Колориметрический метод Антрон для количественной оценки гликогена в печени и скелетной мышце крыс

Краткое содержание

Этот протокол описывает колориметрический метод антрона для количественной оценки гликогена в печени крыс и скелетных мышцах в различных метаболических состояниях.

Аннотация

Гликоген является основным внутриклеточным запасом глюкозы в печени и скелетной мышце и играет фундаментальную роль в метаболизме углеводов. Печёночный гликоген необходим для сохранения системного гликемического гомеостаза, тогда как скелетный мышечный гликоген поддерживает физическую активность и физическую нагрузку. Точная количественная оценка тканевого гликогена имеет решающее значение для исследований, в которых метаболизм гликогена динамически регулируется или патологически изменяется. Здесь мы описываем надёжный и чувствительный антронный колориметрический метод для количественного определения содержания гликогена в печени и скелетных мышцах крыс. Протокол состоит из последовательных этапов, включая щелочное переваривание, депротеинизацию, осаждение гликогена, промывку спиртом и окраску с помощью реагента Anthrone. Применимость этого метода продемонстрирована у крыс, подвергшихся трём физиологически значимым состояниям: кормлению ad libitum , ночному голоданию и краткосрочному повторному кормлению. Эти экспериментальные парадигмы отражают ключевые метаболические состояния, связанные с накоплением, истощением и ресинтезом гликогена. Ортогональный вестерн-блот анализ ключевых ферментов — гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы — обеспечивает механистическую поддержку наблюдаемых метаболических изменений. Применимость этого метода дополнительно продемонстрирована на животных, обработанных эпинефрином, для моделирования острого стресс-индуцированного разрушения гликогена. В совокупности этот метод обеспечивает широкий динамический диапазон и достаточную чувствительность для количественной оценки гликогена тканей при существенно различных физиологических состояниях. Он является надёжным инструментом для исследования метаболизма гликогена in vivo и также может применяться к моделям культуры клеток in vitro.

Введение

Гликоген — это сильно ветвлённый полисахарид, который служит основным энергетическим резервуаром в скелетных мышцах и печени млекопитающих, а в меньшей степени — в других органах, таких как мозг, почки, сердце и^{жировая ткань 1}. Во время кормления избыточная глюкоза подвергается полимеризации или de novo липогенезу и накапливается в виде гликогена или липидов. Однако во время голодания или физической нагрузки гликоген подвергается ферментативному разложению, обеспечивая постоянный и быстрый поступок глюкозы для удовлетворения энергетических потребностей. Эта буферная способность гликогена необходима для поддержания гликемического гомеостаза в физиологических циклах быстрого^{перепитания 2}.

Синтез гликогена катализируется гликогенсинтазой (GYS), которая существует в двух изоформах млекопитающих: GYS1 и GYS2. GYS1 преимущественно экспрессируется в скелетных мышцах, тогда как GYS2 — это изоформа печени. Каталитическая активность GYS подавляется фосфорилированием в нескольких участках, включая Ser641, в условиях голодания, тогда как её активность стимулируется при дефосфорилировании при кормлении. Распад гликогена катализируется гликогенфосфорилазой. Изоформа печени — PYGL, а изоформа мышцы — PYGM. В отличие от GYS, их каталитическая активность стимулируется при фосфорилировании на уровне Ser15 во время голодания и подавляется при дефосфорилировании после^{кормления 3}.

Правильная регуляция метаболизма гликогена является фундаментальной частью многих биологических процессов, и нарушение метаболизма гликогена было определено как причинный фактор многих заболеваний. В частности, нарушение метаболизма гликогена в печени связано с различными метаболическими нарушениями, включая заболевания накопления^{гликогена 4}, диабет^{2 типа 5}, связанное с метаболической дисфункцией стеатозной болезни^{печени 6,7} и нарушение контррегуляторного ответа на гипогликемию⁸. Кроме того, гликоген в мозге необходим для формирования долгосрочной памяти⁹, а гликоген скелетных мышц является ключевым регулятором выносливости¹⁰. Поэтому точная количественная оценка тканевого гликогена крайне важна для исследований, в которых метаболизм гликогена динамически регулируется или патологически изменяется, что позволяет исследовать механизмы заболевания и оценивать гликоген-модулирующие вмешательства.

Было описано несколько методов количественной оценки гликогена, включая метод^{антрона 11,12}, метод амилоглюкозидазы¹³, метод фенол-серной^{кислоты 14} и метод неинвазивной ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (MRS)¹⁵, при этом каждый метод имеет определённые преимущества и ограничения. Здесь мы описываем подробный протокол колориметрического метода антрона для количественной оценки гликогена в печени крыс и скелетных мышцах (рисунок 1). Этот протокол включает последовательные этапы щелочного пищеварения, депротеинизации, осадки гликогена, промывания алкоголя и окраски с помощью реагента антрона. Этот метод прост, экономичен и требует минимального специализированного оборудования. Чтобы продемонстрировать его чувствительность и воспроизводимость, мы рассчитали предел обнаружения (LOD), предел количественной оценки (LOQ), а также коэффициенты вариации внутри и между анализами (CV%), используя ряд стандартов гликогена. Для демонстрации применимости уровень гликогена в печени и скелетной мышце был оценён при трёх физиологически значимых условиях: импровизированное питание, 16-часовое ночное голодание и кратковременное повторное питание. Кроме того, метод был продемонстрирован с использованием животных, обработанных эпинефрином, для моделирования острого стресс-индуцированного распада гликогена. Для подтверждения наблюдаемых метаболических изменений был проведен ортогональный вестерн-блот ключевых ферментов, участвующих в метаболизме гликогена.

