Иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения очагов ядра RAD51 как маркера гомологичной рекомбинационной рекомбинации в клетках рака яичников

Краткое содержание

Ядерные очаги RAD51 являются маркером активности гомологичной рекомбинации (HR). В этой рукописи описывается простой метод иммунофлуоресценции для обнаружения этих очагов в раковых клетках, позволяющий оценить функцию HR и поддерживать доклинические исследования реакций на ДНК-повреждающие агенты.

Аннотация

RAD51 является центральным белком в пути гомологичной рекомбинации (HR) и необходим для точного восстановления разрывов двойной цепочки ДНК (DSB). После образования DSB резекция конца ДНК генерирует моноцепочечные субстраты, которые способствуют набору и сборке нуклеопротеиновых филаментов RAD51 в местах повреждения. Этот процесс приводит к формированию дискретных ядерных очагов RAD51, которые служат широко признанным функциональным показателем HR-активности и суррогатным маркером компетентности HR. Поскольку дефекты HR часто встречаются при ряде злокачественных опухолей, особенно при раке яичников и молочной железы, оценка образования очагов RAD51 стала важным подходом для оценки способности к восстановлению ДНК и прогнозирования реакции на терапию, повреждающие ДНК, включая платиновые соединения и ингибиторы поли(ADP-рибоза)полимеразы (PARP), эффективность которых сильно зависит от статуса восстановления HR. В этой рукописи описывается простой, надёжный и воспроизводимый иммунофлуоресцентный протокол для обнаружения и количественной оценки ядерных очагов RAD51 в культивируемых клетках рака яичников. Метод включает индукцию повреждения ДНК с помощью ионизирующего излучения (ИК), затем фиксацию, иммунное окрашивание антителами против RAD51 и γH2AX, конфокальную микроскопию и ручной количественный анализ ко-локализованных фокусов RAD51/γH2AX. Протокол может применяться при базальных условиях или после генетических и фармакологических возмущений для определения их влияния на функцию пульса. Репрезентативные результаты демонстрируют устойчивую индукцию очагов RAD51 в клетках рака яичников, обладающих HR-способностью, после повреждения ДНК, тогда как истощение RAD51 значительно снижает образование очагов несмотря на сопоставимые уровни DSB, подтверждая специфичность анализа. В целом, этот протокол обеспечивает надёжный и воспроизводимый функциональный анализ для оценки компетентности HR, с широким применением в доклинических и, возможно, трансляционных исследованиях рака.

Введение

Разрывы двухцепочечной ДНК (DSB) являются одними из самых тяжёлых форм повреждения ДНК, поскольку неточное восстановление может нарушить стабильность генома и способствовать развитию опухолей или клеточной^{гибели 1,2,3.} Для противодействия этим угрозам клетки используют несколько путей репарации ДНК, включая гомологичную рекомбинацию (HR), которая считается самым точным механизмом восстановления ^{DSB 2,4,5}. В отличие от ошибочных путей восстановления, HR использует гомологичную последовательность ДНК как шаблон для восстановления генетической информации в повреждённом участке. Следовательно, HR преимущественно функционирует во время фаз S и G2 клеточного цикла, когда сестринские хроматиды доступны в качестве шаблонов^{восстановления 2,5}. Примечательно, что HR необходим для точного восстановления DSB, возникающих от эндогенных источников, таких как стресс репликации, а также экзогенных повреждений, включая ионизирующее излучение (IR) и химиотерапевтические агенты, повреждающие^{ДНК 2,5}.

