Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение и назначение ультразвуковых вокализаций отдельным мышам во время социальных взаимодействий

200 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71121

⸱

7 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychological and Brain Sciences, University of Delaware, 2Interdisciplinary Neuroscience Graduate Program, University of Delaware, 3Center for Bioinformatics and Computational Biology, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод записи синхронизированных видео- и аудиоданных во время многомышных социальных взаимодействий. Метод использует микрофонный массив и локализацию звукового источника для присвоения ультразвуковых вокализаций (USV) отдельным мышам, что позволяет проводить количественный анализ голосового поведения между животными и социальными контекстами.

Аннотация

Мыши (Mus musculus) общаются с помощью ультразвуковых вокализаций (USV) во время социальных взаимодействий. Однако, поскольку УЗ у мышей не связаны с чёткими визуальными индикаторами и встречаются на частотах, выходящих за пределы человеческого слухового диапазона, по-прежнему сложно определить отдельных озвучивающих мышей внутри группы. Этот протокол описывает метод записи синхронизированных видео- и ультразвуковых аудиоданных во время социальных взаимодействий с несколькими животными, что позволяет одновременно фиксировать поведение и голосовую активность. Разработан вычислительный конвейер, интегрирующий отслеживание нескольких животных, обнаружение вокализации, локализацию источника звука и распределение вокализаций отдельным животным. Далее описаны процедуры валидации, используемые для оценки точности отслеживания, извлечения вокализации, точности локализации и уверенности назначения на каждом этапе конвейера. Применение этого протокола к демонстрационному набору данных из четырёх животных даёт индивидуальное разрешённое вокальное отслеживание, пространственно точные оценки источников звука и количественные измерения вокального выхода и акустических особенностей. Вместе эти подходы обеспечивают надёжную основу для связи голосовой коммуникации с индивидуальным поведением и позволяют проводить дальнейший анализ половых различий, индивидуальной вариативности и социальной коммуникации у свободно взаимодействующих мышей.

Введение

Социальная коммуникация в животном мире является важнейшим компонентом поведенческой динамики, способствуя таким процессам, как выживание иразмножение 1,2. Среди млекопитающих мыши общаются акустически через USV, которые охватывают частоты от 35 до 110кГц 3. USV обладают сложными чертами, передающими информацию в зависимости от поведенческогоконтекста 4. Самки мышей предпочитают самцов мышей (USV) 5,6, а самцы и самки взаимодействуют вокально во время ухаживательныхповедений 7, что указывает на то, что USV выступают ключевыми социальными сигналами. Поскольку определённые признаки УСВ связаны с различными поведенческими состояниямимышей 8, точное распределение вокализаций для понимания социальных взаимодействий крайне важно.

Несмотря на обширные усилия по разъяснению функций УСВ и их связи с социальнымповедением 8, постоянной проблемой в этой области является назначение УСВ отдельным мышам во время группового взаимодействия. Трудности возникают как из-за отсутствия видимых движений рта во время производстваUSV 4 , так и из-за частотного диапазона USV, который не слышим человеческимухом 3. В результате предыдущие исследования взаимосвязи между USV и социальным поведением ограничивались упрощёнными анализами или ограниченными средами, которые ограничивают диапазон наблюдаемых групповыхповеденчений 9, давая лишь частичное представление о том, как вокальное поведение проявляется у свободно взаимодействующих животных.

Чтобы углубить понимание связи между слуховой коммуникацией и социальным поведением, необходимо охватить полный спектр мышиных поведенчений и назначать вокализации отдельным людям внутри группы. Определение вокализаторских идентичностей необходимо для определения диапазонов, зависящих от пола и контекста, у людей8, проверки причинных гипотез о том, как конкретные вокальные особенности определяют поведениеконвидов 10,11,12 и, где применимо, корреляции голосового выхода с одновременно измеряемыми сигналами мозга (например, электрофизиологией)13. Исторически считалось, что только самцы мышей были вокализаторами; однако локализация звукового источника показала, что самки мышей также производят УЗ вгрупповых условиях 7 или в паре ссамцами 14. Без определения, какое животное выпустило УСВ, связывание голосовых признаков с индивидуальным поведением и социальными результатами в свободно взаимодействующих группах остаётся ограниченным. Поэтому использование системы локализации, позволяющей назначать вокализации отдельным животным при сохранении естественной динамики взаимодействия, крайне важно.

