Экономически эффективный рабочий процесс для моно- и мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания адгезивных двухмерных клеточных культур на стеклянных покровных стеклах

Краткое содержание

В данном протоколе описан экономичный рабочий процесс для проведения моно- и мультиплексного иммунофлуоресцентного (ИФ) анализа адгезивных двухмерных клеточных культур. Снижение затрат на эксперимент достигается за счет использования недорогих стеклянных покровных стекол, стандартных 24-луночных планшетов и условий окрашивания с малым объемом реагентов, что минимизирует расход антител, обеспечивая при этом репрезентативный подход к определению локализации белков с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

Иммунофлуоресцентная (ИФ) микроскопия является широко используемым методом визуализации локализации и совместного распределения белков с разрешением до одной клетки при сохранении морфологии клеток и субклеточной организации. Целью данного протокола является представление практического и экономически эффективного рабочего процесса для моно- и мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания адгезивных 2D-культур клеток с использованием стандартных лабораторных материалов. Метод основан на культивировании клеток на недорогих стеклянных покровных стеклах, помещенных в обычные 24-луночные планшеты, и реализует мультиплексирование за счет разделения первичных антител по видам животных-хозяев, использования спектрально различимых флуорофоров и надежных условий контроля, включая контроли без первичных антител, без антител вообще, однократное окрашивание и контроль перекрестного сигнала для обеспечения интерпретируемости мультиплексной ИФ. Для снижения расхода реагентов и антител без ухудшения качества сигнала используются этапы окрашивания малым объемом. Данный рабочий процесс исключает необходимость в специализированных планшетах или камерах для визуализации и совместим с рутинной широкопольной или конфокальной флуоресцентной микроскопией. В целом, этот протокол предлагает доступный и практичный метод иммунофлуоресценции для репрезентативной оценки локализации и совместного распределения белков в адгезивных культурах клеток. Адаптация к другим типам клеток или панелям антител требует оптимизации под конкретные мишени, включая валидацию антител, подбор условий фиксации и пермеабилизации, выбор флуорофоров, а также проверку совместимости с микроскопом и наборами фильтров.

Введение

Микроскопия с иммунофлуоресценцией (ИФ) широко используется для визуализации субклеточной локализации, относительного содержания и колокализации белков в фиксированных клетках, что позволяет связать молекулярные маркеры с клеточной морфологией и субклеточным контекстом^1,2. В отличие от методов анализа общей популяции (например, иммуноблоттинга) или диссоциативных методов анализа единичных клеток (например, проточной цитометрии), ИФ сохраняет пространственную организацию клеток и особенно полезна для оценки фенотипической гетерогенности клеток и изменений в субклеточном распределении белков с разрешением до отдельной клетки^3,4,5. Поскольку экспериментальные задачи все чаще требуют одновременной оценки нескольких маркеров, мультиплексная ИФ позволяет осуществлять одновременное обнаружение двух или более мишеней в одном и том же образце, обычно путем сочетания первичных антител, полученных в разных видах животных, со спектрально различающимися флуорофорами⁶ (Рисунок 1), используя стратегии прямого и/или непрямого детектирования (Рисунок 2). Однако мультиплексирование создает серьезные технические проблемы, особенно перекрестную реактивность антител и спектральное перекрытие, которые могут затруднить интерпретацию результатов, если они не будут устранены путем тщательного подбора панели антител и строгого контроля условий эксперимента^7,8.

Общая цель данного метода — предоставить практичный и недорогой рабочий процесс, который широко применим для антител, валидированных методом иммунофлуоресценции, и оптимизирован для рутинной визуализации адгезивных 2D-культур. Мультиплексирование реализуется за счет разделения по видам происхождения антител, использования спектрально различающихся флуорофоров и контрольных групп, позволяющих проверить уровень фона и качество окрашивания^9,10. Благодаря использованию стеклянных покровных стекол диаметром 12 мм в стандартных 24-луночных планшетах вместо специализированных камерных предметных стекол, в данном рабочем процессе исключаются дорогостоящие расходные материалы в пользу материалов, которые обычно имеются в наличии в большинстве лабораторий клеточных культур. Этот рабочий процесс также использует значительно меньше раствора для окрашивания на единицу площади роста (150 µL на ≈1,13 cm², или ≈133 µL/cm²) по сравнению с аналогичными форматами камерных покровных стекол^11,12, для которых обычно требуется 300–500 µL/cm², что соответствует примерно 2- to 4-кратному снижению расхода антител и реагентов на единицу площади. Соответственно, протокол позволяет проводить качественную мультитаргетную оценку локализации и совместного распределения маркеров с использованием стандартных широкопольных или конфокальных микроскопов, а также контр-окрашивания цитоскелета и ядер. Данный рабочий процесс предназначен для традиционной мультиплексной ИФ фиксированных клеток, основанной на разделении по видам и спектральном различии, и не предназначен для итерационных или многомерных подходов к мультиплексированию.

Протокол

Данное исследование не предусматривало участия людей или животных. Все эксперименты проводились с использованием линии клеток остеосаркомы собак D17 — общепризнанной клеточной линии, полученной из государственного банка клеток (Banco de Células do Rio de Janeiro, Cat. No. 0276). Таким образом, этическое одобрение не требовалось.

1. Поддержание клеточных линий

1. Культивируйте адгезивные клетки в стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂, увлажненный инкубатор), используя соответствующую полную среду для данной клеточной линии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве репрезентативного примера клетки остеосаркомы собак D17 (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], кат. № 0276) поддерживают в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствора антибиотика-антимикотика; субкультивирование проводят при достижении 70–80% конфлюэнтности с использованием трипсина-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты); клетки используют в пределах валидированного диапазона пассажей (например, пассажи 5–20).
2. Перед началом экспериментов подтвердите отсутствие микоплазменного заражения с помощью валидированного теста на определение микоплазмы.

2. Подготовка 24-луночного планшета и стеклянных покровных стекол

ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхности покровных стекол следует очищать путем погружения в 70% этанол (5 мин, повторить 3×) перед стерилизацией любым из описанных ниже способов; после стерилизации покровные стекла следует хранить в закрытом контейнере при комнатной температуре до использования.

