Методическая статья

Параллельный in vivo скрининг генного нокаута и активации в молочной железе мыши

DOI:

10.3791/71115

⸱

24 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает масштабируемый подход к интрадуктальному скринингу CRISPR, позволяющий проводить параллельные исследования нокаута и активации гена in vivo в молочной железе мыши.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Передовые генетические скрининги регулярно применяются для объединённого возмущения тысяч генетических элементов с целью создания масштабных карт генотипа на фенотип. Хотя это часто проводится в системах клеточных культур, накопление доказательств подтверждает, что скрининги in vivo способны выявить новую биологию, которую невозможно повторить in vitro. Однако широкое применение этого подхода было ограничено двумя основными проблемами: преобладающим акцентом на нарушения, вызванные потерей функции, а не активацией генов, и значительными техническими трудностями при доставке сложных генетических библиотек в конкретные ткани in vivo. Чтобы преодолеть эти трудности, мы описываем простую и универсальную стратегию инъекции внутри протока, которая позволяет эффективно и быстро проводить функциональный геномный скрининг молочной железы мыши, создавая десятки тысяч отдельных эпителиальных клонов. Кроме того, мы предоставляем все необходимые детали для создания библиотеки, интрадуктальных инъекций, деконволюции экрана и анализа библиотек CRISPR-Knockout и Activation для комплексных скринингов in vivo . Используя эти инструменты, которые мы назвали CRISPR-KOALA (Knockout and Activation Linked Assay), мы выявили новые супрессоры опухолей и онкогены в кодирующем и некодирующем геномах объединённых библиотек от 46 локусов до одной пятой части генома. Важно, что этот подход и анализ могут применяться к другим органам для изучения биологической функции любого гена во время гомеостаза или заболевания.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функциональные геномные скрининги предоставляют мощную основу для изучения функции генов вмасштабе 1. Разработка технологий редактирования генов CRISPR-Cas позволила систематически возмущать сотни и тысячи генов параллельно, а объединённые скрининги на основе CRISPR в клеточных линиях млекопитающих стали краеугольным камнем современных исследований биологии рака2. Эти методы in vitro выявили основныегены 3, супрессорыопухолей 4 и синтетические летальныевзаимодействия 5 в различных контекстах рака. Однако одним из основных ограничений является неспособность в живом виде охватить сложные биологические особенности опухолей, включая взаимодействие с иммунной системой и стромой, градиенты питательных веществ и архитектуру тканей вмикроокружении 2. В соответствии с этим ограничением недавние исследования показали, что многие подлинные гены-драйверы рака не оказывают измеримого эффекта in vitro, особенно когда их функция зависит от микроэкологических сигналов, отсутствующих вклеточной культуре 6,7,8,9,10.

Молочная железа мыши обеспечивает уникально выгодный тканевой контекст для in vivo функционального геномного скрининга. Эпителиальные клетки молочной железы обладают высокой регенеративностью, проходят циклы клонального расширения во время эструального цикла и организованы в разветвлённую протоковую сеть, к которой можно легко получить доступ и генетически манипулировать 11,12,13. Эти особенности поддерживали десятилетия мозаичного генетического анализа и экспериментов по отслеживанию родословной и закрепили молочную железу как управляемую систему для изучения клеточно-внутренней и микро-зависимой функции генов во время гомеостаза и заболеванийтканей 14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Важно, что генетические возмущения могут быть ограничены эпителиальным компартментом, что позволяет непосредственно изучать эпителиально-специфические факторы трансформации, конкуренцию клеток, верность линии и прогрессирование опухоли в целостном тканевом контексте.

Хотя было разработано несколько стратегий для передачи генетических возмущений непосредственно взрослой молочной железе in situ, для приложений с высокой пропускной способностью остаются значительные технические препятствия. Аденовирусная доставка Cre рекомбиназы широко используется для индуцирования соматической рекомбинации условных аллелей во взрослой молочнойжелезе 34,35,36,37, обеспечивая эффективный способ манипуляции функциями генов без сложной зародышевой линии, необходимой для традиционных генетически модифицированных мышиных моделей (GEMM). Хотя аденовирус с высоким титром также может доставлять компоненты CRISPR-Cas9 клеткам, проживающим в ткани, эти векторы не интегрируются в геномхозяина 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49. Это сильно ограничивает масштаб скрининга до ~10–55 генов, поскольку каждый гРНК-целевой участок должен секвенироваться индивидуально с помощью молекулярных инверсионныхзондов 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 . Кроме того, существующие методы внутриканальной доставки обеспечивают прямой доступ к молочной протоковой системе, но требуют либо инвазивного хирургического вмешательствамолочной железы 50, либо использования сравнительно больших шприцев Гамильтона, которыегромоздки 51. Хотя эти подходы эффективны для локализованной доставки вирусов, они сравнительно инвазивны, технически сложны и не оптимизированы для масштабируемой доставки объединённых лентивирусных библиотек. В совокупности эти исследования показывают, что вирусные возмущения in situ возможны, но современные инструменты не поддерживают стабильные, объединённые, восстанавливаемые по последовательности возмущения, необходимые для высокопроизводительного скрининга in vivo CRISPR.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы и другие приступили к интеграции лентивирусных векторов, которые обеспечивают стабильные и наследственные генетические модификации. В отличие от систем культуры клеток, ткани in vivo накладывают строгие ограничения на количество возбуждённых клеток, которые могут генерироваться в одном органе, что делает скрининг по всему геному непрактичным. Следовательно, скрининги in vivo CRISPR требуют создания биологически обоснованных, целенаправленных библиотек, которые балансируют охват и реализуемость. Кроме того, большинство скринингов in vivo CRISPR, рассмотренныхздесь 2, почти исключительно сосредоточены на нарушениях потери функции лентивируса, несмотря на растущие доказательства того, что активация гена может выявлять комплементарные и не пересекающиеся биологические инсайты 52,53,54,55. Мы и другие ранее показали, что интеграция лентивирусных CRISPR нарушений в эпителий молочной железы взрослого молока обеспечивает стабильную, наследственную генетическую модификацию in situ, и что их можно восстановить и количественно оценить из геномнойДНК 36,55,56,57,58. Используя этот подход, мы провели объединённые in vivo скрининги CRISPR, которые выявили новые драйверы онкогеннойтрансформации 36,55, установив как осуществимость, так и биологическую значимость доставки лентивируса и скрининга CRISPR. Однако эти исследования также подчеркнули необходимость простого, стандартизированного и масштабируемого протокола, который можно было бы широко принять и расширить, чтобы включать как модели скрининга потерь, так и усиления функции внутри одной железы.

