Клинически значимые модели трансплантируемых опухолей для изучения метастатического рака яичников и терапевтического ответа у мышей

Краткое содержание

Здесь мы представляем пошаговый протокол установления интрабрюшинной и интрабурзальной моделей опухолей для изучения прогрессирования рака яичников, метасатсиса и терапевтического ответа. Далее мы описываем, как использовать неинвазивную in vivo визуализацию на основе люциферазы для мониторинга прогрессирования опухоли у мышей.

Аннотация

Метастатический рак яичников — это чрезвычайно смертельное гинекологическое злокачественное заболевание, отсутствующее эффективных вариантов лечения. Разработка клинически переводимых терапевтических подходов для пациентов с раком яичников зависит от понимания факторов, способствующих метастазированию рака яичников. Хотя большинство солидных опухолей демонстрируют гематогенные метастазы, раковые клетки яичников распространяются преимущественно по внутрибрюшинному пути. Этот процесс включает отслоение и выделение раковых клеток из первичной опухоли в брюшинную полость, которые затем приобретают свойства, позволяющие им сопротивляться аноикису и образовывать многоклеточные агрегаты. Эти клеточные агрегаты затем прикрепляются к мезотелиальной оболочке брюшины и проникают в неё, образуя метастатические поражения. Клинически значимые модели in vivo необходимы для понимания того, как клеточные факторы и микросреда опухолей влияют на различные этапы метастатического процесса, а также для тестирования новых терапевтических стратегий. Две трансплантируемые модели опухолей мышей, широко используемые для изучения метастазирования рака яичников и терапевтического ответа, — это интрабрюшинная и интрабурсальная модели. В этом отчёте мы описываем пошаговую методологию создания этих моделей и выделяем их преимущества и ограничения. Кроме того, мы описываем, как использовать биолюминесцентную визуализацию для неинвазивного контроля прогрессирования опухоли с помощью этих моделей.

Введение

Несмотря на значительный прогресс в понимании факторов, влияющих на прогрессирование рака яичников, рак яичников остаётся вторым по смерти гинекологической злокачественной опухолью в Соединённых Штатах¹. Из-за отсутствия явных симптомов и надежных ранних диагностических маркеров более 70 процентов пациентов с раком яичников имеют запущенное метастатическое заболевание при^{диагнозе 2,3}. Современные терапевтические средства неэффективны в лечении метастатического рака яичников, и, следовательно, 5-летняя выживаемость пациентов с поздней стадией заболевания остаётся менее 30 процентов^. Одной из основных причин отсутствия терапевтического успеха является появление^{химиорезистентности 5}. Поэтому существует острая необходимость выявить факторы, способствующие метастазированию рака яичников и химиорезистентности. Устранение этого пробела в знаниях будет критически важно для разработки более эффективных терапевтических стратегий для борьбы с этим заболеванием. Для достижения этих целей нам нужны модели in vivo, которые точно имитируют ключевые этапы прогрессирования рака яичников.

Хотя линии клеток рака яичников и трёхмерные модели in vitro внесли огромный вклад в понимание факторов, влияющих на метастазирование и терапевтический ответ, эти модели имеют ряд^{ограничений 6,7,8}. Например, эти модели не учитывают различные нераковые клетки, входящие в микроокружение опухоли, и не отражают сложные взаимодействия, происходящие внутри микросреды ^{опухоли 6,7,8}. Кроме того, чрезвычайно сложно изучать системные факторы и их влияние на прогрессирование опухоли и лекарственный ответ с помощью моделей in vitro ^6,7,8. Эти ограничения моделей in vitro подчёркивают необходимость моделей in vivo, которые точно имитируют различные этапы метастазирования рака яичников, включая сложные взаимодействия с другими типами клеток и факторами внутри микросреды.

Генетически модифицированные модели мышей (GEMM) предлагают платформу in vivo, при которой опухоли возникают спонтанно в естественной микросреде с целостной иммунной^{системой 9}. Однако их производство и обслуживание занимают много времени, сложные и дорогие^. Большинство GEMM при раке яичников также имеют длительный латентный период развития опухоли, что делает работу с ними трудоёмкой и дорогостоящей, даже после их образования¹⁰. Трансплантируемые модели, такие как ксенотрансплантаты и аллотрансплантаты, обеспечивают хороший баланс между биологической значимостью и лёгкостью экспериментов, и часто значительно дешевле в получении, чем^{GEMMs 11}. Помимо более низкой латентности по сравнению с GEMM, легкость генетической модификации опухолевых клеток in vitro делает эти модели удобными и подходящими для изучения того, как различные генетические факторы влияют на прогрессирование^{опухоли 10}. Благодаря этим преимуществам модели трансплантируемых опухолей стали ценными инструментами как для фундаментальных, так и для трансляционных исследований рака яичников.

