Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Интегрированный протокол оценки менингеальных лимфатических факторов: инъекция Cisterna magna, визуализация лимфатических узлов, менингеальная диссекция и окрашивание целого крепления

412 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71140

⸱

29 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для оценки менингеальных лимфатических сосудов мышей (MLV), которые играют важную роль при различных неврологических заболеваниях. Цель этого протокола — предоставить интегрированный метод, позволяющий как функциональную оценку трассерного дренажа, так и детальную морфологическую характеристику дорсальной сети MLVs.

Аннотация

Менингеальные лимфатические сосуды (МЛВ) стали критически важными регуляторами гомеостаза центральной нервной системы (ЦНС), а дисфункция МЛВ связана с различными неврологическими расстройствами. Комплексная оценка морфологии и функции МЛВ необходима для понимания их роли в физиологии и заболеваниях ЦНС. Этот протокол описывает интегрированный метод оценки MLV у мышей с использованием четырёх ключевых методов: внутрицистерна-магна (i.c.m.) инъекции флуоресцентных трассеров, живой визуализации шейных лимфатических узлов (CLN), менингеальной диссекции и окрашивания целого крепления. Сначала игла объемом 30 G подключается к шприцу и инфузионному насосу через полиэтиленовую (PE) трубку. После анестезии мыши твердая орудость обнажается тупым вскрытием мышц шеи, и инъекционная игла вводится в цистерну магна (КМ) для точного контроля в спинномозговую жидкость (СМЖ). Дренаж трассеров к CLN можно визуализировать в реальном времени, а последующая менингеальная диссекция и окрашивание по всему монтажу позволяют провести детальный морфологический анализ дорсальных MLV. Вся процедура может быть завершена за 3 часа, включая инъекцию ИКМ, перфузию тканей, выделение черепа и размещение в фиксирующем растворе. Этот протокол также может быть адаптирован для внутричерепной доставки лекарств или комбинирован с молекулярным анализом, поскольку процедура менингеального рассечения совместима со свежими, нефиксированными тканями, подходящими для экстракции РНК и белка.

Введение

MLV расположены внутри дуральных пазух и способны переносить компоненты СМВ и иммунные клетки из ЦНС вCLN 1,2. Открытие MLV поставило под сомнение традиционное представление о «иммунной привилегии» центральной нервной системы и в последние годы стало центромисследований. Исследования показали, что нарушенная функция МЛВ тесно связана с различными заболеваниями, включая болезнь Альцгеймера, возрастное снижение когнитивных функций, опухоли мозга и инфекции центрального нервногоцентра 4,5,6,7. По мере развития исследований в этой области растёт потребность в интегрированных, воспроизводимых и хорошо стандартизированных экспериментальных методах.

Большинство существующих протоколов для исследований лимфатических сосудов сосредоточены на периферических лимфатическихсосудах 8,9,10. В исследованиях, связанных с МЛВ, было описано простую процедуру каннулирования СМ, которая обеспечивает прямой доступ к СМВ без повреждения черепа или паренхимымозга 11. В сочетании с методами визуализации этот метод позволяет эффективно оценивать функцию глимфатической системы и динамику спинномозговой жидкости. Однако детальные экспериментальные протоколы изучения функции и морфологии MLV были недостаточно задокументированы.

Настоящий протокол интегрирует функциональную визуализацию с морфологическим анализом, что позволяет одновременно собирать данные о функции дренажа и структурной морфологии у одного и того же животного, тем самым снижая количество используемых животных и повышая сопоставимость и согласованность данных. В целом этот протокол может использоваться для изучения структурных и функциональных изменений в МЛВ в различных моделях заболеваний, а также для оценки влияния фармакологических или генетических вмешательств на МЛВ. Протокол содержит подробные описания операционных этапов, ключевых мер предосторожности и рекомендации по устранению неполадок. Кроме того, техника инъекции ИКМ, описанная в этом протоколе, может применяться независимо для внутричерепной введения препарата, а процедура менингеального рассечения совместима со свежей тканью для последующего экстракции РНК или белка, что обеспечивает значительную гибкость и масштабируемость.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры с мышями, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с протоколом, утверждённым Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Шанхайского университета (No одобрения). ECSHU 2023-099).

