Веб-платформа для автоматизированной количественной оценки изолированных поджелудочных островков на основе изображений

Краткое содержание

Этот протокол описывает стандартизированный отбор проб, окрашивание, получение изображений и автоматизированную веб-количественную оценку изолированных островков поджелудочной железы человека и грызунов с использованием анализа изображений с помощью глубокого обучения и визуального контроля качества.

Аннотация

Цель этой публикации — предоставить пошаговый протокол письменного и живого видео для стандартизированного использования IsletNet — веб-платформы для автоматизированного количественного определения изолированных островков поджелудочной железы на изображениях, начиная от отбора проб и получения изображений до загрузки изображений, визуальной валидации и автоматической генерации отчетов. Платформа была разработана для стандартизированной, автоматизированной оценки двумерных микроскопических изображений изолированных островков поджелудочной железы с целью поддержки клинических и экспериментальных рабочих процессов изоляции островков. Сегментация изображений на основе глубокого обучения используется для идентификации островков и экзокринных тканей, из которых извлекаются контуры для анализа изображений. Вычислительные алгоритмы затем количественно определяют количество островков, объём и чистоту. Визуальный инструмент контроля качества поддерживает экспертную валидацию автоматического анализа изображений, позволяя пользователям принимать, исправлять или исключать недействительные изображения вручную. Модуль Clinical Islet Isolation поддерживает массовый анализ чистоты и фракции и генерирует автоматические PDF-отчёты вместе с загружаемыми файлами с изображениями и табличками для ведения учёта и анализа. Модуль Simple Comparison сравнивает автоматизированные оценки с локально полученными эталонными результатами, представленными с соответствующими образцовыми изображениями, чтобы оценить пригодность локально стандартизированных изображений для автоматизированного анализа. Протокол также содержит рекомендации по переобучению с использованием локально сгенерированных стандартизированных изображений при необходимости. Репрезентативные данные из изоляции островков грызунов и человека, включая сложные примеры, демонстрируют улучшенную производительность автоматизированного анализа после соответствующего обучения.

Введение

Трансплантация изолированных островков поджелудочной железы диабетическим реципиентам снижает или устраняет необходимость внешнего введения^{инсулина 1}. Процесс изоляции островков от трупных или живых доноров подвержен биологической и процедурной гетерогенности, что отражается в вариациях урожайности и качества. Общий объём островка является основным фактором для определения дозы и принятия клинических решений относительно пригодности^{трансплантации 2}. Гистограмма размера островка и индекс островка объясняют различия в эффективности, связанной с^{размером 3}. Поэтому внимание уделяется отдельным островкам, помимо общего объёма, который в настоящее время служит суррогатным маркером содержания бета-клеток. Изолированные человеческие островки менее плотные, чем островки грызунов, и часто плохо отделены от экзокриновой ткани. В результате их сложнее отличить, если они не окрашиваются. Был принят быстрый и простой метод окрашивания цинком с использованием дитизона, при котором интенсивный красный свет отражается от обогащённых цинком гранул^{инсулина 4}. Учитывая непрозрачность ткани, собирается только свет, отражённый от поверхности, что позволяет использовать простые стерео- или инвертированные микроскопические приборы с источником света и камерой.

Было предпринято множество попыток снизить межлабораторные вариации с помощью цифровых инструментов анализа^{изображений 5,6,7,8,9,10,11,12}, однако эти подходы имеют ряд ограничений. В этих методах сегментация островков и экзокринных тканей либо основана на ручном пороговом определении, что подвержено субъективным^{ошибкам} 5,6,7,8,9,10, либо использует полностью автоматизированные методы сегментации ^11,12. Кроме того, локальная установка программного обеспечения часто требуется^{в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11} и может быть ограничена определённым^{оборудованием 10, 11}, что ограничивает общую доступность и стандартизацию.

Общая цель настоящей публикации — предоставить стандартизированный рабочий процесс для автоматизированной количественной оценки изолированных островков поджелудочной железы на изображениях с использованием веб-платформы глубокого обучения с человеческим экспертным контролем. IsletNet решает ограничения, связанные как с доступностью, так и в надежности анализа изображений островков. В этой статье мы представляем рекомендуемые рекомендации по отбору образцов трансплантатов островков, получению подходящих микроскопических изображений и правильного использования инструментов IsletNet . Протокол вводит концепцию человеческого надзора за автоматически сгенерируемыми результатами и представляет рабочие процессы для потенциальных и опытных пользователей (рисунок 1). Инструмент Simple Comparison позволяет потенциальным пользователям напрямую сравнивать результаты IsletNet с локально полученными методами справки (рисунок 1A). Поскольку локально сгенерированные стандартизированные изображения могут существенно различаться между центрами, IsletNet может потребовать переобучения для достижения надёжного анализа (рисунок 1B). Для облегчения этого процесса предоставляются рекомендации по стандартизированному окрашиванию и получению изображений. Для опытных пользователей инструмент Clinical Islet Isolation разработан для поддержки рабочего процесса изоляции человеческих островков (рисунок 1C). Скачиваемые отчёты вместе с дополнительными таблицами и визуализациями, сгенерированными IsletNet , описаны в Таблице 1, а ключевые рассчитанные параметры обобщены в Таблице 2.