Здесь мы описываем простую и универсальную стратегию инъекции внутри каналов, которая позволяет параллельно проводить in vivo скрининг библиотек CRISPR-knockout и активации, называемых CRISPR-KOALA, внутри молочнойжелезы взрослой мыши 55. CRISPR-KOALA использует либо обычную 20-21 бп «однопутную» (sg)РНК для возможностей CRISPR-KO, либо 14-бп «мертвую РНК» (dg)РНК для CRISPR-A. dgRNA эффективно направляет Cas9 к целевому участку, но предотвращает активность эндонуклеазыCas9 59,60,61, что позволяет использовать одну мышь, экспрессирующую активный Cas9 как для нокаутирования, так и для активации. Введение двух шпильок PP7 в dgRNA trcr позволяет рекрутировать белок-оболочку PP7: трансактиватор P65:HSF1 62 и обеспечивает эффективную гиперэкспрессию генов in vivo55 (Рисунок 1). Сочетая проектирование таргетной библиотеки гРНК с высокотитровой выработкой лентивируса и нехирургической интрадуктальной подачей с использованием стеклянных микрокапилляров, этот подход генерирует десятки тысяч пространственно дискретных эпителиальных клонов, сохраняя при этом архитектуру тканей и взаимодействия с микроэкологией. Важно отметить, что лентивирусная интеграция в геном хозяина позволяет восстанавливать и количественно оценивать gRNA с помощью высокопроизводительного секвенирования, что позволяет объединять функциональные геномные скрининги in vivo. Вместе это позволяет параллельно или одновременно (в одной клетке) возмущения CRISPR-KO и CRISPR-A внутри одной молочной железы мыши, экспрессирующей Cas9.

Мы представляем подробный пошаговый протокол, охватывающий проектирование библиотек гРНК, выработку и концентрацию лентивируса, внутрочный анализ, библиотечную деконволюцию и анализ данных (рисунок 1). В совокупности этот метод предоставляет практическую и масштабируемую основу для скрининга нокаута и/или активации CRISPR in vivo в молочной железе мыши и может быть адаптирован для изучения функции генов во время гомеостаза тканей, различных контекстов заболеваний, других тканей и других видов, таких как крыса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с животными проводились в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными и были одобрены Комитетом по уходу за животными Центра феногеномики (протокол 26-0272H).

1. Клонирование библиотеки CRISPR

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается объединённое клонирование библиотек CRISPR knockout и активации CRISPR из массив синтезированных олигонуклеотидов в лентивирусные основы. Мы регулярно генерируем библиотеки, содержащие до 4000 гРНК, которые можно открыть с охватом 400X-1000X на 8-20 мышей. Количество gRNA и покрытие можно корректировать по мере необходимости, что влияет на количество мышей, необходимых для поддержания статистической мощности. Мы рекомендуем поддерживать минимальное покрытие 400X, что может быть достаточно для сильных фенотипов усиления функции.