В этом отчёте мы описываем протокол установления двух различных трансплантируемых моделей опухолей мышей, широко используемых для изучения метастатического рака яичников: (1) интрабрюшинная модель и (2) ортотопная или интрабурсальная модель. Обе модели могут быть установлены как ксенотрансплантаты или аллотрансплантаты. В внутрибрюшной модели раковые клетки вводятся в брюшинную полость мышей. Введение раковых клеток яичников в внутрибрюшинное пространство отражает стадию метастазирования рака яичников, когда метастазы рака яичников выделяются из первичной опухоли в брюшинную полость. Подобно метастатическому процессу у человека, эти трансплантированные клетки рака яичников должны адаптироваться к враждебной перитонеальной микросреде, прикрепиться и проникнуть в мезотелиальный слой, выстилающий брюшинную полость, и образовывать метастатические поражения на внутрибрюшнических органах и тканях, таких как оментум, мезентерия, печень и диафрагма. В зависимости от линии раковых клеток, используемой для формирования внутрибрюшнической модели, метастатические опухоли могут сопровождаться асцитом, как это наблюдается на поздних стадиях заболевания у человека. Таким образом, интрабрюшинная модель широко используется для понимания факторов, способствующих метастазированию рака яичников и их прогрессированию в позднюю стадию заболевания¹². Эти модели также полезны для определения эффективности новых терапевтических стратегий при метастатическом раке^{яичников 12}. В интрабурсальной или ортотопической модели раковые клетки имплантируются в бурсу — мембранозную структуру, окружающую яичник мыши. Эта модель имитирует ранние стадии опухологенеза и метастазирования яичников. На этой стадии раковые клетки всё ещё ограничены маточной трубой и яичником. Именно из этих участков раковые клетки попадают в брюшную полость, в конечном итоге метастазируя в другие органы. Поэтому интрабурсальная модель полезна для изучения как ранних стадий опухологенеза яичников, так и событий, приводящих к их последующему трансцеломному метастазированию через^{брюшинную полость 12}.

Таким образом, хотя как внутрибрюшинная, так и интрабурсальная модели являются отличными инструментами для изучения метастазирования рака яичников и терапевтического ответа, они различаются по конкретной стадии метастатического процесса, которую имитирует. Хотя интрабурсальные модели могут имитировать прогрессирование рака яичников с ранних стадий на поздние стадии метастазирования, из-за связанной с этим процессом латентности, они обычно используются для изучения ранних событий метастазирования рака яичников. Для исследований, сосредоточенных на поздних стадиях метастазирования рака яичников, более подходящей внутрибрюшнической модели. Кроме того, интрабурсальная модель технически сложнее в установлении по сравнению с интрабрюшинеальной^{моделью 12}. Установление интрабурсальной модели требует доступа к хирургическому кабинету, оснащённому микрохирургическим оборудованием, позволяющим точно вводить раковые клетки в бурсу яичника. Способность раковых клеток формировать опухоли («скорость приема» или «скорость приживления») также обычно ниже в интрабюрсальных моделях по сравнению с интрабрюшинеальными моделями. Кроме того, поскольку опухоли трудно обнаружить после ортотопических или внутрибрюшинных инъекций, обычно используется неинвазивная техника биолюминесцентной визуализации для мониторинга прогрессирования опухоли. Поэтому как внутрибрюшнический, так и интрабразальный модели требуют дополнительного оборудования, позволяющего проводить неинвазивную визуализацию^{опухолей 12}. В конечном итоге выбор модели для каждого исследования определяют экспериментальные цели, наличие ресурсов и технический набор навыков.

В этом отчёте описывается пошаговый протокол установления внутрибрюшинных и интрабурсальных ксенотрансплантатных моделей мышей с использованием клеточных линий рака яичников человека. Эти модели можно получить, пересаживая клетки в иммунокомпрометированные штаммы мышей, такие как NSG (NOD.Cg-Prkdc^{, scid} , Il2rg^{, tm1Wjl}/SzJ) или Foxn1 nude (B6. Cg-Foxn1 nu/J). Тот же метод можно адаптировать для генерации аллотрансплантатных (сингенетических) моделей. При создании моделей аллотрансплантата клетки рака яичников мышей имплантируются иммунокомпетентным мышам с аналогичным генетическим фоном. Поскольку модели аллотрансплантата разрабатываются с использованием иммунокомпетентных мышей, они полезны для изучения того, как различные факторы регулируют микроокружение опухоли яичников, роль иммунной системы в прогрессировании рака яичников и эффективность иммунотерапии. Помимо установления интрабрюшинальных и интрабурсальных моделей ксенотрансплантата у мышей, в этом отчёте также описывается, как использовать биолюминесцентную визуализацию для неинвазивного мониторинга прогрессирования опухоли в этих моделях.