Рисунок 1: Рабочий процесс для потенциальных и опытных пользователей платформы. (A) Локальный процесс валидации с использованием модуля Simple Comparison. (B) Переобучение требует набора локально стандартизированных изображений. (C) Рабочий процесс рутинного использования с использованием модуля Clinical Islet Isolation. Ключевые этапы рабочего процесса обобщаются для загрузки изображений, анализа, визуального контроля качества (vQC) и генерации отчётов. Масштабные планки не подходят. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Загружаемые файлы результатов, генерируемые платформой. Список загружаемых выходных файлов, сгенерированных инструментами Clinical Islet Isolation и Simple Comparison, сгруппированных по формату файла и категории вывода. В таблице представлены отчётные файлы, сегментированные изображения, визуализационные файлы и экспорт в таблицы для анализа количества островков, объёма, чистоты и гистограммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Ключевые параметры, включённые в загружаемые отчёты и результаты таблиц . Подробный список метаданных, пользовательских настроек и параметров количественного анализа, включённых в загружаемые файлы XLSX и CSV, созданные инструментами Clinical Islet Isolation и Simple Comparison. Параметры включают метаданные сессии, настройки получения изображений и метрики количественной оценки островков для изображений и отдельных островков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Протокол

Процедуры для животных были одобрены Министерством здравоохранения Чешской Республики (Одобрение No 49/2023) в соответствии с Директивой Совета европейских сообществ 86/609/EEC. Процедуры изоляции и использования человеческих островков были одобрены Государственным институтом по контролю за наркотиками (номер одобрения sukls111286/2023). Стандартизированные микроскопические изображения препаратов для крыс и человеческих островков анализировались с помощью инструментов простого сравнения и клинической изоляции островков для сравнения автоматизированного анализа с ручным подсчётом. Стандартная (короткая) таблица преобразования¹³ использовалась как для ручных, так и для автоматических вычислений эквивалентов островков.

1. Человеческий надзор

1. Первоначальный обзор результатов первичных результатов (рисунок 2)
   1. Дождитесь, пока автоматически сгенерированные значения количества островков, объёма и чистоты островков, а также графическая визуализация соответствующих автоматических аннотаций (например, контуров или сегментации) появятся в окне результатов пакета.
   2. Просмотрите сводные результаты для текущего образца изображения в левой информационной панели (рисунок 2A).
   3. Просмотрите значения реплицирования (рисунок 2B) и пакетные средние значения (рисунок 2C) в правой таблице.
   4. Просмотрите на предварительном просмотре изображения (рисунок 2D,E) по ссылкам (рисунок 2F). Кликните правой кнопкой мыши по предварительному просмотру изображения и следуйте всплывающему меню, чтобы при необходимости скачать одно изображение.
   5. Просматривайте примеры изображений с помощью навигационных стрелок (рисунок 2G) или выбирайте напрямую из таблицы.
   6. Откройте окно инспекции, кликнув внутри текущего предпросмотра изображения (рисунок 2D), чтобы оценить качество автоматически сгенерированных контуров и проверить результаты.
2. Визуальный контроль качества
   1. Перемещайте изображение и увеличивайте (рисунок 3A), чтобы проверить контуры на возможные ошибки.
   2. Переключайтесь между Contour (он есть только в подсчётанных островках), Original image и дополнительными визуализационными видами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доступные виды перечислены в легенде справа от окна (рисунок 3B) и доступны с помощью клавишных горячих клавиш или ссылок в верхней панели навигации (рисунок 3C; Таблица 3).
   3. Переходите к следующему изображению, нажав стрелку вниз, если контуры подходят (таблица 3).
   4. Исправляйте ошибки контура вручную, когда это возможно. Если остаются необнаруженные, частично обнаруженные или поддельные островки, можно классифицировать изображение как недействительное и исключить его из анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключённые изображения отмечены в окне результатов пакета (рисунок 2J) и во всех загруженных файлах.
3. Исправляемые ошибки: неотдельные соседние островки
   1. При необходимости разделяйте соседние островки вручную.
   2. Левый клик за пределами островков, чтобы инициировать линию разделения (рисунок 3D).
   3. Добавьте промежуточные левые клики для указания линии разделения между соседними островками (рисунок 3E).
   4. Кликните правой кнопкой мыши снаружи островков, чтобы заполнить линию разделения (рисунок 3F).
   5. Отправьте разделяющую строку для обновления результата (рисунок 3G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включайте или выключайте визуализацию добавленных линий разделения по мере необходимости (рисунок 3H).
4. Исправляемые ошибки: Поддельные островки
   1. Используйте инструмент разделения, чтобы разделить поддельный островок на несколько объектов меньше порога размера островка.
   2. Избегайте подсчёта фрагментов малых островков, установив заранее заданный минимальный порог размера островков (обычно 50 мкм). При необходимости корректируйте порог в соответствии с местной лабораторной практикой.
   3. Кликните правой кнопкой мыши по любой точке линии и выберите соответствующую опцию из всплывающего меню, чтобы убрать одну или все вручную добавленные линии разделения (рисунок 3I).
5. Неисправимые ошибки: отсутствующие, частично сегментированные или поддельные островки
   1. Переключите просмотр сегментации, чтобы проверить, были ли островки обнаружены.
   2. Исключить из расчета пакетного среднего любое недействительное изображение, содержащее необнаруженные, частично обнаруженные или несколько поддельных островков (рисунок 3J).
6. Неисправимые ошибки: Неправильно классифицированные объекты
   1. Исключить изображение из оценки, если экзокриновая ткань, фоновые артефакты или пузырьки ошибочно классифицированы как островки (рисунок 3J).