Система локализации звуковых источников на основе микрофонного массива, ранееопубликованная в 7,15, оценивает пространственное происхождение USV внутри арены и отслеживает положение всех животных, присутствующих в момент вокализации, что позволяет назначать вокализации эмиттеру. Оценки источников звука и отслеживаемые позиции животных затем интегрируются с помощью метрики вероятности для поддержки присвоения USV отдельным животным. Назначение вокализации преобразует ранее неоднозначные групповые вокальные записи в помеченные данные животных 7,15, что позволяет проводить количественный анализ, связывающий тип и время вокализации с поведением и последующим действием конвидов. Цель настоящей работы — предоставить подробный протокол реализации этого метода, который ранее был количественно оценён ивалидирован 15. Следующий протокол описывает установку, калибровку и реализацию этой системы, включая геометрию микрофонного массива, синхронизацию аудио-видео, автоматическое обнаружение звука и вероятностную оценку источников, отслеживание положения нескольких животных, а также процедуру присвоения USV излучающемуживотному 7,15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы, связанные с животными, были утверждены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Делавэра (номер протокола: 1275) и проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Построение установки для локализации источника звука

  1. Подготовьте камеру для записи.
    1. Соберите кубоидную раму (76,2 см × 76. 2 см × 61 см; ширина × длина × высоту), которая служит площадкой для записи, и поместите её в корпус с шумозаглушающим помещением.
    2. Используйте нейлоновую сетку для создания стен и облицовуйте внешнюю часть корпуса акустической пеной для уменьшения звуковых отражений.
    3. Поставьте термометр снаружи, но рядом с камерой записи, чтобы контролировать температуру окружающей среды во время записи.
    4. Выполняйте все записи в тёмных условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стабильные условия окружающей среды во время сессий записи и фиксируйте параметры окружающей среды.
  2. Настройте системы видео- и аудиозаписи.
    1. Установите инфракрасное освещение над ареной для видеозаписи в темноте.
    2. Разместите видеокамеру над ареной и настройте её на непрерывную запись с частотой 30 Гц.
    3. Настройте систему аудиоприёма для записи ультразвуковых сигналов с восьмиканального микрофонного массива с частотой дискретизации 250 кГц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой системе использовалось восемь микрофонов, но количество микрофонов можно регулировать в зависимости от экспериментальных потребностей.
    4. Синхронизируйте видео- и аудиозаписи с помощью общего внешнего триггера для обеспечения временного выравнивания.
    5. Убедитесь, что видео- и аудиоданные записываются одновременно и сохраняются для каждой сессии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аппаратное и программное обеспечение для приобретения приведены соответственно в Таблице материалов и Таблице 1.
  3. Расставьте микрофоны и арену.
    1. Микрофоны равномерно расположены вдоль стен арены (по два на стену).
    2. Разместить центр микрофона на расстоянии 38,1 см друг от друга, 19,05 см от каждого угла и 10,8 см над полом арены.
    3. Визуально отмечайте расположение микрофонов для дальнейшей калибровки и валидации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: светодиоды могут использоваться для обозначения позиций микрофонов.