RAD51 является центральным эффектором HR-пути и играет критическую роль в поиске гомологии и инвазии цепочек при HR-опосредованном восстановлении^{DSB 2,5}. После образования DSB концы ДНК подвергаются резекции — процессу, инициируемому комплексом MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) и сопутствующими факторами, что приводит к образованию 3′-одноцепочечных навесов ДНК. Эти одноцепочечные области изначально покрыты белком репликации A (RPA), который предотвращает формирование вторичной структуры и стабилизирует промежуточный препарат для^{восстановления 4,5,6}. HR затем запускается через скоординированные действия BRCA1, PALB2 и BRCA2, которые способствуют рекрутации и загрузке RAD51 в резецированную ДНК, вытесняя RPA и способствуя образованию нуклеопротеиновых филаментов с^{RAD51 4,5,6}. После сборки эти филаменты ищут гомологичные последовательности ДНК внутри сестринской хроматиде и катализируют обмен цепей, тем самым обеспечивая точное восстановление повреждённой^{ДНК 4,5,6}. Накопление RAD51 в DSB-участках проявляется микроскопически как пунктатные ядерные очаг, которые можно обнаружить с помощью иммунофлуоресценции 7,8,9,10. Поскольку формирование этих фокусов отражает успешное взаимодействие HR-механизма, анализ очагов RAD51 стал широко используемым функциональным подходом для оценки способности HR и навыков восстановления ДНК в^{клетках 7,8,9,10}. Важно, что этот анализ измеряет способность клеток выполнять HR-ответ после повреждения ДНК, а не полагаться исключительно на уровень экспрессии генов или белков, связанных с HR.

Дефекты HR часто наблюдаются при раке, особенно при опухоли, содержащих изменения в паралогах BRCA1, BRCA2, RAD51 или других генах, участвующих в HR, и особенно распространены при раке яичников и молочной^железы 4,11,12,13,14. Дефицит HR имеет важное терапевтическое значение, поскольку повышает чувствительность к ДНК-повреждающим агентам, таким как платиновая терапия, и к ингибиторам поли(ADP-рибоза) полимеразы (PARP) благодаря принципу синтетической^{летальности} 4,11,12,13,14,15 . Следовательно, надёжные функциональные анализы для оценки HR-активности критически важны как для механистических исследований, так и для трансляционных исследований.

Этот протокол описывает иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения и количественной оценки очагов ядерного RAD51 после повреждения ДНК в раковых клетках яичников. Рабочий процесс включает индукцию ДНК-DSB с помощью ИК, затем иммунофлуоресцентное обнаружение RAD51 и γH2AX, а также количественную оценку ко-локализованных ядерных очагов с помощью конфокальной микроскопии. Протокол демонстрируется с использованием HR-компетентных клеток OVCAR-8 и приобретённых клеток ABT R2, резистентныхк ингибиторам PARP, и обеспечивает воспроизводимый функциональный подход для оценки HR-активности после формирования DSB. Хотя анализ очков RAD51 широко используется как функциональная мера активности HR, доступные методы часто сосредоточены на конкретных экспериментальных условиях и часто не содержат подробных рекомендаций по интеграции контролируемой индукции повреждения ДНК, подтверждению образования DBS ДНК, контролям валидации анализов и стандартизированной количественной оценки на основе изображений. Кроме того, альтернативные подходы к оценке функции HR, включая геномные рубцевые анализы, мутационные сигнатуры и анализ экспрессии генов или белков, предоставляют косвенные измерения состояния HR и не оценивают напрямую клеточную способность привлекать RAD51 к местам повреждения ДНК. Анализы на основе репортёров, такие как DR-GFP, предлагают прямые измерения HR-активности, но требуют стабильной генной инженерии и не так легко применим к многим экспериментальным моделям. Поэтому описанный здесь рабочий процесс сочетает ИК-индуцированное повреждение ДНК с двойным иммунофлуоресцентным окрашиванием RAD51/γH2AX для одновременной проверки образования DSB и количественной оценки рекрутации RAD51 в повреждённый хроматин. Этот подход предоставляет практический, биологически значимый и широко применимый метод прямой функциональной оценки компетентности HR в культивируемых раковых клетках, включая контрольные методы анализа, этапы валидации и стандартизированные процедуры количественной оценки фокусов.