Рисунок 2. Окно результатов пакета. (A) Текущий обзор результатов выборки. (B) Результаты для воспроизведения образцов. (C) Средние значения только по принятым изображениям. (D, E, F) Графические превью результатов с ссылками. (G) Примеры навигационных стрелок. (H, I, J) Изменённые, принятые и исключённые изображения. (K) Верхняя панель навигации IsletNet . (L, M) Заголовок и подвал окна результатов пакета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Окно инспекции для vQC и ручной коррекции контуров. (A) Дисплей увеличения изображения. (B) Легенды и навигационные подсказки. (C) Верхняя навигационная панель окна инспекции. (D–G) Строительство и подача ручной линии разделения для соседних островков. (H) Переключение для отображения или сокрытия ручных линий разделения. (I) Удаление ручных разделительных линий. (J) Переключение изображения из статистики. В этом интерфейсном виде шкалы не отображаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 3: Режимы просмотра, горячие клавиши и навигационные элементы, доступные в окне инспекции. Сводка режимов визуализации изображений, клавишных ярлыков и навигационных функций, доступных во время vQC, а также ручной просмотр результатов сегментации в окне инспекции. В таблице представлены контурные наложения, отображения сегментации, визуализация гистограммы и управление навигацией по изображениям, используемые в инструментах Clinical Islet Isolation и Simple Comparison. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

2. Навигация по платформе

1. Версия просмотра и техническая информация
   1. Просмотрите текущую версию программного обеспечения и последнюю дату обучения, отображаемую в верхней навигационной панели (рисунок 2K).
   2. Откройте раздел «Главная», чтобы получить техническое описание и соответствующую справочную информацию.
2. Предварительная оценка местных изображений
   1. Определить, можно ли уже правильно проанализировать локально сгенерированные стандартизированные изображения платформой на основе критериев ошибок, описанных в шагах 1.2.4 и 1.5.2, или требуется ли повторное обучение для локальных стандартизированных изображений (рисунки 1A и 1B).

3. Простое сравнение и внешнее обучение с локальными изображениями

1. Простое сравнение
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инструмент Simple Comparison для сравнения результатов автоматизированного анализа с локально установленным эталонным методом, обычно стандартным ручным подсчётом¹³, альтернативными^{таблицами 7, 11, 18} или^{моделями 5,6}. Загрузка локально сгенерированных стандартизированных изображений вместе с соответствующими эталонными значениями и типом метода. Результаты включают загружаемые таблицы, изображения и PDF-отчёты (Таблица 1).
   1. Откройте панель Simple Compare в верхней панели навигации (рисунки 4A и 4B).
   2. Ознакомьтесь с разделом «Подсказки» для получения необходимых свойств изображения (рисунок 4C).
   3. Скачайте шаблон form.xlsx (рисунок 4D).
   4. Подсчёт островков в нескольких выборках с использованием локально установленного эталонного метода.
   5. Получите стандартизированные микроскопические изображения, соответствующие подсчитанным образцам.
   6. Убедитесь, что все подсчитанные островки полностью включены в кадр изображения.
   7. Введите точные имена файлов изображений и соответствующие значения параметров в шаблон form.xlsx с использованием английских десятичных точек (рисунок 4E).
   8. Загрузите готовую таблицу и соответствующие файлы изображений с помощью перетаскивания или с помощью кнопок загрузки (рисунок 4F).
   9. Выберите таблицу преобразования или модель, используемую для оценки объёма островков (рисунок 4G).
   10. Нажмите «Отправить партию », чтобы собрать сравнение бок о бок.
   11. Дождитесь появления результатов анализа.
   12. Откройте окно инспекции для визуальной проверки контуров.
   13. Исключить изображения из анализа, если контуры неправильны (рисунок 3J).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Ручное редактирование контуров недоступно в инструменте Simple Comparison.
   14. Скачайте результаты в виде таблиц, изображений и PDF-отчётов (Таблица 1).
2. Обучение IsletNet для локально стандартизированных изображений
   1. Свяжитесь с командой разработчиков Института экспериментальной медицины (IKEM) по адресу info@isletnet.com.
   2. Делитесь репрезентативными изображениями, охватывающими диапазон качества, полученного локально.
   3. Обсудите требования к качеству изображения с командой разработчиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые параметры качества изображения включают достаточный контраст, полное включение островков в кадр изображения и минимальное перекрытие между соседними островками. Окраска островков может варьироваться от красного до розового или фиолетового, при условии, что различие от экзокринной ткани остаётся чётким.
   4. Создайте набор обучающих изображений, охватывающих ожидаемый диапазон чистоты островков, увеличений и вариаций цвета.

Рисунок 4. Простой инструмент сравнения, панель управления и рабочий процесс. (A) Верхняя панель навигации. (B) Простая панель сравнения. (C) Загрузить подсказки и инструкции. (D, E) form.xlsx загрузку шаблона и визуализацию параметров. (F) Область для загрузки изображений и таблиц с перетаскиванием сбросов. (G) Выбор преобразования размера островка в объём. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Выборка

ПРИМЕЧАНИЕ: Осадки островков быстро и по-разному различаются по размеру и форме, что может повлиять на результаты отбора проб.