  1. Руководство по проектированию библиотек РНК
    1. Составить список всех генов мышей для скрининга в одном эксперименте для дальнейшего проектирования библиотек CRISPR, поддерживая отдельные списки целей для библиотек CRISPR knockout (CRISPR-KO) и активации CRISPR (CRISPR-A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: БИБЛИОТЕКИ CRISPR-KO и CRISPR-A генерируются отдельно и могут быть комбинированы на стадии лентивирусной трансдукции для одновременного скрининга.
    2. Для библиотек CRISPR-KO выберите четыре-пять однонаправленных РНК (sgRNA) на ген с использованием алгоритмов прогнозирования с высоким баллом, таких какCRISPick 62,63,CHOPCHOP 64 или VBCScore 65.
      ПРИМЕЧАНИЕ: VBC Score показывает очень высокую эффективность и точнуюактивность 66. Независимо от инструмента, отдавайте приоритет гайдам с высокой прогнозируемой активностью по цели, минимальным потенциалом внецелевой цели и экзонами, кодирующими таргетингом.
    3. Для библиотек CRISPR-A выберите от восьми до десяти гайдов на ген с помощью CRISPick62,63 илиCHOPCHOP 64. Для инструментов, позволяющих пользовательски заданные длины направляющих (например, CHOPCHOP), установите длину направляющей на 14 bp перед генерацией направляющей. Если использовать инструмент, генерирующий только 20 б.п., преобразуйте эти последовательности в мертвые РНК (dgRNA), сохраняя последовательность 14 bp непосредственно в 5' соседнего протоспейсера, которая нацелена на промоторные области генов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: dgRNA — это усечённые направляющие последовательности, предназначенные для активации транскрипции на основе CRISPR примерно на 50-85% эффективности полноразмерныхsgRNA 55 без индуцирования расщепленияДНК 59,60,61.
    4. Объедините все sgRNA или dgRNA, соответствующие одному эксперименту, в отдельные списки для обеспечения равномерного клонирования, вирусного производства и скрининга in vivo .
      ПРИМЕЧАНИЕ: sgRNA и dgRNA, которые будут скринингироваться вместе, будут объединены после вирусного производства.
    5. Генерируйте объединённые отрицательные контрольные библиотеки для скринингов CRISPR-KO и CRISPR-A, включая нетаргетируемые55,67 и негенные gRNAпоследовательности 68, как было описано ранее, для контроля фоновых эффектов независимо от нарушения или активации гена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно создать отдельные библиотеки нецелевых и негенных gRNA для создания двух независимых отрицательных управляющих библиотек.
  2. Проектирование и усиление бассейнов олигонуклеотидов
    1. Проектирование объединяет олигонуклеотиды так, чтобы каждая гРНК содержала таргетную последовательность, навесы рестрикционного фермента, совместимые с лентивирусной основой, и библиотечно-специфические праймерные последовательности для обеспечения селективной амплификации из сложного пула олигонуклеотидов (Рисунок 1, Таблица 1).
    2. Назначить уникальную пару праймеров каждой библиотеке gRNA для независимой амплификации отдельных библиотек из общего пула олигонуклеотидов. Уникальные пары праймеров приведены в Таблице 1.
    3. Упорядочите объединённые библиотеки олигонуклеотидов с коммерческой платформы синтеза массивов, обеспечивая эквимолярное представление всех gRNA в каждом пуле.
    4. Амплифицировать отдельные библиотеки гРНК из объединённого шаблона олигонуклеотида с помощью специфических для библиотеки праймеров в следующей реакционной смеси. Реакцию можно модифицировать, чтобы она соответствовала рекомендуемому составу конкретной полимеразы. Подготовьте три реакции с объединённым шаблоном олигонуклеотида и одну отрицательную контрольную реакцию без шаблона.
      4 ng Пулированный олигонуклеотидный шаблон
      2,5 мкл 10 мкм Прямой библиотечный праймер
      2,5 мкл 10 мкм Обратный библиотечный праймер
      10 мкл 5x реакционный буфер
      0,5 мкл Высокоточная ДНК-полимераза
      X мкл Вода без нуклеазы
      50 мкл Общий объём
    5. Проведите усиление ПЦР с использованием следующих циклических условий, регулируя температуру отжига на основе специфической для библиотеки температуры плавления праймера:
      1 цикл при 98 °C в течение 30 секунд
      18 циклов при температуре 98 °C в течение 10 с, 62–65 °C на 20 с и 72 °C в течение 3 с
      1 цикл при 72 °C в течение 5 минут
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 18–19 циклов амплификации для сохранения равного представления gRNA внутри библиотеки.
    6. Разрешить продукты ПЦР на 2,5% агарозном геле при 120 В примерно в течение 45 минут и вырезать полосу, соответствующую ожидаемому размеру вставка gRNA (примерно 100 ударных пунктов, в зависимости от конструкции праймера; Рисунок 2A).
    7. Очищайте продукты ПЦР с помощью набора для экстракции геля и элюируйте в 20 мкл ультрачистой воды на последнем этапе элюирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Очищенные вставки gRNA могут храниться при -20 °C перед клонированием.
  3. Подготовка и переваривание лентивирусного позвоночника
    1. Подготовьте лентивирусные основные плазмиды, содержащие съемную последовательность пуффера для клонирования вставок gRNA. Для in vivo библиотеки CRISPR-KO и CRISPR-A используют pLKO-Cre (Addgene Plasmid #158032 или 256774) и pXPR502-PPH-Cre (Addgene Plasmid #256776) соответственно.
    2. Переварить 5–10 мкг ДНК лентивирусной основы в общем объёме реакции 200 мкл с использованием соответствующего рестриктивного фермента и буфера. Используйте Esp3I для основной основы pLKO-Cre CRISPR-KO и SapI для основы pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A.
      5–10 мкг Основная плазмида
      20 мкл 10x ферментный буфер
      Фермент рестрикции 5 мкл
      X мкл Вода без нуклеазы
      200 мкл Общий объём
    3. Инкубировать реакции пищеварения в течение 2–3 часов при 37 °C.
    4. Добавляйте 2 мкл рекомбинантной щелочной фосфатазы в каждую реакцию пищеварения и инкубируемые в течение 1 часа при 37 °C для дефосфорилирования переваренного позвоночника.
    5. Разрешить переваренные продукты на 1% агарозном геле и удалить полосу, соответствующую линеаризованному позвоночнику (рисунок 2B,C)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обоих позвоночников фрагмент пуффера виден как отдельная полоса примерно на 2000-2500 п.п., в зависимости от вектора.
    6. Очистите вырезанную ДНК с помощью набора для экстракции геля и элюируйте в минимальном объёме ультрачистой воды для поддержания высокой концентрации ДНК (обычно 20 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Очищенные переваренные позвоночники могут храниться при -20 °C перед перевязкой.
  4. Переваривание и лигирование библиотек gRNA
    1. Организовать комплексные реакции переваривания-лигационирования с использованием 750 нг очищенной лентивирусной ДНК, 43 нг вставной ДНК библиотеки гРНК, 3 мкл рестрикционного фермента, 7,5 мкл ДНК-лигазы T4, 15 мкл 10 мМ АТФ и соответствующего количества буфера реакции и стерильной дистиллированной воды для достижения общего объёма реакции 150 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте тот же рестрикционный фермент, который изначально применялся на этапе переваривания плазмидного хребта. Соотношение 750 нг очищенной лентивирусной основы к 43 нг библиотечной вставной ДНК даёт приблизительное соотношение вектора к вставкам 1:7 при использовании рекомендуемых позвоночников.
    2. Разделите каждую слигающую смесь на три равных аликвота для повышения эффективности преобразования и сложности библиотеки.
    3. Подготовьте одну отрицательную контрольную реакцию, содержащую ДНК из основного корпуса, но без вставок gRNA, для оценки фоновой связки.
    4. Инкубировать реакции переваривания и лигации за ночь при 30 °C.
    5. На следующее утро добавьте по 1 мкл соответствующего рестриктивного фермента в каждую аликвотную реакцию и инкубируемые в течение 1 часа при 37 °C, чтобы обеспечить завершение переваривания позвоночника.
    6. Добавьте 2 мкл 10 мМ АТФ и 2 мкл ДНК-лигазы T4 в каждую реакцию и инкубируют при 25 °C в течение 2–3 часов для завершения связывания.
    7. Объедините три отдельные реакции переваривания-лигации в каждой библиотеке, очистите реакции с помощью метода очистки олигонуклеотида на основе колонок и элюируйте каждую в 21 мкл сверхчистой стерильной дистиллированной воды. Элюйте единственную очищенную отрицательную контрольную реакцию в 7 мкл ультрачистой стерильной дистиллированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не элюируйте продукты для лигирования в буферах, содержащих соль или ЭДТА, так как они значительно снижают эффективность бактериального электропорирования. (ТОЧКА ПАУЗЫ) Очищенные продукты лигирования могут храниться при -20 °C перед электропорациями.
  5. Электропорация и расширение библиотеки
    1. Предварительное охлаждение электропорационных куветов диаметром 0,1 см, микроцентрифугные трубки с 2 мкл аликвотами очищенных препаратов для лигирования и 14 мл круглодонных полипропиленовых пробирок на льду не менее 20 минут перед электропорациями.
    2. Разморозить электрокомпетентные бактериальные клетки на льду и аккуратно смешать 25 мкл клеток с 2 мкл очищенного продукта лигации в предварительно охлаждённой трубке микроцентрифуги с помощью пипетирования.
    3. Перенесите смесь клеток-ДНК в предварительно охлаждённую электропорационную кювету диаметром 0,1 см и электропорируйте при напряжении 1,8 кВ, 25 мкФ и 200–600 Ω.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная электропорация обычно даёт временную константу от 4,6 мс до 4,9 мс.
    4. Немедленно добавьте 1 мл предварительно нагретого восстановительного материала при температуре 37 °C, поставляемого с электрокомпетентными элементами, аккуратно подвесьте элементы и перенесите подвеску в круглодонную полипропиленовую трубку объёмом 14 мл.
    5. Инкубировать восстановленные клетки при 30 °C, встряхивая при 180 об/мин в течение 90 минут.
    6. Пластинка 10 мкл восстановленных клеток разбавляется в 90 мкл бульона LB на пластины LB-агар с ампициллином и инкубируется ночью при 30 °C для оценки эффективности трансформации и фоновой связки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное клонирование должно привести к появлению сотен колоний на пластине с вставками и небольшого количества (> 30) колоний на отрицательной контрольной пластине (рисунок 3).
    7. Дополнительно проверьте библиотеку, выбрав ~10 колоний для miniprep и Sanger для секвенирования форвардов с промоутера U6. Успешно клонированные библиотеки будут иметь < 90% минипрепов, содержащих чёткое секвенирование gRNA, без повторных направляющих по 10 минипрепсам. Кроме того, рестриктивный фермент переваривает минипрепы и объединённую библиотеку плазмид (шаг 1.5.10) и запускает агарозный гель для проверки размеров полос и проверки, что лентивирусные конструкции не подверглись аномальной рекомбинации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Представленность библиотек можно оценить, сравнивая количество колоний с разбавляющих пластин с общим количеством гРНК в библиотеке, нацеливаясь на 1000-кратное покрытие. Для облегчения этого расчёта могут использоваться множественные последовательные разбавления.
    8. Если эффективность трансформации достаточна, оставшиеся восстановленные клетки поместите на пластины LB-агар шириной 15 см с соответствующим антибиотиком и инкубируете их ночью при 30 °C, чтобы создать плотный газон из колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластинка по 100 мкл восстановленных клеток на каждую из десяти 15-сантиметровых агарных пластин для восстановления достаточного количества колоний.
    9. На следующий день используйте клеточный скребок для соскреба бактериальных колоний в 500 мл бульона LB с ампициллином, чтобы получить одну бактериальную культуру, представляющую клонированную библиотеку гРНК.
    10. Расширить сгруппированную бактериальную культуру при 30 °C с встряхиванием примерно 3 часа и изолировать плазмидную ДНК с помощью набора для максимпреп.

2. Лентивирусное производство для показов in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутриканалной доставки и in vivo объединённого скрининга лентивирусные препараты должны концентрироваться для достижения высокого титра (желательно от 1 x 108 пфу/мл до 1 x 109 пфу/мл) для обеспечения эффективной трансдукции эпителиальных клеток молочной железы. Следующий протокол описывает производство лентивируса с высоким титрам, оптимизированное для использования in vivo .