1. Поместите чистые круглые стеклянные покровные стекла диаметром 12 mm в стеклянную чашку Петри (или держатель для покровных стекол) и подвергните автоклавированию. Также автоклавируйте пару металлических пинцетов с тонкими кончиками.
2. Альтернативный вариант: очистите покровные стекла и пинцеты 70% этанолом, дайте им высохнуть на воздухе, а затем перед использованием проведите поверхностную деконтаминацию с помощью ультрафиолетового (UV) облучения (30 min) внутри бокса биологической безопасности. Храните стерилизованные покровные стекла в закрытом контейнере при комнатной температуре до использования.
3. В боксе биологической безопасности с помощью стерильного пинцета перенесите одно стерильное покровное стекло в каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей, предназначенную для экспериментальных групп.
4. Дополнительно: если это требуется для используемого типа клеток, покройте покровные стекла адгезивными покрытиями в соответствии с инструкциями производителя или установленными лабораторными рекомендациями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Варианты покрытий (поли-L-лизин, коллаген I или фибронектин) и их рабочие концентрации указаны в Таблице материалов. Для большинства адгезивных клеточных линий, культивируемых на стекле, достаточно не покрытых стерилизованных покровных стекол; компоненты покрытий могут быть антигенными, поэтому выбранное покрытие не должно перекрестно реагировать с антителами из панели.
5. Если покровные стекла были покрыты, аспирируйте излишки раствора покрытия, один раз промойте стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) и дайте стеклам высохнуть на воздухе в боксе биологической безопасности перед посевом клеток.

3. Экспериментальные группы

1. Подберите панель контролей, соответствующую дизайну мультиплексного анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: контроль без антител (без первичных и вторичных антител) позволяет выявить собственную автофлуоресценцию, а контроль без первичных антител (коктейль вторичных антител без первичных) позволяет оценить неспецифическое связывание вторичных антител и фоновый сигнал одновременно по всем каналам; поскольку в данном протоколе используются строго спектрально различающиеся вторичные антитела, этот единый контроль позволяет независимо оценить каждое вторичное антитело в соответствующем канале, выполняя ту же функцию, что и отдельный контроль только с вторичным антителом для каждого флуорофора. Контроли с одним красителем, при которых каждая пара «первичное–вторичное антитело» применяется индивидуально, позволяют проверить эффективность каждого антитела перед мультиплексным объединением и, путем сравнения с условиями мультиплексного анализа, оценить спектральное перекрытие (crosstalk) для каждой пары флуорофоров. По возможности следует использовать положительный контроль с экспрессией целевого антигена для подтверждения эффективности анализа.

4. Посев клеток на покровные стекла

1. В шкафу биологической безопасности отделите клетки с помощью трипсина (или другого подходящего метода диссоциации), нейтрализуйте и ресуспендируйте в полной культуральной среде.
2. Подсчитайте количество клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
3. Разведите клетки до концентрации 6 × 10⁴–1 × 10⁵ клеток/мл.
4. Добавьте по 0,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку (итого: 3 × 10⁴–5 × 10⁴ клеток на лунку).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости можно использовать стерильный наконечник пипетки, чтобы аккуратно убедиться, что покровное стекло плотно прилегает к дну лунки, избегая при этом появления царапин.
5. Инкубируйте клетки в стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂) до тех пор, пока клетки не прикрепятся и не достигнут желаемой степени конфлюэнтности или пока не наступит заданный временной интервал эксперимента.

5. Обработка клеток (опционально)

1. Выберите время проведения обработки в соответствии с планом эксперимента. Обработка может включать фармакологическую терапию, стимуляцию цитокинами, генетические манипуляции для индуцирования или нокдауна экспрессии целевого гена или другие экспериментальные вмешательства, в зависимости от целей исследования.
2. Промаркируйте лунки для идентификации контрольной и опытных групп.
3. Инкубируйте в течение необходимых временных интервалов; избегайте избыточной конфлюэнтности, так как чрезмерный рост клеток увеличивает фон и нарушает морфологию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны прикрепиться к покровному стеклу перед фиксацией, если только план эксперимента не требует фиксации непосредственно после посева.
4. Для быстро секретируемых мишеней (например, цитокинов) добавьте брефелдин А (BFA) в культурную среду до конечной концентрации 1–10 µg/mL (обычно 5 µg/mL) и инкубируйте в течение 4–6 h при 37 °C, 5% CO₂ перед фиксацией.
5. Удалите среду, содержащую BFA, и немедленно переходите к этапу фиксации.

6. Иммунофлуоресцентное окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этапа фиксации, соблюдение стерильности не требуется; окрашивание может проводиться на рабочем столе, при этом при работе с реагентами с пометкой «ОСТОРОЖНО» следует использовать вытяжной шкаф. Образцы не должны высыхать ни на одном из этапов; при аспирации следует оставлять тонкую пленку буфера и немедленно добавлять следующий раствор.