Рисунок 1: Обзор процесса количественной оценки гликогена. Схематическое представление экспериментального рабочего процесса для количественной оценки гликогена в печени и скелетной мышце. Процедура включает сбор тканей, щелочное пищеварение, выделение белков, выделение гликогена и колориметрическое обнаружение на основе антрона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол

Все протоколы для животных были утверждены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC; #1905019) Нанкинского медицинского университета.

1. Подготовка реактивов

1. См. Таблицу материалов для всех реагентов, использованных в этом исследовании.
2. Подготовьте все решения до начала экспериментов.
3. Масштабируйте объемы решений по мере необходимости.
4. Приготовьте раствор гидроксида натрия (NaOH) объёмом 1 М
   1. Вес 40 г гранул NaOH.
   2. Добавьте гранулы NaOH в дистиллированную воду объёмом 800 мл.
   3. Перемешайте раствор стеклянным стержнем, пока у основания сосуда не останется нерастворённые частицы.
   4. Переложите раствор в колбу объёмом 1 л.
   5. Увеличите объём ровно до 1 л с помощью дистиллированной воды.
   6. Храните раствор в плотно закрытой бутылке при комнатной температуре (RT; 18°C–23°C).
      ВНИМАНИЕ: NaOH — коррозийный. Наденьте защитные очки, перчатки и лабораторный халат. Коммерческие гранулы NaOH не являются 100% чистыми и впитывают воду. Избегайте длительного воздействия гранул на воздух.
5. Приготовьте 20% раствор с хлоридом лития (LiCl)
   1. Весите 20 г безводного порошка LiCl.
   2. Добавьте порошок LiCl в дистиллированную воду объёмом 80 мл.
   3. Перемешайте раствор, пока у основания сосуда не останется нерастворённые частицы.
   4. Переложите раствор в объёмную колбу объёмом 100 мл.
   5. Увеличите объём ровно до 100 мл с помощью дистиллированной воды.
   6. Храните раствор в плотно закрытой бутылке в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: LiCl может раздражать кожу, глаза и дыхательные пути. Наденьте защитные очки, перчатки и лабораторный халат. LiCl очень гигроскопична. Минимизируйте воздействие воздуха, чтобы предотвратить впитывание воды.
6. Подготовьте раствор для реакции на троне
   1. Поместите 28 мл дистиллированной воды в стакан объемом 1 л.
   2. Добавьте в воду 72 мл концентрированной серной кислоты высокой чистоты (98%) (H₂SO₄).
   3. Дайте смеси остыть до RT.
   4. Добавьте 50 мг Anthrone в раствор.
   5. Перемешивайте, пока трон не растворится.
   6. Добавьте в раствор 3 г тиомочевины.
   7. Перемешивайте, пока тиомочевина не растворится.
   8. Переливайте раствор в стеклянную бутылку, завернутую в янтарь или фольгу.
   9. Храните раствор в холодильнике (2°C–8°C) максимум на неделю.
      ВНИМАНИЕ: Серная кислота сильно коррозийна, вызывает серные химические ожоги и резко реагирует с водой. Наденьте лабораторный халат, химически стойкие перчатки и защитный экран. Выполняйте все этапы в сертифицированной вытяжке для химических паров. Разбавление создаёт интенсивное тепло. Всегда добавляйте кислоту в воду.
7. Приготовьте 95% этанола, содержащего 0,1% LiCl
   1. Добавьте 95 мл абсолютного этанола в стеклянную бутылку.
   2. Добавьте 4,5 мл дистиллированной воды.
   3. Добавьте 0,5 мл 20% раствора LiCl.
   4. Тщательно перемешайте.
8. Приготовьте 80% метанола, содержащего 0,1% LiCl
   1. Добавьте 80 мл абсолютного метанола в стеклянную бутылку.
   2. Добавьте 19,5 мл дистиллированной воды.
   3. Добавьте 0,5 мл 20% раствора LiCl.
   4. Тщательно перемешайте.
9. Приготовьте раствор трихлоруксусной кислоты (TCA) на 100% (w/v)
   1. Весит 100 г порошка TCA.
   2. Добавьте порошок TCA в дистиллированную воду объёмом 80 мл.
   3. Мешайте до растворения.
   4. Переложите раствор в объёмную колбу объёмом 100 мл.
   5. Увеличите объём ровно до 100 мл с помощью дистиллированной воды.
   6. Храните раствор в плотно закрытой стеклянной бутылке в RT.
10. Приготовьте насыщенный раствор бензойной кислоты
    1. Добавьте 0,5 г кристаллов бензойной кислоты в дистиллированную воду объемом 100 мл в стеклянном стакане объёмом 250 мл.
    2. Нагрейте смесь до 90°C на горячей плите с непрерывным магнитным перемешиванием.
    3. Продолжайте нагревать, пока у основания сосуда не останется нерастворённые частицы.
    4. Дайте раствору остыть до RT.
    5. Аспирируйте прозрачный супернатант, свободный от видимых частиц.
    6. Храните раствор в плотно запечатанной стеклянной бутылке в RT.
11. Подготовьте стандарты глюкозы
    1. Растворить 50 мг глюкозного порошка в насыщенном растворе бензойной кислоты объёмом 50 мл для приготовления бульонного раствора концентрацией 1 мг/мл.
    2. Подготовьте стандарты глюкозы (0, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1 мг/мл) в микроцентрифугных трубках объёмом 1,5 мл путём последовательного разбавления насыщенной бензойной кислотой следующим образом.
       1. Добавьте 500 мкл стандартного раствора 1 мг/мл в трубку 1, чтобы получить стандарт 1 мг/мл.
       2. Добавьте 250 мкл стандартного раствора и 250 мкл насыщенной бензойной кислоты в трубку 2, чтобы получить стандарт 0,5 мг/мл.
       3. Добавьте 200 мкл раствора Tube 2 и насыщенную бензойную кислоту 300 мкл в пробирку 3, чтобы получить стандарт 0,2 мг/мл.
       4. Добавьте 250 мкл раствора Tube 3 и 250 мкл насыщенной бензойной кислоты в Трубку 4, чтобы подготовить стандарт 0,1 мг/мл.
       5. Добавьте 250 мкл раствора Tube 4 и 250 мкл насыщенной бензойной кислоты в Tube 5, чтобы получить стандарт 0,05 мг/мл.
       6. Добавьте 200 мкл раствора Tube 5 и насыщенную бензойную кислоту 300 мкл в пробирку 6, чтобы подготовить стандарт 0,02 мг/мл.
       7. Добавьте 250 мкл раствора Tube 6 и 250 мкл насыщенной бензойной кислоты в Tube 7, чтобы получить стандарт 0,01 мг/мл.
       8. Добавьте 500 мкл насыщенной бензойной кислоты в отдельную трубку для подготовки заготовки (0 мг/мл).
    3. Закройте каждую трубку и вихрь ненадолго на 10 секунд, чтобы хорошо перемешать.