ВНИМАНИЕ: Выполняйте все процедуры обращения с островками внутри ламинарного капюшона с соответствующими средствами индивидуальной защиты.

1. Используйте трубки на 50 мл или 250 мл для подвески островка.
2. Определите необходимую долю отбора пробы с учетом наблюдаемого объёма и чистоты гранул с использованием местных стандартных операционных процедур.
3. Тщательно перемешайте подвеску островка, аккуратно перевернув трубку пять раз непосредственно перед сбором образца.
4. Немедленно возьмите образец с помощью крупнокалиберного наконечника пипетки, чтобы предотвратить закупорку экзокринной тканью и минимизировать повреждения островков.

5. Оптимизация сбора изображений на островках

1. Приготовление дитизона
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения достаточного контраста между островками и экзокринной тканью требуется равномерное окрашивание дитизона. Ниже описаны два распространённых метода подготовки.
   ВНИМАНИЕ: Дитизон — подозрение на репродуктивный токсин. Диметилсульфоксид (DMSO) токсичен и проникает в кожу. Гидроксид натрия сильно коррозионен и может вызывать серьёзные химические ожоги. Обращайтесь со всеми химикатами, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты, избегайте контакта с кожей и утилизируйте отходы в соответствии с процедурами институциональных опасных отходов.
   1. Подвеска в^{DMSO 13}
      1. Весите 50 мг порошка дитизона.
      2. Растворите дитизон в 5 мл DMSO.
      3. Инкубировать раствор при 37°C и интенсивно встраиваться в вихрь в течение 1 минуты каждые 5 минут до завершения растворения.
      4. Разведите 1 мл бульонного раствора 20 мл сбалансированного соляного раствора Hank's Balanced Salt с 2% плодовой сывороткой для приготовления рабочего раствора.
      5. Фильтруйте раствор через фильтр для шприца 0,22 мкм.
      6. Оберните трубку алюминиевой фольгой, чтобы защитить раствор от света.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте рабочий раствор примерно в течение 12 часов.
   2. Ресуспензия в щелочном спиртном растворе (альтернатива ссылке 8)
      1. Весите 50 мг порошка дитизона.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При желании заранее подготовьте аликвоты.
      2. Добавьте 800 мкл этанола 70% в дитизон.
      3. Добавьте 400 мкл раствора гидроксида натрия объёмом 1 М и тщательно введите в вихрь до завершения растворения.
      4. Разведите раствор фосфатно-буферным физиологическим раствором, содержащим 0,2 мг/мл человеческого альбумина, до конечного объёма 20 мл.
      5. Фильтруйте раствор через фильтр для шприца 0,22 мкм.
      6. Оберните трубку алюминиевой фольгой, чтобы защитить раствор от света.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте рабочий раствор примерно в течение 12 часов.
2. Окрашивание островков
   1. Добавьте 25 мкл рабочего раствора дитизона в центр тарелки диаметром 35 мм.
   2. Добавьте 50 мкл островков, взвешенных в сбалансированном солевом растворе Хэнка, содержащем альбумин, полную культурную среду или трансплантационную среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фактический объём образца варьируется от 20 до 50 мкл в зависимости от гранулы с фракцией чистоты, с конечной концентрацией дитизона от 0,85 мг/мл до 1,37 мг/мл.
   3. Трижды вводите и выводите подвеску, медленно перемешивая раствор, чтобы аккуратно перемешать раствор, избегая образования пузырей.
   4. Инкубировать образец при 20°C–25°C в течение 1–2 минут, визуально наблюдая за окрашиванием под микроскопом, пока островки не станут ярко-красными. Некоторые препараты могут содержать плохо окрашенные островки, для которых также обучен IsletNet .
   5. Используйте шприц объемом 10 мл, чтобы быстро ввести 4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора с добавлением 0,2 мг/мл альбумина непосредственно в окрашенный образец, избегая пузырьков и брызг.
   6. Сразу же энергично покрутите блюдо круговым движением, чтобы перемешать растворы, перемещая островки к центру и оставляйте место.
      ВАРИАНТ 1: Аккуратно добавить 4 мл PBS/альбумина, оставив островки в дитизоне нетронутыми. Затем аккуратно покрутите блюдо по кругу, чтобы растворить раствор, оставив островки в центре. Подождите, пока дитизон не распределится в блюде.
      ВАРИАНТ 2 (подходит для стереомикроскопа): Вместо разбавления островков распределите каплю дитизона-островка в тонкий слой с помощью наконечника пипетки или иглой вместо разбавления для уменьшения отражений.
   7. Осмотрите образец под микроскопом и немедленно возвращайте любые смещённые островки в поле камеры, аккуратно помещая окружающий раствор наконечником пипетки.
   8. Начните снимок изображения немедленно, чтобы минимизировать цитотоксичность и изменения объёма островка.
3. Получение изображений
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерео или инвертированный микроскоп с объективом с низким увеличением и стабильным источником света. Защищуйте тарелку от дополнительных источников света, например, освещения в комнате.
   1. Включите источник света и дайте галогенной лампе прогреться 5 минут.
   2. Установите стандартизированную интенсивность света, чтобы избежать бликов и недостаточной экспозиции. Точный диапазон зависит от используемого оборудования для визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная интенсивность света может варьироваться в зависимости от увеличения и чистоты образца.
   3. Выберите параметры объектива и зума, которые позволяют всем островкам оставаться в поле зрения камеры.
   4. Сохраняйте одинаковое увеличение для всех образцов внутри партии и, желательно, для всех партий чистоты.
   5. При необходимости калибруйте баланс белого с помощью нормализованного белого слайда. Если качество изображения остаётся неудовлетворительным из-за уникальных особенностей подготовки островка, корректируйте значения RGB и/или гамма-настройки.
   6. Регулируйте время экспозиции и, при необходимости, интенсивность или усиление освещения с помощью цветной гистограммы, чтобы избежать переэкспозиции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы с обильным содержанием экзокриновой ткани могут потребовать иных настроек камеры или освещения из-за отражения света от неостровочной ткани. Для обеспечения воспроизводимости сохраняйте эти параметры как отдельный конфигурационный файл для будущего использования.
   7. Захватите изображение и сохраните файл в поддерживаемом формате, включая JPG, PNG, TIFF или BMP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включите в имя файла дату, долю чистоты, увеличение или размер пикселя, а также разбавление для облегчения дальнейшего повторного анализа (например, iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
   8. Получите изображение сценического микрометра с использованием тех же параметров увеличения и масштабирования, которые используются для съёмки образцов.