Протокол

Все процедуры с животными, описанные в этом протоколе, одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Мэриленда, округ Балтимор (главный исследователь — Ачут Падманабхан; Номер протокола — 1947).  Полный список материалов и оборудования, используемых в данном протоколе, а также их каталожные номера приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка клеточных линий рака яичников для трансплантации у мыши

Примечание: Для всех моделей in vivo, описанных в этом протоколе, раковые клетки яичников должны быть подготовлены к трансплантации мыши. Раковые клетки яичников должны быть подготовлены в ламинарном потоке для культуры тканей, как описано ниже, при комнатной температуре, если не указано:

1. Выращивайте раковые клетки яичников при 37 ^°C в инкубаторе с водяной рубашкой с_CO2 с поддержанием 5%_CO2 с использованием стандартных сред, рекомендованных в литературе. Если требуется неинвазивная in vivo визуализация опухоли, раковые клетки яичников должны быть спроектированы так, чтобы они стабильно экспрессировали люциферазу до трансплантации.
2. Когда слияние клеток достигает примерно 80–85%, их собирают в стерильных условиях, как описано ниже:
   1. Аспирировать среду из пластины тканевой культуры.
   2. Промывайте прилипшие клетки дважды стерильным 1X фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) без кальция и магния. Наличие кальция и магния в PBS может нарушать активность трипсина и способствовать адгезии клеток. Аспирировать PBS из пластины для культуры тканей.
   3. Добавьте 0,05% трипсина-ЭДТА в пластину для культивирования тканей. Количество трипсина, который будет использоваться, зависит от размера пластины для культуры тканей и клеточной линии, с которой работают. Для большинства клеточных линий, растущих на пластине диаметром 100 мм, используйте 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Для линий клеток рака яичников, таких как OVCA420, рекомендуется 1 мл трипсина-ЭДТА с концентрацией 0,25%.
   4. Перенесите пластину с клетками обратно в инкубатор_с водяной оболочкой 37 ^°C, используемый для культуры тканей, и инкубировать 1–5 минут. Точное время инкубации зависит от клеточной линии. Некоторые клеточные линии, такие как TYK-Nu и HEYA8, отсоединяются очень быстро (1–2 минуты), тогда как другие, например OVCA420, занимают больше времени (4–5 минут).
   5. После отсоединения клеток добавьте среду с FBS, чтобы остановить действие трипсина. Добавьте 6 мл среды с FBS на 1 мл трипсина. Аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы вывести клетки из пластины для культивирования тканей и диссоциировать их в одноклеточную суспензию.
      Примечание: При взгляде под ярким инвертированным микроскопом отделённые клетки будут выглядеть округлыми (вместо плоских/удлинённых) и свободно плавать, а не прилипают к нижней части пластины.
   6. Соберите клетки в коническую трубку и центрифугуйте при температуре 400 г в течение 5 минут при комнатной температуре.
   7. Удалите супернатант, содержащий трипсин, и снова суспензуйте клеточную гранулу в свежей среде с FBS.
3. Считайте клетки с помощью красителя для жизнеспособности клеток, такого как трипан-синий, и гемоцитометра. В качестве альтернативы можно использовать автоматический счётчик ячеек для подсчёта ячеек.
4. Восстановить клетки в определённом объёме стерильного 1X PBS (pH 7,4), чтобы достигать желаемой концентрации клеток на единицу объёма. Рекомендуемое количество клеток для инъекции для широко используемых линий рака яичников указано в таблице 1¹³.
   Примечание: максимальный объём, который можно безопасно ввести мышам, зависит от модели. Для внутрибрюшной модели максимальный рекомендуемый объём составляет 500 мкл (см. раздел 2.1). Для интрабурсальной модели максимальный рекомендуемый объём составляет 5 мкл (см. раздел 2.2).
5. Держите суспензию клетки на льду, пока не придёт время вводить её мышам. Вводите клетки мышам как можно скорее, желательно в течение 30–45 минут после их подготовки.