1. Фиксация (выберите один вариант):
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксатор выбирается в зависимости от локализации мишени и чувствительности эпитопа (см. раздел «Обсуждение»): параформальдегид (PFA) (формальдегид, приготовленный из параформальдегида) подходит для большинства мишеней и совместим с фаллоидином; метанол может быть полезен для определенных ядерных или фосфо-эпитопов, но ухудшает окрашивание F-актина.
   1. Фиксация PFA (рекомендуется для большинства мишеней):
      1. Отосасывают среду и осторожно промывают один раз трис-солевым буферным раствором (TBS) (0,5 мл на лунку).
      2. Добавьте 4% раствор PFA в PBS (фосфатно-солевом буферном растворе) (0,5 мл на лунку) и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре (≈25 °C).
      3. Откачайте PFA и промойте 3 раза× буфером TBS (быстро аспирируйте; не допускайте пересыхания лунок).
         ПРИМЕЧАНИЕ: ОСТОРОЖНО: PFA токсичен и является потенциальным канцерогеном. Работайте с растворами PFA в сертифицированном химическом вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз). Избегайте вдыхания и контакта с кожей; утилизируйте отходы в соответствии с правилами безопасности при работе с химическими веществами, принятыми в вашем учреждении.
2. В качестве альтернативы можно использовать фиксацию метанолом (применима для некоторых ядерных антигенов и определенных фосфоэпитопов):
   1. Предварительно охладите 100%-й метанол до −20 °C.
   2. Добавьте ледяной метанол непосредственно к клеткам (0,5 мл на лунку) и инкубируйте в течение 5 мин при −20 °C.
   3. Промывка 3× буфером TBS (быстро аспирируйте; не допускайте высыхания лунок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации метанолом дополнительная пермеабилизация может не потребоваться; данный этап следует оптимизировать для каждой пары антитело/эпитоп. Фиксация метанолом может повредить мембранные эпитопы и ухудшить окрашивание F-актина фаллоидином, конъюгированным с флуорофором. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Метанол токсичен, летуч и легко воспламеняем. Работать следует в хорошо проветриваемом помещении или в вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты; хранить вдали от открытого огня и источников тепла. ДОПУСТИМАЯ ТОЧКА ОСТАНОВКИ: После фиксации образцы хранить при 4 °C в ПСБ с низкой концентрацией фиксатора (например, ПСБ + 0,1% ПФА) на срок до одной недели; подтвердите допустимое время хранения для каждого антигена.
3. Гашение альдегидов (опционально)
   1. Инкубируйте с 50 мМ глицином в TBS (0,5 мл на лунку) в течение 5 минут при комнатной температуре (≈25 °C).
   2. Промывка 3× в ТБС с добавлением 0,05% полисорбата 20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицин нейтрализует свободные альдегидные группы, остающиеся после фиксации ПФА (параформальдегидом), что снижает связанную с фиксацией автофлуоресценцию и повышает специфичность окрашивания антителами.
4. Пермеабилизация
   1. При исследовании мембранных белков пропустите этап пермеабилизации и перейдите к шагу 6.5.1.
   2. При воздействии на внутриклеточные или ядерные белки проведите пермеабилизацию, используя 0,1–0,3% неионного детергента в TBS (0,5 мл на лунку) в течение 5–10 мин при комнатной температуре (≈25 °C).
   3. Промывка 3× в TBS + 0,05% полисорбата 20 (TBST).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация неионогенного детергента октилфенол этоксилата и время обработки оптимизируются под конкретную цель; адекватность условий оценивается по сигналу в соответствующем компартменте, сохранности морфологии, четкости F-актина и низкому уровню фона (см. раздел «Обсуждение»). При использовании сапонина его следует поддерживать во всех последующих буферах для промывки и растворах антител. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Неионогенный детергент октилфенол этоксилат вреден при вдыхании или контакте с кожей и может вызвать раздражение слизистой оболочки глаз. Работать в перчатках и избегать образования аэрозолей.
5. Блокировка
   1. Добавьте по 0,5 мл блокирующего раствора (5% бычий сывороточный альбумин (BSA)) в каждую лунку в ТБС) и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре (≈25 °C).
   2. Аспирируйте блокирующий буфер.
   3. Переходите непосредственно к инкубации с первичными антителами (промывку не проводить).
6. Инкубация с первичными антителами
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разведения первичных и вторичных антител определяются эмпирически путем титрования (см. раздел «Обсуждение»).
   1. Приготовьте панели первичных антител (одиночных или мультиплексных) в трис-солевом буфере с содержанием 0,05% полисорбата 20 и 1% БСА (TBST-BSA) 1%), используя предварительно оптимизированные концентрации антител для каждой мишени.
   2. Для мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа объедините все неконъюгированные первичные антитела, направленные против различных антигенов и полученные из разных видов животных (например, мышиные антитела к интерферону-β (ИФН-β) + кроличьи антитела к p14ARF + козьи антитела к актину) в единый коктейль антител.
   3. Добавить 150 µL на лунку, обеспечивая полное покрытие всей покровного стекла раствором антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить испарение при малых объемах, планшет инкубируют в увлажненной камере (например, в герметичном контейнере с влажной салфеткой).
   4. Инкубируйте в течение 1,5 ч при комнатной температуре (≈25 °C) или в течение 12–16 ч при 4 °C.
   5. Промывка 3× в буфере TBST по 3 минуты каждый раз при комнатной температуре (≈25 °C), сразу после каждого промывания удаляйте жидкость с помощью аспиратора.
7. Инкубация со вторичными антителами (а также с первичными антителами с прямым конъюгатом, если применимо)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, образцы следует хранить в защищенном от света месте для предотвращения фотовыцветания. Для минимизации перекрестного сигнала во всех вторичных антителах и любых напрямую конъюгированных первичных антителах используются спектрально различаемые флуорофоры; также применяются видоспецифичные, высокоочищенные путем кросс-адсорбции вторичные антитела для минимизации связывания с неродственными первичными антителами. Вопросы подбора панели флуорофоров, включая маркеры ядер и цитоскелета, а также совместимости спектров возбуждения и эмиссии микроскопа рассмотрены в разделе «Обсуждение».
   1. Разведите вторичные антитела в 1% растворе ТБСТ-БСА, используя предварительно оптимизированные концентрации. Для мультиплексного детектирования объедините все вторичные антитела, соответствующие видам животных, в которых были получены использованные первичные антитела (одно вторичное антитело на один вид животного), в один общий коктейль.
   2. Добавить 150 µL на каждую лунку, обеспечивая полное покрытие всей покровного стекла.
   3. Инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре (≈25 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если панель включает один или несколько непосредственно конъюгированных первичных антител, добавьте их вместе с коктейлем вторичных антител и увеличьте время инкубации до 1,5 ч при комнатной температуре (приблизительно 25 °C).
   4. Промывка 3× в буфере TBST по 3 минуты каждый раз при комнатной температуре (≈25 °C), оперативно аспирируя жидкость после каждой промывки.

7. Контрастирование ядер и окрашивание f-актина

1. Добавьте ядерный контраст Краситель Hoechst 33342 (1:5000), разведенный в TBS, и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре (≈25 °C) в защищенном от света месте. Если для маркировки F-актина используется фаллоидин, а не антитела к актину, добавьте фаллоидин (1:400) в тот же раствор.
2. Промойте 3× раствором TBST, быстро аспирируя жидкость после каждой промывки (не допускайте высыхания лунок).
3. Добавьте по 0,5 mL TBS в каждую лунку, чтобы покровные стекла оставались погруженными до момента их извлечения или монтирования.

8. Извлечение покровных стекол и закрепление образцов на предметных стеклах

1. Пока покровные стекла остаются погруженными в TBS, вставьте кончик тонкой иглы или скальпеля под край покровного стекла и осторожно приподнимите его, пока одна сторона не отделится. С помощью тонкого пинцета захватите покровное стекло и извлеките его из лунки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Снятие покровного стекла, когда оно не погружено в жидкость, может привести к его плотному прилипанию к дну лунки из-за поверхностного натяжения, что повышает риск поломки.
2. Удерживая покровное стекло пинцетом, осторожно удалите излишки TBS с краев с помощью вакуумного аспиратора или абсорбирующей бумаги. Избегайте касания поверхности с клетками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать излишков остаточной жидкости, так как она может разбавить среду для заключения и ухудшить четкость и контрастность изображения.
3. Поместите покровное стекло стороной с клетками вниз на чистый предметное стекло, содержащее небольшую каплю (≈3 µL) среды для заключения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать коммерческую самоотверждающуюся среду с антифейдинговым эффектом или среду собственного приготовления на основе 80% глицерина/фосфатно-солевого буфера (PBS); препараты на основе глицерина запечатывают прозрачным лаком для ногтей; среды без ядерного красителя выбирают после проведения контрастирования. Рекомендации по срокам хранения и стабильности флуорофоров приведены в разделе «Обсуждение».
4. Перед получением изображений оставьте предметные стекла для отверждения в горизонтальном положении ≈24 h в защищенном от света месте.