2. Обращение с животными

1. Общее животноводство
   1. Содержать самцов крыс рода Sprague–Dawley (230–270 г) в животноводческом хозяйстве в условиях определённых свободных от патогенов (VAF/Plus health status, Charles River Laboratories), сертифицированных как не содержащие распространённых грызунов, включая вирус Sendai, Mycoplasma pulmonis и крысиные парвовирусы.
   2. Обеспечьте стандартную ежу и обеспечьте свободный доступ к воде.
   3. Поддерживайте животных в 12-часовом цикле свет/темнота (свет включается в 08:00, выключается в 20:00).
   4. Поддерживайте RT при 22°C–23°C.
   5. Поддерживайте относительную влажность на уровне 30–70%.
2. Ночное голодание
   1. Перемещайте крыс в обычные клетки.
   2. Уберите еду и обеспечьте свободный доступ к воде.
   3. Соблюдайте голодание 16 часов с 16:30 до 08:30 следующего утра.
3. Пополнение кормления
   1. Обеспечивайте регулярным кормом (200 г) крысам, голодающим на ночь.
   2. Позвольте животным кормиться ad libitum в течение 2 часов.
4. Вызов с эпинефрином
   1. Приготовьте раствор гидрохлорида эпинефрина.
      1. Взвесьте порошок гидрохлорида эпинефрина 5 мг с использованием калиброванного аналитического веса.
      2. Переложите порошок в центрифугную трубку на 15 мл и добавьте 10 мл физиологического раствора.
      3. Закройте трубку и переверните 10 раз, чтобы получить стандартный раствор на 0,5 мг/мл.
   2. Инъекции крысам без голодания внутрибрюшно раствора гидрохлорида адреналина при объёме 1 мл/кг массы тела (0,5 мг/кг массы тела)³.
      1. Держите животное в положении головы вниз, чтобы содержимое живота могло сдвинуть черепно.
      2. Введите иглу калибра 25 в нижний правый квадрант живота под углом 45°.
      3. Аспирируйте для подтверждения отсутствия крови или кишечного содержимого перед инъекцией.
   3. Внутрибрюшно вводите контрольным животным физиологический раствор с объёмом 1 мл/кг.
   4. Возьмите образцы крови из хвостовых вен.
      1. Держите крысу, чтобы открыть хвост.
      2. Сожмите и нагрейте хвост на 10 секунд, чтобы улучшить кровоток.
      3. Проколите боковую вену хвоста в 3 см от кончика стерильной иглой 25 калибра.
      4. Сбросьте первую каплю крови чистой марлей, чтобы избежать загрязнения тканей жидкостью.
      5. Соберите вторую каплю крови для измерения уровня глюкозы.
   5. Измеряйте уровень глюкозы в крови с помощью глюкометра каждые 15 минут в течение 60 минут.
      1. Калибруйте глюкометр согласно инструкциям производителя.
      2. Проверяйте точность глюкометра ежемесячно с помощью контрольных решений.
      3. Храните тест-полоски в оригинальном контейнере, чтобы предотвратить воздействие влаги.
      4. Используйте тест-полоски сразу после извлечения из контейнера.
      5. Вставьте тест-полоску в глюкометр для автоматического включения прибора.
      6. Позволите образцу крови попасть в полоску капиллярным действием.
      7. Запишите отображаемое значение глюкозы в крови.

