Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ in vitro для деградации LpxC мембранно-связанной протеазой FtsH и адаптером LapB из Escherichia coli

173 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71092

⸱

22 июня 2026 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Escherichia coli регулирует биосинтез липополисахаридов (LPS) главным образом за счёт контроля деградации LpxC — деацетилазы, катализирующей первый фиксированный этап синтеза LPS. Цель этого протокола — установить чувствительный, количественный анализ деградации in vitro для LpxC с использованием восстановленной протеазы AAA+ FtsH и адаптера LapB в протеолипосомах.

Аннотация

Этот протокол представляет чувствительный, количественный анализ деградации LpxC in vitro с использованием восстановленной AAA+ (АТФазы, ассоциированной с разнообразной клеточной активностью) протеазы FtsH и адаптера LapB в протеолипосомах. AAA+ протеазы — это молекулярные машины, зависящие от АТФ, которые поддерживают гомеостаз белков и регулируют различные клеточные процессы в цитоплазме или на клеточных мембранах. По сравнению с цитоплазматическими аналогами, мембранно-связанные AAA+ протеазы остаются плохо охарактеризованными из-за технических сложностей при восстановлении и измерении их активности in vitro. Здесь мы используем систему FtsH–LapB–LpxC в качестве модели для разработки флуоресцентного анализа деградации протеолипосом. FtsH и LapB реконструируются в протеолипосомы для имитации естественной мембранной среды, а LpxC ковалентно маркируется флуоресцентным красителем Atto488. Деградация начинается при сочетании протеолипосом с мечеными LpxC и АТФ и завершается трихлоруксусной кислотой (TCA). Успешный анализ определяется временно-зависимым увеличением флуоресценции в растворимой супернатантной фракции после осадки TCA, что соответствует высвобождению флуоресцентных пептидных фрагментов, образованных протеолизом LpxC. Этот сигнал позволяет напрямую количественно оценивать начальные скорости деградации при определённых условиях. По сравнению с традиционными анализами на основе электрофореза на основе электрофореза натрия додецилсульфат-полиакриламида (SDS-PAGE), этот метод значительно повышает чувствительность и позволяет проводить количественный кинетический анализ. Кроме того, система протеолипосом позволяет систематически изучать, как компоненты белка, такие как адаптеры и антиадаптеры, а также состав липидов влияют на деградацию LpxC. Хотя этот анализ разработан для системы FtsH–LapB–LpxC, он легко адаптируется к другим мембранно-связанным протеазам и субстратам, обеспечивая общую основу для изучения мембранно-ассоциированного протеолиза in vitro.

Введение

AAA+ протеазы — это консервативные, зависящие от АТФ молекулярные машины, которые играют центральную роль в контроле качества белка и регуляторном протеолизе 1,2. Эти аппараты содержат гексамерное кольцо из доменов AAA+ АТФаз, которые гидролизуют АТФ, распознавают, раскрывают и транслируют субстраты в домен компартментальных протеазных длядеградации 1. Хотя цитоплазматические протеазы AAA+, такие как ClpXP3 иLon 4, были широко изучены с помощью хорошо известных in vitro тестов, мембранно-связанные AAA+ протеазы остаются сравнительно слабо изучены. Этот разрыв во многом отражает технические сложности, связанные с восстановлением мембранных белков в определённые липидные среды и количественным измерением их протеолитической активности in vitro. Общая цель этого метода — установить чувствительные количественные анализы для изучения протеолитической активности мембранных протеаз.

FtsH — единственная необходимая протеаза AAA+ при Escherichia coli и служит прототипической мембранно-связанной протеазойAAA+ 5,6,7. Закреплённый на внутренней мембране N-концевыми трансмембранными спиралями, FtsH разрушает разнообразный набор цитоплазматических и мембранных субстратов, тем самым регулируя контроль качества мембранных белков, стрессовые реакции и липидныйгомеостаз 8,9,10,11. Одним из наиболее хорошо изученных субстратов является LpxC — растворимая деацетилаза, катализующая первый фиксированный этап биосинтеза липополисахаридов (LPS) 12,13. Эффективное разложение LpxC с помощью FtsH требует мембранного белка LapB, который выполняет функции адаптера, специально распознавая LpxC и доставляя его впротеазу 14,15,16,17,18.