  1. Подготовка клеток, производящих лентивирус
    1. Поддерживайте HEK293TN клетки в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% сыворотки плода крупного рогатого скота, 1% пенициллин-стрептомицина и культивируемых клеток при 37 °C с 5%CO2.
    2. Проходите клетки каждые 2–3 дня для поддержания логарифмического роста и обеспечения того, чтобы соединение клеток не превышало 90%. Используйте клетки в проходах <20 для оптимальной продукции вируса.
    3. За день до трансфекции покрыть 15-сантиметровые тканевые посевные пластины поли-L-лизином (0,02 мг/мл) в течение 1 часа при комнатной температуре. Подготовьте девять тарелок для одной партии вирусной подготовки.
    4. Удалите раствор поли-L-лизина и дважды помойте пластины физиологическим раствором, содержащим фосфатный буфер.
    5. Посеять 1,1 x 107 HEK293TN клеток на каждую из девяти поли-L-лизин-покрытых 15-см пластин для культуры тканей, обеспечивая достигание слияния клеток ~90% во время трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для применений, не требующих максимального титра вируса, производство лентивируса можно сократить до меньшего количества пластин (например, три или шесть пластин) с пропорционально сниженной урожайностью. Соответственно уменьшайте количество реагентов (плазмидная ДНК, ПЭИ и ДМЭМ) для трансфекции.
  2. Лентивирусная трансфекция на основе ПЭИ
    1. Подготовить ДНК плазмиды для производства лентивируса с помощью трёхплазмидной системы, включающей 95 мкг плазмиды библиотеки gRNA, 95 мкг упаковочной плазмиды psPAX2 (Addgene Plasmid #12260) и 65 мкг оболочивой плазмиды VSV-G pMD2.G (Addgene Plasmid #12259).
    2. Объедините три плазмиды для выработки лентивируса в 10,8 мл безсывороточного DMEM и тщательно перемешайте путём вихря примерно в течение 10 секунд.
    3. Добавьте 366 мкл 1 мг/мл полиэтиленимина (ПЭИ) по капле в разбавленный раствор ДНК, тщательно перемешайте вихрь примерно 10 секунд и инкубируете комплексы ДНК-PEI при комнатной температуре в течение 10–30 минут.
    4. Во время сложного формирования аспирируйте культурную среду из HEK293TN пластин и добавляйте 14 мл безсывороточного DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка плода может подавлять поглощение плазмид клетками.
    5. Распределите 1,2 мл комплекса ДНК-PEI по каплям по плите и породе, чтобы обеспечить равномерное распределение.
    6. Инкубировать клетки при 37 °C с 5%CO2 в течение 6–8 часов.
    7. Замените среду на каждой пластине предварительно подогретой DMEM объёмом 20 мл с добавлением 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота (без 1% пенициллин-стрептомицина) и продолжайте культуру клеток при 37 °C с 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ночная трансфекция не рекомендуется, так как длительное воздействие ПЭИ и нехватка сыворотки снижают выход вируса.
  3. Сбор вирусов и ультрацентрифугирование
    1. Приготовьте 200 мл раствора сахарозной подушки, смешав 40 г сахарозы, 11,7 г хлорида натрия, 4 мл 1 M HEPES (pH 7,4) и 1 мл 0,5 M EDTA (pH 7,9) в соответствующем объёме стерильной дистиллированной воды и фильтруйте-стерилизуйте через фильтрационную установку полиэфирсульфона с низким содержанием белка с низким содержанием белка. Этот раствор можно хранить при 4 °C в течение нескольких месяцев.
    2. Забирайте лентивирусный супернатант через 48–72 часа после трансфекции.
    3. Пропустите 10 мл DMEM с добавлением 10% сыворотки плода крупного рогатого скота через фильтрационную установку полиэфирсульфона с низким содержанием белка с концентрацией 0,45 мкм. Отбросьте поток сквозь. Загрузите супернатант на фильтр и примените вакуум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация не может быть немедленно установлена, храните просветленный вирусный супернатант при 4 °C на ночь.
    4. Добавьте 30 мл очищенного вирусного супернатанта в ультрацентрифуговую трубку.
    5. Постепенно наносите под очищенный вирусный супернатант 4 мл раствора сахарозной подушки.
    6. Поместите ультрацентрифугную трубку в совместимый адаптер для качающегося ротора и точно сбалансируйте трубки.
    7. Центрифугуйте трубки при 104 000 × г минимум 2 часа при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильного пропуска вируса через сахарозную подушку требуется качающийся ротор, такой как ротор Beckman JS24.38.
    8. Аккуратно декантуйте супернатант, не нарушая вирусную гранулу, которая может выглядеть как слабая белая или полупрозрачная плёнка внизу трубки.
    9. Дайте трубкам высохнуть на воздухе минимум 10 минут и используйте лабораторную салфетку, чтобы удалить как можно больше остатков жидкости изнутри, не нарушая гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная сушка трубки критически важна для достижения высоких концентраций вируса, так как уменьшает объём конечного восстановления.
    10. Суспензируйте вирусные гранулы в 20 мкл холодного фосфат-буферного физиологического раствора и аккуратно протягивая пипетку вверх и вниз, стараясь избежать воздушных пузырьков.
    11. Инкубировать трубки на льду в течение 2 часов с мягким перемешиванием, чтобы полностью восстановить вирусные гранулы.
    12. Перенесите концентрированный вирус в чистую микрофужную трубку и очистите раствор центрифугой при 2000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот спин удаляет мусор и остаточные частицы, которые забивают иглу во время операции.
    13. Аликвотируйте концентрированный вирус в одноразовых объёмах, чтобы избежать повторных заморозок и оттаивания, и храните при -80 °C.
  4. Лентивирусная титрация с использованием LSL-tdЭмбриональные фибробласти томатных мышей (MEF)
    1. Пластинка 100 000 LSL-tdТоматных MEFs (полученных из Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) в пластине с 6 лунками за день до заражения в DMEM, дополненных сывороткой 10% плода бычьего скота, 1% пенициллин-стрептомицином, и культивировать клетки при 37 °C с 5%CO2. Поставьте дополнительный колодец для подсчёта клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: LSL-tdТоматные МЭФ выступают в роли репортёра для Cre внутри лентивируса. Может использоваться любая подходящая система репортеров для вирусного титрирования других магистралей.
    2. На следующий день подсчитайте количество LSL-tdTomato MEF из дополнительной скважины, чтобы количественно определить количество клеток, присутствующих на момент заражения.
    3. Приготовьте серийные разбавления концентрированного лентивируса, кодирующего Cre рекомбиназу, в общей сложности 2 мл модифицированной среды Eagle от Dulbecco с добавлением сыворотки из 10% плода бычьего скота. В целом, концентрированный вирус составляет 0,4 мкл, 0,1 мкл и 0,025 мкл концентрированного вируса, который обеспечивает чистый динамический линейный диапазон (рисунок 4A–D).
    4. Добавьте по 2 мл вирусного разбавления в каждую яме LSL-tdTomato MEF и по 2 мкл полибрена по 10 мг/мл в каждую.
    5. Заражайте MEF, вращаясь при 400 × г в течение 90 минут при 37 °C.
    6. Заменить вирусную среду на 2 мл DMEM с добавлением 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота, 1% пенициллин-стрептомицина и культивировать клетки при 37 °C с 5% CO2 в течение 48–72 часа.
    7. Количественно определить td-томатно-положительные клетки с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии, чтобы определить долю инфицированных клеток при каждом разбавлении.
    8. Вычислите функциональный титр на основе доли инфицированных клеток и количества клеток, присутствующих на момент заражения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ВИРУСЫ CRISPR-KO и CRISPR-A производятся, концентрируются и титрируются отдельно. Функциональные титры, определяемые с помощью LSL-tdТоматные MEF, используются для смешивания вирусов CRISPR-KO и CRISPR-A в определённом пропорции перед внутриканальной инъекцией.
  5. Оценка качества библиотек плазмид и лентивирусов
    1. Чтобы убедиться, что библиотеки gRNA клонированы с достаточной глубиной/покрытием и что все gRNA сохраняются во время клонирования и производства вирусов, настоятельно рекомендуется секвенировать пул плазмид, а также трансдуцированные MEF.
    2. Для оценки покрытия лентивирусом трансфицируйте MEF лентивирусом при охвата >1000× на основе рассчитанного вирусного титра. На этом этапе не обязательно обеспечивать одиночное заражение клеток.
    3. Через 48–72 часа отдельте клетки с помощью трипсина или скребка и пеллетуйте. Извлекайте ДНК с помощью коммерческого набора для извлечения gDNA.
    4. Последовательность 1 мкг плазмиды и 3 мкг экстракции MEF ДНК по протоколу, описанному в разделе 5. Глубокое секвенирование 5 миллионов чтений достаточно для большинства кастомных библиотек с <5000 гРНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сильная корреляция (R 2> 0,6) между чтением пула плазмид и относительно равным представлением гайдов (>70% гайдов в течение одного логарифмического десятилетия) без доминирующего количества отдельных гайдов в библиотеках свидетельствует о хорошем качестве (рисунок 4E).