3. Сбор тканей

1. Эвтаназия и подготовка
   1. Эвтаназия животных с помощью передозировки изофлурана. Поместите животных в индукционную камеру и подвергите их воздействию 5% изофлурана, подаваемого в 100% кислороде при 2 л/мин, не менее чем 3 минуты.
   2. Подтвердите смерть, подтвердив прекращение дыхания.
   3. Подтвердите потерю роговицы и рефлекс сжатия пальцев ног.
      1. Аккуратно коснусь роговицы стерильным аппликатором с хлопковым наконечником, чтобы убедиться, что реакция на моргание отсутствует.
      2. Крепко сжмите перепонку между пальцами задней лапы с помощью тупых щипцов, чтобы убедиться в отсутствии моторной реакции.
   4. Положите крысу вентральной стороной вверх на лоток для вскрытия.
   5. Смочите кожу живота 75% этанола с помощью пульверизатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать время между эвтаназией и сохранением тканей, чтобы снизить деградацию гликогена, вызванную посмертной ишемией.
2. Вскрытие печени
   1. Сделайте небольшой разрез на коже примерно в 1 см хвоста от ксевистовидного отростка.
   2. Удлините разрез в сторону грудины.
   3. Отдельте кожу от подлежащей мышцы.
   4. Выполните двустороннюю поперечную лапаротомию, сделав горизонтальный разрез диаметром 4 см примерно 1 см хвостового отростка и вытянув бок к левому и правому подреберному краям, чтобы полностью обнажить брюшную полость.
   5. Определите печень.
   6. Вырезать правую медианную долю (рисунок 2A).
   7. Взвесьте ткань в течение 1 минуты.
   8. Поместите ткань в полипропиленовый пластиковый контейнер.
   9. Заморозьте салфетку в сухом льду.
3. Диссекция скелетной мышцы
   1. Используйте гастрокнемиус мышцу как представительный образец, так как она содержит смешанную популяцию быстрых и медленно дергающихся волокон, отражающих метаболические и сокращающиеся характеристики задней^{конечности.}
   2. Положите крысу на живот.
   3. Сделайте продольный кожный разрез вдоль задней части задней конечности от подколенной ямки до пятичной бугоркости.
   4. Отдельте кожу.
   5. Идентифицируйте и отражайте мышцы бицепса бедра и полутендиноза.
      1. Определите бицепс бедра как крупную, расположенную боком мышцой, покрывающую верхнюю часть задней части бедра.
      2. Идентифицируйте полутендиноз как узкую мышцу, похожую на ремешки, проходящую медиально вдоль задней части бедра и вставляющуюся рядом с коленом.
   6. Обнажите желудочную мышцу.
   7. Перерезайте ахиллово сухожилие в месте его дистального прикрепления на пяточку с помощью тонких хирургических ножниц.
   8. Отдельте мышцу состевого мозга.
   9. Освободить проксимальное прикрепление гастрокнемиусной мышцы к медиальному и латеральному эпикондиллям бедренной кости.
   10. Удалите всю желудочную мышцу (рисунок 2B).
   11. Взвесьте ткань в течение 1 минуты.
   12. Поместите ткань в полипропиленовый пластиковый контейнер.
   13. Заморозьте салфетку в сухом льду.

Рисунок 2: Процедуры вскрытия тканей для печени и скелетной мышцы. (A) Последовательные этапы для обнажения брюшной полости и извлечения печеночных тканей, включая разрез кожи, расширение разреза, отделение кожи от подлежащей мышцы и поперечную лапаротомию. (B) Последовательные шаги для выделения желудочной мышцы, включая продольный разрез, отражение наложенных мышц, идентификацию анатомических структур и удаление мышцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Колориметрический анализ гликогена

1. День 1: Щелочное пищеварение
   1. Добавьте 0,4 г ткани в пробирку центрифугы объемом 50 мл. Допускается допуск ± 0,1 г для обеспечения быстрой обработки и минимизации деградации тканей.
   2. Добавьте в трубку 10 мл раствора NaOH с 1 м.
   3. Измельчите ткань стерильными лезвиями или ножницами, пока фрагменты ткани не достигнут примерно 1–2 мм размера.
   4. Поставьте трубку в водяную баню при 95°C ± 5°C.
   5. Инкубировать 30 минут.
   6. Вихрь образца на 2500 об/мин в течение 10 секунд каждые 10 минут во время инкубации.
   7. Снимите трубку из водяной бани.
   8. Дайте сэмплу остыть до RT.
2. Приготовление лисата для белкового анализа
   1. Перенесите 1 мл щелочного лизата в микроцентрифугную трубку с помощью калиброванного пипеттора P1000.
   2. Центрифуга при 8 000 × г в течение 10 минут.
   3. Забери супернатант.
   4. Зарезервируйте супернатант для анализа белков BCA.
3. Депротеинизация, опосредованная TCA
   1. Перенесите 3 мл щелочного лизата в центрифугную трубку объемом 15 мл.
   2. Добавьте 1 мл раствора 100% (с TCA).
   3. Добавьте 6 мл дистиллированной воды, чтобы увеличить общий объём до 10 мл.
   4. Вихрь смеси на 2 500 об/мин в течение 10 секунд.
   5. Поставьте трубку на лёд (0°C–4°C).
   6. Инкубировать 1 час для осаждения белков.
4. Коллекция депротеинизированных супернатантов
   1. Перенесите 1 мл смеси в микроцентрифугную трубку.
   2. Центрифуга при 8 000 × г в течение 10 минут на RT.
   3. Забронируйте супернатант.
5. Осаждение гликогена
   1. Перенесите 0,4 мл супернатанта в новую микроцентрифугную трубку.
   2. Добавьте 0,8 мл 95% этанола, содержащего 0,1% LiCl.
   3. Тщательно провёрните смесь.
   4. Инкубировать на RT 16 часов.
6. День 2: Гранулирование гликогена
   1. Центрифугуйте образец при 1 000 × г в течение 15 минут при RT, чтобы получить твёрдую, полупрозрачную белую гликогеновую гранулу (рисунок 3A и рисунок 3B).
   2. Отбросьте супернатант.
7. Первый гликогеновый промыв
   1. Добавьте в гранулу 1,5 мл 80% метанола с 0,1% LiCl.
   2. Вихрь образца на 2 500 об/мин в течение 10 секунд.
8. Центрифугирование после промывки
   1. Центрифугу при 1000 × г в течение 5 минут на RT.
   2. Отбросьте супернатант.
9. Второе промывка гликогена
   1. Повторите этап стирки один раз.
   2. Удаляйте остатки жидкости, аккуратно аспирируя пипеттором P200 с тонким наконечником, чтобы гликогеновая гранула оставалась нетронутой.
10. Растворение гликогена
    1. Добавьте в пеллет 0,8 мл дистиллированной воды.
    2. Вихрь при 2500 об/мин до получения прозрачного, однородного раствора без видимых частиц.
11. Подготовка стандартов и образцов
    1. Подготовьте микроцентрифугные пробирки объёмом 1,5 мл для стандартов глюкозы, бланковые и неизвестные образцы в тройном экземпляре.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте реагенты в каждую трубку согласно таблице 1.
    2. Добавьте по 50 мкл каждого стандарта глюкозы в назначенные пробирки.
    3. Добавьте 50 мкл дистиллированной воды в пустую трубку.
    4. Добавьте образец 50 мкл гликогена в каждую неизвестную пробирку.
    5. Добавьте в каждую трубку реакционный раствор 200 мкл антрона.
12. Развитие цвета Anthrone и измерение поглощения
    1. Тщательно прокрутите все трубки.
    2. Поставьте трубки в водяную баню при 95°C ± 5°C.
    3. Инкубировать 15 минут.
    4. Снимите трубки и дайте им остыть до RT.
    5. Перенесите по 200 мкл из каждой трубки на пластину с 96 лунками.
    6. Измеряйте поглощение на 620 нм с помощью считывателя микропластин (режим концевой точки, 25°C) с автоматической коррекцией длины пути до 1 см.
    7. Стандартная кривая должна иметь коэффициент определения (^{R 2}) ≥0,995, определяемый линейной регрессией, чтобы считаться приемлемой.
    8. Любой отдельный стандарт или образец с CV% >20% среди трёхкратных измерений следует считать ненадёжным и повторять.