2. Подготовка к записи социального поведения

  1. Подготовьте экспериментальных животных.
    1. Выберите мышей для записи. Здесь использовались группы из 2 самцов и 2 самок мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 12 недель на момент записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм, соотношение полов и возрастной диапазон мышей и количество дней записи в текущей экспериментальной парадигме регулируются для различных экспериментальных целей. Для демонстрации этого метода подмножество экспериментальных мышей было повторно использовано в течение двух дней записи. Мыши C57BL/6J старше 12 недель могут испытывать сниженную чувствительность к звукамвысокой частоты 16.
  2. Приютить животных.
    1. Поместите каждую мышь отдельно в течение 14 дней перед записью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальное жильё минимизирует влияние предыдущего социального опыта на взаимодействие в группе.
    2. Обеспечьте каждую клетку подстилкой, обогащением и импровизированным доступом к еде и воде.
  3. Отмечайте животных для визуальной идентификации.
    1. За два дня до записи анестезиируйте каждую мышь с использованием 2,5% изофлурана в кислороде при расходе 1 л/мин через прецизионный испаритель в герметичной камере. После анестезии каждой мыши выведите её из камеры, лежа ровно с доступной спиной и получая анестезию из носового конуса на время процедуры маркировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол анестезии, описанный в текущей экспериментальной парадигме, одобрен в нашем животном протоколе и применялся к каждой мыши последовательно, но регулируется для разных животных или экспериментальных целей.
    2. Пока каждая мышь находится под наркозом, нанесите уникальный узор на её спину с помощью нетоксичной краски для волос, чтобы обеспечить визуальную идентификацию во время отслеживания.
    3. Контролируйте каждое животное непрерывно, пока краситель затвердевает, поддерживая анестезию примерно 15 минут, и фиксируйте длительность анестезии.
    4. Промывайте и помещайте каждую мышь в тёплую клетку для восстановления, пока она полностью не станет ходить в туалет.
    5. Верните каждую мышь в чистую клетку с подстилкой, обогащением и доступом к еде и воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите метки на самки мышей перед самцами, чтобы минимизировать передачу запаховых сигналов самца, которые могут повлиять на последующее поведение.
  4. Проведите экспозицию противоположного пола.
    1. За день до записи подготовьте чистые клетки без подстилки.
    2. Для каждой экспериментальной мыши помещайте животное в клетку, а затем новую мышь противоположного пола.
    3. Позвольте животным взаимодействовать в течение 10 минут.
    4. Наблюдайте за взаимодействиями и вручную фиксируйте поведенческие события.
    5. После воздействия возвращайте экспериментальных животных в индивидуальное содержание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие противоположного пола характерно для текущей экспериментальной парадигмы, так как увеличивает вероятность вокального поведения во время последующих групповыхзаписей 17; однако он не является обязательным компонентом описанных методов. Разделяйте животных, если наблюдается копуляторное поведение.
  5. Определите эструозные состояния самок мышей.
    1. Примерно за 2 часа до записи оцените состояние эстру каждой самки мыши (если используются самки).
    2. Проведите вагинальный промывку с использованием 30 мкл физиологического раствора, содержащегося фосфатами.
    3. Перенесите образец промывания на чистый микроскопический стекло и равномерно распределите.
    4. Дайте затворам полностью высохнуть.
    5. Нанесите на каждое стекло хрустально-фиолетовую морилку и используйте пипетку, чтобы аккуратно промыть их водой.
    6. Осматривайте стекла под световым микроскопом.
    7. Классифицировать эструозное состояние на основе относительных пропорций ядреных эпителиальных клеток, роговитых эпителиальных клеток илейкоцитов 18.
    8. Запишите состояние эстру для каждой самки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку USV могут влиять на женскую восприимчивость во времяэструса 19,20, определение состояния эстру зависит от текущей экспериментальной парадигмы; однако он не является обязательным компонентом описанных методов.