Протокол

Все материалы и реагенты, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов, включая информацию о производителе, каталожные номера и разбавления антител. Обзор протокола приведён на рисунке 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Линии рака яичников OVCAR-8 и^{ABT R}2 используются в этом протоколе и были ранее описаны^{в 15, 16, 17, 18, 19, 20}. Клетки OVCAR-8 любезно предоставил доктор Ларри Карниц (Mayo Clinic), который изначально получил их от доктора Доминика Скудиеро (Национальный институт рака, NIH). Клетки^{ABT R2}любезно предоставлены доктором Скоттом Кауфманом (Mayo Clinic)²⁰. ^{ABT R}2 — это PARPi-устойчивая производная BRCA2.- мутировавшая линия рака яичников PEO1, которая приобрела устойчивость через восстановление экспрессии BRCA2. Поскольку восстановление BRCA2 восстановило нагрузку и пульсовую активность RAD51, клетки^{ABT R}2 служат репрезентативной моделью, ориентированной на HR. Идентификация клеточной линии была подтверждена на основе происхождения источника и установленных характеристик, описанных в^{литературе 15, 16, 17, 18, 19, 20}. Эксперименты проводились с использованием клеток с низким проходом (пассажи 3–12), которые сохранялись в культуре не более 1 месяца после отмораивания. Клеточные линии регулярно проверялись на загрязнение микоплазмой каждые 6 месяцев с помощью набора для обнаружения микоплазмы, и все культуры, использованные в этом исследовании, были подтверждены как не содержащие микоплазмы.

ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен и должен быть подготовлен и обработан в сертифицированном капюшоне с химическим дымом при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты. Клеточные линии, полученные от человека, должны обрабатываться в соответствии с институциональными процедурами биобезопасности с использованием соответствующих практик сдержения. Triton X-100, монтажные материалы и лак для ногтей должны обрабатываться в соответствии с рекомендациями производителя по безопасности. ИК должен осуществляться только обученным персоналом и в соответствии с институциональной политикой радиационной безопасности. Утилизировать химические, биологические и радиационные отходы в соответствии с местными институциональными и нормативными требованиями.

1. Культивирование и поддержание клеток

1. Культурные клетки в Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 с добавлением 8% сыворотки плода в увлажнённом инкубаторе при 37 °C с 5% CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия культуры соответствуют тем, что использовались в наших предыдущих исследованиях клеток OVCAR-8 и^{ABT R2} 15,16,17,18,19. В таких условиях обе клеточные линии демонстрируют устойчивый рост и воспроизводимые фенотипы ответа на повреждение ДНК.
2. При желании выполните возмущения (например, knockdown/knockout гена), следуя оптимизированным экспериментальным^{условиям 15,17}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе приводится показательный пример возмущения гена перед иммунофлуоресцентным анализом сиРНК-опосредованный блок RAD51.
   1. Приготовьте 5 × 10⁶ клеток в среде 180 мкл RPMI-1640 с добавлением 8% плодовой сыворотки крупного рогатого скота.
   2. Добавьте 20 мкл раствора 20 мкм siRNA (2 мкм siRNA на трансфекцию) и аккуратно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие сиРНК: люциферазная сиРНК без таргетинга (si LUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCUCGA-3′; RAD51 siRNA (siRAD51.): 5′-GGGAUUGUGAAGCCAA-3′. Все siRNA были приобретены у Horizon Discovery.
   3. Перенесите подвеску ячейки на 4-мм электропорационный кювет.
   4. Электропорированные элементы с электропоратором BTX ECM 830 с двумя импульсами по 10 мс при напряжении 280 В.
   5. Перенесите клетки в полную среду роста и инкубировать в стандартных условиях культуры в 10-сантиметровой чашке в течение 24 часов.
   6. Повторите электропорирование siRNA с использованием тех же условий, описанных в шагах 1.2.1–1.2.4.
   7. Инкубировать клетки в стандартных условиях культуры в чашке диаметром 15 см ещё 48 часов.
   8. Засеять часть клеток для иммунофлуоресцентного анализа, как описано на шаге 2. Резервируйте оставшиеся клетки для валидации нокдауна RAD51 с помощью иммуноблотирования.
   9. Проверьте knockdown RAD51 с помощью иммуноблотирования
      1. Лизные клетки в ледяном буфере лизиса, содержащем 50 мМ HEPES (pH 7,6), 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Тритон X-100, 10 мМ NaF, 30 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ Na₃VO₄, 10 мМ β-глицерофосфата и коктейль ингибиторов протеазы (1 таблетка на 10 мл буфера лизиса).
      2. Очистить лизаты центрифугированием при 18 800 × г в течение 5 минут при 4 °C. Перенесите супернатант в свежую микроцентрифугную трубку и определите концентрацию белка с помощью соответствующего белкового анализа.
      3. Смешайте соответствующее количество белкового лизата с буфером образца 4× Laemmli для достижения конечной концентрации 1×.
      4. Добавьте β-меркаптоэтанол до конечной концентрации 20% и нагрейте образцы при 95 °C в течение 12 минут перед SDS-PAGE.
      5. Разделить равные количества белка по SDS-PAGE и перенести белки на соответствующую мембрану для анализа иммуноблотов.
      6. Заблокируйте мембрану 5% молоком на 30 минут при комнатной температуре с встряхиванием.
      7. Промыйте мембрану три раза (по 5 минут каждая) 1× трибуферным физиологическим раствором с tween 20 (TBST) при комнатной температуре с встряхиванием.
      8. Инкубировать мембрану поликлональными антителами против RAD51 (разбавление 1:1 000) или антителами к ACTIN (разбавление 1:1000) при 4 °C в течение 16–18 часов с трясанием.
      9. Промой мембрану с 1× TBST (по 5 минут каждая) при комнатной температуре с встряхиванием.
      10. Инкубировать мембрану вторичным антителом IgG (1:10 000), конъюгированным с хреном пероксидазой (HRP), при комнатной температуре в течение 1 часа с встряхиванием.
      11. Промыть мембрану 1× TBST (по 5 минут каждая) при комнатной температуре с встряхиванием и выявить иммунореактивные полоски с помощью соответствующего метода хемилюминесценции и подтвердить истощение RAD51 относительно клеток, трансфицированных нетаргетирующей контрольной сиРНК.

