Разработка протокола реконструкции везикул COPII без клеток для исследования сортировки STING в системе на основе клеток HEK-293

Краткое содержание

Этот протокол описывает оптимизированную систему без клеток для восстановления включения STING в везикулы COPII, позволяющую контролируемый биохимический анализ сортировки груза во время экспорта ER.

Аннотация

Путь cGAS–STING является центральным компонентом врождённого иммунитета. После активации белок STING, присутствующий в эндоплазматическом ретикуле (ER), упаковывается в везикулы COPII и транспортируется в аппарат Гольджи для запуска сигнальной передачи вниз. Несмотря на важность этого процесса, молекулярные механизмы, управляющие сортировкой STING в везикулы COPII, остаются неполностью изучены. Здесь представлен оптимизированный рабочий процесс для in vitro восстановления везикул COPII с целью облегчения контролируемого анализа выбора груза. Описывается масштабируемый метод получения высококонцентрационного цитизоля (30–40 мг/мл) из суспензионных клеток HEK-293F, в сочетании с простой процедурой получения полупроницаемых HEK-293T-клеток в качестве определённого источника мембраны. По сравнению с традиционными системами на базе клеточных клеток, этот подход улучшает масштабируемость, снижает стоимость и повышает воспроизводимость. Используя STING в качестве модельного груза, запорождение пузырьков COPII и включение груза подтверждаются с помощью Western blot analysis, с базальной эффективностью упаковки примерно 20% при определённых условиях. Эта система позволяет контролируемо манипулировать биохимическими параметрами, включая стимуляцию нуклеотидами, для оценки их влияния на включение груза. Этот протокол предоставляет надёжную и адаптируемую платформу для исследования сортировки грузов, опосредованного COPII, и может быть расширен для изучения дополнительных трансмембранных белков и регуляторных факторов, участвующих в экспорте ЭР.

Введение

Сигнальный путь cGAS-STING служит фундаментальным механизмом врождённой иммунной системы, определяя цитозольную двухцепочечную ДНК (dsDNA) для запуска противовирусного ответа. При обнаружении dsDNA фермент cGAS производит циклический динуклеотид cGAMP, который действует как второй мессенджер, связывающийся с^{STING 1,2}. Важно, что STING находится в виде неактивного димера в эндоплазматическом ретикуле (ЭР) при стационарных^{условиях 3}. Его активация требует быстрой, строго регулируемой транслокации из отделения неотложной помощи в аппарат Гольджи. Именно на Гольджи STING привлекает и активирует нижние по течению киназы TBK1 и IRF3, что приводит к образованию интерферонов типа I и провоспалительных^{цитокинов 4}.

Транспорт STING осуществляется везикулами с покрытием COPII — универсальными средствами экспорта белка из^ER-5. Сборка слоя COPII — включающая малую GTPазу Sar1, внутренний слой Sec23/24 и внешний слой Sec13/31 — отвечает как за деформацию мембраны ER в везикулы, так и за селективное привлечение^{груза 6,7}. Sec22b сортируется в везикулы COPII через структурный эпитоп, признанный комплексом Sec23/24^{COPII 8}. Другие грузы включают семейство p24 и маркер ERGIC ERGIC-53, оба из которых зависят от C-концевого дигидрофобного φC мотива для^{сортировки 9}. В отличие от этого, некоторые белки, закреплённые к ER, такие как рибофорин I (RPN1), остаются ограниченными в ER и служат маркерами целостных структур ER, поскольку они не транспортируются через везикулы^{COPII 10}. В результате в экспериментах по восстановлению везикул COPII без клеток Sec22b и p24 часто рассматриваются как грузы COPII, а рибофорин служит маркером для мониторинга загрязнения ER в препаратах везикул. Хотя общий механизм транспортировки COPII хорошо изучен, конкретные молекулярные сигналы, запускающие селективное секвестрирование активированного STING в эти везикулы, остаются неуловимыми. Понимание этих механизмов сортировки крайне важно, поскольку нарушение регуляции транспорта STING связано с различными аутоиммунными и аутовоспалительными заболеваниями, такими как васкулопатия, ассоциированная с STING, с началом в младенчестве (SAVI) и синдром^{COPA 11}. Однако изучение этих временных и высокодинамичных событий в целостных клетках остаётся технически сложным.