3. Записи социальных взаимодействий

  1. Подготовьте арену для записи.
    1. Добавьте постельное бельё на основе белой бумаги на пол арены до равномерной глубины примерно 1,25 см.
    2. Убедитесь, что подстилка равномерно покрывает все углы.
    3. Убедитесь, что все микрофоны выровнены, не помещены и ориентированы на арену.
    4. Перед экспериментальными записями разместите линейку и высококонтрастный объект в центре арены для проверки фокуса камеры и установления пространственного масштабирования.
    5. Удалите калибровочные объекты до начала поведенческих записей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подстилка на основе белой бумаги создаёт контраст для животных с более тёмной шерстью, облегчая отслеживание. Если используются животные с более светлой шерстью, то чёрная бумажная подстилка поможет отслеживать. Если продолжительность записи увеличена, добавьте еду и воду в арену. Добавление ориентиров Север/Юг и Восток/Запад к линейке облегчает идентификацию восьми микрофонов.
  2. Проведите запись системы поведения до появления поведения.
    1. Непосредственно перед поведенческими записями запишите 15 секунд фонового шума с включёнными инфракрасными лампами.
    2. Запишите 15 секунд теста локализации микрофона с выключенными инфракрасными индикаторами и индикаторами микрофона.
    3. Сохраняйте все записи до появления поведения для последующей проверки работы системы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти записи используются для проверки работы микрофона и базового уровня шума. Скрипты, используемые для записи, доступны в соответствующем репозитории кода.
  3. Записывайте групповое социальное поведение.
    1. Заранее подготовьте все настройки записи, чтобы минимизировать взаимодействие с животными до сбора данных.
    2. Поместите самок мышей на арену.
    3. Поместите самцов мышей на арену.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы записываете несколько животных одного пола, размещайте оба одновременно.
    4. Закройте ограждение и начните запись.
    5. Записывайте групповое социальное поведение непрерывно в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность записи регулируется.
    6. Убедитесь, что видео- и аудиофайлы читаемы и не повреждены перед предобработкой.
    7. В конце записи удалите всех животных, кроме одного.
  4. Записывайте отдельных животных.
    1. Запишите оставшуюся мышь в одиночестве на арене на 10 минут.
    2. Повторяйте отдельные записи для каждой из оставшихся мышей.
    3. Взвешивайте каждую мышь сразу после отдельных записей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальные записи используются для обучения и валидации отслеживания нескольких животных. Документируйте температуру внутри установки перед каждой сессией записи, так как температура влияет на распространение звука. Повторяйте запись, если видео- или аудиофайлы повреждены или неполны.

4. Предварительная обработка видео

  1. Подготовьте видеоматериалы.
    1. Проверьте, что все видеозаписи хранятся в одной папке, связанной с экспериментом.
  2. Отрегулируйте интенсивность видео для отслеживания.
    1. При необходимости примените равномерную корректировку яркости ко всем видеокадрам, добавляя постоянное значение (brightness_adjustment x 255) к каждому пикселю, где brightness_adjustment — скаляр, обычно варьирующий от 0,1 до 0,6 в зависимости от условий освещения.
    2. При необходимости примените глобальную корректировку контраста с помощью перераспределения интенсивности (например, функция некорректировки MATLAB) с определённым входным диапазоном (например, [0.2, 0.8]), которая отображает интенсивность пикселей при 20% от максимума в чёрный и 80% максимальных в белые и линейно масштабируемые промежуточные значения. Этот шаг выполняется для увеличения расстояния между светлыми идентификационными знаками и фоном.
    3. Отрежьте интенсивность пикселей до допустимого диапазона для глубины видеобитов (то есть от 0 до 255 для 8-битного видео).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одинаковые параметры предварительной обработки должны применяться ко всем кадрам внутри записи и между записями для обеспечения согласованности. Эти настройки являются необязательными и зависят от условий записи. Для представленных здесь репрезентативных данных не применялись корректировки яркости или контраста. При необходимости корректировки пользователи должны предварительно просмотреть обработанный первый кадр, чтобы убедиться в достаточном контрасте между животными и ареной перед обработкой всего видео.
  3. Экспортируйте предварительно обработанные видео.
    1. Сохраняйте заранее обработанные видеофайлы с той же частотой кадров и временным выравниванием, что и оригинальные записи.
    2. Сохраняйте оригинальные видеофайлы для справки и проверки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипты, используемые для предварительной обработки видео, и применяемые конкретные значения параметров доступны в соответствующем репозитории кода.

5. Отслеживание нескольких животных

  1. Подготовьте программное обеспечение для отслеживания и данные.
    1. Установите программное обеспечение для отслеживания нескольких животных и все необходимые зависимости. В этом исследовании использовался MOuse TRacker (MoTR; Таблица 1) потому что формат вывода совместим с Muse (Таблица 1), другим программным обеспечением в нашем конвейере, используемым для расчётов локализации источниковзвука 21.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие автоматизированные программы для отслеживания, такие как Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 илиDeepLabCut 23, могут использоваться для отслеживания животных, при условии, что сгенерированы положение животного, направление движения и носа.
    2. Организуйте заранее обработанные видеофайлы так, чтобы записи с одним и несколькими животными были чётко разделены.
    3. Проверьте, что все видеофайлы имеют одинаковую частоту кадров и пространственные разрешения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по установке программного обеспечения и требования к зависимости приведены в соответствующем репозитории кода.
  2. Обучайте модели с одним животным.
    1. Выберите записи отдельных животных, соответствующие каждому экспериментальному участнику.
    2. Обучайте отдельный классификатор идентичности для каждого животного, используя признаки, извлеченные из записи одного животного этого животного. Во время групповых записей эти результаты классификаторов для каждого животного комбинируются с информацией о траектории между кадрами для поддержания идентичности животных.
    3. Убедитесь, что обучение успешно завершено, прежде чем продолжить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Записи отдельных животных используются для инициализации индивидуального отслеживания в сессиях с участием нескольких животных.
  3. Отслеживайте записи с участием нескольких животных.
    1. Примените модель обученного отслеживания к записям социальных взаимодействий с несколькими животными.
    2. Генерируйте покадровые оценки положения, ориентации и формы тела животных для каждого объекта.
    3. Сохраняйте результаты отслеживания для дальнейших анализов.