2. Установление трансплантируемых моделей рака яичников у мышей

1. Установление внутрибрюшинной модели рака яичников
   Примечание: в этом процессе раковые клетки яичников, стабильно экспрессирующие люциферазу, вводятся в брюшинную полость взрослой самки мыши. Использование клеток, стабильно экспрессирующих люциферазу, позволит проводить продольный, неинвазивный мониторинг прогрессирования опухоли с помощью системы визуализации In Vivo (IVIS).
   1. Подготовьте ячейки так, как описано в разделе 1. Аккуратно суспензируйте клетки с помощью микропипетки на 1000 мкл и убедитесь, что клетки остаются диссоциированными.
      Примечание: если не сдвинуться комки, иглы будут засоряться.
   2. Набрать 500 мкл клетки в шприц объёмом 1 мл и прикрепить иглу размером 21G X 1 дюйм. Убедитесь, что в шприце нет пузырьков воздуха.
      Примечание: максимальный объём, который можно инъекционально ввести взрослой самке мыши (25–30 г), составляет 500 мкл. Поэтому ресуспензировать клетки в объёме, чтобы необходимое количество ячеек находилось в максимальном объёме 500 мкл. Рекомендуемое количество клеток для инъекции для широко используемых линий рака яичников указано в таблице 1¹³.
      Примечание: если вес мыши составляет от 20 до 25 г, рекомендуется вводить меньший объём (менее 400 мкл).
   3. Вынимите животное из клетки и положите его на грубую или проволочную поверхность, чтобы удержать.
   4. Удержите мышь, аккуратно загрибив обвисшую кожу у основания шеи недоминантной рукой, как показано на рисунке 1A.
   5. Аккуратно поднимите мышь и поверните её так, чтобы её вентральная сторона была обращена вверх. Закрепите хвост животного пальцами, как показано на рисунке 1B.
   6. Проведите воображаемую линию посередине живота. Чтобы определить место инъекции, представьте треугольник между средней линией и двумя сосками в нижнем правом квадранте. Убедитесь, что место инъекции находится в центре этого воображаемого треугольника. См. рисунок 1B.
   7. Слегка наклоните голову мыши к земле, чтобы она опустилась ниже задней части. Удержание мыши в таком положении помогает мозговому содержимому живота смещаться краниально. Это снижает риск прокола внутренних органов во время инъекции.
   8. Используйте стерильный спиртовой тампон для очистки места инъекции.
   9. Используя доминирующую руку, вводите иглу в место инъекции под углом 45° или ниже. Продвигайте только на 0,5 дюйма и не более половины длины иглы. Убедитесь, что игла остается стабильной, так как движение в брюшной полости может привести к повреждению внутренних органов.
   10. Вводите клетки медленно и ровно в брюшную полость мыши.
   11. Вытащите иглу из мыши под тем же углом вставки. Немедленно разместите стерилизованный манометр на место инъекции, чтобы предотвратить утечку.
   12. Убрать иглу и шприц в соответствующую ёмкость для острых предметов.
   13. Перед тем как положить мышь в клетку, наклейте их на уши по предпочтительному способу. Ушная метка позволит позже определить введённую мышь.
2. Установление интрабурсальной модели рака яичников
   Примечание: В интрабурсальной модели раковые клетки яичника, стабильно экспрессирующие люциферазу, вводятся непосредственно в бурсу яичника взрослой самки мыши. Бурса — это мембранный мешок, окружающий мышиные яичники. Стабильная экспрессия люциферазы в клетках рака яичников позволит проводить неинвазивный продольный мониторинг прогрессирования опухоли с помощью IVIS.
   1. День 1 – Подготовка оборудования и мыши для интрабурзальной трансплантации
      1. Автоклав — инструменты, необходимые для операции. Список приборов следует (рисунок 2A):
         Ножницы с тонким наконечником, 5-дюймовые изогнутые щипцы с тонким концем, держатель для иглы Mayo-Heger, микропинцеты для ювелирных предметов, мелкий наконечник, инструменты для препарирования щипцов с тонкими кончиками
      2. Вводите предоперационную анальгезию карпрофена (15 мг/кг) каждые 24 часа путём подкожной инъекции мыши.
         Примечание: Вводите обезболивающий карпрофен подкожно каждые 24 часа, начиная за день до операции и продолжая в течение 3 дней после неё.
   2. День 2 – Внутрибурсальная трансплантация раковых клеток яичников у мыши
      1. Подготовьте раковые клетки яичников для инъекций, как описано в разделе I. Максимальный объём, который можно безопасно вводить мыши интрабурсально, составляет 5 мкл. Поэтому предпочтительнее иметь клетки с концентрацией 10–⁴ клетки/мкл. Это позволит пересадить 5 x 10⁴ клеток.
         Примечание: рекомендуемое количество клеток для инъекции для широко используемых линий рака яичников указано в таблице 1¹³.
      2. Держите клетки на льду до использования. После сбора рекомендуется вводить клетки как можно скорее, желательно в течение 30–45 минут.
      3. Индуцировать анестезию, поместив мышь в камеру изофлурана с расходом изофлурана 4 процента и расходом кислорода 3,5 л/мин. Убедитесь, что мышь анестезиирована, проверив на иммобилизацию и отсутствие рефлекса сжатия пальцев.
      4. Перенесите анестезированную мышь на стерильную хирургическую занавеску, которую кладут поверх грелки для грызунов при температуре 37 °C. Быстро поставьте носовой конус и поддерживайте анестезию с помощью 1,5% изофлурана и 98,5% кислорода. Убедитесь, что мышь под наркозом, подтвердив отсутствие рефлекса щипки пальца.
