Диагностическая эффективность плазмы miR-362-3p в сочетании с доплеровским ультразвуком в диагностике рака молочной железы

Краткое содержание

Уровень диагностирования рака молочной железы относительно низок. Метод четырёхкратной таблицы был использован для анализа диагностической ценности miR-362-3p в сочетании с доплеровским ультразвуком при раке молочной железы. Комбинация доплеровского ультразвукового исследования и miR-362-3p эффективно повысило диагностическую эффективность, обеспечивая перспективный метод диагностики рака молочной железы.

Аннотация

Рак молочной железы — вторая по распространённости злокачественная опухоль в мире, серьёзно угрожая жизни женщин и возлагающая огромную экономическую нагрузку. Цель данного исследования — изучить значение miR-362-3p в сочетании с доплеровским ультразвуком в диагностике рака молочной железы. В это исследование было включено всего 182 пациента с раком молочной железы и 147 пациентов с доброкачественными заболеваниями молочной железы. Уровни miR-362-3p в плазме пациентов измерялись с помощью квантитативной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR). Тест хи-квадрат использовался для анализа различий в параметрах доплеровского ультразвука между двумя группами пациентов. Для оценки диагностической эффективности miR-362-3p, индекса сопротивления (RI) и пульсативности (PI) использовалась кривая оператора приемника (ROC). Диагностическая эффективность допплеровского ультразвука в сочетании с плазменным miR-362-3p при раке молочной железы была проанализирована с помощью четырёхкратного метода. Уровни miR-362-3p были заметно снижены у пациенток с раком молочной железы. Имелись значительные различия в параметрах двумерного ультразвука. miR-362-3p, RI и PI имеют диагностическую ценность для рака молочной железы. Совокупная диагностическая ценность трёх факторов была выше. Ультразвук в сочетании с miR-362-3p значительно повысил чувствительность, точность и отрицательную прогностическую ценность при диагностике рака молочной железы. Допплеровское ультразвуковое исследование в сочетании с miR-362-3p может повысить диагностическую эффективность рака молочной железы, что может стать неинвазивным и потенциально вспомогательным диагностическим инструментом при раке молочной железы.

Введение

Согласно статистике Международного агентства по изучению рака, уровень заболеваемости раком груди превысил уровень рака легких в 2020^{году 1}. Рак молочной железы — это злокачественная опухоль, которая часто возникает и является одной из ведущих причин смерти, связанной с раком, у женщин по всему^{миру. 1}. Своевременная диагностика рака молочной железы полезна для прогнозирования пациентов. Биопсия ткани — это золотой стандарт диагностики рака молочной железы. Однако это тип инвазивной диагностики, и он не применяется к пациентам с ранней стадией рака^{молочной железы 2}.

Доплеровское ультразвуковое исследование — это широко используемая методика визуализации для скрининга рака молочной железы и вспомогательной^{диагностики 3}. Допплеровское ультразвуковое исследование позволяет точно оценить размер узлов, сигналы кровотока и статус метастазирования лимфатических^{узлов 4}. Доплеровское ультразвуковое исследование молочной железы, благодаря своим преимуществам, таким как отсутствие ионизирующего излучения, безопасность и неинвазивность, а также возможности повторяющихся исследований, стало одним из самых широко используемых методов визуализации в скрининге и диагностике рака^{молочной железы 5}. Однако доплеровское ультразвуковое исследование склонно к нарушениям со стороны тканевого фона при выявлении рака молочной железы с низкой плотностью или малым объёмом, что приводит к значительному снижению диагностической чувствительности и затрудняет удовлетворение клинических потребностей для ранней^{диагностики 6}. Поэтому необходимо разработать биомаркеры плазмы, способные преодолеть ограничения допплеровской ультразвуковой технологии. Если сочетание этих двух методов поможет повысить чувствительность к диагностике рака молочной железы, это будет иметь значительную клиническую ценность и практическую значимость.

