Методическая статья

Высокоточное обнаружение сайтов редактирования РНК с помощью калиброванного дифференциального РНК редактирования

DOI:

10.3791/71148

⸱

23 июня 2026 г.

 ,  , 
1Shanghai Institute of Biological Products, 2State Key Laboratory of Novel Vaccines for Emerging Infectious Diseases, China National Biotec Group Company Limited

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает использование Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES) — вычислительного рабочего процесса, который интегрирует совместный вызов вариантов ДНК и РНК, оптимизированную по сигналам перекалибровку и репликационное статистическое моделирование с учётом репликаций для высокой точности выявления дифференциальных участков редактирования РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точное разграничение редактирования РНК остаётся технически сложным, поскольку подлинные посттранскрипционные изменения необходимо отличать от геномных вариантов и артефактов секвенирования. Эта сложность особенно заметна при редактировании цитидина в уридин, катализируемом ферментами APOBEC, где смешанные изменения ДНК и РНК затрудняют истинный сигнал редактирования. Калиброванный сканер редактирования дифференциальной РНК (CADRES) предоставляет структурированную вычислительную структуру для устранения этих ограничений через интегрированное исследование вариантов ДНК и РНК и целенаправленное сохранение аутентичных сигнатур редактирования. Этот протокол представляет рабочий процесс CADRES, включающий подготовку данных, совместный вызов РНК-вариантов, перекалибровку базового качества с сохранением сигнала, фильтрацию артефактов и дифференциальную оценку редактирования РНК между экспериментальными условиями. CADRES поддерживает парное секвенирование РНК-секвенации и целого генома или целого экзома с биологической репликацией.  Многоступенчатая стратегия фильтрации, включая удаление гомополимеров и скрининг паралога на основе PBLAT, систематически снижает количество ложноположительных результатов, сохраняя при этом события редактирования низкой частоты. Сочетая калибровку с моделированием, осознанным на репликациях, CADRES повышает точность и воспроизводимость анализа редактирования РНК, позволяя анализировать динамику редактирования в различных биологических контекстах. По сравнению с устоявшимися методами, CADRES разработан для повышения точности обнаружения редактирования РНК, особенно для событий C-to-U, опосредованных APOBEC.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Редактирование РНК представляет собой динамический слой посттранскрипционной регуляции, который позволяет осуществлять местоспецифические нуклеотидные замещения внутри транскриптов РНК без изменения базовой последовательности ДНК. У метазоев доминирующей формой является деадинация аденозина-инозину (A>I), опосредованная ферментами ADAR, которая способствует диверсификации транскриптов, стабильности мРНК, врождённой иммунной модуляции и функциинейронов 1,2. Цитидин в уридин (C>U) (далее «C>U» в биологическом контексте; «C>T» в контексте секвенирования) дезаминирование, катализируемое представителями семейства APOBEC, работает параллельно с этими путями и участвует в метаболизме липид, рестрикции вирусов, мутагенезе и новых регуляторных ролях в иммунной и онкологической биологии 3,4,5,6,7. Недавние исследования показали, что несколько ферментов APOBEC, включая APOBEC1, APOBEC3A и APOBEC3B (A3B), катализируют редактирование РНК в физиологических и патологическихконтекстах 3,4,7,8,9,10. APOBEC3 ферменты также вызывают редактирование ДНК, вызывая перекрывающиеся мутационные сигнатуры, которые усложняют различие редактирования РНК отгеномных вариаций 8,10,11,12.

Секвенирование следующего поколения позволило идентифицировать потенциальные сайты редактирования РНК по всему транскриптому, однако отличить истинные правки от геномных SNV или технического шума остаётся сложно. События A>I и C>U проявляются как замены A>G и C>T в библиотеках кДНК и могут быть запутаны ошибками в прайме, ошибками полимеразы, артефактами картирования и контекстно-специфическими изменениями экспрессии. Общественные ресурсы, такие какREDIportal 13, каталогизируют миллионы сайтов A>I, тогда как аннотации C>U остаются редкими, отражая как биологические, так и аналитические ограничения. Таким образом, надёжная идентификация C>U редактирования — особенно изменения в зависимости от условий — остаётся неудовлетворённой аналитической потребностью.