6. Клинический инструмент изоляции островков

ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые шаги рабочего процесса изложены на рисунке 1C. Анализируйте изображения партиями с фракцией чистоты по мере появления образцов.

1. Настройка размера пикселя
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитанный размер пикселя остаётся действительным только тогда, когда изображение с микрометром ступени получено с использованием тех же параметров увеличения и масштабирования, что и анализируемые образцы.
   1. Откройте панель Clinical Islet Isolation .
   2. Нажмите «Загрузить микрометр стадии» и выберите изображение сценического микрометра.
   3. Проведите концы красной измерительной линии на цифровой линейке на известном расстоянии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более длинное калибровочное расстояние для повышения точности измерений.
   4. Введём известное расстояние в микрометрах (мкм).
   5. Отправьте рассчитанный размер пикселя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа сохраняет рассчитанный размер пикселя до ручного изменения.
2. Пакетная загрузка изображений с фракцией чистоты
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 3–4 реплицированных образца для надёжного расчёта партийного среднего и стандартных отклонений. Используйте одинаковое разбавление для всех образцов в партии.
   1. Перетаскивание изображений, представляющих образцы, повторяют образцы той же доли чистоты в область загрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа предотвращает повторное использование одного и того же изображения на основе распознавания имён файла.
   2. При необходимости измените размер пикселя.
   3. Введите минимальный порог размера островка.
   4. Введём значение разбавления образца (например, 1000).
   5. Введите объём гранул в миллилитрах, записанный из оригинальной колбы.
   6. Введём инициалы оператора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инициалы оператора отображаются в сгенерированном отчёте.
   7. Введите идентификатор сессии, представляющий текущую процедуру изоляции.
   8. Введите идентификатор партии (например, 1 Высокая Чистота).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа упорядочивает дроби буквенно-цифровым порядком согласно Batch ID.
   9. Нажмите «Отправить партию», чтобы начать анализ.
3. Просмотр и окончательное утверждение результатов партии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Закройте предыдущее окно результатов пакета, кликнув по заголовку при необходимости (рисунок 2L).
   1. Дождитесь, пока числовые и графические результаты появятся в окне пакетных результатов .
   2. Откройте окно инспекции, дважды кликнув по предпросмотру изображения в окне результатов пакета.
   3. Пересмотрите и, при необходимости, исправьте контуры, как описано в Шаге 1.
   4. Переходите к следующему изображению, используя стрелку вниз, если контуры подходят.
   5. Добавьте ещё одну партию или переходите к сводке сессии, используя кнопки, расположенные внизу окна (рисунок 2M).
4. Пакетное редактирование
   ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа сохраняет имена файлов изображений на протяжении всей сессии, чтобы предотвратить случайное повторное использование одного и того же изображения. Это касается и удалённых изображений. При необходимости переименуйте изображения перед повторным использованием.
   1. Нажмите «Редактировать пакет », чтобы добавить или удалить изображения, скорректировать примерные характеристики или переименовать партию (рисунок 2L).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите имена файлов изображений перед изменением пакета, если ожидается повторное использование.
   2. Нажмите «Удалить пакет», чтобы полностью удалить пакет (рисунок 2L).
5. Просмотр резюме и создание отчётов
   1. Нажмите «Показать резюме », чтобы отобразить обзор сессии (рисунок 2M).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вернитесь к предыдущим партиям и при необходимости отредактируйте их.
   2. Просмотрите общее количество островков, объёма и объёма гранул за сессию вместе с соответствующими средними значениями партии.
6. Скачайте отчёт.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Краткий отчёт включает общее количество островков, объём, чистоту, значения гранул, гистограммы и сводки по долям чистоты. Полный отчёт дополнительно включает графическую информацию для каждого образца изображения, при этом принятые значения отображаются красным, а исключённые — чёрным.

Результаты

Чистые крысиные островки

В первом эксперименте было получено 36 изображений, представляющих 12 образцов с общей сложностью 249 очищенных крысиных островков во время четырёх независимых сеансов визуализации. Изображения создавались с помощью стереомикроскопа при трёх стандартизированных, но различных условиях освещения с использованием галогеновых и светодиодных (LED) источников света, а также с разными настройками камеры. Сегментации по правде (Ground-truth, GT) были сгенерированы вручную для трёх репрезентативных изображений экспертом по обучению IsletNet .