Несмотря на свою физиологическую значимость, количественный анализ протеолиза, опосредованного FtsH, in vitro был ограничен, особенно для цитоплазматических субстратов, таких как LpxC. Традиционные анализы деградации in vitro используют FtsH, очищенный в детергентныхмицеллах 13,19, которые не создают мембранную среду для мембранно-закреплённой протеазы. Кроме того, анализы на деградацию часто основаны на обнаружении исчезновения субстрата на основе SDS–PAGE 13, что может быть трудоёмким, низкопроизводительным и недостаточно чувствительным для кинетического анализа. В последнее время FtsH, реконструированный в бицеллы, использовался для изучения деградации мембранных субстратов, как это было разработано группой ХидокаХонга 20; Однако сопоставимой системы анализа цитоплазматических субстратов до сих пор отсутствует. Здесь мы адаптируем восстановление бицеллы Хидока Хона к реконструкции протеолипосом, чтобы имитировать оболочную среду. Кроме того, водорастворимый субстрат LpxC флуоресцентно-маркирован, что позволяет чувствительно и количественно измерять кинетику FtsH/LapB-зависимого деградации LpxC in vitro.

Этот метод следует использовать, когда исследователям необходимо количественно измерить протеолиз водорастворимых субстратов, опосредованный FtsH. Это даёт несколько преимуществ по сравнению с существующими подходами. Во-первых, флуоресцентное обнаружение протеолитических продуктов, а не исчезновения субстрата, значительно улучшает чувствительность и динамический диапазон, облегчая количественное сравнение протеолитической активности. Во-вторых, использование протеолипосом сохраняет мембранный контекст, необходимый для функции FtsH, одновременно позволяя точный контроль состава белков илипидов 18. Наконец, хотя протокол разработан с использованием системы FtsH–LapB–LpxC, он легко адаптируется к другим мембранно-связанным AAA+ протеазам и их цитоплазматическим субстратам, требующим механизмов деградации, связанной с мембраной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Маркировка LpxC с помощью Atto488

  1. Подготовка LPXC
    1. Экспрессируйте и очищайте белок LpxC, как сообщалосьранее, 18. Заменить буфер очищенного LpxC с Tris на 50 мМ фосфатный буфер, pH 7,6 (6 мМ2PO4, 44 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl) гелевой фильтрацией с использованием высокоразрешающей гелевой фильтрационной колонки (например, колонка Superdex 200 Increase 10/300 GL).
    2. Концентрируйте LpxC с помощью ультрафильтрационной колонки до конечной концентрации не менее 5 мг/мл при 4 °C.
  2. Маркировка LpxC с помощью Atto488
    1. Разведите 0,5 мг LpxC в буфере фосфатов 50 мМ, pH 7,6, до конечного объёма 225 мкл. Добавьте 25 мкл 1 м бикарбоната натрия, чтобы снизить pH примерно до 8,3.
    2. Растворить 0,24 мг реактивного красителя Atto488 в 20 мкл буфера бикарбоната натрия объемом 0,1 м для приготовления стандартного раствора (0,012 мг/мкл). Приготовьте рабочий раствор, разбавляя 2 мкл стандартного раствора с 18 мкл буфера бикарбоната натрия объемом 0,1 м, получая окончательную концентрацию 0,0012 мг/мкл.
    3. Немедленно добавьте 4 мкл рабочего раствора Atto488 в белковый раствор (соответствующее молярному соотношению LpxC: Atto488 3:1). Обмотайте трубку алюминиевой фольгой и инкубируйте при 4 °C в течение 2 часов с мягким перемешиванием (18 об/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как запас, так и рабочие растворы Atto488 могут быть быстро заморажены в жидком азоте и хранятся при -80 °C.
  3. Отделение LpxC–Atto488 от свободного красителя
    1. Уравновесить колонку десолизации PD-10 с 10 мл сверхчистой воды, затем 15 мл буфера фосфатов 50 мМ, pH 7,6.
    2. Нанесите реактивную смесь маркировки на колонку и дайте ей полностью войти в смолу.
    3. Элют с 5 мл буфера фосфатов 50 мм, pH 7,6. Должны стать видимыми две отдельные полосы, соответствующие LpxC–Atto488 (первая полоса) и свободный краситель Atto488 (вторая полоса). Собрать дроби из первого диапазона в ~0,5 мл аликвот.
    4. Анализируйте элюированные дроби с помощью SDS-PAGE. Визуализируйте флуоресценцию под ультрафиолетовым освещением перед окрашиванием Coomassie Brilliant Blue (CBB).
    5. Объедините фракции, содержащие LpxC–Atto488, и концентрируйте маркированный белок примерно до 2 мг/мл.
    6. Оценить эффективность маркировки, измеряя концентрацию белка и концентрацию Atto488 с помощью микрообъёмного спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение концентрации Atto488 (в пмоль/мкл) к концентрации LpxC (в мг/мл) в диапазоне 2–5 указывает на соответствующий уровень маркировки. Это соответствует молярному соотношению Atto488 к LpxC от 1:15 до 1:6 после маркировки.
    7. Aliquot LpxC–Atto488 в микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл, мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при -80 °C. На этом этапе протокол можно приостановить до 3 месяцев.
      ВНИМАНИЕ: Жидкий азот чрезвычайно холоден; Обращайтесь с ним с помощью соответствующего защитного оборудования (криоперчатки, защита глаз).