1. Подготовка хирургических инструментов и буферов

ВНИМАНИЕ: Работайте в капюшоне с химическими парами и носите перчатки, чтобы минимизировать потенциальные риски при работе с PFA — умеренно токсичным и канцерогенным веществом. Все операции с использованием изоамилового спирта должны проводиться в химическом выхлопчике, вдали от источников возгорания, при этом используются перчатки и маска, чтобы снизить риск воздействия.

  1. Подготовьте хирургические инструменты, такие как одна пара прямых ножниц, две пары изогнутых тонких щипцов, две пары тупых щипцов, одну пару микроножниц и одну пару прямых микропинцетов с гладкими (незубчатыми) наконечниками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протрите хирургические инструменты 75% этанола и держите их сухими как до, так и после эксперимента.
  2. Подготовьте буферы.
    1. 1x PBS.
    2. 4% раствор фиксации параформальдегид (4% PFA).
    3. Блокирующий раствор (1x PBS, содержащий 3% бычьей сывороточной альбумина (BSA), 0,5% Triton X-100 и 2% сыворотки плода).
    4. Буфер разбавления антител (1x PBS, содержащий 3% BSA и 0,5% Triton X-100).
    5. Средний монтаж антифейда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленный реагент можно хранить при 4 °C в течение одного месяца.
  3. Приготовьте раствор анестетика 2,2,2-триброметанола (Авертин, 1,25%, 50 мл)
    1. Взвесьте 0,625 г триброметанола в трубку объёмом 2 мл, добавьте 1,25 мл изоамилного спирта и тщательно растворите (вшейковать 37 °C).
    2. Полностью растворённый раствор триброметанола-изоамилспирта переложите в коническую трубку объемом 50 мл, добавьте 1x PBS, чтобы увеличить общий объём до 50 мл, и тщательно перемешайте.
    3. Фильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм в биологическом защитном шкафе.
  4. Приготовьте раствор овальбумина, Alexa Fluor 647 Conjugate (OVA-647) (2 мг/мл). Растворить 2 мг OVA-647 в 1 мл искусственной спинномозговой жидкости (aCSF).

2. Сборка инжекторной иглы и соединение с микроинъекционным насосом

  1. Используйте тупые щипцы, чтобы сломать иглу 30 G и сохранить кончик11 (внешний диаметр 0,30 мм, внутренний 0,15 мм, длина 8 мм).
  2. Используйте трубку PE-10 длиной 30 см (внешний диаметр 0,64 мм, внутренний диаметр 0,28 мм), чтобы соединить сломанную иглу массой 30 G с иглой для микроинъекции с иглой на 30 G (рисунок 1).
  3. Закрепите иглу для микроинъекции с трубкой и иглой на 30 G на микроинъекционный насос.

3. Инъекция ИКМ и живые визуализации

ВНИМАНИЕ: Если игла введена слишком глубоко и проникает в паренхиму мозга, инъекция будет введена в ткань мозга, а не в отдел СМЖ, что снижает точность результата и может привести к смертности мышей. Во время хирургической процедуры требуется непрерывный физиологический мониторинг мыши. Глубину анестезии следует оценивать каждые 15 минут с помощью рефлекса сжатия пальцев, чтобы животное оставалось безболезненным. Температуру тела следует поддерживать на уровне 37 °C ± 0,5 °C с помощью грелки, чтобы предотвратить гипотермию и связанные с ней влияние на физиологическую функцию. Кроме того, дыхание и частота сердечных сокращений должны записываться каждые 30 минут, оцениваться с использованием движения грудной клетки и пальпации вершины сердца. Во время инъекции ИКМ, если игла введена слишком глубоко и это вызывает кровотечение, это указывает на неудачную инъекцию. Прекратите эксперимент и усыпьте животное.