При анализе изображений с помощью общедоступной версии инструмента Simple Comparison ни один из автоматически сгенерированных контуров не проходил контроль визуального качества (vQC, рисунок 5F). Впоследствии платформа была переобучена с использованием репрезентативных локальных изображений, и все контуры, сгенерированные переобученной экспериментальной версией, прошли через vQC (рисунок 5C).

Соотношение автоматизированных и ручных оценок объёма островков демонстрировало стабильную производительность в трёх условиях изображения после повторного обучения: медианные значения 1,03, 0,98 и 0,94 для условий освещения A, B и C соответственно (рисунок 5A). Эти результаты представляли собой значительное улучшение по сравнению с исходной моделью обучения (рисунок 5B).

Сравнение по пикселям с сегментацией GT показало близкое согласование автоматизированных и ручных контуров после переобучения (рисунок 5D), что соответствует точному размещению контуров на репрезентативных изображениях (рисунок 5C). В отличие от этого, оригинальная обучающая модель показала увеличенную долю ложноотрицательных пикселей (рисунок 5G) и неправильного расположения контуров (рисунок 5F), что привело к смещению к меньшим категориям островков в соответствующих гистограммах размера островков (рисунок 5E против 5H).

Рисунок 5. Оценка переобучения платформы с использованием трёх установок визуализации и подготовки крысиных островков. (A) Сравнение оценок IsletNet и ручного эквивалента островков (IEQ) после переобучения с использованием трёх систем визуализации. (B) Сравнение IsletNet и ручных оценок IEQ с использованием оригинальной модели публичного обучения. (C, F) Репрезентативное размещение контуров с помощью инструмента vQC после и до повторного обучения модели соответственно. Белые наконечники стрелок указывают на правильное расположение контуров, а пурпурные наконечники — неправильное расположение контуров. (D, G) Сравнение по пикселям с реальностью после переобучения и с оригинальной обучающей моделью соответственно. В легенде отмечены области истинного положительного, ложноположительного, ложноотрицательного и истинно отрицательного. (E, H) Репрезентативные гистограммы размера островков после повторного обучения и с исходной моделью обучения соответственно по сравнению с ручным подсчётом. Установка изображения 1 = светодиодное освещение; установка визуализации 2 = галогенное освещение; Настройка изображения 3 = светодиодное освещение в тёмном поле. Шкала = 100 мкм. Коробочные плоты показаны согласно конвенции Тьюки; Усы простираются до точек данных в пределах 1,5 × межквартильного диапазона от первого и третьего квартилей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Клинические приготовления человеческих островков

Во втором эксперименте было проанализировано 17 изображений, представляющих одну процедуру изоляции человеческого островка с тремя парами чистоты-доли с использованием общедоступной версии платформы. Один образец был утерян. После vQC все изображения, показывающие фракции средней и низкой чистоты, были исключены из-за ошибочного обнаружения островков (данные не показаны). Впоследствии платформа была переобучена с использованием репрезентативных локальных изображений.

После переобучения все изображения прошли vQC после добавления трёх ручных линий разделения. Сравнение по партиям с ручным подсчётом показало общее занижение ≤5% по оценкам общего количества островков и объёма. Образцы, разбавленные от 2000 до 4000 раз, содержали от 80 до 4 островков в зависимости от доли чистоты. Относительный вклад отдельных долей чистоты в итоговую подготовку показан на рисунке 6A. Фракция высокой чистоты 1VC2 преимущественно обеспечивала меньшие островки по сравнению со средней чистотой 2SC1. Общий размер гистограммы островка, автоматически генерируемый платформой, показан на рисунке 6B.

Рисунок 6. Количественная оценка и анализ образцов изоляции человеческих островков. (A) Оценка количества островков и эквивалентного объёма островков с использованием методов IsletNet и ручного подсчёта по долям чистоты полного трансплантата. (B) Гистограмма размера конечного островка, генерируемая IsletNet с использованием пакетных средних значений. (C) Сравнение IsletNet и ручные оценки количества и объёма по 17 отдельным изображениям. (D) Репрезентативная деталь изображения из образца 3NC1, показывающая исходное изображение и расположение контуров, сгенерированные переобученным IsletNet. (E) Пиксельное сравнение сегментации IsletNet с реальностью на земле, генерируемой экспертом по ручному подсчету и экспертом по обучению IsletNet (GT1 против GT2). В легенде отмечены области истинного положительного, ложноположительного, ложноотрицательного и истинно отрицательного. (F) Репрезентативная гистограмма размера островка для того же изображения, сравнивающая IsletNet и ручные результаты. Пурпурные наконечники стрелок указывают на смещение категорий контуров и размеров островка. Шкала = 100 мкм. Коробочные плоты показаны согласно конвенции Тьюки; Усы простираются до точек данных в пределах 1,5 × межквартильного диапазона от первого и третьего квартилей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Автоматические и ручные оценки были впоследствии сравниваны для всех отдельных изображений (рисунок 6C). Медианные коэффициенты между автоматизированными и ручными оценками составляли 1,00 для количества островков и 0,93 по объёму островков, при этом были отмечены несколько исключений. В одном репрезентативном выборке низкой чистоты (3NC1) платформа выявила такое же количество островков, как и ручной подсчёт (пять островков), но оценила на 29% меньший объём островков. Эти точки обозначены стрелками на рисунке 6C.