2. Восстановление FtsH/LapB в протеолипосомы

  1. Подготовка липосом
    1. Переведите 100 мг 1-пальмитоил-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфохолина (POPC) в стеклянной пробирке. Испарить растворитель под мягким струёй N₂, затем сушить его ночью под вакуумом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: POPC имеет температуру фазового перехода ~-2 °C и широко используется в мембранной биофизике, липосомных формулировках и клеточных моделях.
      ВНИМАНИЕ: Хлороформ может повредить глаза, кожу, печень, почки и нервную систему. При обращении требуется надлежащее защитное снаряжение (перчатки, защита глаз, маска). Обрабатывайте его в капюшоне с помощью стеклянного шприца.
    2. Добавьте 1 315 мкл буфера A (20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 100 мМ NaCl) к высушенной плёнке POPC. Суспендируйте липиды, чередуя 1 минуту водяной бани и 1 минуту вихря на максимальной скорости в общей сложности ~15 минут или до полного рассеяния. (итоговая концентрация липид: 100 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения липидной суспензии отрегулируйте глубину погружения стеклянной пробирки в водяной соникатор для максимизации перемешивания. Восстановленные липиды могут храниться при -20 °C. На этом этапе протокол можно приостановить до месяца.
    3. Липосому разрежьте на порции по 200 мкл и храните при -20 °C.
  2. Экструзия липосом
    1. Разморозить липосому объёмом 200 мкл в водяной бане при комнатной температуре и разбавить 800 мкл буфера A до конечного объёма 1 мл.
    2. Подвергайте липосомы трём циклам замораживания и оттаивания, чередуя жидкий азот и водяную ванну при комнатной температуре.
    3. Шприцы для промывания, две опоры фильтра и поликарбонатная мембрана диаметром 200 нм с буфером A. Соберите мини-экструдер и экструдируйте липосомы 20 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подвеска липосомы должна выглядеть прозрачной после экструзии.
    4. Разделите экструдированную липосом объемом 1 мл на три трубки (по 330 мкл на трубку) и разведите каждую с помощью 600 мкл буфера A.
  3. Титрование набухания Triton X-100
    ПРИМЕЧАНИЕ: Triton X-100 — это моющее средство с низкой концентрацией мицелл (CMC), и во многих случаях он оказался наиболееэффективным 21
    ВНИМАНИЕ: Triton X-100 — опасное химическое вещество, которое в первую очередь вызывает серьёзное повреждение глаз, раздражение кожи и вредные последствия при проглатывании. При обращении требуется надлежащее защитное снаряжение (перчатки, защита глаз).
    1. Приготовьте 10% (v/v) Triton X-100, смешав 100 мкл Triton X-100 с 900 мкл ультрачистой водой и инкубировав его в шейкере для полного растворения Triton X-100.
    2. Измерьте поглощение липосом на расстоянии 540 нм (A₅₄₀) с помощью спектрофотометра.