Для решения этих проблем была разработана оптимизированная система восстановления без клеток для изучения молекулярных потребностей сортировки груза, опосредованного COPII. Хотя экстракорпоральные тесты для почков давно являются основой клеточной^{биологии 12}, их широкое распространение часто ограничено высокой стоимостью и сложностью подготовки высококачественных компонентов. В этом исследовании внедряется упрощённый рабочий процесс, использующий суспензионные клетки HEK-293F как экономичный источник активного цитозолея и полупроницаемых клеток HEK-293T в качестве надёжного донора мембраны. Общий рабочий процесс безклеточной системы восстановления везикул COPII иллюстрируется на рисунке 1. В этой системе Sec22b использовался как положительный контроль для подтверждения включения груза в везикулы, а RPN1 — как отрицательный контроль для мониторинга и исключения загрязнения мембраной ER. Используя STING как доказательство концепции, это исследование показало, что система эффективно моделирует основные биохимические аспекты сортировки STING. Эта платформа предоставила универсальный и масштабируемый инструмент для идентификации цитозольных факторов и мембранных сигналов, управляющих сортировкой STING, с потенциальным применением для изучения широкого спектра других везикулярных транспортных путей.

Протокол

Клеточные линии HEK-293F (RRID: CVCL_6642) и HEK-293T (RRID: CVCL_0063) были получены в Центре клеточных ресурсов при Медицинском колледже Пекинского союза. Обе клеточные линии были подтверждены с помощью профилирования короткого тандемного повтора (STR) и подтверждены как свободные от загрязнения микоплазмой. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

В этом исследовании не участвовали ни люди, ни позвоночные животные. Поэтому этическое одобрение не требовалось. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности.

1. Подготовка цитозоля клетки HEK-293F

1. Семенные клетки HEK-293F с плотностью 1 ×^{10 6} клеток/мл в определённой 100 мл среды для культуры млекопитающих с добавлением 1% пенициллин-стрептомицина. Культивируйте клетки в конической колбе объёмом 500 мл.
2. Инкубировать суспензионную культуру при 37 °C с 5% CO₂ в встряхивающем инкубаторе в течение 60 часов.
3. Собирайте клетки центрифугированием при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C. Определите общее количество ячеек с помощью автоматического счётчика ячеек.
4. Промыйте клеточную гранулу 50 мл солевой раствором, буферированной фосфатом (PBS). Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
5. Суспензировать клеточную гранулу в равном объёме ледяного буфера B88 (20 мМ HEPES, pH 7,3; 250 мМ сорбитол; 150 мМ ацетата калия; 5 мМ магнийацета).
6. Лизируйте клетки на льду, пропуская подвеску через шприц объёмом 5 мл с иглой 22 калибра более 100 ударов.
7. Исследуйте лизис клеток с помощью световой микроскопии. Удалить клеточный мусор центрифугой при 20 000 × г в течение 10 минут при 4 °C.
8. Перенесите супернатант в ультрацентрифугальные трубки. Центрифуга при 100 000 × г в течение 1 часа при 4 °C.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что трубки ультрацентрифуг правильно сбалансированы, чтобы предотвратить повреждения оборудования и опасность безопасности.
9. Соберите очищенный супернатант. Сконцентрируйте образец с помощью ультрафильтрационного устройства с отсечением молекулярной массы (MWCO) мощностью 3 кДа при температуре 4 000 × г при 4 °C.
10. Измеряйте концентрацию белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA). Отрегулируйте концентрацию до 30–40 мг/мл.
    ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с жидким азотом с соответствующими защитными средствами, чтобы избежать криогенных повреждений.
11. Аликот цитозоль. Заморозьте аликвоты в жидком азоте и храните при −80 °C (рисунок 2A)
    ВНИМАНИЕ: Избегайте более двух циклов заморозки и оттаивания. Храните аликвоты при −80 °C до 6 месяцев.

2. Подготовка полупроницаемых HEK-293T-клеток

1. Пластинчатые клетки HEK-293T, экспрессирующие полноразмерный человеческий STING с плотностью 3 ×^{10 6} клеток на 15-сантиметровую чашку в 15 мл DMEM, дополненных 10% плодовой бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином. Инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48 часов.
2. Собирайте клетки примерно при 60% совпадения.
3. Аспирируйте среду и дважды промывайте клетки 10 мл ледяного PBS.
4. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина–ЭДТА. Инкубировать при комнатной температуре 2–3 минуты, чтобы отделить клетки.
5. Добавьте 200 мкл ингибитора трипсина сои (1 мг/мл), чтобы остановить трипсинизацию. Ресуспензировать клетки в ледяно-холодном буфере KHM объёмом 10 мл (20 мМ HEPES, pH 7,2; 110 мМ ацетата калия; 2 мМ ацетата магния).
6. Пульируйте клетки центрифугой при 250 × г в течение 3 минут. Отбросьте супернатант.
   ВНИМАНИЕ: Дигитонин токсичен. Держите его в выхлопчике с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
7. Суспензировать ячейки в ледяной буфере KHM 6 мл. Добавьте 6 мкл наложного раствора дигитонинов (40 мг/мл в DMSO).
8. Аккуратно смешивайте инверсией. Инкубировать на льду 5 минут.
9. Добавьте буфер 8 мл KHM для разведения дигитонина. Центрифуга при 250 × г в течение 3 минут для сбора проницаемых клеток.
10. Суспензировать гранулу в ледяной буфере HEPES объемом 14 мл (50 мМ HEPES, pH 7,3; 90 мМ ацетата калия). Инкубировать на льду в течение 10 минут.
11. Центрифуга при 250 × г в течение 3 минут. Восстановите гранулу в 1 мл ледяного KHM· Буфер Cl (20 мМ HEPES, pH 7,3; 110 мМ KCl; 2 мМ MgCl₂).
12. Центрифуга при 10 000 × г на 15 секунд. Отбросьте супернатант.
13. Подвесьте гранулу в 50 мкл KHM· Буфер Cl. Измерьте концентрацию белка с помощью BCA-анализа и отрегулируйте до 5–7 мг/мл.