Результаты

Данный протокол описывает методику моно- и мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания адгезивных опухолевых клеток собак, культивируемых на стеклянных покровных стеклах, что позволяет одновременно визуализировать ядерные, цитоплазматические и цитоскелетные маркеры при сохранении морфологии клеток. Типичные результаты представлены на Рисунке 3.

В успешных экспериментах клетки остеосаркомы собак D17, модифицированные с помощью генетической манипуляции (раздел 5.1) для экспрессии p14ARF и IFN-β собак, демонстрировали сильные, пространственно правильные флуоресцентные сигналы с низким фоном и минимальным неспецифическим окрашиванием. Для клеток, экспрессирующих p14ARF (Рисунок 3A), иммунофлуоресценция выявила преимущественно ядерную локализацию, что соответствует известному субклеточному распределению p14ARF. Использование 0,3% неионного детергента октилфенол этоксилата для пермеабилизации обеспечило эффективный доступ антител к ядерным эпитопам при сохранении морфологии ядер и целостности цитоскелета, что подтверждается четким контрастированием ядер и визуализацией структур актина с помощью антител к актину (флуорофор с оранжевым излучением).

Для клеток, экспрессирующих IFN-β (Рисунок 3A), после инкубации с BFA для блокирования секреции белков наблюдался цитоплазматический сигнал, что позволило обеспечить внутриклеточное накопление и детекцию этого растворимого цитокина. В данных условиях более мягкой пермеабилизации было достаточно для проникновения антител без избыточного вымывания содержимого цитоплазмы. Успешное окрашивание характеризовалось точечной или диффузной цитоплазматической флуоресценцией, минимальным перекрестным сигналом в ядре и сохраненной структурой актина.

При отсутствии надлежащей оптимизации ключевых параметров наблюдались субоптимальные результаты. Недостаточная пермеабилизация приводила к слабому или отсутствующему ядерному сигналу p14ARF, что показано для условий без пермеабилизации (0% неионогенного детергента октилфенолэтоксилата; Рисунок 3B и Дополнительный рисунок 1). Напротив, избыточная пермеабилизация (≥0.5% неионогенного детергента октилфенолэтоксилата или длительное время инкубации) может привести к частичной потере окрашивания цитоскелета, увеличению фоновой флуоресценции и нарушению морфологии клеток. В экспериментах с быстро секретируемыми белками (например, IFN-β) отсутствие BFA часто приводило к более слабому внутриклеточному сигналу, что отражало быструю секрецию, а не неудачу протокола.

Контроли с одиночным окрашиванием (Supplementary Figure 2) показали сигнал только в канале, соответствующем каждой мишени, что подтверждает специфичность наблюдаемого иммунофлуоресцентного окрашивания. В условиях отрицательного контроля, включая контроли без первичных антител и без антител вообще (Supplementary Figure 2), наблюдалось ожидаемое окрашивание ядер при незначительном сигнале в антителозависимых каналах, что указывает на низкую автофлуоресценцию и минимальное неспецифическое связывание вторичных антител.

В совокупности эти репрезентативные результаты демонстрируют, что данный протокол позволяет обнаруживать белки с различной субклеточной локализацией при условии, что фиксация, степень пермеабилизации и специфические стратегии, зависящие от мишени (например, блокировка секреции), соответствуют биологическим особенностям мишени. Надлежащая оптимизация обеспечивает сильную специфическую флуоресценцию с низким фоном и сохраненной морфологией клеток, тогда как неоптимальные условия приводят к более слабым или зашумленным сигналам и изменению клеточной структуры.