Самый большой островок, частично захваченный в экзокриновой ткани, на этом репрезентативном изображении показан на рисунке 6D, включая оригинальное изображение и автоматически сгенерированное контурное наложение. Сравнение по пикселям с сегментациями GT, созданное двумя экспертами независимо, показано на рисунке 6E. Соответствующие гистограммы размера островков продемонстрировали сдвиг распределения размеров между ручной и автоматизированной сегментацией (рисунок 6F).

Операционная эффективность автоматизированного анализа

Операционная производительность инструментов Simple Compare и Clinical Islet Isolation оценивалась в стандартных интернет-условиях со средней скоростью загрузки и выгрузки 50 Мбит/с и 30 Мбит/с соответственно. Пять партий изображений, содержащие по 12 изображений каждая, анализировались с использованием размеров изображений от 0,5 МБ JPEG до 20 МБ TIFF. Длительность загрузки измерялась для полных пакетов результатов ZIP.

Время визуализации анализа и длительность загрузки постепенно увеличивались с ростом размера изображения для обоих инструментов (Таблица 4). Инструмент Clinical Islet Isolation требовал более длительной обработки, чем Simple Comparison для эквивалентных наборов изображений. Эти результаты демонстрируют практическую связь между разрешением изображения, форматом файла и пропускной способностью анализа во время рутинной эксплуатации.

Таблица 4: Время визуализации анализа и время загрузки для инструментов Clinical Islet Isolation и Simple Comparison. Сравнение времени обработки, необходимых для визуализации результатов и загрузки файлов с использованием пакетов изображений разных размеров и форматов. Измерения были получены с использованием пакетов, содержащих 12 изображений, и они отражаются как прошедшее время от отправки пакета до визуализации результатов или завершения загрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Представленный здесь протокол описывает практический рабочий процесс для будущих и опытных пользователей IsletNet, с акцентом на две ключевые особенности платформы: экспертный vQC и переобучение нейронных сетей. Репрезентативные результаты показывают, что точная автоматизированная количественная оценка зависит не только от эффективности сегментации изображения, но и от способности пользователя критически оценивать расположение контуров и пригодность изображения перед принятием результатов. Для получения выбранных результатов валидации использовались два дополнительных продвинутых инструмента — Pixel-to-Pixel Comparison и My Segmentations; однако эти инструменты предназначены прежде всего для поддержки обучения нейронных сетей и поэтому не включены в рабочий процесс протокола.

IsletNet был разработан как совместный и широко доступный справочный инструмент для стандартизированного анализа изображений островков в лабораториях. Нейронная сеть была обучена и валидирована с помощью вручную аннотированных сегментаций оригинальных двумерных микроскопических изображений изолированных островков людей и^крыс 14,15,16. Были разработаны две отдельные модели препаратов, окрашенных дитизоном, и дополнительная исследовательская модель для незапятнанных крысиных островков, доступ к которым был доступен по запросу. Версия платформы и дата обучения отображаются в пользовательском интерфейсе. IsletNet автоматически сегментирует островки и экзокринные ткани, а затем рассчитывает количество островков, объём и чистоту с использованием пользовательского размера пикселя и минимального порога размера островка. Выбор порога размера островков зависит от качества изображения и цели анализа (сравнение рядом с ручным подсчётом и изучением малых островков), а не от видов. Учитывая разрешение традиционной микроскопии, значимый минимальный размер островка составляет 50 мкм ^7,8,9,12, но его можно уменьшить до 10 мкм для изображений, полученных соответствующим^{инструментом 10}. Оценки объёма островков генерируются с использованием стандартной таблицы преобразования на основе сфер¹³, а также альтернативных таблиц преобразования^{7, 18, 19}, включая приближённые эллипсы ^5,6 и контурные модели Spinacle и Sphiracle¹⁷. Полученные значения сообщаются в эквивалентах островков и нанолитрах, а чистота рассчитывается либо по площади ткани, либо по оценочному объёму ткани. Критическим этапом протокола является получение стандартизированных микроскопических изображений, подходящих для автоматизированной сегментации. IsletNet проходила обучение с использованием изображений, полученных стерео- и инвертированными микроскопами, оснащёнными различными комплементарными полупроводниковыми камерами и системами освещения на основе комплементарных металлических оксидов. Объективы с низким увеличением (1–2×) выгодны, поскольку позволяют всему образцу оставаться в поле зрения, при этом сохраняя размер пикселя, совместимый с надёжным обнаружением небольших островков. Стабильное освещение, стабильный баланс белого и предотвращение переэкспозиции изображения необходимы для надёжной генерации контуров. Репрезентативные результаты показывают, что повторное обучение с использованием репрезентативных локальных изображений может существенно улучшить результаты сегментации в гетерогенных условиях визуализации. В качестве практического ориентира изображения обычно подходят для обучения IsletNet, когда границы тканей островков и экзокрины чётко различимы опытному наблюдателю. Изображения с сгруппированными или сильно перекрывающимися островками следует избегать по возможности по возможности.