      5. Убедитесь, что мышь остаётся под анестезией на протяжении всей процедуры, подтверждая отсутствие рефлекса сжатия пальцев каждые 15 минут. Следите за частотой дыхания мыши во время анестезии, чтобы оно было медленным и плавным. Если частота дыхания меняется, корректируйте дозировку изофлурана. Если у мыши затруднённое дыхание или задыхание, уменьшите дозу. Напротив, если у мыши учащается частота дыхания, дозу изофлурана немного увеличить.
         Примечание: Избегайте держать мышь под наркозом дольше 40 минут. Для этого важно действовать эффективно и быстро во время операции.
      6. Расположите мышь с той стороны, в которую должны быть пересадены раковые клетки яичника внутри оружия, лицом вверх, как показано на рисунке 2B.
      7. Нанесите глазную мазь на оба глаза мыши, чтобы защитить их от пересыхания (высыхания роговицы).
      8. Если у мыши шерсть, сбрийте волосы на нижней половине мыши с той стороны, которая смотрит вверх. Тщательно очистите выбритое место и положите мышь на новую стерильную подушечку. Если работать с Foxn1 nude (B6. Cg-Foxn1 nu/J) мышиный штамм, пропустите этот шаг.
      9. Используйте стерильную хирургическую занавеску, чтобы покрыть мышь так, чтобы была видна только нижняя часть тела.
      10. Тщательно помойте руки с мылом перед началом операции и наденьте свежие стерильные хирургические перчатки. Избегайте прикасаться к нестерильным участкам или предметам после нанесения хирургических перчаток.
      11. Используйте стерильный ватный аппликатор для нанесения бетадина в область операции по часовой стрелке изнутри наружу. Затем используйте стерильный спиртовой тампон, чтобы очистить тот же участок аналогичным образом. Повторите эту процедуру ещё два раза.
          Примечание: Не трогайте нестерильные предметы или участки во время операции. При контакте с нестерильной поверхностью немедленно заменяйте перчатки. Настоятельно рекомендуется обратиться к другому человеку для помощи во время интрабурсальной инъекции. Этот человек может помочь обращаться с нестерильными предметами во время операции.
      12. Подождите 1 минуту, пока спирт высохнет.
      13. Определите место, которое находится примерно в 1,5 см над задней лапой и в 5 мм от грудной клетки мыши, как показано на рисунке 2B. Поднимите кожу в этом месте изогнутыми щипцами, затем сделайте вертикальный разрез длиной 5 мм с тонкими ножницами.
          Примечание: перед выполнением разреза убедитесь, что мышь полностью находится под анестезией, подтвердив отсутствие рефлекса защипывания пальцев.
      14. Держите кожу с одной стороны мелким микрощипцом и сделайте разрез в подкожной ткани в том же месте.
      15. В этот момент брюшинный слой под подкожной тканью становится видимым. Используйте тонко изогнутые, зубчатые щипцы для удержания брюшного слоя и сделайте разрез длиной около 2,5 мм с помощью тонких ножниц.
      16. Держите боковую часть брюшного разреза зазубренными щипцами и найдите жировую подушечку яичника с помощью тонких щипцов. Яичник расположен под жировой подушечкой.
      17. Аккуратно вытащите немного жировой подушечки яичника вместе с яичником через разрез.
      18. Используйте расщепляющие щипцы, чтобы удерживать жировую подушечку так, чтобы яичник был обращён вверх и был неподвижен.
          Примечание: не держите яичник щипцем. Всегда используйте зубчатые щипцы для удерживания жировой подушечки, потому что ткань скользкая.
      19. Попросите помогающего подготовить шприц с клеточной суспензией. Рекомендуется использовать шприц с инсулином объёмом 0,3 мл.
      20. Аккуратно вводите иглу с скошенным лицом вверх в бурсу яичника от соединения маточной трубы и яичника. Убедитесь, что вся фаска помещается внутрь бурсы, прежде чем нажимать на поршень.
          Примечание: будьте осторожны, чтобы не проколоть бурсу на противоположном конце места установки.
      21. Аккуратно нажмите на поршень и переложите содержимое шприца в бурсу яичника. Быстро убери иглу.
      22. Отёк бурсы вокруг яичника указывает на успешную инокуляцию клеток.
      23. Подождите 5 секунд и аккуратно верните яичник обратно в брюшинную полость.
      24. Закройте брюшину с помощью васывающегося монофиламентного шва 6-0 с одним или двумя простыми прерванными хирургическими пришками.
      25. Закройте кожный разрез с помощью васывающегося монофиламента 6-0 с помощью простого хирургического шва. Убедитесь, что из места разреза нет кровотечения.
      26. Нанесите тройную антибиотиковую мазь (Бацитрацин, Неомицин и Полимиксин B) на место разреза после закрытия.
      27. Введите мыши карпрофен 15 мг/кг подкожно для облегчения боли.
      28. Поставьте ушную метку мыши по предпочтительному способу. Ушная метка позволит позже определить введённую мышь.
      29. Перенесите мышь в новую клетку. Поставьте эту клетку с одной половиной на грелку минимум на 60 минут. Убедитесь, что к этому времени действие анестезии полностью прошло, мышь бодрствует и активна.
          Примечание: мыши склонны к гипотермии под анестезией. Поэтому важно обеспечивать внешнее тепло для регулирования температуры тела.
      30. Проверьте мышей через 4-5 часов после операции на наличие признаков кровотечения из места разреза или другого дискомфорта.
      31. Давайте мышям карпрофен 15 мг/кг подкожно каждые 24 часа в течение следующих 3 дней.
      32. Если инокуляционные клетки генетически модифицированы для стабильной экспрессии люциферазы, то опухолевой нагрузка может измеряться с помощью IVIS с первого дня после инъекции, как описано в разделе 3.