Главная цель метода, представленного здесь, Калиброванного сканера дифференциальной РНК редактирования (CADRES), — это точная идентификация дифференциальных вариантов РНК (DVR): редактирующих участков, которые статистически значительно изменяют глубину редактирования между двумя или более определённымиусловиями. 14. Разрабатывая этот протокол, мы стремились решить два устойчивых препятствия. Во-первых, подлинные редактирования РНК необходимо отличать от вариантов, закодированных ДНК. Во-вторых, различия в редактировании должны быть статистически надёжно оценены на основе биологически реплицированных наборов данных с РНК-секвенциями. Главная инновация CADRES заключается в интеграции совместного вызова вариантов ДНК/РНК с калиброванной обработкой вариантов РНК во время перекалибровки баллов по базовому качеству (BQSR). Эта стратегия «буст-рекалибровки» сохраняет недавно обнаруженные участки редактирования РНК во время BQSR, тем самым предотвращая систематическое понижение качества, которое обычно снижает чувствительность при низкочастотныхредактировании 15,16,17. Такой подход снижает ложноотрицательные результаты и повышает специфичность по сравнению с конвейерами, которые полагаются исключительно на неполные базы данных редактирования РНК.

CADRES находится в рамках системы методов, каждый из которых охватывает различные аспекты анализа редактирования РНК. артефакты фильтров SNPiR18 и RVboost19 из наборов вариантов только с РНК; VaDiR 20 включает сравнения ДНК и РНК, но не моделирует реплицированную структуру; rMATS-DVR21 проводит дифференциальное тестирование на основе GLMM, но полностью использует RNA-seq; и JACUSA/JACUSA2 22,23 поддерживают обнаружение с учётом репликации, но не включают совместные стратегии анализа ДНК и РНК или перекалибровки. CADRES объединяет репликационное статистическое моделирование, совместный вызов вариантов ДНК/РНК и перекалибровку, обогащённые для de novo редактируемых сайтов, обеспечивая единый рабочий процесс, оптимизированный для обнаружения редактирования РНК, зависящих от условий — включая события C>U, связанные с активностьюAPOBEC 10,11,12.

В этом контексте пользователи могут считать CADRES подходящим, если их экспериментальная система соответствует следующим критериям. Во-первых, доступно парное секвенирование РНК-секвенации и целого генома или целого экзома из одних и тех же образцов, что позволяет строго разбить события, полученные из РНК, из вариантов, закодированных ДНК. Во-вторых, биологический вопрос касается изменений редактирования РНК в разных условиях — таких как индукция ферментов, стресс окружающей среды, стадии развития или состояния заболеваний — где статистическое моделирование аллельно-специфической глубины между репликатами крайне важно. В-третьих, исследователь стремится к повышенной специфичности при обнаружении редактирования C>U, где необходимо отличить РНК-события от мутагенеза ДНК, вызванного APOBEC. CADRES особенно ценен в системах, где активность APOBEC индуцирует как редактирование РНК, так и ДНК, что показано в индуцируемых моделяхA3B 10,11,12, а также где традиционные методы, основанные только на РНК, демонстрируют завышенные показатели ложноположительных результатов из-за смешанных SNV или артефактов повторяющихся последовательностей.

CADRES предлагает несколько практических преимуществ. Совместное вызов вариантов ДНК/РНК снижает ложноположительные результаты, вызванные SNV. Перекалибровка буста сохраняет истинные сигналы редактирования, включая новые события, отсутствующие в справочных базах данных. GLMM, основанный на rMATS, предоставляет статистически принципиальную основу для анализа дифференциального редактирования между репликатами. Вместе эти возможности создают калиброванную, высокоточную платформу для изучения динамического редактирования РНК в экспериментальных и заболевающих условиях. В нашем предыдущемисследовании 14 CADRES был тщательно сравненный с установленными методами обнаружения редактирования РНК, используя как in silico моделируемые наборы данных, так и реальные индуцируемые модели клеток A3B. В оценке in silico CADRES стабильно достигал точных оценок 0,85–0,95 и точных оценок 0,92–0,98 по числам реплицированных. Общий рабочий процесс CADRES иллюстрирован на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает чисто вычислительный биоинформатический рабочий процесс для выявления событий редактирования C>U РНК с использованием фреймворка CADRES. Все шаги выполняются в среде Linux с помощью командной строки. Используются только общедоступные наборы данных секвенирования, и не участвуют ни люди, ни позвоночные.