Протокол также выделяет ряд ограничений и аспектов устранения неполадок, связанных с автоматизированным анализом изображений. Хотя IsletNet значительно увеличивает пропускную способность, объективность и воспроизводимость по сравнению с полностью ручным подсчётом, метод остаётся чувствительным к качеству изображения. Иногда может возникать неправильное расположение контуров (обнаружение ошибочных островков и отсутствие сепа-скорости соседних островков) и влиять на дальнейшую количественную оценку. Рутинный vQC остаётся необходимым перед принятием автоматизированных результатов. Немедленное применение на месте в IsletNet выгодно, поскольку неподходящие изображения можно получить с помощью скорректированных параметров изображения. Ручная коррекция автоматических контуров возможна в окне инспекции, за исключением отсутствующих островков или нескольких поддельных островков. Кроме того, автоматизированный алгоритм разделения основан на геометрии контуров и статистике распределения размеров островков, поэтому может отличаться от первоначальной интерпретации конкретного эксперта, оставаясь при этом аналитически приемлемым.

Надёжность IsletNet определяется прежде всего согласованностью локального качества изображения с обучающим набором данных, а не только по виду. Хотя текущий набор обучения включает человеческие островки разной чистоты и крысиные островки высокой чистоты, платформа может быть расширена на другие виды, при условии, что характеристики изображения останутся соответствующими данным по обучению. Например, свиные островки, очищенные культурой, могут напоминать встроенные человеческие островки, присутствующие в наборе данных для обучения. В отличие от этого, широко культивируемые островки с слабым дитизонным окрашиванием не были представлены во время тренировки и могут требовать дополнительной подготовки. Таким образом, инструмент Simple Comparison поддерживает важный этап валидации для новых пользователей или новых конфигураций изображения. Представленные здесь результаты подчёркивают, как различные экспертные интерпретации встроенных островков могут влиять на генерацию GT и оценку объёмов в дальнейшем сегменте. Чтобы компенсировать отсутствие широкого экспертного консенсуса в будущих многоцентровых исследованиях, было разработано приложение^{IsletSwipe 20} для облегчения аннотаций изображений на основе консенсуса.

По сравнению с традиционным ручным подсчётом под микроскопом, IsletNet обеспечивает значительно более высокую пропускную способность, постоянную цифровую документацию и стандартизированные количественные результаты, снижая вариативность, зависимую от оператора. Ручной подсчёт всё ещё может обеспечить большую уверенность в идентификации тканей при пограничных случаях, но ограничен субъективной оценкой размера, низкой масштабируемостью и обширными требованиями к обучению персонала. Как веб-сервис, IsletNet обеспечивает межлабораторную сопоставимость с помощью централизованного, но анонимного анализа. Скорость анализа зависит от пропускной способности локального интернета, размера файла изображений и сложности изображения. Крупные TIFF-файлы могут улучшить качество изображения, но требуют более длительного времени загрузки и загрузки по сравнению с сжатыми JPEG-изображениями.

В целом, представленные здесь результаты показывают, что надёжная автоматизированная количественная оценка может быть достигнута, если локальное получение изображений остаётся воспроизводимым и согласованным с обучающим набором. Пользователям рекомендуется включать vQC в свою рутину и рассматривать возможность повторного обучения при существенных изменениях в местных условиях визуализации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
35 мм чаши Петри	Sigma-Aldrich	P5481	Нестерильные
Наконечники для пипеток 200 µL с широким отверстием	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	Для дозирования суспензии островков перед окрашиванием
Диметиловый сульфоксид (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Градиент GC или для культуры клеток
Дитизон (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	В порошке
Этанол, 70%	Местный поставщик	Н/Д	(об. %) в H2O; для приготовления DTZ
Фетальный бычий сыворотка (FBS)	Gibco	10270106	Теплоинактивированная, квалифицированная
Растворы солей Ханка (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	С фенолсульфонфталеином или без (указать в зависимости от анализа)
Человеческий альбумин	Grifols	61953-0001-2	Высококонцентрированный раствор (200 г/л)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 МП
Infinity Capture	Lumenera	Н/Д	Стандартное программное обеспечение для сбора изображений
Инвертированный микроскоп CKX41	Olympus	Н/Д	Объективы 1,25x и 2x
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	LED-источник света; двойной гусячий нос
Источник света Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Галогенный источник света (14,5 В, 90 Вт); ручное регулирование интенсивности; двойной гусячий нос
Лабораторные принадлежности	Различные	Н/Д	Пипетки, пробирки, иглы, шприцы, лабораторные таймеры, стандартное ИИЗ
Программное обеспечение MicroCam	Bresser	Н/Д	Стандартное программное обеспечение для сбора изображений
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, 3,1 МП камера
Фильтрующий блок Millex-MP	MilliporeSigma	SLMP025SS	Размер поры 0,22 µm, мембрана из ПЭС
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	Gibco	10010023	pH 7,4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, 5 МП, камера с высоким динамическим диапазоном
QuickPHOTO	Promicra	Н/Д	Стандартное программное обеспечение для сбора изображений
Гидроксид натрия (1 М NaOH)	Местный поставщик	Н/Д	Для корректировки pH и растворения при приготовлении DTZ
Стадийный микрометр	Thorlabs	R1L3S1P	Длина 10 мм; деления 50 µm для калибровки
Стереоскопический микроскоп SZH10	Olympus	Н/Д	Объектив 1x апохроматов