2. Посев клеток

1. Когда клетки достигают логарифмической фазы роста (примерно 70–80% совпадения), аспирируйте культурную среду и аккуратно промывайте клетки стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления остаточной сыворотки.
2. Добавьте достаточное количество раствора трипсина–ЭДТА с 0,25% для покрытия монослоя клетки (например, 1–2 мл на колбу T175) и инкубируют при 37 °C в течение 2–5 минут, контролируя отслоение клеток под микроскопом.
3. После отсоединения клеток немедленно нейтрализуйте трипсин, добавив равный объём полного культурного материала, содержащего FBS.
4. Соберите суспензию ячейки в коническую трубку объёмом 15 мл
5. Определите жизнеспособность и концентрацию клеток с помощью исключения трипана синего и гемоцитометра или автоматического счётчика клеток перед посевом.
6. Подготовьте одноклеточную суспензию в полной ростовой среде при концентрации 4 × 10⁴ клеток/мл.
7. Засадите 200 мкл суспензии ячейки в каждую яме стеклянной камеры с 8 лунками, чтобы получить окончательную плотность 8 000 ячеек на каждую скважину.
8. Инкубировать камерные затворы в течение 24 часов при 37 °C с 5% CO₂ для прикрепления клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек для засея может варьироваться в зависимости от типа клетки. Подготовьте избыточную ячейку суспензию, достаточную для хотя бы одной дополнительной ямы для учёта вариабельности пипетирования. Сейте каждое состояние в дублировании или больше, чтобы обеспечить воспроизводимость. Если требуется фармакологическая модуляция пульса, клетки следует обрабатывать после ночного прикрепления (через 12–16 часов после посева). Плотность посева следует корректировать по мере необходимости, чтобы клетки достигли нужного слияния во время обработки и анализа, учитывая ожидаемое влияние фармакологического агента на пролиферацию или жизнеспособность клеток. Поскольку HR преимущественно происходит во время фаз S и G2 клеточного цикла, поддерживайте культуры в логарифмическом росте и избегайте перераспределения. Для экспериментов, связанных с методами лечения, изменяющими прогрессию клеткового цикла, может проводиться внедрение EdU, анализ содержания ДНК или другие измерения клеточных циклов для облегчения интерпретации результатов очагов RAD51. Включайте в каждый эксперимент необработанные (–ИК) и облучённые (+ИК) контроли для установления базального и ДНК-индуцированного ДНК-индуцированного очагов RAD51 соответственно. При проведении возмущений, опосредованных siRNA, включайте нетаргетируемую контрольную siRNA (например,si LUC) и специфичные для цели siRNA условия (например,si RAD51). При оптимизации антител рекомендуются контроли без первичных и вторичных антител для оценки неспецифического окрашивания и фоновой флуоресценции.