Рисунок 3: Изоляция гликогена и количественная оценка при различных питательных состояниях. (A) Репрезентативное изображение осаждённых гликогеновых гранул из образцов печени в условиях питания, натощак и рефеда. (B) Репрезентативное изображение осаждённых гликогеновых гранул из образцов скелетных мышц в условиях кормления, натощак и реферирования. (C) Стандартная кривая, полученная из стандартов глюкозы, показывающая линейную связь между поглощением при 620 нм и концентрацией глюкозы. (D) Уровень глюкозы в крови при кормлении, натощак и реферированных условиях. (E) Содержание гликогена в печени при кормлении, натощаде и рефере. (F) Содержание гликогена в скелетных мышцах при кормлении, натощаке и рефере. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 6 на группу). Статистический анализ проводился с использованием обычного одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) с множественными сравнениями, корректируемыми методом Бенджамини–Хохберга. **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, ns: не значительно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Реагенты	0 мг/мл	0,01 мг/мл	0,02 мг/мл	0,05 мг/мл	0,1 мг/мл	0,2 мг/мл	0,5 мг/мл	1 мг/мл	Blank	Неизвестный образец
Раствор стандарта глюкозы	50 мкл	50 мкл	50 мкл	50 мкл	50 мкл	50 мкл	50 мкл	50 мкл	–	–
Дистиллированная вода (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 мкл	–
Образец гликогена	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 мкл
Решение для реакции Антрона	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл	200 мкл

Таблица 1: Настройка реакции для колориметрического анализа на гликоген. Настройка реакции для стандартов глюкозы, бланков и неизвестных образцов гликогена, используемых в колориметрическом анализе Антрон. Определённые объёмы глюкозных стандартов, дистиллированной воды или образцов гликогена комбинировались с раствором антитроновой реакции перед инкубацией и измерением поглощения.

5. Расчёт содержания гликогена в тканях

ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализуйте измеренный гликоген либо по массе ткани, либо по общей массе белка.

1. Определение стандартной кривой и концентрации
   1. Используйте показания поглощения из восьми стандартных трубок глюкозы.
   2. Вычитайте пустые значения из показаний поглощения перед отображением их с концентрацией глюкозы.
   3. Подогнать линейную регрессионную кривую с использованием обычной регрессии наименьших квадратов в Excel (рисунок 3C).
   4. Вычислите концентрацию глюкозы в каждом неизвестном образце гликогена (C_{неизвестно}), интерполируя её вычитаемую из пустых элементов поглощение на линейную стандартную кривую с помощью регрессионного уравнения, полученного в шаге 5.1.3.
2. Нормализация по влажному весу тканей
   1. Вычислите содержание гликогена с помощью следующего уравнения:
      
   2. Определим_{C неизвестную} как концентрацию глюкозы (мг/мл) в неизвестном образце гликогена, определяемую на шаге 5.1.4.
   3. Определим 0,8 как объём растворённого образца гликогена (мл) на шаге 4.10.1.
   4. Определим 0,9 как фактор, используемый для преобразования значения глюкозы в гликоген.
   5. Определим 2.5 как фактор разбавления, введённый во время осадки гликогена на шаге 4.5.
   6. Определим 10 как коэффициент разбавления, учитывающий 1 мл аликвота, анализируемого из общей смеси 10 мл, приготовленной на шаге 4.3.3.
   7. Определим 10/3 как коэффициент разбавления, учитывающий 3 мл аликвота, использованных из общего щелочного дигеста объёмом 10 мл, подготовленного на шаге 4.1.2.
3. Нормализация до общей массы белка
   1. Вычислите содержание гликогена с помощью следующего уравнения:
      