3. Неинвазивная визуализация опухоли мыши с использованием системы in vivo визуализации (IVIS)

Важной целью в нескольких исследованиях с использованием моделей трансплантируемых опухолей, описанных в этом отчёте, является получение продольных данных о прогрессировании опухоли. Хотя объём подкожных опухолей можно оценить с помощью верньерного суппорта, это не является жизнеспособным вариантом для опухолей, образованных с использованием интрабрюшинальной и интрабурзальной моделей. Для преодоления этой проблемы и определения внутрибрюшинной опухолевой нагрузки большинство лабораторий используют неинвазивную биолюминесцентную визуализацию на основе люциферазы. Для этого трансплантированные раковые клетки модифицированы так, чтобы они стабильно экспрессировали люциферазу, которая при введении субстрата D-люциферина образует биолюминесценцию. Биолюминесценция обнаруживается неинвазивно с помощью системы визуализации in vivo (IVIS). Этот сигнал затем количественно оценивается для отслеживания опухолевой нагрузки и раскрытия информации о метастазах и эффективности лекарственной терапии. Ниже мы описываем протокол отслеживания опухолевой нагрузки с помощью неинвазивной биолюминесценции на основе люциферазы с помощью IVIS у мышей.

1. Подготовка субстрата D-люциферина
   1. Приготовьте раствор D-люциферина 15 мг/мл в 1X PBS (pH 7,4) в стерильных условиях.
   2. Фильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм.
   3. Оберните раствор в алюминиевую фольгу, чтобы защитить его от света до использования.
2. Инициализация имиджера IVIS для получения изображений
   1. Откройте программное обеспечение «живое изображение» на компьютере, подключённом к IVIS-имиджеру, и войдите в систему.
   2. Для получения изображения нужно инициализировать имиджер. Это делается следующим образом:
      1. При входе в систему откроется окно панели управления IVIS, как показано на рисунке 3A.
      2. Нажмите кнопку «инициализировать», расположенную в нижней правой части окна (рисунок 3A). Система инициализируется через пару минут.
         Примечание: Изначально полоса температуры внизу окна становится красной, что указывает на то, что камера достигает целевой температуры -90 °C (рисунок 3B).
      3. Когда камера достигает целевой температуры (-90 °C), индикатор температуры становится зелёным, а статус системы покажет «Готов к использованию» (рисунок 3C). Теперь имиджер готов к визуализации мыши.
         Примечание: время экспозиции, биннинг и f/stop можно регулировать в зависимости от требований пользователя.
3. Подготовка мыши к IVIS визуализации
   Перед проведением изображения мыши D-люциферин необходимо вводить внутрибрюшинно.
   1. Вынимите мышь из клетки и положите её на грубую или проволочную поверхность. Аккуратно пожимайте мышей, чтобы правильно их удержать, как описано в разделе 2.1.
   2. Поднимите мышь и поверните её так, чтобы её вентральная сторона была обращена вверх.
      Примечание: Если мышь правильно закреплена, все четыре лапки вытянут наружу при подъёме, как показано на рисунке 1B. Держите хвост между пальцами в качестве дополнительной меры сдерживания во время процедуры.
   3. Используйте стерильный спиртовой тампон для очистки места инъекции, как в протоколе инъекции внутрибрюшника в разделе 2.1.
   4. Используйте шприц для туберкулёз объемом 1 мл и иглу 30G диаметром 1/2 дюйма, чтобы внутрибрюшинно ввести соответствующее количество D-люциферина из стандартного раствора, чтобы получить окончательную дозу 150 мг/кг D-люциферина.
      Примечание: Ознакомьтесь с протоколом инъекций внутрибрюшинной инъекции в разделе 2.1 для получения инструкций по проведению внутрибрюшинной инъекции. При использовании мышей C57BL/6 (для сингенных аллотрансплантатных моделей) настоятельно рекомендуется удалять шерсть перед проведением биолюминесцентной визуализации с использованием IVIS. Чёрный мех и пигментированная кожа значительно ослабляют свет, снижая интенсивность сигнала.
   5. Аккуратно положите мышь обратно в клетку. Точное время ожидания и время воздействия необходимо определить эмпирически. Это можно определить следующим образом.
      1. Анестезируйте мышь сразу после инъекции D-люциферина и сделайте изображение, как описано в разделе 3.4, каждые 2 минуты в течение 20 минут.
         Примечание: При первом проведении этого эксперимента рекомендуется определить, как сигнал люциферазы меняется со временем после введения D-люциферина. Это поможет определить наиболее подходящее время для снимка мыши после введения D-люциферина в последующих экспериментах. Биолюминесцентный сигнал может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая клеточную линию, модель ксенотрансплантата мышей, уровень экспрессии люциферазы и т.д.
      2. На каждом интервале берите экскурсии по 5, 10 и 15 секунд.