3. Индукция повреждения ДНК с помощью ИК

1. Подвергайте клетки на затворах камеры ИК с дозой 6^{Gy 21} для индуцирования ДНК-DSB.
2. Немедленно возвращайте препараты в увлажнённый инкубатор при 37 °C с 5% CO₂.
3. Инкубировать клетки в течение 6 часов после IR.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ИК доставлялся с помощью биологического излучателя RS-2000, работевшего при напряжении 160 кВ и 25,0 мА (позиция полки 5). Клетки облучались при комнатной температуре одной дозой 6 Гр (примерно 4,8 Гр/мин) и немедленно возвращались в инкубатор при 37 °C с 5% CO₂ для восстановления. Излучатель регулярно калибровался в соответствии с рекомендациями производителя, а все процедуры выполнялись в соответствии с институциональными рекомендациями по радиационной безопасности. 6-часовая инкубация после IR ранее была^{установлена 15, 17 и 22}. Оптимальное время может различаться в зависимости от типа клеток и должно быть оптимизировано для каждой клеточной линии.

4. Фиксация и проницаемость

1. Аккуратно аспирируйте культурную среду из колодцев, не нарушая клетки.
2. Фиксируйте клетки с помощью свежеприготовленного 3% параформальдегида в 1× PBS в течение 12 минут при комнатной температуре.
3. Аккуратно аспирируйте фиксатор и промывайте колодцы три раза с 500 мкл по 1× PBS на колодцу.
4. Проницать клетки с 0,2% Triton X-100 за 1× PBS в течение 12 минут при комнатной температуре.
5. Промой колодцы три раза с помощью 1× PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно выполняйте этапы фиксации, пермеабилизации и промывания, добавляя и удаляя растворы вдоль стенок каждой колодца, чтобы минимизировать отслоение клеток. Если не указано иное, используйте 500 мкл по 1× PBS за одну стирку.

5. Блокировка

1. Приготовьте блокирующий раствор, растворив 5% (с в/в) бычий сывороточный альбумин (BSA) в 1× PBS.
2. Инкубировать клетки в блокирующем растворе в течение 60 минут при комнатной температуре, чтобы уменьшить связывание неспецифических антител.

6. Инкубация первичных антител

1. Удалите блокирующий раствор и трижды промыйте клетки 1× PBS.
2. Подготовьте первичные антитела с соответствующими разбавлениями в блокирующем растворе. Используются антитела кролика с поликлональными анти-RAD51 (1:1000) и мышиными моноклональными антифосфо-гистоновыми H2AX (γH2AX) (1:1000), при этом γH2AX служит маркером для^{DSB 23,24}.
3. Добавьте 100 мкл разбавлённого раствора первичных антител в каждую яму.
4. Инкубировать затворы при комнатной температуре в течение 16–18 часов в увлажнённой камере, чтобы предотвратить испарение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два основных антитела могут быть объединены в одном растворе для одновременного окрашивания.

7. Инкубация вторичных антител

1. Подготовьте вторичные антитела в соответствующих разбавлениях в блокирующем растворе. Для обнаружения RAD51 используется Alexa Fluor 488-конъюгированный козёлый анти-кроличий IgG (1:350), а для обнаружения γH2AX используется Alexa Fluor 488-конъюгированный козёл IgG (1:350).
2. Аспирируйте первичный раствор антител и промывайте клетки три раза с помощью 1× PBS.
3. Добавьте 100 мкл разбавленной вторичной антитела в каждую яму.
4. Инкубировать слайды в течение часа при комнатной температуре в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два вторичных антитела могут быть комбинированы для одновременного обнаружения. Начиная с этого участка, выполняйте все этапы в защищённом от света пространстве, чтобы минимизировать фотоотбеливание.