   2. Определим_{C неизвестную} как концентрацию глюкозы (мг/мл) в неизвестном образце гликогена, определяемую на шаге 5.1.4.
   3. Определим 0,8 как объём растворённого образца гликогена (мл) на шаге 4.10.1.
   4. Определим 0,9 как фактор, используемый для преобразования значения глюкозы в гликоген.
   5. Определим 2.5 как фактор разбавления, введённый во время осадки гликогена на шаге 4.5.
   6. Определим 10 как коэффициент разбавления, учитывающий 1 мл аликвота, анализируемого из общей смеси 10 мл, приготовленной на шаге 4.3.3.
   7. Определим 1/3 как корректировочный коэффициент, учитывающий 3 мл аликвот, используемых из щелочного дайджеста в шаге 4.3.1.
   8. Определите концентрацию белка как концентрацию общего белка (мг/мл) в щелочном дижасте, определяемую анализом BCA в шаге 4.2.4.

6. Западный блот ключевых ферментов, катализирующих метаболизм гликогена

1. Общие соображения
   1. См. ранее описанные протоколы стандартных процедур western blot^17,18.
2. Экстракция белка
   1. Весите 75 мг замороженной ткани. Допускается толерантность ± 25 мг для быстрой обработки и минимизации оттаивания тканей.
   2. Добавьте 1 мл ледяного буфера лизиса RIPA (50 мМ Tris-HCl, pH 7,4; 150 мМ NaCl; 1% тритон X-100; 0,5% натрия дезоксихолата; 0,1% SDS; и 1 мМ EDTA), дополненного ингибиторами протеазы и фосфатазы.
   3. Гомогенизуйте ткань с помощью портативного гомогенизатора ротор-статора.
3. Приготовление лизата
   1. Инкубировать гомогенаты на льду в течение 30 минут.
   2. Вихрь образцов при 2500 об/мин в течение 10 секунд каждые 10 минут во время инкубации.
   3. Центрифуга при 10 000 × г с использованием ротора с фиксированным углом в течение 5 минут при 4°C.
4. Количественная оценка белков
   1. Соберите супернатант в виде полного белкового лизата.
   2. Проведите анализ BCA для определения концентрации белка.
   3. Подготовьте стандарты BSA: 0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 0,75 и 1 мг/мл, разбавленные в буфере лизиса RIPA.
   4. В микропластине с 96 лунками загрузите по 20 мкл каждого стандартного или неизвестного образца в отдельные скважины.
   5. Добавьте в каждую скважину 200 мкл рабочего реагента BCA (приготовленного путём смешивания 50 частей реагента A с 1 частью реагента B).
   6. Инкубировать реакционную пластину при 37°C в течение 30 минут.
   7. После охлаждения до RT (18°C–23°C) измеряйте поглощение на 562 нм с помощью считывателя микропластин (режим конечной точки, 25°C) с автоматической коррекцией длины пути до 1 см.
5. SDS-PAGE
   1. Смешайте 15 мкг белка с буфером загрузки SDS-PAGE.
   2. Нагрейте образцы при 95°C в течение 5 минут.
   3. Охладите образцы на льду.
   4. Загрузите образцы на гель 10% SDS-PAGE.
   5. Растворить белки с помощью электрофореза в буфере (25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 0,1% SDS).
   6. Пропустите гель при постоянных 100 В, пока передняя часть бромофенол-синего красителя не достигнет низа геля.
6. Перенос и блокировка белков
   1. Переносят белки на мембрану нитроцеллюлозы или PVDF.
   2. Для мембран нитроцеллюлозы уравновесьте мембрану в буфере переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% метанол, pH 8,3) в течение 10 минут.
   3. Для мембран PVDF активируйте мембрану погружением в 100% метанол в течение 30 секунд, затем уравновесьте в буфере переноса в течение 10 минут.
   4. Соберите сэндвич для переноса в следующем порядке: губка, фильтрующая бумага, гель, мембрана, фильтрующая бумага, губка.
   5. Провести перенос белка при постоянном токе 200 мА в течение 90 минут при 4°C.
   6. Подготовьте 3% (с в/в) BSA в TBST (20 мМ Tris-HCl, pH 7,4; 150 мМ NaCl; и 0,1% Teen-20).
   7. Блокируйте мембрану на RT на 1 час с постоянным покачиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При обнаружении фосфорилированных белков используйте BSA вместо обезжиренного молока.
7. Инкубация первичных антител
   1. Приготовьте первичный раствор антител в блокирующем буфере при разбавлении 1:1 000.
   2. Инкубировать мембрану первичным антителом при 4°C ночью с постоянным покачиванием.
8. Стирка
   1. Промой мембрану TBST.
   2. Повторяйте стирку три раза по 10 минут каждый.
9. Инкубация вторичных антител
   1. Приготовьте вторичные антитела, конъюгированные с HRP, в блокирующем буфере при разбавлении 1:10 000.
   2. Инкубировать мембрану в RT в течение 1 часа с постоянным покачиванием.
10. Стирка
    1. Промой мембрану TBST.
    2. Повторяйте стирку три раза по 10 минут каждый.
11. Хемилюминесцентное обнаружение
    1. Подготовьте хемилюминесцентный субстрат, смешивая равные объемы люминола/энхансера и стабильных растворов перекиси.
    2. Нанесите субстрат при объёме 0,1 мл/см^² поверхности мембраны и инкубировать 2 минуты в RT на орбитальном шейкере (100 об/мин).
    3. Захват сигналов с помощью хемилюминесцентного имиджера.
    4. Проверьте время экспозиции от 10 до 300 с и выберите экспозицию в линейном диапазоне обнаружения для каждого пятна.
    5. Проверьте линейность сигнала, подтвердив отсутствие насыщенности пикселей с помощью встроенного программного обеспечения прибора.
12. Анализ изображений
    1. Анализировать интенсивность полос с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 1.51, NIH).
    2. Преобразуйте изображения в 8-битные оттенки серого и применяйте вычитание фона с вращающимся шаром радиусом 50 пикселей.
    3. Определите каждую полосу с использованием прямоугольной области интересующих одинаковых размеров и вычтите локальный фон из соседней пустой области, чтобы получить необработанные интегрированные значения плотности.
13. Тотальное окрашивание белков
    1. Инкубировать мембрану в растворе чернил 0,1% в TBST на RT в течение 1 часа с постоянным покачиванием.
    2. Промой мембрану три раза по 10 минут с помощью TBST.
    3. Количественно определить несколько окрашенных полос как контролёров нагрузки для нормализации сигналов иммуноблоттинга.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте полное окрашивание белка вместо генов домашнего хранения (HKG), так как экспрессия HKG может варьироваться при различных экспериментальных^{условиях 19}.