      3. Используйте эти данные для построения стандартной кривой. Исходя из кривой, выберите время ожидания и экспозиции, при которых сигнал достигает плато, сохраняя при этом максимальную интенсивность.
         Примечание: обычно это время составляет от 5 до 10 минут, но может варьироваться в зависимости от модели.
4. Неинвазивная визуализация опухолей мышей с помощью IVIS
   1. После периода ожидания поместите мышь в камеру изофлурана с 4% содержанием изофлурана и расходом кислорода 3,5.
   2. Убедитесь, что мышь анестезиирована, проверив отсутствие рефлекса сжатия пальцев.
   3. Поместите мышь на сцену внутри IVIS имиджера и вставьте её нос внутрь носового конуса для поддержания анестезии во время визуализации. Убедитесь, что они остаются в пределах отмеченных линий фокуса камеры и закройте дверцу имиджера.
      Примечание: внутри имиджера будет пять позиций на сцене. В каждой позе также будут свои носовые конусы для анестезии. Это позволяет одновременно снимать 5 мышей. В зависимости от количества мышей для изображения регулируйте угол обзора камеры в панели управления с «D» (более широкое поле) на «A» (узкий фокус). Мышь можно разместить в любом месте сцены, при условии, что её нос находится внутри анестезиологических конусов на протяжении всего процесса съёмки. Рекомендуется последовательно снимать мышей сначала на их спинной стороне, а затем на вентральной стороне.
   4. Отрегулируйте время экспозиции и нажмите «Приобретить» на панели управления (рисунок 3C).
      Примечание: убедитесь, что люминесценция, фотография и наложение включены в панели управления.
      После захвата изображения на экране появится изображение мыши с люциферазовым сигналом.
   5. Откройте имиджер и поверните мышь так, чтобы вентральная сторона была обращена вверх, после закрытия дверцы изображения нажмите «Приобрести».
      Примечание: убедитесь, что нос мыши находится внутри носового конуса для поддержания анестезии во время визуализации.
   6. После получения как дорсального, так и вентрального изображений, откройте дверцу имиджера и поместите мышь обратно в клетку.
   7. Подождите 5-10 минут, чтобы мышь пришла в сознание.
5. Анализ изображения IVIS для определения опухолевой нагрузки у мыши
   1. Корректировка цветовой шкалы изображений
      1. Сохраните необработанные изображения в соответствующую папку, нажав на «file» и затем «Save as».
         Примечание: Имиджер автоматически корректирует цветовую шкалу в зависимости от интенсивности сигнала. Рекомендуется сохранять цветовую шкалу постоянной для всех изображений, сделанных в ходе эксперимента. Масштаб цвета также можно отрегулировать позже, открыв RAW-изображение с помощью этого программного обеспечения.
      2. Для ручной настройки в верхнем правом углу экрана появляется ещё одно окно палитры инструментов (рисунок 3D), перейдите в «Настройка изображения», затем выберите «ручное» для масштабирования. Введите минимальное и максимальное количество для значения масштаба и нажмите «Enter» (рисунок 3E).
         Примечание: При корректировке цветовой шкалы ранее приобретённого изображения сначала откройте сохранённый raw infoclick.txt файл изображения из соответствующей папки с помощью «file», затем «open».
         3.5.1.3. Сохраните это изображение отдельно от RAW-изображения в соответствующей папке.
   2. Анализ опухолевой нагрузки у мыши
      Примечание: для количественного измерения опухолевой нагрузки можно измерить интенсивность сигнала каждой мыши на изображениях, сделанных за весь период. Вы можете разместить эти значения в Excel или GraphPad Prism для статистического анализа и создания линейных графиков прогрессирования опухоли.
      1. Откройте сохранённый RAW infoclick.txt файл из соответствующей папки.
      2. Перейдите в раздел ROI (Регион интереса) окна палитры инструментов, который появляется в правом верхнем углу (рисунок 3F).
      3. Рисуйте область возврата инвестиций на каждой мыши вручную или автоматически с помощью функции «рисовать», используя любую форму, которая подходит именно вам. Чтобы сделать это вручную, поддерживайте одинаковую площадь для всех изображений среди сравниваемых мышей.
         Примечание: Для интрабрюшинной инокуляции лучше всего подбирать ROI для всей груди и брюшной полости на вентральное изображение мыши. Для интрабурсальной инокуляции лучше всего работает ручной выбор ROI в дорсальной области изображения с сигналом.
         Примечание: Автоматический выбор ROI выберет только области с более высокой интенсивностью сигнала.
      4. Нажмите на «Измерить ROI» (рисунок 3F). Это откроет дополнительное окно с данными о сумме и среднем количестве для каждого выбранного ROI.
      5. Сохраните этот файл в соответствующей папке, чтобы получить доступ к нему позже. Используйте эти данные для построения графика в MS Excel или GraphPad Prism.