МикроРНК (миРНК) — это класс некодирующих РНК молекул длиной примерно от 20 до 24 нуклеотидов ^7,8. Одной из особенностей миРНК является высокая степень сохранения в ходе эволюционного процесса. МиРНК имеют широкое тканевое распределение, которое не только специфически экспрессируется в различных клетках человеческих тканей, но и может стабильно присутствовать в различных жидкостях организма, таких как кровь и^слюна. Эти характеристики распределения обеспечивают преимущества для разработки неинвазивных диагностических маркеров. Функционально миРНК разрушают мРНК путём комплементарного связывания с 3' нетранслированными областями (UTR^)10,11, участвуя в ряде ключевых патологических и физиологических процессов, таких как клеточные воспалительные реакции, окисляющий стресс, апоптоз, а также пролиферация и дифференцировка¹². Множество исследований подтвердили, что аномальные изменения профилей экспрессии миРНК тесно связаны с возникновением и развитием рака молочной^{железы 13,14}. Дисрегуляция экспрессии миРНК может способствовать злокачественной трансформации эпителиальных клеток молочной железы, регулируя сети экспрессии онкогенов или генов-супрессоров опухолей. miR-362-3p — типичный фактор, который подавляет прогрессирование опухоли. Несколько отчётов показали, что miR-362-3p подавляет прогрессирование рака молочной^железы 15,16,17. Ассири и др. сообщили, что низкая экспрессия miR-362-3p тесно связана с плохим прогнозом и более короткой общей выживаемостью у пациенток с раком^{молочной железы 15}. Механистически miR-362-3p оказывал противоопухолевой эффект при раке молочной железы, нацеливаясь на DEAD-box helicase 5 (DDX5) для стимулирования пролиферации, инвазии и миграции раковых^{клеток 16}. Кроме того, команда под руководством Канга также обнаружила, что miR-362-3p значительно понижается в тканях рака молочной железы, и таргетная регуляция экспрессии miR-362-3p может служить новой потенциальной терапевтической стратегией для лечения рака^{молочной железы 17}. Однако нет сообщений о том, может ли miR-362-3p служить ранним диагностическим маркером рака молочной железы.

В этом исследовании измерялся уровень экспрессии miR-362-3p в плазме и одновременно проанализировали основные параметры изображения допплеровского ультразвука у пациенток с раком молочной железы. Исследование тщательно исследовало совокупное значение применения уровней экспрессии miR-362-3p в плазме и параметров доплеровского ультразвукового изображения, а также ясно продемонстрировало эффективность этого комбинированного диагностического подхода при скрининге рака молочной железы и в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных заболеваний молочной железы.

Протокол

Это исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Одобрение было получено Этическим комитетом аффилированной больницы Второго медицинского университета Шаньдуна, Школы клинической медицины Шаньдунского второго медицинского университета (номер одобрения: wyfy-2023-ky-124). Было получено информированное согласие от всех участников исследования. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Экспериментальные субъекты

Расчёт размера выборки проводился с помощью программного обеспечения G*Power 3.1 на основе независимого t-теста выборки. Были установлены средний размер эффекта (коэффициент Коэна = 0,5, широко используемый в клинических наблюдательных исследованиях), двусторонний тест α = 0,05 и степень (1 − β) = 0,95. Расчёт показал, что в каждой группе требуется не менее 105 участников. Наконец, были включены 182 пациентки с раком молочной железы и 147 пациентов с доброкачественными поражениями молочной железы, а фактический размер выборки обеих групп значительно превысил минимально требуемый размер выборки, обеспечивая достаточную статистическую мощь для подтверждения выводов исследования и контролируя риск ошибки типа II в приемлемом диапазоне. Все участники были строго и последовательно зачислены в соответствии с унифицированными критериями включения и исключения.

С 2023 по 2024 год все пациенты были зачислены в Аффилированную больницу Второго медицинского университета Шаньдуна, Школу клинической медицины Второго медицинского университета Шаньдуна. Доброкачественные поражения: Незлокачественные поражения были подтверждены патологией. Рак молочной железы: злокачественные опухоли были подтверждены патологическим методом. После ночного голодания у всех участников были собраны образцы венозной крови. Венозные образцы крови были антикоагулянты и центрифугированы для разделения плазмы, строго соблюдая стандартные процедуры, а затем переведены до −80 °C для длительного хранения, что впоследствии использовалось для экстракции миРНК. Все образцы плазмы строго ограничивались не более чем двумя циклами заморозки и оттаивания перед экстракцией РНК, чтобы предотвратить деградацию миРНК. Все пациенты были полностью проинформированы о протоколе исследования и добровольно предоставили письменное информированное согласие перед регистрацией.

Критерии включения пациентов с раком молочной железы: (1) Пациенты с патологически подтверждённым первичным раком молочной железы. (2) Нет хирургического вмешательства до зачисления. (3) Не проходил лучевую или химиотерапию до взятия образца.

Критерии включения для пациенток с доброкачественными заболеваниями молочной железы: (1) Патологически подтверждённые доброкачественные поражения молочной железы. (2) Без каких-либо других системных злокачественных опухолей или предраковых поражений. (3) Не беременны и не кормят. (4) Нет тяжёлой острой инфекции или хронического воспалительного заболевания.

Критерии исключения для пациенток с раком молочной железы и доброкачественными поражениями молочной железы: (1) Тяжёлая инфекция молочной железы или острое критическое заболевание. (2) Тяжёлая дисфункция печени или почек, либо аутоиммунное заболевание. (3) Пациенты, получившие гормональную терапию в течение 6 месяцев.