  1. Взвесьте мышь и введите 200 мг/кг Авертина через внутрибрюшинную инъекцию для анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться альтернативные анестетики (например, кетамин/ксилазин).
  2. Нанесите депиляционный крем на шейную область, чтобы удалить волосы над лимфатическими узлами, когда рефлекс сжатия пальцев на ногах прекращается, а дыхание становится медленным и ровным.
  3. Сбрийте спинную часть шеи.
  4. Поместите мышь в стереотаксичную рамку на грелке, наклонив голову под углом 120° к багажнику (рисунок 2A).
  5. Очищайте участок последовательно с помощью повидона-йода и 75% этанола.
  6. Нанесите эритромициновую офтальмологическую мазь.
  7. Сделайте средний разрез на коже шеи и тупо разделите мышечные слои.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью двух пар щипцев с тупым наконечником разделяйте мышечные слои, чтобы минимизировать кровотечение.
  8. Вскрытие мышцы с помощью тонких щипцов до тех пор, пока полупрозрачная твердая твердость над CM не станет видна  (рисунок 2B, C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изогнутый щипец с тонкими наконечниками, чтобы втянуть мышцы и поддерживать постоянное открытие СМ.
  9. Под стереомикроскопом используйте тупые щипцы, чтобы удерживать иглу и вводить её под углом 45° к плоскости твердой мозговой оболочки на глубину примерно 1–2 мм. Разместите скошенную фаску параллельно твердой мозговой опухлини так, чтобы она полностью лежала под твердой орудостью (рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приложите мягкое усилие иглой, чтобы проколоть твердую орудость. Успешная пункция характеризуется ощутимой потерей сопротивления, а также визуализацией кончика иглы под твердой мозговой мозговой косткой и вытоком СМЖ.
  10. Используйте впитывающую бумагу для сушки протекающей жидкости жидкости.
  11. Установите микроинжекторный насос на 1 мкл/мин. Введите 5 мкл раствора OVA-647 (2 мг/мл) в CM4 (рисунок 2E).
  12. Оставьте иглу на 2 минуты, чтобы предотвратить обратный поток.
  13. Нанесите одну каплю биологического клея на мозговые каналы.
  14. Закройте хирургический разрез.
  15. Проведите in vivo визуализацию мыши для мониторинга интенсивности красителя в CLN в разные временные моменты (30 мин, 60 минут). Используйте следующие параметры изображения: время экспозиции: 0,5 с; фильтр возбуждения: 640 нм; Эмиссионный фильтр: 680 нм.

4. Выделение дорсальной части черепа мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите отсутствие рефлекса сжатия пальца ног и прекращение спонтанного дыхания перед началом грудной диссекции.

  1. Эвтаназия мыши с помощью передозировки Авертина (600 мг/кг) и проведение сердечной перфузии с помощью 20 мл 1x PBS или физиологического раствора.
  2. Обезглавить мышь, чтобы изолировать голову.
  3. Сделайте разрез вдоль средней линии черепа, чтобы открыть кожу головы.
  4. Используйте два изогнутых гемостата, чтобы разделить кожу головы в двусторонний бок путём мягкого втягивания. Затем вставьте изогнутые гемостаты в орбитальную ямку и аккуратно снимите остатки кожи головы из носовой и ротовой областей (рисунок 3A–C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет быстро и полностью отделить кожу головы.
  5. Удалите нижнюю челюсть, сохранив череп целым (рисунок 3D).
  6. Удалите кость от основания черепа, чтобы обнажить вентральную часть мозга (рисунок 3E).
  7. Аккуратно извлекайте мозг тупыми щипцами, избегая контакта с твердой мозговой поверхностью теменных костей (рисунок 3F).
  8. Полностью погрузите спинной череп в 5 мл с 4% PFA и фиксируйте 24 часа при 4 °C (рисунок 3G).
    ТОЧКИ ПАУЗЫ: Храните фиксированные черепа при 4 °C не дольше одной недели. Удалите образец с температуры 4 °C и дайте ему вернуться к комнатной температуре перед менингеальной вскрытием.