3. Эксперимент по восстановлению пузырьков COPII без клеток

1. Подготовьте все реагенты, указанные в Таблице материалов. Аликвот и храните при −80 °C.
2. Приготовьте реакционную смесь с концентрацией 50 мкл, содержащую 110 мМ KCl, 20 мМ HEPES (pH 7,2), 2 мМ MgCl₂, коктейль ингибитора протеазы (1×), 0,2 мМ GTP и систему регенерации АТФ (40 мМ креатинфосфат, 0,2 мг/мл креатинфосфокиназы, 1 мМ АТФ).
3. Добавьте cGAMP до конечной концентрации 10 мкм. Инкубуйте реакцию при комнатной температуре в течение 15 минут.
4. Добавьте 50 мкг полупроницаемых HEK-293T-клеток. Аккуратно перемешивайте.
5. Добавьте 80 мкг цитозоля HEK-293F для начала формирования пузырьков. Инкубировать при 37 °C в течение 45 минут.
6. Поместите реакцию на лёд, чтобы прекратить почки. Центрифуга при 12 000 × г в течение 20 минут при 4 °C.
7. Соберите супернатант, содержащий везикулы. Сохраняйте гранулы, содержащие органеллы.
8. Ультрацентрифугировать супернатант при 100 000 × г в течение 1 часа при 4 °C. Суспензировать пеллет везикулы в буфере с нагрузкой белка 30 мкл.
9. Проба тепла при 95 °C в течение 5 минут. Центрифугите при 20 000 × г в течение 5 минут для удаления осадков.
10. Выполните SDS-PAGE и переносите белки на мембраны PVDF. Зонд с антителами против Sec22b, STING и RPN1.

Результаты

Во время приготовления цитозля HEK-293F были оценены два параметра для оценки качества цитозоля. Клетки HEK-293F культивировались с высокой плотностью, давая цитозольные экстракты с высокой концентрацией белка. Кроме того, степень разрушения клеток после лизиса на основе шприцев оценивалась световой микроскопией, что подтверждало эффективный лизис клеток при применяемых условиях (рисунок 2B).

Для получения полупроницаемых клеток H...