1. Настройка среды и установка программного обеспечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальные вычислительные требования для рабочего процесса CADRES следующие: процессор ≥ 8 ядер (рекомендуется 16 ядер), оперативная память ≥ 32 ГБ (рекомендуется 64 ГБ для полногеномных наборов данных) и дисковое пространство ≥ 100 ГБ.

  1. Убедитесь, что доступна ли операционная система Linux. Откройте окно терминала и убедитесь, что разрешение доступно для установки в текущей пользовательской среде.
  2. Установите менеджер пакетов Conda, если он ещё не присутствует на системе. Скачайте установщик для минимального дистрибутива Conda с официального сайта. Выполните скрипт установки, следуя инструкциям на экране.
  3. Проверьте, активна ли Conda, введя следующую команду, и убедитесь, что команда печатает действительный номер версии.
    $ conda --version
  4. Создайте рабочий каталог для рабочего процесса CADRES. Переходите в этот каталог с помощью следующего:
    $ cd /путь/к/working_directory
  5. Скачайте исходный код CADRES, выполнив:
    $ git clone --branch v1.0.0 https://github.com/junsun-hash/CADRES
  6. Входите в клонированный каталог, запустив:
    $ cd КАДРЫ
  7. Создайте выделенную среду Conda, используя файл environment.yml, предоставленный в репозитории CADRES. Выполните следующую команду и дайте процессу установки завершиться без прерываний.
    $ conda env create -f environment.yml
  8. Активируйте новосозданную среду, введя следующую команду. Убедитесь, что среда активирована, проверив, отображается ли название терминала.
    $ conda активировать CADRES
  9. Убедитесь, что необходимые командные инструменты установлены правильно. Выполните каждую команду ниже и убедитесь, что они возвращают номер версии, а не сообщение об ошибке:
    $ python --version
    $ samtools --версия
    $ gatk — помощь
    $ bedtools --версия
    $ pblat
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точный набор инструментов, включённых в среду CADRES, может немного отличаться в зависимости от обновлений файла environment.yml. Если инструмент отсутствует, воссоздайте окружение или обновите список зависимостей по мере необходимости.
  10. Убедитесь, что достаточно места на диске. Убедитесь, что существует не менее 100 ГБ свободного пространства для эталонных геномов, индексов выравнивания и промежуточных BAM-файлов, введём:
    $ df -h
  11. Убедитесь, что права записи доступны во всех рабочих, выходных и временных каталогах, создав тестовый файл:
    $ Touch test_file.txt
  12. Затем удалите файл, введём:
    $ RM test_file.txt

2. Подготовка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативный набор данных, используемый в этом протоколе, включает: HEK293T клеток с доксициклиндуцино-индуцируемым A3B–GFP; WGS на 33×; цепочно-специфический парный конец РНК-секвенция (2×150 п.п., ≥60 М чтений/образца); n = 3 биологических репликации на каждое состояние (DMSO против доксициклина 72 h). Полные данные: SRA PRJNA1211186. Демонстрационное подмножество chr22 предоставлено в репозитории CADRES.

КАДРЫ требуют: (i) WGS (≥33×) или WES (≥33×); (ii) цепочно-специфическая, парная РНК-секвенция (≥60 миллионов чтений на образец); (iii) два экспериментальных условия с ≥2 биологическими реплицированными в каждом.