5. Вскрытие менинга с черепа мыши

  1. Промой фиксированный череп 5 мл 1x PBS, повторяя стирку три раза (по 10 минут каждая).
  2. Положите череп спинной стороной вниз в 10-сантиметровую чашку, наполненную 1x PBS  (рисунок 4A).
  3. Используйте кончик тонкоконечных щипцов, чтобы схватить или прижать барабанную перепонку и удалить её из черепа (рисунок 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление барабанной перепонки — важный шаг для предотвращения разрыва менингеального образования, вызванного спайками при отделении от черепа.
  4. Плотно подрежьте вдоль вентральной поверхности черепа на расстояние около 2 мм ножницами для сглаживания (рисунок 4C).
  5. Используйте тонкие щипцы, тщательно прозрачную остаточную белую ткань из области слияния синусов (COS) в менингах (рисунок 4D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное удаление остаточных тканей — одна из основных причин неспецифического окрашивания при иммуномаркировке.
  6. Используйте тонкие микрощипцы, чтобы аккуратно поднять один край мозговых волос от края черепа, затем поднимите противоположный край (рисунок 4E, F).
  7. Захватите чашевидный край менинга и потяните, чтобы отделить его от черепа в области COS (рисунок 4G).
  8. Удалите верхнечелюстную кость ножницами (рисунок 4H).
  9. Снова возьмите чашевидный край менинга и потяните, чтобы отделить их от черепа в области лобной кости (рисунок 4I).
  10. Поместите целые мазовые клетки в пластину на 24 ямы, содержащую 1 мл 1x PBS, готовую к окрашиванию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если мозговые мозги разрываются во время вскрытия, особенно в месте соединения верхнего сагиттального и поперечного пазух, образец может быть непригоден для дальнейшего анализа. Если наблюдается сильное неспецифическое окрашивание на фоне, добавьте этап закалки после фиксации PFA (например, инкубировать раствором 0,1 M глицина в течение 40мин 12), чтобы дополнительно уменьшить фоновый сигнал.

6. Блокировка, окрашивание первичных и вторичных антител

  1. Используйте пипетку объёмом 1 мл, чтобы аспирировать 1x PBS, чтобы мозги прилипали к дну пластины скважины.
  2. Заблокируйте целые менинги раствором блокировки 200 мкл в пластине на 24 лунки в течение 1 часа при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно полностью распределите мазки в растворе для блокировки с помощью щипцов, чтобы обеспечить равномерное обнажение.
  3. Используйте пипетку для удаления раствора блокировки.
  4. Инкубировать целые мозговые клетки 200 мкл разбавленного анти-LYVE-1 (лимфатический сосудоспецифическиймаркер 13) с разбавлением 1:200 (конечная концентрация 1 мкг/мл) за ночь при 4 °C.
  5. Используйте пипетку для удаления раствора антител.
  6. Постирайте три раза с помощью 1x PBS (по 10 минут каждая).
  7. Инкубировать целые мышки с помощью DAPI (конечная концентрация 1 мкг/мл) и Alexa Fluor 488 IgG против крыс (конечная концентрация 2 мкг/мл) в течение 1 часа при комнатной температуре в 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте от света во время инкубации антител.
  8. Используйте пипетку для удаления раствора антител.
  9. Постирайте три раза с помощью 1x PBS (по 10 минут каждая).