7. Чувствительность и воспроизводимость метода

1. Подготовка стандартов гликогена
   1. Приготовьте настоящий раствор гликогена 20 мг/мл в 1 М NaOH.
   2. Подготовьте серию стандартов гликогена (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1 мг/мл) в центрифугных трубках по 15 мл путём поэтапного разбавления с 1 M NaOH, как описано ниже.
      1. Подготовьте пробирку 1 (1 мг/мл), смешав раствор гликогена 500 мкл с 9,5 мл 1 М NaOH.
      2. Подготовьте трубку 2 (0,5 мг/мл), смешивая раствор гликогена 250 мкл с 9,75 мл 1 М NaOH.
      3. Подготовьте трубку 3 (0,2 мг/мл), смешав стандартный раствор 100 мкл гликогена с 9,9 мл 1 М NaOH.
      4. Подготовьте трубку 4 (0,1 мг/мл), смешав стандартный раствор гликогена 50 мкл с 9,95 мл 1 М NaOH.
      5. Подготовьте трубку 5 (0,05 мг/мл), смешав 25 мкл раствора гликогена с 9,975 мл 1 М NaOH.
      6. Подготовьте трубку 6 (0,02 мг/мл), смешивая раствор гликогена 10 мкл с 9,99 мл 1 М NaOH.
      7. Подготовьте трубку 7 (0,01 мг/мл), смешав 100 мкл раствора трубки 1 с 9,9 мл 1 М NaOH.
      8. Подготовьте трубку 8 (0,005 мг/мл), смешав 50 мкл раствора трубки 1 с 9,95 мл 1 M NaOH.
      9. Приготовьте заготовку (0 мг/мл), добавив 10 мл 1 M NaOH в центрифугную трубку на 15 мл.
   3. Закройте каждую трубку и вихрь на 2 500 об/мин на 10 секунд для смешивания.
2. Колориметрический анализ Антрон
   1. Извлекать гликоген и провести колориметрический анализ на троне в соответствии с шагами 4.1.4–4.12.6.
   2. Зафиксировать показания поглощения на 620 нм (_A620).
3. Расчёт концентрации гликогена
   1. Сгенерируйте кривую стандарта глюкозы и вычислите концентрацию глюкозы в каждом стандартном образце (_{стандарт} C), как указано в шаге 5.1.
   2. Вычислите концентрацию гликогена в каждой стандартной трубке с помощью следующего уравнения:
      
   3. Определим_{стандарт} C как концентрацию глюкозы (мг/мл), определяемую в каждом стандартном образце.
   4. Определим 0,8 как объём образца гликогена (мл).
   5. Определим 0,9 как фактор для преобразования значения глюкозы в гликоген.
   6. Определим 2.5 как коэффициент разбавления.
   7. Определим 10 как коэффициент разбавления, учитывающий 1 мл аликвота, анализируемого из общей смеси 10 мл, приготовленной на шаге 4.3.3.
   8. Определим 1/3 как корректировочный коэффициент, учитывающий 3 мл аликвот, используемых из щелочного дайджеста в шаге 4.3.1.
   9. Повторите всю процедуру ещё три раза в течение одного дня, всего получится четыре забега.
   10. Повторите четыре забега за четыре дня — всего 16 забегов.
4. Расчёт LOD и LOQ
   1. Нанесём все 16 показаний поглощения по оси y по каждой стандартной концентрации гликогена по оси x.
   2. Вычислим кривую линейной регрессии и^{R 2}. Линейная регрессия с R² равной ≥0,995 считается приемлемой.
   3. Вычислите LOD и LOQ с помощью следующих уравнений:
      
      
   4. Определим σ как стандартную ошибку ответа (y-перехват).
   5. Определим S как наклон кривой линейной регрессии.
5. Расчёт внутри- и межанализового CV%
   1. Для каждого стандарта гликогена вычислите внутрианализовый CV% рассчитанных значений из четырёх пробов в первый день с помощью следующего уравнения:
      
   2. Определим s₁ как стандартное отклонение значений от четырёх забегов на первый день.
   3. Определим как среднее значение из четырёх забегов первого дня.
   4. Повторите этот расчёт для второго, третьего и четвёртого дней, чтобы получить CV₂,_{CV 3} и CV₄.
   5. Вычислите итоговый внутри-анализный CV% с помощью следующего уравнения:
      
   6. Вычислите межтестовый CV% с помощью следующего уравнения:
      
   7. Определите s_inter как стандартное отклонение CV₁,_{CV 2}, CV₃ и CV₄.
   8. Определим как среднее значение CV₁, CV₂, CV₃ и CV₄.