2. Доплеровское ультразвуковое исследование

Двусторонние груди пациентки были тщательно обследованы в четырёх квадрантах с помощью доплеровского УЗИ. Для записи особенностей поражения использовалось двухмерное ультразвуковое сканирование, включая границы, форму, внутреннее эхо, задние эховолны и соотношение сторон поражения. Для оценки параметров кровотока в поражении применялась цветная допплеровская визуализация, включая индекс резистентности (RI), индекс пульсативности (PI) и максимальную скорость кровотока (_{V max}). Сигналы кровотока были оценены согласно ранее опубликованной системе^{классификации 18}: Степень 0: Сигнал кровотока отсутствует; Степень I: минимальный сигнал кровотока; Степень II: длина сигнала кровотока превышает половину диаметра поражения; Степень III: обильный сигнал кровотока.

3. Положительное определение для ультразвуковой диагностики рака молочной железы

К ним относились: (1) неоднозначные границы; (2) неправильная форма; (3) Неравномерное внутреннее эхо; (4) Ослабленное заднее эхо; (5) Соотношение сторон >1; (6) RI > 0,70; (7) PI > 1,50; (8) Максимальная скорость кровотока (Vmax)> 18,00 см/с; (9) Сигнал кровотока ≥ II степени. Любое поражение, соответствующее какому-либо из вышеуказанных подозрительных критериев, классифицируется как ультразвуковое положительное, а те, что не имеют подозрительных признаков, — как ультразвуково отрицательные.

4. Квантитативная полимеразная цепная реакция в реальном времени флуоресценции (RT-qPCR)

Плазменные миРНК экстракцировались с помощью специализированного набора для экстракции миРНК. Успешно экстракцированные образцы РНК использовались для синтеза кДНК с помощью специализированных наборов для обратной транскрипции miRNA. Условия реакции обратной транскрипции для miR-362-3p: общий объём этой реакции составил 20 мкл. Процедура ПЦР-реакции была следующей: (1) Смесь инкубировала при 37 °C в течение 15 минут, (2) Обратная транскрипция проводилась в течение 50 минут при 42 °C, (3) Фермент был инактивирован в течение 5 минут при 95 °C. Продукт хранился при 4 °C. Условия реакции qPCR: Общий объём реакционной системы составлял 20 мкл. Условия амплификации выполнялись следующим образом: (1) кДНК была предденатурирована, а ДНК-полимераза активировалась при 95 °C в течение 2 минут. (2) Цепи ДНК отжигают и продолжаются 30 с при 60 °C. Два предыдущих шага были выполнены в общей сложности 40 циклов. Относительная экспрессия генов рассчитывалась по формуле 2^-(ΔΔCt). Относительная экспрессия miR-362-3p была откалибрована U6. Для обоснования использования U6 в качестве эндогенного контроля стабильность U6 оценивалась с помощью алгоритма BestKeeper в плазменной когорте. Коэффициент вариации (CV) значений U6 Ct во всех образцах составлял менее 2%, что свидетельствует о высокой стабильности экспрессии. Поэтому U6 был валидирован и выбран в качестве эталонного гена для нормализации экспрессии miR-362-3p в данном исследовании. Последовательность капсюля обеспечивалась набором. Последовательности праймеров были следующими:

miR-362-3p: GCCGAGAACACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCAGCACATATACT.

5. Кривая рабочей характеристики приёмника (ROC)

Индекс Юдена использовался для определения оптимального порога для miR-362-3p при диагностике рака молочной железы путём расчёта значений чувствительности и специфичности кривой ROC. Комбинированная диагностическая модель была построена с использованием бинарной логистической регрессии в SPSS, при этом miR-362-3p, RI и PI были введены как независимые переменные. Переменные были включены методом Enter для генерации предсказанного вероятностного значения комбинированного диагноза для каждого участника. Формула вероятности предсказания (PRE): . Кривые ROC были построены на основе PRE. Тест Делонга использовался для сравнения различий в значениях Area Under Curve (AUC) между различными кривыми ROC.

6. Определение параметров исхода

Основным параметром исхода была общая диагностическая эффективность комбинированной модели плазмы miR-362-3p и допплеровского ультразвукового исследования рака молочной железы, при этом патологическая диагностика была золотым стандартом. Вторичные параметры исхода включали диагностические результаты только доплеровского ультразвука и только плазменного miR-362-3p.