3. Внутрипроточная инъекция лентивируса в молочную железу мыши

  1. Разбавление иглой и вирусом
    1. Вытягивайте иголки стеклянных микрокапилляров с помощью микропипеточного иголочного вытягивателя для получения мелкоконечных капилляров, подходящих для внутритрубопроводного введения объёмом 9–10 мкл. Используйте тонкие щипцы, чтобы отломать самый кончик иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное расположение создаёт размер иглы, достаточно большой, чтобы её можно было наполнить жидкостью, но при этом достаточно тонкий, чтобы легко помещаться в отверстие соска.
    2. Разбавить лентивирусные препараты до конечной концентрации 1 ×107 пфу/мл в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе с добавлением 0,05% (с в/в) красителем Fast Green FCF.
    3. При смешивании вирусов CRISPR-KO и CRISPR-A для скрининга в одном комплексном пуле можно скорректировать обе библиотеки на равный вирусный титр с помощью стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора и смешать их в соотношении для обеспечения равномерного представления gRNA в обеих библиотеках.
  2. Подготовка мышей для внутрёковых инъекций
    1. Обезболить взрослую самку мыши (8–20 недель) под 4% изофлурана с кислородом 1 л/мин и нанести стерильную офтальмологическую смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрипродуктальная инъекция — это неинвазивная процедура и не требует обезболивания. Для этих экспериментов используйте мыши Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 или Rosa-LSL-tdTomato.
    2. Закрепите мышь в положении на спине на накрытой грелке, установленной на низкий режим для поддержания температуры тела и анестезии с использованием 2% изофлурана с 1 л/мин кислорода через носовой конус на протяжении всей процедуры.
    3. Удалите шерсть вокруг третьего грудного и четвёртого брюшных сосков с помощью депиляционного крема, нанесённого стерильной ватной палочкой в круглую область радиуса примерно 0,5 см в течение 10–15 секунд. Немедленно снимите крем стерильной марлей и стерильной водой, чтобы предотвратить раздражение кожи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Третья и четвёртая молочные железы обычно легче всего для инъекций. В качестве альтернативы вторая и пятая железы могут быть подготовлены к инъекции аналогичным образом.
    4. Дезинфицируйте кожу вокруг каждого соска, последовательно стирая 70% изопропилового спирта и йода стерильной марлей.
    5. Поместите мышь под микроскоп для вскрытия в шкафу для биобезопасности, чтобы получить чёткое визуализирование сосков.
    6. Используя тонкие щипцы, очищенные 70% этанолом, аккуратно удалите мёртвую кожу, накрывающую сосок, чтобы открыть отверстие в протоке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот мертвый кератинизированный слой слабо прикреплён и может мешать проникновению иглы. Удаление не должно повреждать жизнеспособную кожу или подлежащие ткани.
  3. Внутрипроточечная инъекция
    1. Загрузите 8 мкл разбавленного вируса в микрокапилляр из стекла.
    2. Удержите область соска тонкими щипцами и аккуратно введите кончик иглы в отверстие соска (рисунок 5A). Правильно расположенная игла войдёт в воздуховод с минимальным сопротивлением. Постепенно вводите вирусную суспензию в молочный проток в течение 5–10 секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 8 мкл 1 × 107 пфу/мл лентивируса обеспечат примерно 30% инфекционности эпителиальных клеток люминальной молочной железы и 5% инфекционности базальных эпителиальных клеток молочной железы, при этом незначительная инфекция (< 0,5%)стромы 36. Вирусный титр можно скорректировать для достижения более высокой или меньшей инфекционной активности.
    3. Отслеживайте распространение красителя Fast Green во время инъекции через микроскоп. Подтверждение успешной внутриканальной доставки, наблюдая дисперсию красителя по всей проточечной сети под кожей (рисунок 5B).
    4. Идентифицировать неудачные инъекции путём накопления красителя внутри жировой подушки молочной железы рядом с соском, а не вдоль протока (рисунок 5C).
    5. Повторите процедуру инъекции для третьей грудной и четвёртой брюшной молочных желез с обеих сторон, в общей сложности вводя четыре железы на мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С опытом успешная внутритрубная доставка достигается в >95% инъекций. Неудачные инъекции в жировой подушечке не связаны с побочными эффектами, и оставшиеся железы всё равно могут использоваться. Дальнейшая проверка инъекций может проводиться с помощью иммуногистохимии и потоковой цитометрии (рисунок 5D, E).
    6. Прекратите анестезию и перенесите мышь в чистую клетку для восстановления.
    7. Следите за мышью, пока она полностью не передвигается, и возвращайте её в специально отведённый биозащитный корпус, когда поведение соблюдается в норме.
    8. Через три дня после инъекции выполните полную замену клетки, выбрасывая корпус и подстилку как вирусные отходы, и переносите мышь в чистую клетку, которую можно вернуть в стандартное помещение.

4. Выделение геномной ДНК из молочных желез и опухолей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия мышей с помощью воздействияCO2 или передозировки анестетиков с последующим вывихом шейки матки, в соответствии с рекомендациями по уходу за животными. Собирайте молочные железы или опухоли молочной железы в нужные сроки или в гуманном конечном состоянии согласно нормативным требованиям. Инфицированные клетки собирались уже через 48 часов после лентивируснойинфекции 36,55 или в течение 5+ месяцев после инъекции у диких мышей36 часов, или >24 месяца в онкогенномфоне 55. Следующие шаги следует выполнять в помещении, очищенном с помощью ДНК Erase и с оборудованием, свободным от плазмид, содержащих кассеты sgRNA/dgRNA. Даже следовые количества плазмидной ДНК достаточно, чтобы привести к загрязнению образцов тканей, поэтому следует проводить последующие глубокие секвенирование ПЦР и отрицательные (без тканей) контроль для обеспечения чистой подготовки.