6. Акустическая сегментация

  1. Подготовьте аудиоданные.
    1. Убедитесь, что все аудиозаписи с отдельных микрофонных каналов доступны и доступны.
  2. Обнаружить вокализации.
    1. Запускайте программное обеспечение акустической сегментации Ax (Таблица 1) на каждой записи для обнаружения USV.
    2. Настройте параметры времени-частоты, определённые в входном файле, рассматриваемом Ax. Частота дискретизации микрофона была установлена на 250 кГц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассматривались три размера окон для неравномерного быстрого преобразования Фурье, включая 64, 128 и 256 образцов. Применялся многоконусный продукт по времени и пропускной способности 3 с 5 конусами, а также порог значимости 0,05. Использовалась минимальная длительность 0 сэмплав с низкочастотным срезом 30 кГц и высокой частотой 110 кГц. Размер свёртки был установлен так, чтобы охватывать 1001 Гц на 0,001 с. Был добавлен флаг для объединения гармонически связанных сигналов. Для подробностей см. Neunuebel и др.7.
    3. Извлекать кандидатные USV на основе этих временно-частотных признаков.
    4. Сохраняйте выходы сегментации в виде таблицы для каждой записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по установке программного обеспечения, скрипты и настройки параметров размещены в соответствующем репозиториикода 7.
  3. Скомпилируйте выходы сегментации.
    1. Сгенерировать объединённый список обнаруженных событий вокализации, включающий время появления, смещение и границы частот.
    2. Сохраняйте консолидированные файлы вокализации для анализа локализации на последующих этапах.

7. Локализация источника звука

  1. Подготовьте входные данные к локализации.
    1. Убедитесь, что доступны акустические сегментационные выходы и результаты отслеживания с несколькими животными для каждой записи.
    2. Организуйте входы локализации так, чтобы аудиоданные, данные отслеживания и геометрия арены были доступны программному обеспечению локализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипты, используемые для организации входных файлов, определения необходимых структур каталогов и сбора информации о геометрии арен, предоставляются в соответствующем репозитории кода.
  2. Оцените расположение источников звука.
    1. Примените алгоритм локализации источника звука MUSE (Таблица 1) к каждой обнаруженнойвокализации 7.
    2. Используя микрофонные записи, оцените пространственное происхождение каждой вокализации внутри арены.
    3. Для каждой вокализации оцените расположение источника звука с помощью ресемплирования с помощью jackknife, повторяя процедуру локализации восемь раз, каждый раз пропуская один микрофон, чтобы каждая оценка была основана на оставшихся семи микрофонах. Это даёт восемь оценок на каждую вокализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различия в времени прибытия между микрофонами критически важны для оценки расположения источника звука. Ресемплирование с помощью джекнайфа используется для оценки надежности локализации и снижения чувствительности к отдельным каналам микрофона. Скрипты, используемые для оценки расположения источника звука, представлены в соответствующем репозиториикода 7.
  3. Вычислите распределения вероятности местоположения источника звука.
    1. Для каждой вокализации вычислите ковариационнуюматрицу 24 и используйте её вместе со средними оценками точки отборного ножа для вычисления плотности вероятности по всему полу арены.
  4. Интегрируйте локализацию с положением животных.
    1. Извлекайте отслеживаемые положения головы или носа для всех животных во время каждой вокализации.
    2. Для каждой вокализации оценивайте плотность вероятности локализации в положении носа каждого животного.
    3. Для каждой вокализации вычислите метрику доверия присвоения для каждого животного на основе вероятностных значений. Метрика доверия присвоения рассчитывается для каждого животного как значение плотности у носа этого животного, делённое на сумму значений плотности всех животных. Мы называем эту метрику индексом вероятности мыши (MPI)15.
  5. Назначайте вокализации.
    1. Если метрика доверия присвоения для одной мыши превышает 0,95, сигнал присваивается этоймыши 7,15.
    2. Обозначайте вокализации, которые не соответствуют критериям присвоения, как неприсвоенные.
    3. Сохраняйте выходы локализации и назначения для дальнейшей валидации и анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пороги назначения, критерии доверия и код предоставляются в соответствующих скриптах анализа.