    3. Добавьте 5 мкл аликвотов 10% Triton X-100 последовательно, аккуратно перемешивая после каждого добавления, и измеряйте A₅₄₀. Продолжайте добавлять тритон X-100, пока A₅₄₀ не достигнет максимума, затем добавляйте тритон X-100 ещё 4–5 раз, пока поглощение не снизится примерно до 60% от пикового значения.
    4. Согласно кривой титрации, липосомы набухают, добавляя 35 мкл 10% тритона X-100, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа с мягким перемешиванием.
  4. Восстановление FtsH/LapB в липосомы
    1. Экспрессировать и очищать белки FtsH и LapB, как описаноранее, 18.
    2. Промывайте ~2 г неполярного полистиролового адсорбента (например, Bio-Beads SM-2) один раз 10 объёмами метанола, один раз 10 объёмами этанола и десять раз 10 объёмами сверхчистой воды. Промытый адсорбент храните в буфере A при 4 °C.
    3. Для каждой трубки липосом Triton X-100–набухшие добавьте 3 мкл 500 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), 22,5 мкг FtsH и 22,5 мкг LapB. Отрегулировать общий объём до 1 мл с помощью буфера A и инкубировать при RT 1 час с мягким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение белков к липидам от 1:20 до 1:200 (масса/масса) регулярно применялось при восстановлении протеолипосом21. Здесь используется соотношение 1:100.
    4. Удалять детергентное средство последовательной инкубацией с неполярным полистиролом: 40 мг при RT в течение 0,5 часа, затем 40 мг при RT в течение 1 часа, затем 40 мг при 4 °C ночью и наконец 40 мг при 4 °C в течение 1 часа.
    5. Кратковременно центрифугировать для гранулирования неполярного полистиролового адсорбента при 4 °C (400 × г на 3 секунды). Перенесите супернатант в ультрацентрифугальные трубки. Промой неполярный полистиролный адсорбент с 1 мл буфера A и смешай промывку с супернатантом. Добавьте дополнительный буфер A к итоговому объёму ~6 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для безопасности ультрацентрифугные трубки должны содержать не менее 6 мл жидкости.
    6. Сбалансировать трубки и ультрацентрифугу при 250 000 × г при 4 °C в течение 45 минут в роторе с фиксированным углом (например, MLA-80) до гранулирования протеолипосом.
    7. Отбросьте супернатант и снова суспензуйте гранулу протеолипосомы в 70 мкл буфера А с добавлением 1 мМ TCEP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объём протеолипосомы составляет примерно 100 мкл.
    8. Заморозьте протеолипосомы в жидком азоте и храните при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе протокол можно приостановить до месяца.
  5. SDS-PAGE анализ протеолипосом
    1. Тщательно смешайте протеолипосомы и соедините 5 мкл образца с 5 мкл буфера нагрузки 2× SDS (0,1 м Tris-HCl, pH 6,8, 5% SDS, 20% глицерила, 0,01% бромофенол-синий, 200 мМ DTT).
    2. Загрузить образцы протеолипосомы вместе с 525 нг FtsH (соответствующего 0,06 мкм гексамера FtsH в 20 мкл) на гель SDS-PAGE с концентрацией 4–20%.
    3. Покрасьте гель CBB.
    4. Сканируйте гель и количественно определите интенсивность FtsH для каждого образца. Вычислите объём суспензии протеолипосом, эквивалентный 525 нг FtsH.