  1. Диссоциация тканей
    1. Для молочных желез переварить каждую молочную железу в 2 мл полного Epicult-B Medium (мыши), дополненного 0,2 мл мягкой коллагеназы/гиалуронидазы в конической трубке объёмом 15 мл и инкубировать ночь при 37 °C.
    2. Пеллетные клетки диссоциировали при 450 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
    3. Аккуратно перенесите верхний жировой слой с помощью пипетки, покрытой альбумином из сыворотки крупного рогатого скота, в новую коническую трубку объёмом 15 мл и выбросьте оставшийся супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний жировой слой на этом этапе часто содержит остаточные эпителиальные органоиды, которые не были отделены и остаются ассоциированными с жировой тканью. Обработка этой фракции в отдельной трубке значительно увеличивает восстановление эпителиальных клеток.
    4. Промыйте жировую фракцию и клеточную гранулу один раз 5 мл физиологического раствора с фосфатным буфером, центрифугуйте при 450 × г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте супернатанты.
    5. Объедините промытую жировую фракцию и клеточную гранулу из той же молочной железы в одну коническую трубку объёмом 15 мл, содержащую 5 мл фосфатно-буферного физиологического раствора.
    6. Гранулируйте комбинированный материал при 450 × г в течение 5 минут и сбросьте супернатант.
    7. При опухолях молочной железы измельчите ткань на мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц или скальпеля и напрямую переносите в микрофужную трубку объемом 2 мл.
  2. Геномная изоляция ДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Геномная экстракция ДНК может проводиться с помощью набора Qiagen DNEasy Blood and Tissue согласно инструкциям производителя или следующего протокола фенолхлороформа.
    1. Подготовьте буфер для лизиса ДНК, объединив 5 мл 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 мл EDTA (pH 8,0), 25 мл 5 M NaCl и 50 мл 10% SDS, и доведите итоговый объём до 500 мл стерильной дистиллированной водой.
    2. Добавьте 1 мл буфера для лизиса ДНК и 10 мкл протеиназы K (20 мг/мл) в каждый образец и тщательно перемешайте инверсией.
    3. Инкубировать образцы при 56 °C ночью для полного лизиса.
    4. Центрифуга лизируется при 16 000 × г в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы получить гранулы нерастворимого мусора.
    5. Перенесите очищенный супернатант в новую микроцентрифугную трубку объемом 2 мл.
      ВНИМАНИЕ: Фенол:хлороформ:изоамил-спирт токсичен и коррозионен. Выполняйте все действия с органическими растворителями в вытяжке с химическим дымом, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты.
    6. Добавьте равный объём спирта фенол:хлороформ:изоамил-спирт и энергично перемешайте путём вихря примерно 15 с до образования однородной смеси.
    7. Центрифугировать при 16 000 × г в течение 10 минут при 4 °C для разделения органической и неорганической фаз.
    8. Аккуратно перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку, не нарушая межфазу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте аспирационного материала из белой интерфазы, чтобы минимизировать загрязнение белков и РНК.
    9. Добавьте 0,7 объёма изопропанола в восстановленную водную фазу и энергично перемешайте с помощью вихря примерно 15 секунд.
    10. Центрифуга при 16 000 × г в течение 10 минут при 4 °C.
    11. Аккуратно сбросьте супернатант и прополосните ДНК-гранулу 500 мкл 70% этанола.
    12. Центрифугуйте при 16 000 × г в течение 10 минут при 4 °C и полностью удалите этанол.
    13. Высушить ДНК-гранулы на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут.
    14. Суспензировать ДНК-гранулу в 50 мкл стерильной дистиллированной воды.
    15. Инкубировать образцы при 37 °C в течение 1 часа или при 4 °C ночью для полной реанимации геномной ДНК.
    16. Измеряйте концентрацию и чистоту ДНК с помощью нанодроп или флюорометрической квантифицированной оценки.

5. Секвенирование библиотек CRISPR следующего поколения


ПРИМЕЧАНИЕ: Сгенерируйте эталонную образцу для расчёта изменений складок gRNA со временем. Трансдуцированные МЭФ (Секция 2) или молочные железы (Секция 4), собранные через 3 дня после заражения, а также исходный плазмидный максипреп могут быть использованы для определения представления в стартовой библиотеке и вирусном запасе.