  1. Подготовьте референсный геном и аннотации.
    1. Скачайте референсный геном (FASTA) и файл аннотации GTF с Ensembl или аналогичного репозитория. Рекомендуемый эталонный геном — первичная сборка Ensembl GRCh38: https://ftp.ensembl.org/pub/release-111/fasta/homo_sapiens/dna/, а рекомендуемая аннотация GTF — GENCODE release 45:
      https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/.
    2. Индексируйте эталонный FASTA:
      $ samtools faidx FASTA_FILE.fa
      Убедитесь, что конвенции именования хромосом (например, «chr1» против «1») согласованы во всех эталонных материалах.
  2. Получите данные секвенирования.
    1. Получите DNA-seq файлы FASTQ (WGS или WES) с глубиной ≥33×.
    2. Получите специфические для цепи парные РНК-секвентивные файлы FASTQ с ≥60 миллионами чтений на образец, в двух биологических условиях и как минимум по две биологические реплики на группу.
  3. Выровняйте считывания секвенирования ДНК с помощью BWA-MEM.
    1. Создайте индекс BWA:
      $ индекс BWA Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -p bwaindex -a bwtsw
    2. Выравнивание и конвертация в BAM:
      $ bwa mem -R '@RG\tID:ID\tPL:platform\tLB:library\tSM:sample_name' bwaindex wgs_R1.fq.gz wgs_R2.fq.gz | samtools view -b > wgs.bam
  4. Выровняйте показания секвенирования РНК с помощью STAR.
    1. Генерируйте индекс генома STAR:
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --genomeDir STAR_index \
      --sjdbGTFфайл Homo_sapiens. GRCh38.gtf
    2. Выравнивание РНК-считывания
      $ STAR \
      --genomeDir STAR_index \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFфайл Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM Unsorted \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outFileNamePrefix pass1_
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это создаёт файл соединения (pass1_SJ.out.tab), содержащий как аннотированные, так и новые соединения.
    3. Регенерировать индекс генома STAR с учётом новых соединений:
      $ cat pass1_SJ.out.tab > SJ_all.tab
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --genomeDir STAR_index_2pass \
      --sjdbGTFфайл Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --sjdbFileChrStartEnd SJ_all.tab
    4. Выполните выравнивание во втором проходе с использованием обновлённого индекса:
      $ STAR \
      --genomeDir STAR_index_2pass \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFфайл Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outFileNameПрефикс output_name
  5. Подготовьте вспомогательные справочные ресурсы.
    1. (Рекомендуемо) Получить dbSNP VCF
      Скачайте человеческий GRCh38 dbSNP VCF (например, dbSNP build 150) с NCBI FTP-сервера:
      https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/latest_release/VCF/ Поместите загруженный файл (например, dbsnp_150.vcf.gz) в рабочую директорию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Записи, полученные из РНК (molType="cDNA") в dbSNP, могут маскировать истинные сайты редактирования РНК. Исключите их с помощью следующих методов:
      $ bcftools view -i 'INFO/molType!="cDNA"' dbsnp.vcf.gz -Oz -o dbsnp_no_cDNA.vcf.gz
    2. (Рекомендуемо) Сортируйте dbSNP VCF
      Отсортируйте VCF так, чтобы он был совместим с эталонным геномом и GATK:
      $ gatk SortVcf \
      -Я dbsnp_150.vcf.gz \
      -О dbsnp_150.sorted.vcf.gz \
      --словарь последовательностей Homo_sapiens. GRCh38.dict
    3. (Рекомендуемо) Индексируйте отсортированный dbSNP VCF
      Создайте индекс для отсортированного dbSNP VCF:
      $ gatk IndexFeatureFile -I dbsnp_150.sorted.vcf.gz
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется соответствующий справочный словарь. Если файл Homo_sapiens. GRCh38.dict отсутствует, генерируйте его следующим образом:
      $ gatk CreateSequenceDictionary \
      -R Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      -О Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.dict
    4. (Рекомендуемо) Получить gnomAD зародышевой линии VCF
      Скачайте варианты GRCh38 gnomAD с зародышевой линией VCF из: https://gnomad.broadinstitute.org/downloads Используйте геном VCF, подходящий для конвейера (например, gnomad.genomes.vX.X.sites.vcf.gz).
    5. (Рекомендуемо) Сортируйте VCF gnomAD
      Сортируйте gnomAD VCF с помощью того же справочного словаря для обеспечения совместимости:
      $ gatk SortVcf \
      -Я gnomad.vcf.gz \
      -О gnomad.sorted.vcf.gz \
      --словарь последовательностей Homo_sapiens. GRCh38.dict
    6. (Рекомендуемо) Индексируйте отсортированный gnomAD VCF
      Создайте индекс для отсортированного gnomAD VCF:
      $ gatk IndexFeatureFile -I gnomad.sorted.vcf.gz
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что названия хромосом (например, «chr1» против «1») совпадают с эталонным FASTA перед запуском SortVcf.
  6. Получите известную ссылку на редактирование РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Совместимый справочный файл REDIportal (rediportal.txt), подходящий для CADRES, курируется в репозитории CADRES и может быть скачаён напрямую из:
    https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0. Этот файл используется для аннотации известных событий редактирования на шаге 3.
  7. Подготовьте аннотации генов в формате RefGene. Скачайте аннотацию RefGene (например, refGene.txt.gz с UCSC). При необходимости декомпрессируйтесь и убедитесь, что названия хромосом соответствуют названиям референсного генома.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример, подходящий для CADRES, курируется в репозитории CADRES и может быть скачаён напрямую из:
    https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0