Результаты

Уровни гликогена в печеночной и скелетной мышцах при различных питательных состояниях

Ночное голодание значительно снизило уровень глюкозы в крови (средняя ± стандартной ошибки среднего [SEM]) с 7,9 ± 0,4 мМ у крыс, питаемых импровизией, до 5,4 ± 0,3 мМ. Уровень глюкозы в крови был восстановлен до 8,3 ± 0,1 мМ после 2 часов повторного кормления (рисунок 3D). В соответствии с этими изменениями, уровень гликогена в печени (средний ± SEM) со...

Обсуждение

В этой статье мы описываем модифицированный колориметрический метод антрона для количественной оценки гликогена в тканях животных. В дополнение к традиционным последовательным этапам сбора тканей, щелочного переваривания, осадки гликогена, промывания спиртом и развития цвета на основе антрона, мы включили этап депротеинизации для уменьшения фоновых помех (рисунок 1). Затем мы применили этот метод для оценки изменений содержания гликогена в печени и желудочно...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1.5 мл микроцентрифужные пробирки	LABGIC	BS-15-M	Используется для обработки образцов и настройки реакции
15 мл микроцентрифужные пробирки	LABGIC	BS-150-M-S	Используется для работы с лизатами и шагами осадки
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Буфер для мойки мембраны в вестен-блоте
37 oC Инкубатор	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	Инкубация пластинки BCA
50 мл центрифужные пробирки	LABGIC	CT-112-50A	Используется для переработки тканей и экстракции
96-лунная пластинка	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Измерение абсорбции на пластинке
Аналитическая весы	Changzhou Xingyun	FA2204N	Взвешивание химических порошков
Антрон	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Реагент для колориметрического определения гликогена
Анти-GYS1 антитело	Proteintech	10566-1-AP	Определение гликогена синтетазы 1
Анти-GYS2 антитело	Proteintech	22371-1-AP	Определение гликогена синтетазы 2
Анти-фосфо-GYS1/2 (Ser641) антитело	Cell Signaling Technology	47043S	Определение фосфорилированного GYS
Анти-фосфо-PYGL (Ser15) антитело	Abcam	ab227043	Определение фосфорилированного гликогена фосфорилазы
Анти-PYGL антитело	Proteintech	15851-1-AP	Определение фосфорилазы печеночного гликогена
Анти-PYGM антитело	Novus Biologicals	NBP2-16689	Определение фосфорилазы мышечного гликогена
Комплект для BCA анализа	Beyotime	P0012	Количественное определение белка
Бензойная кислота	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Приготовление насыщенного раствора для стандартов
Тупые щипцы	Shanghai Jinzhong	J42010	Захват пальцев; диссекция тканей
БСА фракция V	Beyotime	ST023	Блокирующий агент в вестен-блоте
Хемилюминесцентный изображатель	Tanon	Tanon 5200 Multi	Обнаружение сигналов в вестен-блоте
Хемилюминесцентный субстрат (ECL)	Beyotime	P0018S	Развитие сигнала в вестен-блоте
Дистиллированная вода	Beyotime	ST872	Растворитель для приготовления реагентов
Эпинефрин гидрохлорид	Sigma-Aldrich	E4642	Индукция разрушения гликогена in vivo
Этанол	Macklin	E809065	Осаждение гликогена и его мойка
Тонкие хирургические ножницы	Shanghai Jinzhong	JA2601	Диссектирование тканей
Центрифуга Fresco 17	Thermo Fisher Scientific	75002402	Центрифугирование образцов
Глюкометр	i-SENS	CareSens N	Измерение уровня глюкозы в крови
Глюкометр	i-SENS	CareSens N	Измерение уровня глюкозы в крови из хвостовой вены
Полоски для глюкометра	i-SENS	CareSens N Strips	Измерение уровня глюкозы в крови из хвостовой вены
Глюкоза	Macklin	G6172	Приготовление стандартной кривой
Запас гликогена	Beyotime	D0812	Приготовление ряда стандартов гликогена
Вторичное антитело козье анти-кроликовое IgG	Thermo Fisher Scientific	31462	Обнаружение первичных антител
Ручной гомогенизатор	GreenPrima	PB100	Омогогенизация тканей
Индийская чернила	Sigma-Aldrich	198285	Окрашивание общего белка для нормализации
Изофлуран	RWD Life Science	R510-22-10	Эвтаназия животных
Лабораторный нагревательный блок	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Нагрев образцов во время анализов
Хлорид лития	Macklin	767397	Усиливает осадок гликогена
Метанолл	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Шаг мойки гликогена
Микроплатформенный читатель	BioTek	ELx800	Измерение абсорбции на 620 нм
Нитроцеллюлозная мембрана	Millipore	HATF04700	Мембрана для переноса белка
Орбитальный шейкер	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Инкубация с хемилюминесцентным субстратом
Пипетка P1000	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Перенос раствора
Пипетка P200	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Удаление остаточной жидкости
Ингибиторы фосфатаз (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Сохранение фосфорилирования белка
Пластиковые контейнеры (для хранения тканей)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Хранение собранных тканей
Коктейль ингибиторов протеаз