Рисунок 1: Общая схема процесса проведения моно- и мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа.Основные этапы от поддержания клеточных культур до получения изображений, включая две точки принятия решений, требующие выбора в зависимости от мишени: метод фиксации (PFA или метанол) и пермеабилизация (на основании субклеточной локализации мишени). Опциональная экспериментальная обработка, включая предварительную обработку брефельдином А (BFA) для быстро секретируемых мишеней, указана в виде ответвления перед фиксацией. Дополнительные этапы, не показанные для ясности (например, гашение альдегидов), описаны в полном протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Схематическое представление стратегий флуоресцентного детектирования на основе антител. При прямом детектировании используются первичные антитела, конъюгированные с флуорофором, тогда как при непрямом детектировании используются неконъюгированные первичные антитела в сочетании с конъюгированными с флуорофором вторичными антителами; именно эта стратегия применяется на протяжении всего данного протокола. Для мультиплексных приложений непрямое детектирование требует использования неконъюгированных первичных антител, полученных в разных видах животных, что позволяет каждому вторичному антителу селективно распознавать соответствующее первичное антитело без перекрестной реактивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Мультиплексная иммунофлуоресценция клеток остеосаркомы собак линии D17. Клетки D17 (5 × 10⁴) высевали на стеклянные покровные стекла в 24-луночные планшеты и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в течение 10 мин при 25 °C. Клетки подвергали мультиплексной иммунофлуоресценции с использованием первичных антител к p14ARF (1:200; флуорофоры с зеленым излучением), актину (1:200; флуорофоры с оранжевым излучением) и интерферону-β (IFN-β) (1:200; флуорофоры с дальним красным излучением), с соответствующими вторичными антителами в разведении 1:500. Ядра подвергали контрастному окрашиванию. Перед определением IFN-β клетки обрабатывали BFA (5 µg/mL, 4 ч) для блокирования секреции белков. (A) Пермеабилизация клеток проводилась 0,3% неионным детергентом в течение 10 мин при 25 °C. (B) Клетки, обработанные без пермеабилизации (0% неионного детергента). Представлены репрезентативные изображения из 2 независимых биологических повторов, каждый из которых был выполнен в 2 технических повторах. На данном рисунке показаны только объединенные каналы; отдельные каналы представлены на Дополнительном рисунке 1. Различия в окрашивании наблюдаются между условиями, особенно для p14ARF (A; стрелки), внутриядерной мишени, сигнал которой отсутствовал в группе без пермеабилизации (B). Изображения на панелях A и B были получены и обработаны с использованием идентичных настроек (Дополнительная таблица 1). Отрицательный контроль и контроли с одиночным окрашиванием, соответствующие данной панели, показаны на Дополнительном рисунке 2. Масштабный отрезок: 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Отдельные каналы флуоресценции, соответствующие рисунку 3, сгруппированные по маркерам для пермеabilизированных (левый столбец) и непермеabilизированных (правый столбец) клеток. Сравнение условий: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; флуорофоры зеленого спектра), актин (E, F; флуорофор оранжевого спектра) и IFN-β (G, H; флуорофоры дальнего красного спектра), а также соответствующие совмещенные панели (I, J), соответствующие рисункам 3A и 3B соответственно. Стрелками указано типичное ядерное окрашивание p14ARF; эллипсами указано типичное окрашивание актина (E) и IFN-β (G) соответственно. В условиях отсутствия пермеabilизации наблюдается исчезновение ядерного сигнала p14ARF, а также субоптимальное мечение IFN-β и актина. Остаточный сигнал, наблюдаемый в (D; звездочка), отражает спектральное перекрытие с присутствующими флуорофорами, что подтверждается его отсутствием в соответствующих контролях с одиночным окрашиванием и только вторичными антителами (Дополнительный рисунок 2). Масштабная линейка: 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Комбинированные контроли иммунофлуоресценции, соответствующие мультиплексной панели на рисунке 3. Для каждой контрольной группы отдельные каналы (Hoechst 33342, зеленые флуорофоры, оранжевый флуорофор и дальне-красные флуорофоры) показаны рядом с совмещенным изображением (пятый столбец). (A–E) Контроль без антител: клетки, обработанные без первичных или вторичных антител. (F–J) Контроль только с вторичными антителами: клетки, инкубированные с коктейлем вторичных антител в отсутствие первичных антител. (K–O) Контроль однократного окрашивания p14ARF (зеленые флуорофоры). (P–T) Контроль однократного окрашивания актина (оранжевый флуорофор). (U–Y) Контроль однократного окрашивания IFN-β (дальне-красные флуорофоры). Настройки сбора и обработки данных были идентичны тем, что использовались на рисунке 3 (Дополнительная таблица 1). Масштабный отрезок: 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Характеристики флуоресцентных фильтр-кубов и порядок сбора данных. Изображения были получены последовательно на инвертированном широкопольном флуоресцентном микроскопе (40×/0.80 объектив) с использованием перечисленных ниже фильтр-кубов в указанном порядке для каждого поля обзора, представленного на Рисунке 3, Дополнительном рисунке 1 и Дополнительном рисунке 2. Изображения были получены в виде одиночных оптических плоскостей (без z-стекинга).Интенсивность возбуждения была установлена с помощью регулятора интенсивности флуоресценции на указанных уровнях, при этом диафрагма освещения для всех каналов находилась в положении 6. Настройки камеры (8-битная оцифровка, формат 3072×2048, гамма 1.0) и фиксированная настройка цифрового повышения резкости были идентичны для всех каналов и панелей, включая контрольные изображения на Дополнительном рисунке 2. Для отображения ко всем каналам и панелям была применена единая линейная корректировка яркости/контрастности. Изображения были экспортированы в формате TIFF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Руководство по устранению распространенных технических проблем в процессе иммунофлуоресцентного анализа. Распространенные проблемы, вероятные причины и корректирующие действия на различных этапах протокола.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Для стабильного воспроизведения результатов данного протокола иммунофлуоресценции с использованием покровных стекол критически важны несколько этапов. Все процедуры проводятся в ограниченном объеме лунки 24-луночного планшета для культивирования, что упрощает работу, ограничивает манипуляции с образцами и обеспечивает полное покрытие покровного стекла при использовании малых объемов реагентов, тем самым снижая расход антител на один эксперимент. Поскольку растворы малого объема склонны к испарению, инкубации рекомендуется проводить в увлажненной камере; образцы ни в коем случае не должны пересыхать, так как даже кратковременное высыхание увеличивает фоновую флуоресценцию и ухудшает морфологию клеток. При аспирации на покровном стекле оставляют тонкую пленку буфера, после чего немедленно добавляют следующий раствор.

Правильная плотность посева клеток и контролируемая степень слияния (конфлюэнтность) на момент фиксации необходимы для ограничения фона и сохранения морфологии, так как чрезмерный рост увеличивает фоновый сигнал и нарушает клеточную архитектуру. Аналогичным образом на всех этапах требуется точный контроль времени и температуры инкубации, поскольку оба этих параметра влияют на эффективность фиксации, связывание антител и фоновый сигнал^5,13. При колебаниях условий окружающей среды использование инкубатора с регулируемой температурой или сухого шкафа, настроенного на 25 °C, в сочетании с единообразным временем инкубации для всех повторов, повышает воспроизводимость.

Фиксация является первым решающим этапом, так как она определяет сохранность антигенов и клеточной архитектуры⁵, и выбор фиксатора осуществляется в зависимости от локализации мишени и чувствительности эпитопов. PFA рекомендуется для большинства мембранных, цитоплазматических, ядерных и цитоскелетных мишеней, поскольку он сохраняет архитектуру, поддерживает распределение антигенов и совместим с окрашиванием F-актина фаллоидином. Метанол может быть предпочтительным для некоторых ядерных антигенов, которые плохо выявляются после сшивающей фиксации, в частности для фосфо-эпитопов или эпитопов, чувствительных к альдегидам, однако он нарушает целостность мембран, экстрагирует растворимые белки и ухудшает окрашивание фаллоидином/F-актином; совместимость должна быть проверена для каждой мишени ^13,14,15,16. Для растворимых цитокинов и других быстро секретируемых белков фиксация PFA в сочетании с предварительной обработкой BFA позволяет сохранить внутриклеточный сигнал до фиксации: BFA блокирует транспорт белков из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, что способствует внутриклеточному накоплению секретируемых белков и позволяет выявлять их методом иммунофлуоресценции. Если необходимо одновременно выявить мишени с противоречивыми требованиями к фиксации, требуется эмпирическая оптимизация. Глиоксаль, малогабаритный диальдегид, упоминается как альтернатива PFA, обеспечивающая более быстрое сшивание, улучшенную сохранность антигенов и совместимость с иммунофлуоресценцией и микроскопией сверхвысокого разрешения; у нас нет собственного прямого опыта использования фиксации глиоксалем, и мы представляем этот метод как вариант, подтвержденный литературой^17,18.