7. Статистика данных

Уровни экспрессии miR-362-3p и кривые ROC у двух групп пациентов были проанализированы с помощью статистических и графических программ. t-тест использовался для сравнения различий в непрерывных переменных между двумя группами. Тест хи-квадрата и метод четырёхкратной таблицы были проанализированы с использованием SPSS 26.0. Тест хи-квадрата использовался для оценки статистических различий категориальных переменных; двухиндексная комбинация (miR-362-3p + допплеровское ультразвуковое исследование) рассматривалась как основной анализ, представляя собой рутинный качественный диагностический вывод в клинической практике; если из классификации Breast Imaging Reporting and Data System (BI-RADS) были выявлены подозрительные признаки, поражение определялось как положительное; метод четырёхкратной таблицы был использован для расчёта специфических, положительных прогностических значений, отрицательных прогностических значений и точности комбинированного диагноза допплеровского ультразвука и miR-362-3p. Диагностические результаты по доплеровскому УЗИ и miR-362-3p включали истинно положительный (a), ложноположительный (b), ложноотрицательный (c) и истинно отрицательный (d). Формула вычисления: чувствительность = a / (a + c); Специфичность = d / (d + b); Положительное предсказательное значение = a / (a + b); Отрицательная предсказательная ценность = d / (d + c); Точность = (a + d) / (a + b + c + d). Три диагностических метода (miR-362-3p, УЗИ и комбинированная диагностика) проводились с использованием теста Pearson χ² для таблиц резервных ситуаций R×C. P < 0,05 считался статистически значимым.

Результаты

Уровень miR-362-3p был значительно снижен у пациенток с раком молочной железы

Сравнивались клинические исходные данные и патологические характеристики 182 пациенток с раком молочной железы и 147 пациенток с доброкачественными поражениями молочной железы. Подробные данные были обобщены в Таблице 1. RT-qPCR использовался для измерения уровней плазмы miR-362-3p у двух групп пациентов. Результаты показали, что экспрессия циркулиру...

Обсуждение

Рак молочной железы — один из самых распространённых видов злокачественных опухолей, став серьёзной проблемой общественного здравоохранения, угрожающей здоровью^{человека 19,20}. Высокий уровень заболеваемости и смертности не только причиняет серьёзную психологическую травму семьям пациентов, но и накладывает огромную нагрузку на общество и экономику. Большинство пациенток с раком молочной железы уже имели локальное вторжение или да...

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	USA	367861	Для сбора венозной крови и приготовления плазмы для анализа miRNA.
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855195	96-лунный 6-канальный флуоресцентный квантитативный ПЦР-инструмент, использующий оптическое волокно и изображение охлажденного CCD, с синхронным сбором флуоресценции в каждой лунке без задержки. Динамичный диапазон достигает 10 порядков, и он совместим как с обычным qPCR, так и с анализом плавки высокого разрешения (HRM). Программное обеспечение поддерживает экспорт в формате RDML, совместимо как с исследованиями, так и с клиническими тестированиями, и широко используется в экспериментах, таких как количественное определение экспрессии генов, типирование SNP и анализ метилирования.
Kirgen 0.1 mL PCR Tubes (or 8-Strip PCR Tubes), Sterile	Shanghai, China	KG0811	Используются для приготовления и проведения реакций qPCR.
Kirgen 1.5 mL Microcentrifuge Tubes, Sterile	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	Используются для хранения образцов, приготовления реагентов и центрифугирования при извлечении miRNA и обратной транскрипции.
miRcute miRNA Isolation Kit (Spin Column)	Beijing, China	DP501	Для изоляции и очистки общей РНК, включая miRNA, из образцов плазмы человека, с использованием технологии на основе столбиковых колонок.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	Beijing, China	KR211	Для обратной транскрипции очищенного miRNA в одноцепочечную комплементарную ДНК по методу поли(А)-хвостования.
miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	Для количественного реального времени ПЦР-детекции miRNA с использованием химии на основе SYBR Green I.
Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, White	Mannheim, Germany	4729692001	Используется для количественных реакций ПЦР в реальном времени на инструменте Roche LightCycler 480.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Linear Array Probe	Siemens Healthineers	10041226	Высокочастотная линейная антенная решетка с частотным диапазоном 5–14 МГц, специально разработанная для исследования поверхностных органов, таких как молочные железы и щитовидная железа. Обладает высоким разрешением и отличным контрастом тканей, поддерживает эластографию и автоматическое сканирование объема молочной железы.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultrasound System	Siemens Healthineers	/	Система ультразвукового допплерографического диагностики цветного режима поддерживает функции реального времени 3D/4D изображения и исследования эластичности, и широко используется в различных отделениях, таких как абдоминальное, кардиологическое, гинекологическое и акушерское, а также в исследовании молочных желез.
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	96-канальный градиентный ПЦР-инструмент, поддерживает оптимизацию градиентной температуры; обладает высокой точностью управления температурой; используется для синтеза комплементарной ДНК и обычного ПЦР-усиления.

```