8. Валидация результатов

  1. Проверьте отслеживание нескольких животных.
    1. Загрузите финальные выходы для каждой записи.
    2. Наложение отслеживали положение и форму тела животных на соответствующие видеокадры.
    3. Визуально проверьте результаты отслеживания, чтобы подтвердить точное положение мыши и согласованное присвоение идентичности между кадрами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты отслеживания включают цветовые эллипсы, указывающие направление головы, наложенные на каждую мышь в каждом кадре видео. Размер эллипса и ориентация корпуса должны соответствовать размеру мыши и ориентации соответственно в каждом кадре. Цвет эллипса должен быть одинаковым для каждой мыши на протяжении всей записи.
    4. Выявляйте и исправляйте ошибки отслеживания.
      Сохраняйте скорректированные выходы отслеживания для дальнейших анализов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Распространённые ошибки отслеживания возникают во время тесных социальных взаимодействий или вблизи границ арены. Исправьте все случаи переворотов головой-хвостом, переключений идентичности и прыжков и дрейфов на эллипсе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В репозитории кода предоставлены программы для просмотра вывода отслеживания и исправления ошибок.
  2. Проверьте экстракция вокализации.
    1. Загружайте акустические сегментационные выходы для каждой записи.
    2. Генерируйте спектрограммы из сырых аудиоданных для репрезентативных временных окна.
    3. На спектрограммы наложали обнаруженные события вокализации, включая индивидуальное время и частотные диапазоны.
    4. Визуально подтверждают соответствие между обнаруженными событиями и вокализациями, наблюдаемыми в спектрограммах.
    5. Если наблюдаются систематические ошибки, корректируйте параметры сегментации перед повторным запуском этапов экстракции и локализации, либо вручную корректируйте любые ошибки сегментации (то есть неправильное определение времени вокализации или диапазона частот).
  3. Валидируйте назначение вокализации.
    1. Загрузить локализацию и назначение звуковых источников.
    2. Для каждой вокализации визуализируйте оценки локализации, пространственные распределения вероятностей и положения животных, наложенные на видеокадры.
    3. Подтвердить, что плотности вероятности локализации сосредоточены вблизи головы назначенного животного и чётко отделены от других животных.
    4. Проверьте, помечены ли вокализации, не соответствующие критериям присваивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка результатов назначения включает проверку того, что все ожидаемые выходы сгенерированы и что вероятностная карта каждой вокализации находится в пределах арены и окружает назначенную мышь.
    5. Сохраните валидированные результаты заданий для дальнейших анализов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пороги доверия присвоения и критерии валидации определены в соответствующих скриптах анализа.