После фиксации надлежащая пермеабилизация обеспечивает доступ антител к внутриклеточным и ядерным эпитопам при сохранении структурной целостности⁵. Недостаточная пермеабилизация обычно приводит к слабому или отсутствующему сигналу при сохранной морфологии, что указывает на ограниченный доступ антител, тогда как чрезмерная пермеабилизация приводит к экстракции растворимых белков, разрушению мембран, потере окрашивания цитоскелета и увеличению фона. Поэтому тип детергента, его концентрация и время инкубации оптимизируются под конкретную мишень. Адекватность пермеабилизации можно оценить по четырем критериям: (i) наличие специфического сигнала в ожидаемом субклеточном компартменте; (ii) сохранная морфология с четко выраженными границами ядра и цитоплазмы, визуализируемыми с помощью Hoechst 33342 и фаллоидина соответственно; (iii) четкое окрашивание F-актина, так как диффузный или отсутствующий сигнал цитоскелета указывает на избыточную пермеабилизацию; и (iv) низкий фон в отрицательных контролях. Если эти критерии не соблюдены, концентрация неионогенного детергента октилфенол этоксилата и/или время инкубации корректируются эмпирически. При объединении мембранно-ассоциированных и внутриклеточных антигенов в одной панели более мягкие условия (более низкая концентрация детергента, более короткая инкубация) позволяют сохранить мембранные эпитопы, обеспечивая при этом доступ внутрь клетки; в этом случае полезно использовать временную серию, начиная с 5 min с постепенным увеличением интервала. Если вместо него используется сапонин, его необходимо добавлять во все последующие буферы для антител и промывки, так как его пермеабилизирующий эффект обратим.

Концентрации антител определяют эмпирически путем титрования, а не на основании общих рекомендаций. Практический подход заключается в создании серии последовательных разведений, охватывающей как минимум 3–4 концентрации выше и ниже рекомендуемого производителем разведения (например, 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400 при рекомендуемом 1:200), которые применяют к повторам на покровных стеклах в идентичных условиях. Каждое разведение оценивают по интенсивности специфического сигнала в ожидаемом компартменте; соотношению сигнал/фон путем сравнения окрашенных образцов с соответствующим контролем без первичных антител и фона вторичных антител с контролем без антител; а также по сохранности морфологии. Выбирают наименьшую концентрацию, обеспечивающую сильный специфический сигнал при минимальном фоне. Стойкий высокий фон обычно устраняют путем дальнейшего титрования, продления блокировки или повышения строгости промывки, в то время как слабый сигнал может быть следствием чрезмерной фиксации, субоптимальной концентрации антител, неспособности первичных антител распознать свой целевой эпитоп, несоответствия вторичных антител виду животного-хозяина первичных антител (например, использование антикроличьих вторичных антител для первичных антител, полученных от мыши) или потери сигнала флуорофора из-за деградации вторичных антител вследствие истечения срока годности или неправильного хранения, особенно при неоднократном воздействии света. Если сигнал отсутствует при всех разведениях, целесообразно увеличить время инкубации с первичными антителами или перевести ее на ночь при 4 °C, подтвердить экспрессию антигена в клеточной линии, проверить совместимость антител с условиями фиксации и пермеабилизации, проверить номер лота, условия хранения и срок годности первичных и вторичных антител, убедиться, что микроскоп оснащен подходящими фильтрами возбуждения и эмиссии для данного флуорофора, и, если проблема сохраняется, протестировать альтернативный клон. При приготовлении рабочих растворов необходимый объем коктейля рассчитывают как количество лунок, умноженное на 150 µL, плюс примерно 10% избытка для компенсации потерь при пипетировании; объем каждого стокового раствора антител равен этой общей сумме, деленной на коэффициент разведения (например, 825 µL ÷ 200 = 4.13 µL для разведения 1:200), остальной объем доводят раствором TBST–BSA 1%. Аналогичный расчет применяется к коктейлю из вторичных антител с подстановкой соответствующего коэффициента разведения.

Эффективность мультиплексного анализа в конечном счете зависит от дизайна панели флуорофоров. Флуорофоры, назначенные для основных мишеней, ядерного контрастирования и маркера цитоскелета, должны быть согласованы во избежание спектрального перекрывания или дублирования сигнала, а система визуализации должна поддерживать возбуждение и детектирование каждого выбранного флуорофора^9,10; диапазоны возбуждения и эмиссии для каждого фильтр-куба приведены в Дополнительной таблице 1, что позволяет напрямую сравнить спектральную совместимость всех компонентов панели. Пользователям, адаптирующим эту панель под другие флуорофоры, рекомендуется по возможности выбирать комбинации с минимальным перекрыванием соседних каналов и проверять отсутствие перекрестных помех (crosstalk) на контролях с одним красителем перед объединением мишеней, как это было сделано в данной работе. Остаточный сигнал, обусловленный присутствием других флуорофоров, наблюдался во всех зарегистрированных каналах мультиплексной панели (Дополнительный рисунок 1), но отсутствовал в соответствующих контролях с одним красителем и только со вторичными антителами (Дополнительный рисунок 2), что указывает на спектральные перекрестные помехи из-за использования широкополосных наборов фильтров при широкопольном сканировании (которые, потенциально, можно уменьшить при использовании конфокального возбуждения лазером). Учитывая пространственное разделение между ядрышковой локализацией p14ARF и филаментозным/цитоплазматическим распределением актина и IFN-β, эти перекрестные помехи не влияют на интерпретацию локализации p14ARF в мультиплексной панели. Данный рабочий процесс основан на традиционном мультиплексировании с использованием флуорофоров, при котором количество одновременно разрешимых мишеней ограничено доступными видами животных, в которых вырабатывались антитела, и спектрально различимыми флуорофорами. Мультиплексирование более высокого порядка может быть достигнуто с помощью циклической иммунофлуоресценции или спектральной визуализации, которые позволяют проводить итеративное окрашивание/выжигание или линейное разделение (unmixing) перекрывающихся флуорофоров соответственно, но требуют специализированного оборудования и программного обеспечения, которые не рассматриваются в данной работе^19,20.

Среда для заключения объектов влияет как на качество изображения, так и на стабильность сигнала. Можно использовать коммерческую самоотверждаемую среду с антифейдингом или, в качестве альтернативы собственного приготовления, 80% глицерин в PBS (без антифейдинга и без самоотверждения); препараты на основе глицерина собственного приготовления запечатывают бесцветным лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и смещение покровного стекла, а среды без ядерных красителей выбирают в том случае, если ядерное контрастирование уже было проведено. Снимки лучше всего делать сразу после отверждения. Если немедленное получение изображений невозможно, отвержденные стекла можно хранить в темном боксе при 4 °C в течение 2–4 недель или при −20 °C до 6 месяцев, учитывая, что высокофотолабильные флуорофоры (например, флуорофоры с зеленым излучением) теряют сигнал со временем даже при оптимальных условиях хранения. Коммерческие среды с антифейдингом существенно продлевают стабильность флуорофоров по сравнению со средами на основе глицерина собственного приготовления; при использовании последних настоятельно рекомендуется проводить съемку в течение 24–48 ч. Бесцветный лак для ногтей совместим с большинством флуорофоров и не оказывает заметного влияния на сохранность сигнала при условии, что перед хранением препараты выдерживаются в темноте не менее 30 мин для полного высыхания.