  1. ПЦР-амплификация гРНК-кассет из геномной ДНК
    1. Используйте пары праймеров, перечисленные в таблице 2 , для уникального индексирования образцов, что позволяет мультиплексировать и демультиплексировать до 306 образцов после секвенирования.
    2. Подготовьте ПЦР-реакции с использованием 1 мкг геномной ДНК в качестве шаблона в общем объёме реакции 50 мкл, содержащем 25 мкл 2x Q5 Master Mix, 2,5 мкл прямого праймера 10 мкм и 2,5 мкл 10 мкм обратного праймера.
    3. Включите параллельную реакцию контроля без шаблонов для мониторинга загрязнения.
    4. Проведите усиление ПЦР с использованием следующих циклических условий, регулируя температуру отжига на основе специфической для библиотеки температуры плавления праймера:
      1 цикл при 98 °C в течение 30 секунд
      5 циклов при 98 °C в течение 10 с, 68 °C (-1 °C/цикл) 10 с и 72 °C 15 с
      20 циклов при температуре 98 °C в течение 10 с, 63 °C на 30 секунд и 72 °C в течение 15 с
      1 цикл при 72 °C в течение 2 минут
    5. Определите продукты с ПЦР на 2,5% агарозном геле, чтобы определить правильный размер ампликона.
    6. Подтвердите наличие полос примерно на 306 bp для pLKO-базированных sgRNA библиотек и 430 bp для dgRNA на основе pXPR502 (рисунок 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чёткий контроль без шаблонов обеспечивает чистоту реагентов и подтверждает, что анализ не подвержен перекрёстному загрязнению.
    7. Очищайте продукты ПЦР с помощью подходящего метода очистки ДНК и количественно измеряйте концентрацию ДНК с помощью флюорометрической квантификации.
  2. Секвенирование следующего поколения
    1. Определить необходимую глубину секвенирования на основе ожидаемой сложности библиотеки и клональности сэмпла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для опухолей, подозреваемых в клональности, примерно 1 миллион считываний на образец достаточно для точной количественной оценки направляющей представленности. Чтобы рассчитать глубину секвенирования по молочным железам, умножьте количество руководств в библиотеке на 1000-кратное покрытие, затем умножьте на 6 пг геномной ДНК/клетки, чтобы вычислить общую массу геномной ДНК на образец, который должен быть амплирован с помощью ПЦР. Общее количество чтений, требуемых для секвенирования, равно количеству руководств в библиотеке, умноженное на 1000.
    2. Объединить очищенные библиотеки из разных образцов в эквимолярных концентрациях.
    3. Библиотеки последовательности объединялись с помощью платформы секвенирования Illumina с коротким чтением.
  3. Анализ данных
    1. Демультиплексное сырое секвенирование FASTQ-файлов с использованием специфичных для выборок индексов.
    2. Трим считывает последовательность gRNA protospacer с помощью Trimmomatic69. Для образцов CRISPR-A триммирование считывается до 14 bp, а для CRISPR-KO — до 20 bp с конца переднего капсюля.
    3. Align trimmed считывается в соответствующую справочную библиотеку gRNA с использованиемBowtie 70. Используйте параметры выравнивания -v 2 и -m 1 для CRISPR-KO и -v 2 и -m 2 для CRISPR-A и смешанных пулов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно более 90% считываний успешно выравниваются. Низкое выравнивание обычно возникает из-за ошибок обрезания, неправильного форматирования входных файлов или загрязнения образца во время ПЦР.
    4. Количественно определить выровненные считывания для каждой gRNA с помощью функции подсчёта в MAGeCK72 для создания окончательных таблиц подсчёта gRNA для дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы предлагаем протокол объединённого скрининга in vivo CRISPR в молочной железе мыши. Этот конвейер может использоваться сквозь конец для проектирования и амплификации объединённых гРНК-библиотек из олигонуклеотидных массивов, клонирования библиотек гРНК в лентивирусные основы, производства высокотитрового лентивируса, внутриканальной доставки объединённых лентивирусных библиотек во взрослую молочную железу и восстановления гРНК для секвенирования деконволюции библиотечног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ключевым фактором при объединённом in vivo скрининге CRISPR является обеспечение достаточного охватов библиотеки при сохранении разрежённой одноклеточной трансдукции для сохранения клонального разрешения2. В молочной железе мыши эпителиальный компартмент консервативно состоит примерно из 3,5 × 105 клеток наодну железу 36. При средней скорости трансдукции лентивируса 15%, что минимизирует частоту множественных инфекций на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Д.С. является консультантом и основателем ViVerita Therapeutics, а его лаборатория спонсировала исследовательские и сервисные соглашения с ViVerita Therapeutics.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим всех сотрудников наших лабораторий за полезные комментарии и обсуждения, связанные с этой работой. Мы также благодарим и признаем Центр феногеномики за всю помощь и экспертизу в работе с мышами в Исследовательском институте Луненфельда-Таненбаума (LTRI), Торонто, Канада. Это исследование было поддержано грантом Канадского института исследований здоровья (PJT462506) и грантом Terry Fox Research Institute Program Projects для D.S. (TFRI Project #1107) для D.S. и Фондом семьи Никол. E.R.L. была поддержана Канадским онкологическим обществом за исследовательскую подготовку и Мемориальным фондом Фрэнка Флетчера. K.N.A. была поддержана постдокторской премией H.L. Holmes и грантами 1318698 и 26089 от Cancer Research Society. Дж.Н. был поддержан стипендией магистратуры Канадского института исследований здравоохранения и премией Канадских институтов медицинских исследований (#193389). Y.L получила поддержку стипендией Канадского института исследований в области исследований, разнообразия и независимости (#ED6-190718).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.45 micron filterSigmaS2HVU02RE
12k or 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture platesCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkaline phosphataseNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart bufferNEBB6004S
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)Illumina
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kitQiagen69506
Dulbecco’s modified Eagle mediumWisent319-015-CL
Endura electrocompetent cellsLucigen60242-1
EpiCult-B Mouse Medium KitStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Fetal Bovine SerumWisent090-150
Gel DNA-cleanup kitZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation CuvettesBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
High-Speed CentrifugeBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
Micropipette pullerSutter InstrumentP97
Mini-prep plasmid KitFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)NEBR0580L
Oligo Clean and ConcentratorZymo ResearchD4061
Oligo cleanup kitZymo researchD4060
PAGE purified illumina sequencing primerIDT DNA
PCR MicropipettesDrummond5-000-1001-X10
PEI (polyethyleneimine)Sigma408727-100ML
Penicillin and StreptinomycinWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysineSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Fluorometric QuantificationInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato miceJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligaseNEBM0202L
Ultra-centrifuge tubesBeckman Coulter344058
Vacuum Filter UnitsFisher ScientificSCHVU02RE