8. Ядерное контрокрашивание и монтаж

1. Приготовьте раствор Hoechst 33342 с разбавлением 1:1 000 в 1× PBS для окрашивания ядер.
2. Аспирируйте вторичный раствор антител и промывайте клетки один раз с 1× PBS.
3. Инкубировать клетки с разбавленным раствором Hoechst 33342 в течение 90 секунд при комнатной температуре.
4. Аспирируйте раствор Hoechst 33342 и промывайте клетки три раза с 1× PBS.
5. Удалите 1× PBS и отсоедините верхнюю камеру от стеклянных затворов, добавьте около 25 мкл крепления антифейда в каждую яму.
6. Надевайте стеклянные крышки поверх установленных ячеек, обеспечивая равномерный контакт с креплением.
7. Аккуратно удалите пузырьки воздуха и запечатайте края лаком для ногтей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ядерное контрокрашивание служит ориентиром для ядер, облегчая точную локализацию и количественную оценку ядерных фокусов RAD51 и γH2AX.

9. Визуализация и количественная оценка очагов RAD51 в DSB

1. Изображение скользит немедленно или храните при 4 °C в слайд-боксе в темноте до анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы минимизировать возможное ухудшение сигнала и фотоотбеливание, делайте изображения как можно скорее, желательно в течение 1 недели после монтажа.
2. Получайте изображения с помощью конфокального микроскопа с соответствующими лазерными линиями и наборами фильтров: Hoechst 33342 (405 нм) для ядер, Alexa Fluor 488 (488 нм) для RAD51 и Alexa Fluor 594 (561/594 нм) для γH2AX.
3. Проводите конфокальную визуализацию с помощью объектива с большим увеличением, подходящего для разрешения субклеточных структур.
4. Количественно определить фокусы RAD51 вручную, подсчитывая дискретные ядерные фокусы, которые солокализуются с γH2AX; исключают фокусы, не солокализованные с γH2AX.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверить эффективность антител до количественного анализа путём подтверждения IR-индуцированных ядерных очагов RAD51 и γH2AX в контрольных клетках и снижения сигнала RAD51 после обработки RAD51 siRNA. Количественно определить только отдельные ядренные очаги RAD51, которые солокализуются с γH2AX в ядрах с целостной морфологией и чёткими узорами окрашивания; исключают диффузное или неядерное окрашивание, неколокализованные сигналы RAD51, перекрывающиеся или многонуклеированные клетки, митотические клетки и апоптотические клетки. Поддерживайте одинаковые настройки визуализации в каждом эксперименте и применяйте последовательные ручные критерии оценки во всех условиях. Проанализируйте ~50 ядер на каждое условие из нескольких полей зрения для каждого биологического репликата и выполните как минимум три независимых биологических реплицирования. Сообщите о числе ко-локализованных очагов RAD51/γH2AX на ядро с помощью соответствующего статистического анализа.

10. Статистический анализ

1. Количественно определить ко-локализованные очаги RAD51/γH2AX примерно из 50 ядер на каждое состояние.
2. Приведите данные как среднее ± SD по минимум трём независимым биологическим репликам.
3. Выполнять статистические сравнения с помощью соответствующего статистического теста (например, непарного двухстороннего t-теста Студента для двухгрупповых сравнений или одностороннего ANOVA для сравнений между несколькими группами)
4. Рассмотрим p. < 0,05 как статистически значимый.
5. Выполнять статистический анализ и генерировать графики с помощью GraphPad Prism (версия 10.6.1).

Результаты

ИК индуцирует образование очагов RAD51 в DSB ДНК в клетках OVCAR-8
Для функциональной оценки активности HR образование очагов RAD51 было исследовано в клетках рака яичников с OVCAR-8 с HR-компетентностью после индукции ДНК-DSB с помощью IR. Для установления специфичности анализа и подтверждения того, что наблюдаемые очаги представляют собой подлинные RAD51-зависимые HR-события, клетки были трансфектированы либо с помощью нецеленаправленной контрольной люциферазной...