7. Монтаж и визуализация

  1. Пипетта 100 мкл 1x PBS в центр слайда.
  2. Плавать и распределять целые менинги внутри капли (рисунок 5A).
  3. Аспирируйте 1x PBS, чтобы ткань могла плотно прилипнуть к стеклу (рисунок 5B).
  4. Нанесите 20 мкл крепящего материала на весь крепящий менинга.
  5. Накройте накладку на ткань (рисунок 5C).
  6. Сушите слайды на воздухе при комнатной температуре и храните их при 4 °C.
    ТОЧКИ ПАУЗЫ: Слайды можно хранить при 4 °C до одного месяца. Снимите затвор с температуры 4 °C и дайте ему вернуться к комнатной температуре. Удалите конденсат с поверхности затвора с помощью впитывающей бумаги.
  7. Используйте объектив с объективом 20x для получения изображений MLV. Установите канал на FL Green с длиной волны излучения 518 нм и временем экспозиции 100 мс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После инъекции OVA-647 в микроорганизме in vivo изображения мелких животных выявили отчетливые овальные флуоресцентные сигналы, распределённые двустороннее в шейной области (рисунок 6A). При успешных инъекциях трассер был чётко виден в CLN после инъекции, при этом интенсивность флуоресценции достигала пика примерно на 60 минутах (рисунок 6B). Кроме того, флуоресцентные сигналы наблюдались в изолированных поверхностных и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает комплексный метод оценки функции и морфологии МЛВ путём интеграции инъекции ИКМ, in vivo визуализации CLN, менингеальной диссекции и окрашивания целого крепления. Ключевым преимуществом такого интегрированного подхода по сравнению с традиционными методами является возможность одновременно оценивать функцию лимфатического дренажа и морфологию сосудов у одного и того же животного, устраняя необходимость в отдельных когортах и, тем самым снижая вариабельн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансированием Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2023YFC2306500), Национального фонда естественных наук Китая (82502108) и Китайского фонда постдокторских наук (2024M760542).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)InvitrogenCat# A-21208
Antifade Mounting MediumBeyotimeCat# P0126
Blunt-tipped forcepsRWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
CoverslipsCITOTESTCat# 80312-3161
Curved sharp forcepsRWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
Depilatory creamVeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
Disposable intravenous (IV) infusion needleZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Ethanol-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
Fetal Bovine SerumExcellCat# FSD500
Filter-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
Glass slidesCITOTESTCat# 80340-3610
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
Micro forcepsShinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
Micro scissorsShinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
Microinjection needle (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
Microinjection pumpVoyage PowerCat# QHZS-001A
Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male CavensN/A
Needle-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde Fix Solution-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 tubingShanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
Phosphate-buffered saline (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)Santa CruzCat# sc-65647
StereomicroscopeJonecCat# JSZ6
Stereotaxic frameRWD Life ScienceCat# 68030
Straight scissorsRWD Life ScienceCat# S12007-10
Syringe-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
Tissue Adhesive I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 High-throughput fluorescence imaging systemOlympusN/A

Ссылки

  1. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  2. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212, 991-999 (2015).
  3. Sandrone, S., Moreno-Zambrano, D., Kipnis, J., Van Gijn, J. A (delayed) history of the brain lymphatic system. Nat Med. 25, 538-540 (2019).
  4. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and alzheimer's disease. Nature. 560, 185-191 (2018).
  5. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
  6. Li, X., et al. Meningeal lymphatic vessels mediate neurotropic viral drainage from the central nervous system. Nat Neurosci. 25, 577-587 (2022).
  7. Rustenhoven, J., et al. Age-related alterations in meningeal immunity drive impaired cns lymphatic drainage. J Exp Med. 220, (2023).
  8. Kodama, T., Hatakeyama, Y., Kato, S., Mori, S. Visualization of fluid drainage pathways in lymphatic vessels and lymph nodes using a mouse model to test a lymphatic drug delivery system. Biomed Opt Express. 6, 124-134 (2015).
  9. Banerjee, R., Knauer, L. A., Yang, Y. Protocol for in vivo and in vitro study of lymphatic valve formation driven by shear stress signaling pathway. STAR Protoc. 4, 102141 (2023).
  10. Akwii, R. G., et al. Murine dermal lymphatic endothelial cell isolation. J Vis Exp. (197), e65393 (2023).
  11. Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378 (2018).
  12. Hsieh, Y. T., Chen, S. L. Visualization and analysis of neuromuscular junctions using immunofluorescence. Bio Protoc. 14, e5076 (2024).
  13. Banerji, S., et al. Lyve-1, a new homologue of the cd44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144, 789-801 (1999).
  14. Da Mesquita, S., et al. Meningeal lymphatics affect microglia responses and anti-abeta immunotherapy. Nature. 593, 255-260 (2021).
  15. Betsholtz, C., et al. Advances and controversies in meningeal biology. Nat Neurosci. 27, 2056-2072 (2024).
  16. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathol. 137, 151-165 (2019).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high eeg delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5, eaav5447 (2019).
  18. Lee, H., et al. The effect of body posture on brain glymphatic transport. J Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Интегрированный протокол оценки менингеальных лимфатических факторов: инъекция Cisterna magna, визуализация лимфатических узлов, менингеальная диссекция и окрашивание целого крепления
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.