Начиная с этапа фиксации, соблюдение стерильности более не требуется, и окрашивание можно проводить на лабораторном столе, используя сертифицированный вытяжной шкаф только для реагентов с маркировкой CAUTION. Работа с клетками D17 и другими опухолевыми клеточными линиями осуществляется в соответствии с институциональными правилами биологической безопасности для материалов 1-й или 2-й группы риска, в зависимости от ситуации. Все материалы, контактировавшие с культивируемыми клетками, покровными стеклами, наконечниками, средой, а также жидкие отходы подвергаются деконтаминации перед утилизацией: жидкие отходы инактивируют отбеливателем до конечной концентрации 10% в течение не менее 30 min, а твердые отходы утилизируют в соответствующие контейнеры для биоотходов. Химические отходы, содержащие PFA, метанол или неионогенное моющее средство октилфенолэтоксилат, собирают отдельно и утилизируют в соответствии с институциональными правилами химической безопасности.

Несмотря на то, что данный рабочий процесс разработан для широкого применения, его следует рассматривать скорее как метод, допускающий адаптацию в зависимости от мишени, а не как жесткую универсальную процедуру; успех применения зависит от понимания исследователем локализации, растворимости, доступности эпитопа каждого антигена, а также его чувствительности к фиксации и пермеабилизации. Необходимо подчеркнуть два ограничения. Во-первых, оценка окрашивания в данной работе является качественной и основана на сравнении с отрицательными контролями и ожидаемой субклеточной локализацией, а не на формальном количественном определении отношения сигнал/фон; соответственно, сообщаемая здесь согласованность отражает воспроизводимое качественное окрашивание на повторных покровных стеклах и в контрольных условиях, а не количественно подтвержденную эффективность. Обобщенное руководство по устранению неполадок, в котором перечислены распространенные проблемы, их вероятные причины и корректирующие действия, приведено в Дополнительной таблице 2. Лаборатории, которым требуются количественные показатели, могут использовать программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом для измерения средней интенсивности, вычитания фона, количественного анализа на основе выбранных областей интереса (ROI) и профилирования интенсивности²¹. Во-вторых, репрезентативные данные получены на одной адгезивной линии опухоли собак (D17), поэтому расширение метода на другие типы клеток, виды или комбинации антигенов потребует специфической для каждой мишени реоптимизации условий фиксации, пермеабилизации и использования антител.