Обсуждение

Иммунофлуоресцентное обнаружение ядерных очагов RAD51, описанное здесь, предоставляет надёжный и функциональный подход к оценке HR-активности в культивируемых клетках рака яичников. В отличие от геномных или транскриптомических анализов, которые косвенно выводят статус HR, образование очагов RAD51 напрямую отражает способность клетки нанимать и собирать основной аппарат пульса в местах ДНК-DSB. Таким образом, этот анализ служит чувствительным показателем компетентности HR после поврежден...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10% Полиакриламидный гель рецепт (Нижний буфер геля 20 мл, ddH2O 33.4 мл, 30% Акриламид/Бис-акриламид (29:1) 26.6 мл. 10% APS (свежий) 200 µL  TEMED 70 µL)	Сделанный вручную	NA	Разрешающий гель для SDS-PAGE
10% Полиакриламидный гель рецепт (Верхний буфер геля 10 мл, ddH2O 23.6 мл, 30% Акриламид/Бис-акриламид (29:1) 6.4 мл 10% APS (свежий) 160 µL  TEMED 40 µL)	Сделанный вручную	NA	Слоистый гель для SDS-PAGE
100 мл трипсина EDTA 1X, 0.25% трипсин/2.21 мМ EDTA в щелочной соли бикарбоната	Corning	25-053-C1	Используется для отделения адгезивных клеток при рутинных пассажах и до посева клеток.
10x фосфатный буферизированный раствор соли (PBS)	Bio-Rad	1610780	Разбавляется до 1× и используется для шагов промывания, блокирующего раствора, разбавления антител, фиксации и пермеабилизирования.
10X Рабочий буфер (6 л) Трис 181.8 г +Глицеин 864.0 г+SDS 60 г	Сделанный вручную	NA	Бег белкового образца в геле
10X Перенос (6 л) Трис 181.8 г+ Глицеин 864 г	Сделанный вручную	NA	Перенос белка из геля на мембрану
10x Трис буферизированный раствор	Bio-Rad	1706435	Буфер
30%  (w/v) Акриламид ;0.8(w/v)/Бис-акриламид основной раствор (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	Для SDS-PAGE
Клетки ABTR2	Майо клиника	NA	полученные PARPi-устойчивые клетки рака яичника
Рецепт буфера лизиса AKT (50 мМ HEPES (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, 10 мМ NaF, 30 мМ натриевого пирофосфата, 1 мМ Na3VO4, 10 мМ 2-глицеросфосфата, 10 μг/мл леупептина, 5 μг/мл апротинина, 5 μг/мл пепстатина и 20 мМ микроцистин-LR.)	Сделанный вручную	NA	Буфер лизиса клеток
Аммонийный персульфат	Bio-Rad	16107000	Молекулярная биология как полимеризация для гелев как окисляющий агент, используемый в качестве инициирующего свободный радикал
Анти-фосфо-гистон H2A.X (Ser139) антитело, клон JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Первичное антитело, используемое для обнаружения фокусов γH2AX. Используется в разбавлении 1:1000
Анти-Rad51 (Ab-1) кроличье pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Первичное антитело, используемое для обнаружения ядерных фокусов RAD51 как маркера активности гомоложной рекомбинации. Используется в разбавлении 1:1000
Белок сыворотки быка Протеаз-свободный	GoldBio	A-420-250	Используется для приготовления блокирующего раствора (5% BSA в PBS) для уменьшения неспецифической связи антител во время иммунофлуоресцентного окрашивания.
Изображение системы ChemiDoc	Bio-Rad	12003154	Система изображений
Конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп	ZEISS	Zeiss LSM 780	Иммунофлуоресцентное изображение, анализ фокусов γH2AX, определение количества фокусов RAD51, совместное расположение белков и получение 3D-изображений
Автоматизированный счетчик клеток Countess II FL	Life Technologies	AMQAF1000	Автоматизированный счетчик клеток
Крышки	Cardinal Health	M6045-10A	Размещаются над установленными образцами для защиты окрашенных клеток и обеспечения высокоразрешающего изображения.
Система электропорации квадратной волны ECM 830	Hbio-BTX	45-2052	Система электропорации, применимая для доставки генов в клетки млекопитающих
Фетальная сыворотка быка	Corning	35-010-CV	Добавляется в RPMI-1640 (в качестве 8%) для поддержания роста клеток и их жизнеспособности.
Глици́н	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	Буфер
Высококрессадсорбированное вторичное антитело антикошечного IgG (H+L), Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Вторичное антитело, используемое для обнаружения первичного антитела γH2AX. Используется в разбавлении 1:350
Высококрессадсорбированное вторичное антитело антикроличьего IgG (H+L), Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Вторичное