Обсуждение

Восстановление ключевых биохимических реакций in vitro заложило основу для бесклеточных систем, которые сыграли ключевую роль во многих знаковых открытиях. Среди них — идентификация cGAS как цитозольного ДНК-сенсора^14,15, выяснение роли цитохрома c в апоптозе и открытие первой гистондеметилазы JHDM1^16,17. Такие определённые биохимические подходы особенно эффектив...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стерильные шприцы объемом 5 мл	WEGO	V526273	Используется для механического лизиса ячеек
Аденозин 5′-трифосфат (АТФ)	MCE	HY-B2176	запас 100 мМ в воде, pH 7,3, хранится в и минус; 80 градусов; C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Используется для создания концептуальных иллюстраций и схем
Система регенерации АТФ (10 и более раз;)	—	—	Смесь, регенерирующая энергию, содержащая креатинфосфат, креатинкиназу и АТФ
Набор для анализа белков BCA	Термо Фишер	23227	Колориметрический белковый анализ
BioRender	BioRender	SCR_018361	Используется для создания концептуальных иллюстраций и схем
BSA	Биоригин	BN20815	Блокирующий реагент
Инкубатор с встряхиванием углекислого газа	ЧжиЧу	ZCZY-CS8	Поддерживает температуру, CO2 и перемешивание для культуры суспензии
CO2 инкубатор	Термо Фишер	3110	Поддерживает температуру и CO2 для прикреплённой культуры
Обычный микроскоп	Олимп	CX43	Используется для оценки лизиса клетки и морфологии
Креатинкиназа	Рош	CKRO	Запас 20 мг/мл в буфере, хранится при и минусе; 80 градусов; C
Креатинфосфат	Рош	CRPHO-RO	Компонент системы регенерации АТФ
Настольная центрифуга	Эппендорф	5810R	Используется для центрифугирования на низких скоростях
Дигитонин	Sigma	D5628	Запас 40 мг/мл в ДМСО, хранится в и минус; 20 и °; C
DMEM	Корнинг	10-013-CMR	Среда роста для клеток HEK-293T
D-Сорбитол	Сангон	A100691	1 м запасного раствора в воде, хранится при температуре 4 градуса; C
Реагент для обнаружения ECL	Биоригин	BN16009	Хемилюминесцентный субстрат
Электрофорезный резервуар	Био-Рад	1658001	Оборудование для SDS-PAGE
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)	Корнинг	35-015-CV	Сывороточная добавка
Ротор с фиксированным углом (TFT 80.2)	Термо Фишер	54456	Ротор для ультрацентрифугирования
Ячейки FreeStyle 293-F	Термо Фишер	R79007	Используется для приготовления цитозоля
Козла против мышей IgG (H+L)	Инвитроген	31430	Вторичные антитела, конъюгированные с HRP
Козла против кроликов IgG (H+L)	Инвитроген	31460	Вторичные антитела, конъюгированные с HRP
GraphPad Prism	Программное обеспечение GraphPad	SCR_002798	Используется для проведения статистического анализа (односторонний ANOVA) и построения количественной столбчатой диаграммы на рисунке 4D.
Гуанозин 5&просто;-трифосфат (ГТФ)	MCE	HY-113225	10 мМ запаса в воде, pH 7,3, хранится при и минус; 80 градусов; C
Клетки HEK-293T, экспрессирующие человеческое STING	—	—	Генерируется внутри компании; используется как источник мембраны
Буфер HEPES (1 М, pH 7,3)	Beyotime	C0215	Буферный компонент для приготовления раствора
Система визуализации	Био-Рад	12003153	Используется для обнаружения сигналов
Тетрагидрат ацетата магния	Hampton Research	HR2-561	Буферный компонент для подготовки B88
Гексагидрат хлорида магния	Hampton Research	HR2-559	Компонент буфера
Микроцентрифуга	Эппендорф	5420R	Используется для среднескоростной центрифугирования
Микроцентрифуга	Эппендорф	5420	Используется для рутинной центрифугирования
NanoDrop спектрофотометр	Термо Фишер	840-317400	Используется для количественной оценки белков
Носитель OPM-CD Trans293	OPM	P82019	Среда без сыворотки для культуры подвески HEK-293F
Penicillin– стрептомицин (100 и больше раз;)	Servicebio	G4003	Антибиотик для культивирования клеток
Фенилметилсульфонилфторид (ПМСФ)	Сангон	A610425	Ингибитор протеазы
Ингибиторы фосфатазы	Lablead	C0104	Предотвращение дефосфорилирования белков
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)	Servicebio	G4202	Буфер для промывки ячеек
Ацетат калия	Sigma	236497	1 м запасного раствора в воде, хранится при температуре 4 градуса; C
Источник питания	Био-Рад	1645052	Обеспечивает напряжение для электрофореза
Коктейль с ингибиторами протеаз, без ЭДТА	Рош	4693132001	Широкочастотная смесь ингибиторов протеазы
Мембрана PVDF	Миллипор	ISEQ00010	Мембрана для западного блоттинга
Антитело к RPN1 (кролик mAb)	Abcam	AB197888	Маркер неотложной помощи
SDS-PAGE гель (4– 20%)	—	—	Используется для разделения белков
Буфер загрузки SDS-PAGE (5 и раз;)	Solarbio	P1040	Буфер для подготовки образцов белка
Антитело Sec22b (кролик mAb)	Abcam	ab181076	Маркер COPII
Ингибитор соевого трипсина (SBTI)	Sigma	T9128	Запас 1 мг/мл в PBS, хранится в и минус; 20 и °; C
Антитела к STING (кролик mAb)	CST	13647	Первичное антитело
Буфер TBST	Servicebio	G0004	Буфер для промывания для иммуноблотинга
Термический циклер	Био-Рад	186-1096	Используется для нагрева и инкубации
Термостатическая металлическая ванна	DLAB	5062102100	Поддерживает постоянную температуру
Трансферная ячейка	Био-Рад	1703930	Используется для переноса белков
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Servicebio	G4011	Используется для отсоединения клеток
Ультрацентрифуга	Термо Фишер	75000100	Используется для высокоскоростной центрифугирования
Ультрацентрифугные трубки (2 мл)	Термо Фишер	54460	Трубки, совместимые с ультрацентрифугой
Ультрафильтрационная трубка (4 мл, 10 кДа MWCO)	Миллипор	UFC8010	Используется для концентрации цитизоля