Резюмируя, данный протокол представляет собой гибкий и экономичный рабочий процесс для моно- и мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания адгезивных 2D-культур, сочетающий низкий расход реагентов со стабильными результатами окрашивания на стандартном лабораторном оборудовании и позволяющий вносить обоснованные коррективы в зависимости от конкретной мишени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24-луночные планшеты для культивирования тканей	Corning	3524	Посев и окрашивание клеток на покровных стеклах
Антибиотик-антимикотик	Gibco	15240062	Используется для предотвращения бактериальной и грибковой контаминации в клеточных культурах.
Раствор для разведения антител (TBST-БСА 1%)	Приготовлено самостоятельно	—	Для 10 мл: 2 мл 5% блокирующего раствора БСА + 5 µL Tween-20 + 7,995 мл 1x TBS (рабочий раствор) до конечного объема 10 мл (итоговый состав: 1% BSA, 0,05% Tween-20 в TBS; pH 7,6). Готовить непосредственно перед использованием; при хранении содержать при 4 °C хранить в условиях, защищающих от контаминации, и использовать в течение 1 недели.
Блокирующий раствор	Приготовлено самостоятельно	—	Для 10 мл: 0,5 г BSA, растворенных в 10 мл 1x TBS (1 мл стокового раствора 10x TBS + 9 мл дистиллированной воды); pH 7,6. Инкубация в течение 30 мин при 25 °C; приготовить непосредственно перед использованием.
(5% БСА в ТБС)
Брефельдин А	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mL; 4-часовая предварительная обработка для блокирования секреции белков перед определением цитокинов.
БСА (бычий сывороточный альбумин)	Sigma-Aldrich	A7906	5% в TBS для блокировки; 1% в TBS + 0,05% Tween-20 для разведения антител.
Реагент на основе коллагена (для покрытия покровного стекла, опционально)	Corning	354231	Коллаген I типа, полученный из дермы быка; разведенный до 50 µg/mL в 0,01 N HCl; прикладывали при 5–10 µg/cm² (≈100 µL/well); инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре (≈25°C); аспирируйте и промойте PBS перед высевом клеток.
Предметные стекла (покровные стекла), стеклянные, круглые, 12 мм	Стекло Knittel	100013	Субстрат для культивирования адгезивных клеток и окрашивания.
линия клеток остеосаркомы собак D17	Банк клетокéкальмары Рио-де-Жанейро	276	Репрезентативная модель клеток; культивируемая в среде DMEM с добавлением 10% FBS и антибиотика-антимикотика; поддерживать при 37 °C, 5% CO2.
(BCRJ)
Деионизированная/дистиллированная вода	Приготовлено самостоятельно	—	Приготовление буферного раствора.
DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла)	Gibco	12100-046	Полная среда для культивирования клеток.
Этанол	Supelco	1.00983	Деконтаминация покровных стекол и пинцетов.
Фетальная бычья сыворотка	Sigma-Aldrich	F7524	Добавка в питательную среду для культивирования клеток.
(ФБС)
Фибронектин	Gibco	33016015	Гликопротеин внеклеточного матрикса; разведенный до концентрации 0,0125 мг/мл в среде для культивирования клеток; наносимый в концентрации 100 µL/well и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (≈25°C) перед посевом клеток.
Металлический пинцет с тонкими кончиками	Разное	—	Работа с покровными стеклами.
Флуоресцентный микроскоп	Leica Microsystems	DMi8	широкопольный флуоресцентный микроскоп DMi8 (Leica Microsystems), объектив HC PL FLUOTAR 40×объектив DRY с числовой апертурой 0,80; совместим с флуорофорами панели (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
Предметные стекла для микроскопа	Биослайд	—	Закрепление окрашенных покровных стекол для визуализации.
Держатель для стеклянных чашек Петри или покровных стекол	Разное	—	Автоклавирование и хранение покровных стекол.
Глицин	Sigma-Aldrich	8,16E+09	Для приготовления 10 мл 50 мM раствора: 37,5 мг глицина растворить в 10 мл 1x TBS; pH 7,6. 5 мин при 25 °C; необязательный этап гашения альдегидов после фиксации, перед пермеабилизацией; готовить непосредственно перед использованием.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Для приготовления 10 мл рабочего раствора: разведите исходный раствор в TBS в пропорции 1:5000. Контрастное окрашивание ядер; инкубировать в защищенном от света месте; готовить непосредственно перед использованием.
Увлажненная камера	Различные/Приготовлены самостоятельно	—	Для инкубации с антителами; в качестве альтернативы использовать закрытый пластиковый контейнер с увлажненной абсорбирующей бумагой.
ImageJ	Открытый источник (NIH)	—	Используется для анализа изображений после сбора данных.
Программное обеспечение для сбора изображений	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Используется для получения изображений на микроскопе Leica DMi8.
Метанол	Merck	1.06009	Альтернативная фиксация (ядерные антигены/фосфо-эпитопы); предварительно охлаждено до −20 °C, инкубация в течение 5 мин; может ухудшить окрашивание фаллоидином/F-актином.
Среда для заключения препаратов	Sigma-Aldrich	G2289	Для приготовления 10 мл: тщательно смешайте 8 мл глицерина и 2 мл ФСБ (PBS), pH 7,6. Не обладает антифейдинговыми свойствами и не затвердевает самостоятельно. Заклейте края покровного стекла лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание или смещение препарата; храните стекла при 4 °C защитить от света и незамедлительно провести визуализацию, чтобы минимизировать фотовыгорание.
(на основе глицерина)
Среда для заключения препаратов (ProLongТМ Стекло)	Invitrogen	P36984	Содержит антифейдинговые реагенты и самостоятельно отвердевает (застывает) примерно через 24 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте, образуя постоянный препарат (герметизация лаком для ногтей не требуется). Хранить стекла при 2–8 °Cв защищенном от света месте до проведения визуализации.
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Ионный компонент буфера TBS; поддерживает физиологическую осмолярность для сохранения морфологии клеток и тканей во время этапов промывки и инкубации с антителами.
Игла (малого диаметра, например, 25G)–27G)	Разное	—	Используется в качестве рычага для осторожного поднятия/отделения покровного стекла от дна лунки, чтобы не повредить монослой клеток.
Параформальдегид (ПФА)	Sigma-Aldrich	158127	Для 10 мл: 0,4 г порошка параформальдегида, растворенного в 8 мл PBS, нагретого до 60°C–65 °C до просветления добавляют несколько капель 1N NaOH, охлаждают, доводят pH до 7,4 и дополняют объем буферным раствором PBS до 10 мл; фильтруют через 0.2 µm отфильтруйте перед использованием. Приготовьте свежий раствор или разделите на аликвоты и храните при −20 °Cизбегая повторных циклов замораживания-оттаивания.
Фаллоидин, конъюгированный с флуорофором.	Invitrogen	В зависимости от выбранного типа флуоресценции.	Для приготовления 10 мл рабочего раствора: разведите исходный раствор в соотношении 1:400 в TBS (pH 7,6) в соответствии с инструкциями производителя. Альтернативный маркер цитоскелета/F-актина; готовить непосредственно перед использованием, хранить в защищенном от света месте.
Фосфатно-солевой буферный раствор	Sigma-Aldrich	P4474-1L	Изотонический фосфатный буфер (pH 7,4); поддерживает физиологическую осмолярность для сохранения морфологии клеток в ходе этапов фиксации и промывки.
(Фосфатно-солевой буфер, PBS)
Поли-L-лизин (покрытие покровного стекла, опционально)	Sigma-Aldrich	P8920	Синтетический поликатионный реагент для нанесения покрытия, усиливающий электростатическую адгезию клеток; использовать в концентрации 0,1 мг/мл в дистиллированной воде; объем должен быть достаточным для покрытия поверхности покровного стекла; инкубировать в течение 30 мин при 25 °C перед посевом клеток.
Первичный антитело, анти-актин (хозяин — коза)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Антитела к актину; поликлональные, неконъюгированные, детектируются с помощью вторичных антител против козьих антител. Используются в рабочем разведении 1:200.
Первичные антитела, анти-IFN-β (мышь-хозяин)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Анти-ИФН-β антитело; поликлональное, неконъюгированное, детектируемое с помощью вторичного анти-мышиного антитела. Использовалось в рабочем разведении 1:200.
Первичный антитело, анти-p14ARF (хозяин — кролик)	Calbiochem	PC409	Антитело к p14ARF; поликлональное, неконъюгированное, детектируется с помощью вторичного антитела к кролику. Данный продукт снят с производства; при планировании работы с этой мишенью потребуется валидация нового антитела. Используется в рабочем разведении 1:200.
Вторичное антитело, антикроличье, конъюгированное с Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A32731TR	Антитела против кролика, конъюгированные с AF488. Используются в рабочем разведении 1:500.
Вторичное антитело, антикозье, конъюгированное с Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21432	Конъюгированные с AF555 антитела против козьих антител. Используются в рабочем разведении 1:500.
Вторичные антитела, антимышиные, конъюгированные с Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21235	Антитела против мыши, конъюгированные с AF647. Используются в рабочем разведении 1:500.
Трис-солевой буфер (TBS), 10-кратный стоковый раствор	Приготовлено в собственных лабораториях	—	Для приготовления 100 мл: растворить 6,06 г Tris-основания и 8,77 г NaCl в 80 мл дистиллированной воды; довести pH до 7,6 с помощью концентрированной HCl; довести объем до 100 мл; автоклавировать. Для приготовления рабочего раствора (TBS 1x) развести в дистиллированной воде в соотношении 1:10 (конечный состав: 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,6); хранить при комнатной температуре или 4 °C на срок до 3 месяцев.
TBST (TBS + 0,05% Tween-20)	Приготовлено в собственных лабораторных условиях	—	Для 10 мл: 1 мл 10-кратного стокового раствора TBS + 8,995 мл дистиллированной воды + 5 µL Tween-20 (0,05% об/об); pH 7,6. Промывочный буфер для этапов между окрашиваниями; готовить свежим, использовать в течение ~1 недели при 4 °C.
трис-основание	Sigma-Aldrich	252859	Буферный агент, используемый для приготовления основного раствора TBS; обеспечивает стабильность pH в физиологическом диапазоне (pH 7,6) для промывочных и разбавляющих буферов при иммунофлуоресцентном анализе.
Triton X-100 (неионогенное моющее средство на основе этоксилата октилфенола)	Sigma-Aldrich	X100	Для 10 мл: 10 µL Triton X-100 в 9,99 мл 1x TBS для получения 0,1% TX100; 30 µL в 9,97 мл 1х TBS с 0,3% TX100 (в зависимости от мишени; для ядерных мишеней требуются более высокие концентрации).
Трипсин-ЭДТА	Gibco	25200056	Используется для открепления клеток.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Используется в составе TBS для приготовления промывочного буфера (TBST) и разбавителя антител (TBST-BSA 1%).