9. Анализ данных

  1. Визуализируйте локализацию источника звука.
    1. Для сессий записи с участием одного или нескольких животных выбирайте видеокадры, во время которых фиксировались вокализации.
    2. Генерируйте схемные представления выбранных видеокадров.
    3. Сгенерируйте пространственную схему на выходе MUSE, построив на графике положения всех микрофонов, оценки точек отдельного источника звука, расчетное расположение источника звука, распределение вероятностей пространственности, положение мыши, предполагаемую идентичность вокализатора и шкалу.
    4. Генерируйте спектрограммы соответствующей вокализации, записанной каждым микрофонным каналом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти визуализации полезны для качественной оценки результатов локализации как в индивидуальном, так и в групповом контексте.
  2. Количественно оцените ошибку локализации и точность.
    1. Вычислите расстояние между предполагаемым местоположением источника звука и положением записанного животного для количественной оценки ошибки локализации. Для этих расчётов используйте одиночные записи мыши, так как существует только один эмиттер, а источник известен.
    2. Для оценки точности присвоения преобразуйте оценки источников звука и соответствующие положения животных в систему отсчёта, сосредоточенную на вокализирующем животном.
    3. Визуализировать пространственное распределение оценок источников звука относительно положения центрированного животного.
  3. Генерируйте спектрограммы для визуализации вокализаций.
    1. Определите интересующие вокализации с помощью голосовых экстракционных выходов, содержащих идентичность вокализатора, время начала и смещения вокализации, а также границы высоких и низких частот.
    2. Выберите временные окна, охватывающие период до начала первой вокализации до смещения последней вокализации в каждом бою.
    3. Извлекать трассы напряжения из файлов аудиоканала для выбранных временных окна.
    4. Генерировать спектрограммы, преобразуя извлеченные трассы напряжения из временной области в частотную.
    5. Отмечайте временные точки, соответствующие назначенным и неназначенным вокализациям, используя разные цвета на спектрограмме.
    6. Для сессий социального взаимодействия определяйте вокализационные приступы, произведённые разными людьми, и генерируйте спектрограммы с идентификационными идентичностями вокализатора, обозначенными цветами, специфичными для идентичности.
  4. Количественно оценивайте вокальные данные по отдельным участникам.
    1. Используйте выход кода локализации источника звука, чтобы каждой вокализации присваивать идентификационную метку, чтобы нелокализованные, локализованные, но неназначенные и индивидуальные идентичности животных кодировались числово.
    2. Суммуйте количество вокализаций, произведённых каждым конкретным животным.
    3. Сравните количество вокализации у разных людей и между полами.
  5. Проанализируйте вокальные характеристики.
    1. Извлекайте частотные контуры для каждой вокализации.
    2. Количественно определите вокальные параметры, такие как максимальная частота, минимальная частота, средняя частота, полоса пропускания и длительность вокализации.
    3. Сравните голосовые параметры между полами.
    4. Проведите соответствующие статистические анализы на основе распределения свойств данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите статистические методы, соответствующие параметрическим свойствам измеряемых переменных. Здесь количество испытуемых слишком мало для статистических сравнений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Результаты, представленные в этой статье, взяты из записей, проведённых в течение 2 дней, и призваны проиллюстрировать результат протокола, первоначально опубликованного в Warren et al.15. Эти данные не предназначены для поддержки статистических выводов или обобщённых выводов.

Извлечение и назначение USV
USV записывались как во время индивидуальных, так и групповых сессий социального взаимодействия с использованием с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Достоверное приписывание USV отдельным животным во время групповых взаимодействий стало важным техническим ограничением в изучении голосовой коммуникации мышей. Хотя мыши широко используются для изучения социальной коммуникации, невозможность присвоить вокализации конкретным особям ограничила количественный анализ голосового поведения в натуралистических социальных условиях. Метод, позволяющий отслеживать вокализацию животных во время социальных взаимодействий, поэтому необходим для изуч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников исследовательского центра жизни и науки Университета Делавэра за уход за животными, Джима Фармера и Джейми Кузенберри за помощь в создании лабораторного оборудования, а также Группу высокопроизводительных вычислений Университета Делавэра за поддержку в поддержании вычислительного кластера. Благодарим Андре Ичон Ма за помощь в сборе данных. Работа была профинансирована NIH, количество грантов R01MH122752 и T32GM142603.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alpha-Dri BeddingShepherd Specialty PapersALPHA-driНеобходим для системы локализации источников звука
Экструзия алюминия8020Специально изготовлен для совпадения с площадкой для записиНеобходим для системы локализации источников звука
BNC-2110National Instruments777643-01Необходим для системы локализации источников звука
Прозрачная акриловая панельHome DepotMC-24Необходим для системы локализации источников звука
CM16/CMPA40-5VAvisoft40014Необходим для системы локализации источников звука
КомпьютерHewlett–PackardZ620Необходим для системы локализации источников звука
Grasshopper 3FLIRGS3-U3-41C6M-CНеобходим для системы локализации источников звука
ИК огниGANZIR-LT30Необходим для системы локализации источников звука
NI PXIe-1073National Instruments781161-01Необходим для системы локализации источников звука
NI PXIe-6356National Instruments781053-01Необходим для системы локализации источников звука
Nice ‘N Easy, Born Blonde MaxiClairol 2523721Необходим для системы локализации источников звука
Нейлоновая сетка для стен клетокMcMaster-Carr9318T25Необходим для системы локализации источников звука
Силовой шнурNational Instruments763000-01Необходим для системы локализации источников звука
SCHC68-68-EPMNational Instruments192061-02Необходим для системы локализации источников звука
Sonex foamPinta AcousticVLW-35Необходим для системы локализации источников звука