3. Деградация LpxC–Atto488 in vitro

  1. Проведение анализов деградации in vitro в реакции 20 мкл, содержащей протеолипосомы FtsH/LapB (соответствующие 0,06 мкм FtsH) и 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 40 мкм LpxC-Atto488 в буфере деградации (50 мМ трис-ацетат, pH 8,0, 10 мМ мг-ацетат, 5 мМ АТФ, 25 мкм Zn-ацетата, 80 мМ NaCl, 1,4 мМ β-меркаптоэтанола).
  2. Для измерения каждой концентрации субстрата подготовьте реакцию 70 мкл.
    1. Возьмите фракцию 20 мкл и закалите её, сразу смешав с 48 мкл 5% трихлоруксусной кислоты (TCA) в микроцентрифугных трубках объёмом 1,5 мл (0 мин). Возьмите вторую и третью дроби и закалите их на 10 и 20 минутах соответственно.
    2. Параллельно подготовьте соответствующие контрольные реакции без протеолипосом, для фонового вычитания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется три повторных измерения для получения надёжных результатов.
      Минимизировать экспозицию света при работе с LpxC–Atto488.
      ВНИМАНИЕ: TCA — это сильно коррозийное химическое вещество, вызывающее сильные ожоги кожи, постоянные повреждения глаз и сильное раздражение дыхательных путей при вдыхании. Обращайтесь с ним с помощью соответствующего средства защиты (перчатки, защита глаз, маска).
  3. Инкубировать образцы при 37 °C в течение 30 минут для осаждения белков, затем центрифугировать при 18 800 × г при комнатной температуре в течение 20 минут.
  4. Нейтрализовать образцы путём переноса 50 мкл супернатанта в пробирку с 60 мкл 500 мМ Tris-HCl, pH 8,8. Хорошо перемешайте и перенесите 100 мкл на чёрную пластину на 96 лунок. Измерять флуоресценцию с помощью пластинчатого считывателя с возбуждением на 498 нм и излучением на 520 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для повышения чувствительности экстракорпорального деградационного анализа субстрат LpxC был маркирован флуоресцентным красителем Atto488. Сукцинимидил-эфирная группа Atto488 эффективно реагирует с первичными аминогруппами LpxC при слабо щелочных условиях. Поскольку Tris-буфер содержит первичные амины, мешающие этой реакции, LpxC, очищенный в Tris-буфере, обменивался в фосфатный буфер с помощью гелевой фильтрации перед маркировкой. Для реакции маркировки использовалось молярное...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Первым критическим шагом этого протокола является маркировка LpxC Atto488. Умеренная маркировка критически важна для точного измерения активности деградации in vitro . Согласно нашим оптимизационным экспериментам, молярное отношение LpxC к Atto488 между 9:1 и 3:1 является оптимальным. Чрезмерное содержание Atto488 приводит к чрезмерной маркировке, что, вероятно, нарушает естественное состояние LpxC. При таких условиях разница в деградации LpxC–Atto488 только на FtsH по сравнению...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Все исследования проводились в Йельском университете. W.M. поддерживается Национальным институтом общих медицинских наук по номерам R01GM137068 и RM1GM149406, а также Фондом семьи Ричарда и Сьюзан Смит через премию Odyssey.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1.5 мл микроцентрифужная пробиркаUSA scientific1415-2500
Поликарбонатная мембрана 200 нмAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEСделанный в домашних условиях
Динатриевая соль аденозин-5'-трифосфата гидратSigmaA26209
Набор для маркировки белков Atto 488Sigma38371
Bio-Beads SM-2Bio-Rad152-8920Неполярный полистироловый адсорбент
Черная 96-лунковая пластинкаCostar3915
Бромофеноловый синийSigma114391
Коомасси Бриллиант Блю R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
ЭтанолSigma459844
Подложка для фильтраAvanti Polar Lipids610014
Стеклянная шприцевая игляAvanti Polar Lipids610017
Стеклянная пробиркаKIMBLE45066-16150
ГлицеринAvantor2136-01
Тетрагидрат ацетата магнияSigma228648
МетанолSigma179337
МикроцентрифугаThermo Fisher Scientific75-002-436
Мини-экструдераAvanti Polar Lipids610000
Ротор MLA-80Beckman367096Ротор с фиксированным углом
Пластиковая пластинка для считыванияTecanInfinite M1000 PRO
POPCAvanti Polar Lipids850457C
Холодильная микроцентрифугаThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Карбонат натрияSigmaS6014
Хлорид натрияSigmaS9888
Дифосфат натрияSigma38400100
Дифосфат натрияSigma567547
Ультразвуковой омекерFisherbrandFB-11201
СпектрофотометрSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Колонка для геля с высокой разрешающей способностью
Ультрацентрифуга настольного типаBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Трихлоруксусная кислотаSigmaT6399
Трис-основаниеSigma252859
Тритон X-100SigmaT8787
Трубки для ультрацентрифугиBeckman355647
Колонка для ультрафильтрацииMilliporeUFC8030
Миксер Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
Двухводный ацетат цинкаSigma379786
β-меркаптоэтанолSigma444203

Ссылки

  1. Sauer, R. T., Baker, T. A. Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction. Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).
  2. Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).
  3. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine. Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).
  4. Gur, E., Sauer, R. T. Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease. Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).
  5. Ogura, T., Wilkinson, A. J. Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function. Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).
  6. Tomoyasu, T., et al. The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression. J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).
  7. Tomoyasu, T., et al. Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).
  8. Ito, K., Akiyama, Y. Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).
  9. Chai-Danino, M., et al. Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH. bioRxiv. , (2023).
  10. Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics. Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).
  11. Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli. J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).
  12. Young, K., et al. The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase. J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).
  13. Ogura, T., et al. Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli. Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).
  14. Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein. J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).
  15. Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).
  16. Nicolaes, V., et al. Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli. J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).
  17. Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).
  18. Shu, S., Mi, W. Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).
  19. Tomoyasu, T., et al. Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32). EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).
  20. Yang, Y. Q., et al. Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH. J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).
  21. Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  22. Asahara, Y., et al. FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues. J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).
  23. Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA). Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Протеаза FtsHадаптор LapBреконструкция в протеолипосомыААА+-протеазафлуоресцентный анализбелковый гомеостазкинетический анализ

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.