Результаты

Репрезентативные данные из интрабрюшинальной модели рака яичников с использованием клеток OVCAR8 с люциферазой у иммунокомпрометированных мышей Foxn1 показаны на рисунке 4. Стабильная экспрессия люциферазы в этих клетках позволила проводить продольный мониторинг прогрессирования опухоли с помощью неинвазивной биолюминесцентной визуализации с использованием имиджера IVIS, как описано в разделе III. Интрабрюшинеальная инъекция 5 миллионов клеток OVCAR8-люцифер...

Обсуждение

Способность имитировать сложные взаимодействия между опухолевыми клетками, микроокружением и системными факторами делает мышиные модели отличным ресурсом для изучения прогрессирования рака^{яичников 12}. Помимо расширения понимания факторов, влияющих на прогрессирование и метастазирование рака яичников, in vivo мышиные модели также играют важную роль в доклинической оценке малых молекул и стратегиях лечения метастатического рака^{яичников 1...}

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,22 мкм стерильный фильтр для шприца, 33 мм	Fisher Scientific	09-720-004
1 мл ТБ шприц	BD	309659
21G, игла 1 дюйм	BD	305167
30G и фрак12; дюймовая игла	BD	305106
5-дюймовые изогнутые щипцы	Fisher Scientific	1631
6-0 Впитываемый монофиламентный шов	MaxonTM	6532-11
Спиртовой мазок (70% изопролил)	Dukal Corp	80003156
Бетадин (1% раствор йода)	Продукты Purdue	367618150085
Карпрофен инж, 50 мг/мл	Левафен	RXLEVA50-20INJ
Центрифуга	Эппендорф	5702
D-люциферин	Syd Labs	MB000102-R70170
Вскрытие ювелирных микропинцетов, мелкий наконечник	Fisher Scientific	08-953E
Мазь для глаз	Медвет	11897
Тонкие ножницы с тонким наконечником	Fisher Scientific	8940
Грелка	Sunbeam	731-500
Инструменты для препарирования щипцов с тонкими наконечниками	Fisher Scientific	S08096
Инсулиновый шприц 3/10 мл	BD	328438
Изофуран	Fluriso	Fluriso250
IVIS	Перкин Элмер	IVISLMIII
Держатель для прямых игл Mayo-Heger	Fisher Scientific	08-966
Стерильный 1X PBS, без кальция и магния	Корнинг	21-040-CV
Стерильные хлопковые аппликаторы на кончиках	Маккиссон	24-106-1S
Стерильный датчик	Кендалл	3033
Стерильная прокладка/полотенце/драпировка, без фенестрации	Генри-Шейн	100-9687
Тройная антибиотиковая мазь	Глобус	4006-4SL
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красный	Gibco	25200-056