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  2. Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
  3. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nat Biotechnol. 34 (6), 631-633 (2016).
  4. Michels, B. E., et al. Pooled in vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screening identifies tumor suppressors in human colon organoids. Cell Stem Cell. 26 (5), 782-792.e7 (2020).
  5. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  6. Han, K., et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 580 (7801), 136-141 (2020).
  7. Lyu, J., et al. DORGE: discovery of oncogenes and tumor suppressor genes using genetic and epigenetic features. Sci Adv. 6 (46), eaba6784(2020).
  8. Martin, T. D., et al. The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation. Science. 373 (6561), 1327-1335 (2021).
  9. Uijttewaal, E. C. H., et al. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 43, 1848-1860 (2024).
  10. Lowden, C. CRISPR-StAR to transform in vivo functional genomic screening. Nat Rev Cancer. 25 (6), 395-395 (2025).
  11. Brisken, C., Duss, S. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective. Stem Cell Rev. 3 (2), 147-156 (2007).
  12. Fridriksdottir, A. J. R., Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L. Mammary gland stem cells: current status and future challenges. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 719-729 (2011).
  13. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes Dev. 28 (11), 1143-1158 (2014).
  14. Wuidart, A., et al. Quantitative lineage tracing strategies to resolve multipotency in tissue-specific stem cells. Genes Dev. 30 (11), 1261-1277 (2016).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Cursons, J., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The complexities and caveats of lineage tracing in the mammary gland. Breast Cancer Res. 18 (1), 116(2016).
  16. Van Keymeulen, A., et al. Lineage-restricted mammary stem cells sustain the development, homeostasis, and regeneration of the estrogen receptor positive lineage. Cell Rep. 20 (7), 1525-1532 (2017).
  17. Mahendralingam, M. J., et al. Mammary epithelial cells have lineage-rooted metabolic identities. Nat Metab. 3 (5), 665-681 (2021).
  18. Casey, A. E., et al. Mammary molecular portraits reveal lineage-specific features and progenitor cell vulnerabilities. J Cell Biol. 217 (8), 2951-2974 (2018).
  19. Kim, H., et al. Differential DNA damage repair and PARP inhibitor vulnerability of the mammary epithelial lineages. Cell Rep. 42 (10), 113256(2023).
  20. Waas, M., et al. Droplet-based proteomics reveals CD36 as a marker for progenitors in mammary basal epithelium. Cell Rep Methods. 4 (4), 100741(2024).
  21. Dravis, C., et al. Epigenetic and transcriptomic profiling of mammary gland development and tumor models disclose regulators of cell state plasticity. Cancer Cell. 34 (3), 466-482.e6 (2018).
  22. Giraddi, R. R., et al. Single-cell transcriptomes distinguish stem cell state changes and lineage specification programs in early mammary gland development. Cell Rep. 24 (6), 1653-1666.e7 (2018).
  23. Trejo, C. L., Luna, G., Dravis, C., Spike, B. T., Wahl, G. M. Lgr5 is a marker for fetal mammary stem cells, but is not essential for stem cell activity or tumorigenesis. npj Breast Cancer. 3 (1), 16(2017).
  24. Dravis, C., et al. Sox10 regulates stem/progenitor and mesenchymal cell states in mammary epithelial cells. Cell Rep. 12 (12), 2035-2048 (2015).
  25. Boulanger, C. A., Wagner, K. U., Smith, G. H. Parity-induced mouse mammary epithelial cells are pluripotent, self-renewing and sensitive to TGF-β1 expression. Oncogene. 24 (4), 552-560 (2005).
  26. Matulka, L. A., Triplett, A. A., Wagner, K. U. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers associated with stem cells. Dev Biol. 303 (1), 29-44 (2007).
  27. Feng, Y., Manka, D., Wagner, K. U., Khan, S. A. Estrogen receptor-α expression in the mammary epithelium is required for ductal and alveolar morphogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14718-14723 (2007).
  28. Hanasoge Somasundara, A. V., et al. Parity-induced changes to mammary epithelial cells control NKT cell expansion and mammary oncogenesis. Cell Rep. 37 (10), 110099(2021).
  29. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), dev169862(2020).
  30. Twigger, A. J., Khaled, W. T. Mammary gland development from a single cell ‘omics view. Semin Cell Dev Biol. 114, 171-185 (2021).
  31. Bach, K., et al. Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors. Nat Commun. 12 (1), 1502(2021).
  32. Twigger, A. J., et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun. 13 (1), 562(2022).
  33. Ciwinska, M., et al. Mechanisms that clear mutations drive field cancerization in mammary tissue. Nature. 633 (8028), 198-206 (2024).
  34. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. J Virol. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  35. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage tracing of mammary epithelial cells using cell-type-specific Cre-expressing adenoviruses. Stem Cell Rep. 2 (6), 770-779 (2014).
  36. Langille, E., et al. Loss of epigenetic regulation disrupts lineage integrity, induces aberrant alveogenesis, and promotes breast cancer. Cancer Discov. 12 (12), 2930-2953 (2022).
  37. Bu, W., et al. Efficient cancer modeling through CRISPR-Cas9/HDR-based somatic precision gene editing in mice. Sci Adv. 9 (19), eade0059(2023).
  38. Li, C., et al. Quantitative in vivo analyses reveal a complex pharmacogenomic landscape in lung adenocarcinoma. Cancer Res. 81 (17), 4570-4580 (2021).
  39. Foggetti, G., et al. Genetic determinants of EGFR-driven lung cancer growth and therapeutic response in vivo. Cancer Discov. 11 (7), 1736-1753 (2021).
  40. Cai, H., et al. A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS–driven lung cancer. Cancer Discov. 11 (7), 1754-1773 (2021).
  41. Wang, G., et al. CRISPR-GEMM pooled mutagenic screening identifies KMT2D as a major modulator of immune checkpoint blockade. Cancer Discov. 10 (12), 1912-1933 (2020).
  42. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nat Genet. 50 (4), 483-486 (2018).
  43. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Sci Adv. 4 (2), eaao5508(2018).
  44. Rogers, Z. N., et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods. 14 (7), 737-742 (2017).
  45. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nat Neurosci. 20 (10), 1329-1341 (2017).
  46. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  47. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  48. Wertz, M. H., et al. Genome-wide in vivo CNS screening identifies genes that modify CNS neuronal survival and mHTT toxicity. Neuron. 106 (1), 76-89.e8 (2020).
  49. Xu, C., et al. piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (4), 722-727 (2017).
  50. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. J Vis Exp. (148), e59502(2019).
  51. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), e50692(2013).
  52. Wangensteen, K. J., et al. Combinatorial genetics in liver repopulation and carcinogenesis with a in vivo CRISPR activation platform. Hepatology. 68 (2), 663-676 (2018).
  53. Jia, Y., et al. In vivo CRISPR screening identifies BAZ2 chromatin remodelers as druggable regulators of mammalian liver regeneration. Cell Stem Cell. 29 (3), 372-385.e8 (2022).
  54. Borrelli, C., et al. In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis. Nature. 632 (8024), 411-418 (2024).
  55. Al-Zahrani, K. N., Langille, E. R., Nurtanto, J., et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature. , Available from: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9 (2026).
  56. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev. 30 (12), 1470-1480 (2016).
  57. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 10 (1), 397(2019).
  58. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO J. 39 (5), embj.2019102169(2020).
  59. Dahlman, J. E., et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol. 33 (11), 1159-1161 (2015).
  60. Kiani, S., et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 12 (11), 1051-1054 (2015).
  61. Liao, H. K., et al. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell. 171 (7), 1495-1507.e15 (2017).
  62. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 9 (1), 5416(2018).
  63. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  64. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  65. Michlits, G., et al. Multilayered VBC score predicts sgRNAs that efficiently generate loss-of-function alleles. Nat Methods. 17 (7), 708-716 (2020).
  66. Lukasiak, S., et al. A benchmark comparison of CRISPRn guide-RNA design algorithms and generation of small single and dual-targeting libraries to boost screening efficiency. BMC Genomics. 26 (1), 198(2025).
  67. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
  68. Morgens, D. W., et al. Genome-scale measurement of off-target activity using Cas9 toxicity in high-throughput screens. Nat Commun. 8 (1), 15178(2017).
  69. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  70. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  71. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554(2014).
  72. Veltmaat, J. M., Ramsdell, A. F., Sterneck, E. Positional variations in mammary gland development and cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 18 (2), 179-188 (2013).
  73. Esmaeili Anvar, N., et al. Efficient gene knockout and genetic interaction screening using the in4mer CRISPR/Cas12a multiplex knockout platform. Nat Commun. 15 (1), 3577(2024).
  74. Griffith, A. L., et al. Optimization of Cas12a for multiplexed genome-scale transcriptional activation. Cell Genomics. 3 (9), 100387(2023).
  75. Sack, L. M., et al. Profound tissue specificity in proliferation control underlies cancer drivers and aneuploidy patterns. Cell. 173 (2), 499-514.e23 (2018).
  76. Yanchus, C., et al. A noncoding single-nucleotide polymorphism at 8q24 drives IDH1-mutant glioma formation. Science. 378 (6615), 68-78 (2022).
  77. Martinez, S., et al. In vivo CRISPR screens reveal SCAF1 and USP15 as drivers of pancreatic cancer. Nat Commun. 15 (1), 5266(2024).
  78. Lü, Y., et al. Genome-wide CRISPR screens identify novel regulators of wildtype and mutant p53 stability. Mol Syst Biol. 20 (6), 719-740 (2024).
  79. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils Myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343 (6168), 309-313 (2014).
  80. Bu, W., Li, Y. Advances in immunocompetent mouse and rat models. Cold Spring Harb Perspect Med. 14 (3), a041328(2024).
  81. Ben-Jonathan, N., LaPensee, C. R., LaPensee, E. W. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev. 29 (1), 1-41 (2008).
  82. Sánchez-Criado, J. E., et al. Biological role of pituitary estrogen receptors ERα and ERβ on progesterone receptor expression and action and on gonadotropin and prolactin secretion in the rat. Neuroendocrinology. 79 (5), 247-258 (2004).
  83. LaPensee, C. R., et al. The prolactin-deficient mouse has an unaltered metabolic phenotype. Endocrinology. 147 (10), 4638-4645 (2006).
  84. Kinoshita, Y., et al. Similarity of GATA-3 expression between rat and human mammary glands. J Toxicol Pathol. 27 (2), 159-162 (2014).
  85. Nicotra, R., Lutz, C., Messal, H. A., Jonkers, J. Rat models of hormone receptor-positive breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 12(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи