты кишечника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма микробного состава; обилие типов в группах Control, Model и ZeLan; анализ микробиома.
Рисунок 4: Состав микробиоты кишечника на уровне типов. Стековая столбчатая диаграмма, показывающая относительное обилие преобладающих типов бактерий в микробиоте кишечника групп Control, Model и группы, получавшей ZeLan. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ микробиома, гистограмма показателей LDA, демонстрирующая обогащение родов в контрольной группе и группе модели.
Рисунок 5: Дифференциальные бактериальные таксоны, выявленные с помощью анализа LEfSe. Линейный дискриминантный анализ размера эффекта (LEfSe) для идентификации родов бактерий, различающих контрольную группу (Control) и группу модели (Model). Показатели LDA указывают на размер эффекта таксонов с дифференциальной численностью. Изменения, связанные с ZeLan, описаны в разделе «Результаты» на основе сдвигов численности относительно группы модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

График-вулкан, отображающий анализ экспрессии генов; log2 кратности изменения против -log10 p-значения.
Рисунок 6: Дифференциальный профиль метаболитов. График-вулкан, демонстрирующий дифференциальные признаки метаболитов между группами Model и Control. Красные и синие точки представляют собой статистически значимо повышенные и пониженные уровни соответствующих признаков метаболитов на основе кратности изменения и статистической значимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Точечный график анализа путей; размер пузырька указывает на количество; цвет показывает p-значение; оси: фактор обогащения (Rich Factor) против пути (Pathway).
Рисунок 7: Анализ обогащения путей KEGG. Пузырьковый график, показывающий статистически значимо обогащенные метаболические пути, выявленные на основе дифференциальных метаболитов. Размер пузырька соответствует количеству картированных метаболитов, а цвет пузырька указывает на статистическую значимость (P-value) обогащения пути. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Тепловая карта корреляций между микробами и метаболитами; анализ данных микробиоты кишечника.
Рисунок 8: Корреляция между микробиотой кишечника и метаболитами сыворотки крови. Тепловая карта с иерархической кластеризацией, отображающая коэффициенты корреляции Спирмена между бактериальными родами с дифференциальной численностью и репрезентативными метаболитами сыворотки крови. Красный цвет указывает на положительную корреляцию, синий — на отрицательную. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ГруппаNМасса тела (г)Тестостерон (нг/мл)Соотношение ЛГ/ФСГИнсулин (мЕД/л)
Контроль8227.45 ± 10.120.51 ± 0.051.25 ± 0.1112.55 ± 1.12
Модель8291.12 ± 15.35a1.85 ± 0.21a 3.28 ± 0.25a28.95 ± 2.35a
ZeLan8245.25 ± 10.21b0.92 ± 0.12b1.85 ± 0.15b18.82 ± 1.55b
Примечание: данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). a = p < 0,05 по сравнению с контрольной группой; b = p < 0,05 по сравнению с группой Model.

Таблица 1: Эндокринные и метаболические показатели у крыс с СПКЯ. Масса тела, уровень тестостерона в сыворотке крови, соотношение LH/FSH и уровень инсулина натощак были измерены в контрольной группе, группе модели и группе, получавшей ZeLan. Данные представлены как среднее значение ± SD.

ГруппаИндекс ШеннонаИндекс СимпсонаОценщик Chao1
Контроль6.51 ± 0.280.98 ± 0.011215.3 ± 45.4
Модель4.19 ± 0.35a0.82 ± 0.03a665.8 ± 52.1a
ZeLan5.79 ± 0.26b0.93 ± 0.02b963.5 ± 38.6b
Примечание: данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). a = p < 0,05 по сравнению с контрольной группой; b = p < 0,05 по сравнению с группой модели.

Таблица 2: Индексы альфа-разнообразия микробиоты кишечника. Сравнение индекса Шеннона, индекса Симпсона и оценки Chao1 в группах контроля, модели и терапии ZeLan. Данные представлены как среднее значение ± SD.

Название метаболитаID HMDBКлассТенденция (модель в сравнении с контролем)значение pПоказатель VIP
ТестостеронHMDB0000286СтероидВверх ↑< 0.0012.56
АндростендионHMDB0000055СтероидВверх ↑< 0.0012.34
Пальмитиновая кислотаHMDB0000220Жирная кислотаВверх ↑< 0.0012.12
Арахидоновая кислотаHMDB0001043Жирная кислотаВверх ↑0.0031.89
Простагландин E2HMDB0001036ЛипидВверх ↑< 0.0012.05
Литохолевая кислотаHMDB0000752Желчная кислотаВниз ↓< 0.0012.45
Масляная кислотаHMDB0000039КЦЖКВниз ↓< 0.0012.21
Янтарная кислотаHMDB0000254Органическая кислотаВниз ↓0.0211.65
L-триптофанHMDB0000929АминокислотаВниз ↓0.0151.58
Примечание: VIP = Variable Importance in Projection (переменная важности в проекции) > 1 считается значимым). 

Таблица 3: Репрезентативные дифференциальные метаболиты сыворотки крови. Репрезентативные аннотированные метаболиты, связанные с СПКЯ и регулируемые экстрактом ZeLan, включая идентификаторы HMDB, класс метаболитов, тенденцию регуляции, значение P и показатель VIP. Полный список из 52 аннотированных признаков метаболитов представлен в Дополнительной таблице 1.

Дополнительная таблица 1: Полный аннотированный набор данных по метаболитам. Полный список из 52 аннотированных признаков метаболитов, отобранных для отчетности по метаболомике, включая название метаболита, идентификатор HMDB, биохимический класс, кратность изменения (fold change), P-значение и направление регуляции.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Исходные данные, подтверждающие результаты экспериментального анализа, анализа микробиома и метаболомики. Эта рабочая книга содержит информацию об образцах, показатели клинического фенотипа, индексы разнообразия секвенирования 16S рРНК, относительное обилие микроорганизмов на уровне типа, анализ дифференциальных таксонов LEfSe, дифференциальный метаболомный анализ, репрезентативные метаболиты, анализ обогащения путей KEGG, данные матрицы корреляции и сводку верификации данных, использованные для построения рисунков и таблиц, представленных в рукописи.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Настоящее исследование предоставляет доказательства того, что экстракт ZeLan улучшает эндокринные и метаболические фенотипы, связанные с СПКЯ, в модели крыс с индуцированным DHEA, и что эти эффекты сопряжены с благоприятными изменениями в составе микробиоты кишечника и метаболических профилях сыворотки. Интегрированный мультиомный подход показал, что терапия ZeLan уменьшает гиперandрогению, снижает повышенное соотношение LH/FSH и инсулинорезистентность, частично восстанавливая при этом альфа-разнообразие микробиома кишечника, восстанавливая баланс микробного состава и нормализуя несколько метаболических путей, участвующих в патофизиологии СПКЯ. Эти результаты расширяют современное понимание биологических ответов на традиционные китайские растительные лекарственные средства и обосновывают дальнейшее изучение оси «кишечник-яичник» как потенциальной мишени для терапии СПКЯ.

Снижение уровня тестостерона в сыворотке крови и соотношения LH/FSH после терапии ZeLan согласуется с результатами предыдущих исследований, демонстрирующих антиандрогенные свойства растительных экстрактов, содержащих флавоноиды и фенольные соединения16. В комплексном обзоре клинических исследований применения фитопрепаратов при СПКЯ были обобщены эндокринные и метаболические улучшения, наблюдаемые при различных растительных вмешательствах17. Механизм, посредством которого ZeLan модулирует биосинтез андрогенов, может включать прямое воздействие на стероидогенные пути в яичниках, системные противовоспалительные и инсулин-сенсибилизирующие эффекты или косвенные эффекты, связанные с метаболитами кишечной микробиоты; при данной схеме исследования невозможно полностью разграничить эти возможности. Улучшение соотношения LH/FSH указывает на частичное восстановление функции гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси, которая обычно нарушена при СПКЯ18. Систематические обзоры экспериментов на животных с использованием рецептур традиционной китайской медицины для лечения СПКЯ также сообщают об улучшении репродуктивных и эндокринных показателей19. Одновременное улучшение показателей, связанных с инсулином, позволяет предположить, что ZeLan может оказывать метаболический эффект, выходящий за рамки эндокринной регуляции, потенциально за счет усиления периферической передачи сигналов инсулина или снижения уровня воспалительных медиаторов, нарушающих функцию инсулиновых рецепторов20.

Восстановление альфа-разнообразия кишечной микробиоты после применения ZeLan согласуется с ответом, связанным с микробиомом. Снижение альфа-разнообразия, наблюдаемое у крыс с моделью СПКЯ, соответствует растущему объему литературы, документирующей дисбиоз кишечника как в экспериментальных моделях СПКЯ, так и в клинических популяциях21. Insenser и соавторы далее сообщили, что на профили микробиоты кишечника при СПКЯ влияют пол, половые гормоны и ожирение22. Наше наблюдение о том, что лечение ZeLan частично восстановило индекс Шеннона с 4,19 до 5,79, позволяет предположить, что этот растительный экстракт может поддерживать структуру микробного сообщества. Аналогичные эффекты восстановления разнообразия были описаны для других растительных экстрактов, богатых полифенолами, которые могут селективно стимулировать популяции полезных бактерий, подавляя при этом потенциально патогенные таксоны23. Таксономические сдвиги, наблюдаемые на уровне типов, в частности снижение соотношения Firmicutes к Bacteroidetes после применения ZeLan, имеют важное значение, учитывая установленную связь между повышенным соотношением F/B и метаболической дисфункцией, включая ожирение и инсулинорезистентность24. Дополнительные исследования, включая работу Jobira и соавторов на подростках с СПКЯ, выявили изменения биоразнообразия микробиоты желудочно-кишечного тракта, что подтверждает биологическую значимость состава микробиоты для метаболизма хозяина25.

Идентификация конкретных родов бактерий, дифференциально ассоциированных с СПКЯ и лечением препаратом ZeLan, обеспечивает биологический контекст для выявленных в данном исследовании взаимосвязей между микробиотой и метаболомом. Обогащение здорового контроля родами Lactobacillus и Ruminococcus и их дефицит у животных с СПКЯ согласуются с предыдущими сообщениями, подчеркивающими защитную роль этих родов26. Виды Lactobacillus известны способностью вырабатывать молочную кислоту и антимикробные пептиды, которые поддерживают целостность кишечного барьера и подавляют патогенные бактерии, в то время как виды Ruminococcus являются важными продуцентами короткоцепочечных жирных кислот в процессе ферментации пищевых волокон27. Восстановление этих полезных родов после лечения ZeLan может улучшить функцию кишечного барьера и повысить метаболическую активность, связанную с SCFA, о чем свидетельствует повышение уровня масляной кислоты, наблюдаемое при метаболомном анализе. Напротив, повышенное содержание Bacteroides, Prevotella и Escherichia у животных с СПКЯ согласуется с исследованиями, указывающими на связь этих родов с воспалительными и метаболическими расстройствами28. Виды Escherichia, в частности Escherichia coli, могут вырабатывать липополисахарид, который может запускать системное воспаление и инсулинорезистентность через сигнализацию Toll-подобного рецептора 4, что представляет собой вероятную связь между дисбиозом кишечника и метаболической дисфункцией, ассоциированной с СПКЯ29.

Результаты метаболомного анализа свидетельствуют о метаболических связях между микробиотой кишечника и хозяином, сопровождающих лечение ZeLan. Изменения уровней вторичных желчных кислот, таких как литохолевая кислота, биологически значимы, так как эти метаболиты образуются в результате ферментативной активности бактерий30. Желчные кислоты участвуют не только в абсорбции липидов, но и выступают в роли сигнальных молекул, регулирующих метаболизм глюкозы и липидов через фарнезоидный X-рецептор и Takeda G-белоксопряженный рецептор 5, что позволяет предположить, что нормализация профилей желчных кислот может способствовать улучшению метаболического гомеостаза. Аналогичным образом, восстановление уровней масляной кислоты имеет важное значение, учитывая ее многочисленные благотворные эффекты, включая укрепление барьерной функции кишечника, противовоспалические свойства и повышение чувствительности к инсулину. Наблюдаемые корреляции между полезными бактериями и защитными метаболитами в противовес связям между патогенными бактериями и вредными метаболитами служат косвенным подтверждением гипотезы о существовании оси «кишечник-яичники», подчеркивая при этом необходимость прямого механистического подтверждения.

Клиническое значение этих результатов следует интерпретировать с учетом ограничений доклинического исследовательского дизайна. Полученные данные обосновывают дальнейшее изучение экстракта ZeLan в качестве дополнительного метода лечения СПКЯ, особенно в контексте применения растительных препаратов, которые могут влиять как на эндокринно-метаболические показатели, так и на кишечную микросреду. Идентификация микробных и метаболических биомаркеров, связанных с ответом на лечение, может помочь в планировании будущих механистических и трансляционных исследований. Кроме того, концепция оси «кишечник-яичники» в перспективе может лечь в основу комбинированных стратегий, сочетающих применение ZeLan с пробиотиками или модификацией рациона, однако такие стратегии требуют контролируемой валидации перед клиническим применением.

Необходимо признать ряд ограничений данного исследования. Во-первых, хотя крысиная модель, индуцированная DHEA, воспроизводит несколько признаков человеческого СПКЯ, она не в полной мере отражает гетерогенность фенотипов СПКЯ у людей, включая подтипы с нормальной массой тела, ожирением, инсулинорезистентностью и воспалением; следовательно, клиническая трансляция требует валидации на хорошо охарактеризованных популяциях пациентов. Во-вторых, в исследовании использовалась одна доза ZeLan без градиента «доза-эффект» или положительного лекарственного контроля, такого как метформин, поэтому эффективный диапазон доз, сравнительная эффективность и оптимальный цикл введения еще предстоит определить. В-третьих, отбор проб проводился только в конечной точке, что ограничивает интерпретацию динамических временных изменений в микробиоте, метаболитах и гормональных профилях в период вмешательства. В-четвертых, в данный экспериментальный дизайн не были включены гистопатология яичников, подсчет фолликулов, количественная оценка желтого тела и серийный мониторинг эстрального цикла; таким образом, восстановление функции яичников оценивалось по эндокринным и метаболическим показателям, а не на основе прямого анализа тканей и циклов. В-пятых, в ходе исследования были выявлены корреляции между микробными таксонами и метаболитами, но не проводились трансплантация фекальной микробиоты, эксперименты на животных с отсутствием микробов (germ-free), целенаправленное введение метаболитов, анализы маркеров воспаления или измерения стероидогенных ферментов яичников, таких как CYP17A1, CYP19A1 и StAR; следовательно, на основании имеющихся данных невозможно подтвердить причинно-следственные механизмы. В-шестых, нецелевая метаболомика предоставляет данные на уровне поиска, и в будущих работах потребуется целевая количественная валидация ключевых метаболитов, таких как литохолевая кислота, масляная кислота и тестостерон. В-седьмых, для данной публикации не были доступны визуализация бета-разнообразия, функциональное прогнозирование микробиоты и интегрированное моделирование путей «микробиота-метаболит-ген», что ограничивает возможность построения полной регуляторной сети. Наконец, экстракт ZeLan был стандартизирован по общему содержанию флавоноидов, однако по-прежнему необходима комплексная качественная и количественная фитохимическая характеристика активных мономеров.

В заключение, экстракт ZeLan улучшил эндокринные и метаболические фенотипы, связанные с СПКЯ, на крысиной модели, что сопровождалось частичным восстановлением альфа-разнообразия кишечной микробиоты, изменением состава микробиома и модуляцией метаболических путей в сыворотке крови, включая биосинтез стероидных гормонов, метаболизм желчных кислот и метаболизм, связанный с короткоцепочечными жирными кислотами. Наблюдаемые корреляции между полезными бактериями и защитными метаболитами в противовес ассоциациям между бактериями, число которых увеличилось при СПКЯ, и вредными метаболитами, подтверждают биологически обоснованную связь по оси кишечник-яичники. Эти результаты закладывают основу для будущих механистических и трансляционных исследований применения экстракта ZeLan при лечении СПКЯ, подчеркивая при этом необходимость причинно-следственной валидации и более широкого фитохимического анализа.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данное исследование было профинансировано в рамках Плана научно-исследовательских проектов Администрации традиционной китайской медицины провинции Хэбэй (грант № 2021316).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АцетонитрилFisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA955-4Optima, сорт LC-MS, 4 л; подвижная фаза и реконституция образца
колонка ACQUITY UPLC HSS T3Waters Corporation186003539100 Å, 1.8 μm, 2.1 × 100 мм; разделение методом УВЭЖХ
Система электрофореза в агарозном гелеBio-Rad Laboratories1704486Система горизонтального электрофореза Mini-Sub Cell GT; оценка качества ДНК
Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MSAgilent TechnologiesG7120A/G7167B/G7116B/G6550Bкомплект модулей UHPLC 1290 Infinity II, сопряженный с Q-TOF MS 6550 iFunnel; платформа для нетаргетного метаболомного анализа сыворотки крови
Алгоритм DADA2BioconductorВерсия 1.24.0Генерация ASV и удаление химер; версия соответствует рабочему процессу R 4.2.1/Bioconductor 3.15
Дегидроэпиандростерон (ДГЭА)Sigma-Aldrich / MilliporeSigmaD4000Индукция модели СПКЯ; 6 мг/100 г массы тела; CAS 53-43-0
Дистиллированная водаInvitrogen / Thermo Fisher Scientific10977015Сверхчистая дистиллированная вода, не содержащая ДНКаз и РНКаз; растворитель для перорального зондирования в контрольной группе и группе модели
Муравьиная кислотаFisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA117-50Optima, степень чистоты для ЖХ-МС, 50 мл; добавка 0,1% для подвижных фаз ЖХ-МС
База данных метаболома человекаUniversity of Alberta / HMDBHMDB 5.0База данных аннотаций метаболитов
платформа Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Система секвенирования, используемая поставщиком услуг по секвенированию для парноконцевого секвенирования 16S рРНК (длина прочтения 250 п.н.)
Трава Lycopus lucidus Turcz.Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd.Партия ZL-20230315Аутентифицированное растительное сырье для водного экстракта ZeLan
МетанолFisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA456-4Optima, степень чистоты для ЖХ-МС, 4 л; осаждение белков для метаболомики сыворотки крови
база данных METLINScripps ResearchMETLIN Classic 2023База данных масс-спектральной аннотации метаболитов
Спектрофотометр NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-WМикрообъемный УФ-видимый спектрофотометр NanoDrop One; оценка количества и чистоты ДНК
Набор QIAamp Fast DNA Stool Mini KitQiagen51604Экстракция ДНК из содержимого слепой кишки; набор для выделения ДНК из кала на 50 проб
QIIME2Команда разработчиков QIIME2Версия 2022.2Обработка последовательностей 16S рРНК
программное обеспечение RR FoundationВерсия 4.2.1Статистический анализ и обработка с помощью XCMS
Наборы для ИФА сыворотки на определение тестостерона, ЛГ, ФСГ и инсулинаCusabio BiotechCSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070rНаборы для ИФА на тестостерон, ЛГ, ФСГ и инсулин крысы для количественного определения гормонов и инсулина в сыворотке крови
Кунжутное маслоSigma-Aldrich / MilliporeSigmaS3547Растворитель для инъекций DHEA
Пентобарбитал натрияSigma-Aldrich / MilliporeSigmaP3761Анестезия; 50 мг/кг внутрибрюшинно
программное обеспечение SPSSIBM CorporationВерсия 26.0Статистический анализ
Универсальные праймеры к 16S рРНК 338F/806RSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Специальный синтез: 338F/806RАмплификация регионов V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Пакет XCMSBioconductor / RВерсия 3.18.0Детекция пиков, выравнивание по времени удерживания и интегрирование
Экстракт ZeLanСобственный водный экстрактПартия ZLE-20230402Введение препарата через рот (пероральный зонд); стандартизированное общее содержание флавоноидов ≥2.5%

Ссылки

  1. Joham AE, Norman RJ, Stener-Victorin E, et al. Polycystic ovary syndrome. Lancet Diabetes Endocrinol. 2022;10(9):668-680.
  2. Islam H, Masud J, Islam YN, et al. An update on polycystic ovary syndrome: a review of the current state of knowledge in diagnosis, genetic etiology, and emerging treatment options. Womens Health (Lond). 2022;18:17455057221117966.
  3. Azziz R, Carmina E, Chen Z, et al. Polycystic ovary syndrome. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16057.
  4. Fahs D, Salloum D, Nasrallah M, et al. Polycystic ovary syndrome: pathophysiology and controversies in diagnosis. Diagnostics (Basel). 2023;13(9):1559.
  5. Conway G, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, et al. The polycystic ovary syndrome: a position statement from the European Society of Endocrinology. Eur J Endocrinol. 2014;171(4):P1-P29.
  6. Huddleston HG, Dokras A. Diagnosis and treatment of polycystic ovary syndrome. JAMA. 2022;327(3):274-275.
  7. Zhang J, Xin X, Zhang H, et al. The efficacy of Chinese herbal medicine in animal models of polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:4892215.
  8. Chen J, Na E, Lim SY. Effect of fractions from Lycopus lucidus Turcz. leaves on genomic DNA oxidation and matrix metalloproteinase activity. Comb Chem High Throughput Screen. 2022;25(10):1778-1784.
  9. Ślusarczyk S, Hajnos M, Skalicka-Woźniak K, et al. Antioxidant activity of polyphenols from Lycopus lucidus Turcz. Food Chem. 2009;113(1):134-138.
  10. Qi X, Yun C, Sun L, et al. Gut microbiota-bile acid-interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome. Nat Med. 2019;25(8):1225-1233.
  11. He FF, Li YM. Role of gut microbiota in the development of insulin resistance and the mechanism underlying polycystic ovary syndrome. J Ovarian Res. 2020;13(1):73.
  12. Chadchan SB, Singh V, Kommagani R. Female reproductive dysfunctions and the gut microbiota. J Mol Endocrinol. 2022;69(3):R81-R94.
  13. Puspitasari VD, Lestari ES, Pramono N. Testosterone induced Wistar rat model for gut microbiota dysbiosis of polycystic ovarian syndrome research. J Indones Med Assoc. 2024;74(3):132-140.
  14. Zhang J, Sun Z, Jiang S, et al. Probiotic Bifidobacterium lactis V9 regulates the secretion of sex hormones in polycystic ovary syndrome patients. mSystems. 2019;4(2):e00017-19.
  15. Xuan Y, Hong X, Zhou X, et al. The vaginal metabolomics profile with features of polycystic ovary syndrome: a pilot investigation in China. PeerJ. 2024;12:e18194.
  16. Hu M, Zhang Y, Guo X, et al. Hyperandrogenism and insulin resistance induce gravid uterine defects in association with mitochondrial dysfunction and aberrant ROS production. Endocrinology. 2019;160(9):2208-2223.
  17. Moini Jazani A, Nasimi Doost Azgomi H, Nasimi Doost Azgomi A, et al. A comprehensive review of clinical studies with herbal medicine on polycystic ovary syndrome (PCOS). DARU J Pharm Sci. 2019;27(2):863-877.
  18. McCartney CR, Marshall JC. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med. 2016;375(1):54-64.
  19. Cui Y, Zhang C, Li X, et al. Systematic review and meta-analysis of animal experiments on Bushen formulas for the treatment of polycystic ovary syndrome. Sci Rep. 2025;15(1):7648.
  20. Thackray VG. Sex, microbes, and polycystic ovary syndrome. Trends Endocrinol Metab. 2019;30(1):54-65.
  21. Torres PJ, Siakowska M, Banaszewska B, et al. Gut microbial diversity in women with polycystic ovary syndrome correlates with hyperandrogenism. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(4):1502-1511.
  22. Insenser M, Murri M, Del Campo R, et al. Gut microbiota and the polycystic ovary syndrome: influence of sex, sex hormones, and obesity. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(7):2552-2562.
  23. Guo Y, Qi Y, Yang X, et al. Association between polycystic ovary syndrome and gut microbiota. PLoS One. 2016;11(4):e0153196.
  24. Liu R, Zhang C, Shi Y, et al. Dysbiosis of gut microbiota associated with clinical parameters in polycystic ovary syndrome. Front Microbiol. 2017;8:324.
  25. Jobira B, Frank DN, Pyle L, et al. Obese adolescents with PCOS have altered biodiversity and relative abundance in gastrointestinal microbiota. J Clin Endocrinol Metab. 2020;105(6):e2134-e2144.
  26. Bai X, Ma J, Wu X, et al. Impact of visceral obesity on structural and functional alterations of gut microbiota in polycystic ovary syndrome (PCOS): a pilot study using metagenomic analysis. Diabetes Metab Syndr Obes. 2023;16:1-14.
  27. Rizk MG, Thackray VG. Intersection of polycystic ovary syndrome and the gut microbiome. J Endocr Soc. 2021;5(2):bvaa177.
  28. He S, Li H, Yu Z, et al. The gut microbiome and sex hormone-related diseases. Front Microbiol. 2021;12:711137.
  29. Chu W, Han Q, Xu J, et al. Metagenomic analysis identified microbiome alterations and pathological association between intestinal microbiota and polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2020;113(6):1286-1298.
  30. Yurtdaş G, Akdevelioğlu Y. A new approach to polycystic ovary syndrome: the gut microbiota. J Am Coll Nutr. 2020;39(4):371-382.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ZeLan16SUHPLC Q TOF MS

Похожие статьи