Ссылки

  1. Barfield, R. J., Thomas, D. A. The role of ultrasonic vocalizations in the regulation of reproduction in rats. Ann N Y Acad Sci. 474 (1), 33-43 (1986).
  2. Placer, J., Slobodchikoff, C. N. A fuzzy-neural system for identification of species-specific alarm calls of Gunnison's prairie dogs. Behav Processes. 52 (1), 1-9 (2000).
  3. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (12), e386 (2005).
  4. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  5. Shepard, K. N., Liu, R. C. Experience restores innate female preference for male ultrasonic vocalizations. Genes Brain Behav. 10 (1), 28-34 (2011).
  6. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic songs with approach behaviour. Biol Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  7. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. Elife. 4, e06203 (2015).
  8. Sangiamo, D. T., Warren, M. R., Neunuebel, J. P. Ultrasonic signals associated with different types of social behavior of mice. Nat Neurosci. 23 (3), 411-422 (2020).
  9. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). PLoS One. 12 (12), e0188647 (2017).
  10. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  11. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice Mus musculus musculus. Anim Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  12. Warburton, V. L., Sales, G. D., Milligan, S. R. The emission and elicitation of mouse ultrasonic vocalizations the effects of age sex and gonadal status. Physiol Behav. 45 (1), 41-47 (1989).
  13. Chen, P., Hong, W. Neural circuit mechanisms of social behavior. Neuron. 98 (1), 16-30 (2018).
  14. Heckman, J. J., et al. High-precision spatial localization of mouse vocalizations during social interaction. Sci Rep. 7 (1), 3017 (2017).
  15. Warren, M. R., Sangiamo, D. T., Neunuebel, J. P. High channel count microphone array accurately and precisely localizes ultrasonic signals from freely moving mice. J Neurosci Methods. 297, 44-60 (2018).
  16. Johnson, K. R., Erway, L. C., Cook, S. A., Willott, J. F., Zheng, Q. Y. A major gene affecting age-related hearing loss in C57BL/6J mice. Hear Res. 114 (1), 83-92 (1997).
  17. Zala, S. M., et al. Primed to vocalize wild-derived male house mice increase vocalization rate and diversity after a previous encounter with a female. PLoS One. 15 (12), e0242959 (2020).
  18. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  19. Floody, O. R., Pfaff, D. W., Lewis, C. D. Communication among hamsters by high-frequency acoustic signals II determinants of calling by females and males. J Comp Physiol Psychol. 91 (4), 807-819 (1977).
  20. McIntosh, T. K., Barfield, R. J., Geyer, L. A. Ultrasonic vocalisations facilitate sexual behaviour of female rats. Nature. 272 (5649), 163-164 (1978).
  21. Ohayon, S., Avni, O., Taylor, A. L., Perona, P., Egnor, S. E. R. Automated multi-day tracking of marked mice for the analysis of social behaviour. J Neurosci Methods. 219 (1), 10-19 (2013).
  22. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nat Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  23. Mathis, A., et al. DeepLabCut markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  24. Peña, D., Prieto, F. J. Multivariate outlier detection and robust covariance matrix estimation. Technometrics. 43 (3), 286-310 (2001).
  25. Matsumoto, J., et al. Acoustic camera system for measuring ultrasound communication in mice. iScience. 25 (8), 104812 (2022).
  26. Waidmann, E. N., Yang, V. H. Y., Luo, E., Doyle, W. C., Jarvis, E. D. Mountable miniature microphones to identify and assign mouse ultrasonic vocalizations. Cell Rep Methods. 5 (6), 101081 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

233233JoVE
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.