3. Выполнение аналитического рабочего процесса CADRES

ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 3 выполняется в терминале Linux с активированной средой CADRES Conda.

  1. Калибровка и перекалибровка буста
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1 стандартизирует BAM-файлы и выполняет рекалибровку Boost — усовершенствованную BQSR, включающую dbSNP, gnomAD и предварительный набор кандидатов в редактирование РНК для сохранения подлинных редактируемых сигналов. Перечислите все РНК-BAM-файлы, разделённые пробелами. Вывод: перекалиброванные BAM (суффикс: _recalibration.bam) и сайты-кандидаты Boost.
    1. Для выполнения шага 3.1:
      $ Python pipeline_step1_calibration.py \
      --rna_bams /путь/к/rna_sample1.бам /путь/к/rna_sample2.бам ... \
      --dna_bam /path/to/wgs_normal.bam \
      --геном /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /путь/к/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step1_calibration \
      --префикс project_demo
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кандидаты на буст создаются на основе предварительного совместного вызова ДНК-РНК Mutect2 (--max-events-in-region 4, только PASS-фильтр; без дополнительных порогов AF/качества). Гомополимерная и повторная фильтрация выполняются на шаге 3.2.
  2. Вызов вариантов, оценка загрязнения и фильтрация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3.2 выполняет совместный вызов вариантов ДНК-РНК с оценкой загрязнения (с помощью gnomAD), затем фильтрует кандидатов по контексту гомополимера и перевыравниванию PBLAT. Выход: {префикс}.final.vcf.
    1. Для выполнения шага 3.2:
      $ python pipeline_step2_variant_calling.py \
      --rna_bams ./output/step1_calibration/rna_sample1_split_recalibration.бам ... \
      --dna_bam ./output/step1_calibration/DNA_processed_recalibration.bam \
      --геном /path/to/hg38.fa \
      --гномад /путь/к/gnomad.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step2_variant_calling \
      --префикс project_demo
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап даёт финальный, строго отфильтрованный набор вариантов (project_demo.final.vcf), представляющий высокоуверенные различия РНК и ДНК во всех образцах. Ключевые параметры: Mutect2 --min-median-base-quality 12, --max-events-in-region 4; PBLAT minbasequal 5; все они заранее настроены в скрипте конвейера.
  3. Статистическое тестирование и функциональная аннотация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3.3 количественно оценивает дифференциальное редактирование РНК с помощью GLMM, адаптированного из rMATS (коррекция Бенжамини-Хохберга FDR), и аннотирует каждый участок с указанием области гена, символа гена и известного статуса редактирования. Выход: {префикс}_Result.txt (DVR с P-значениями и FDR).
    Фильтр выравнивания PBLAT удаляет кандидаты, отображённые в несколько геномных локусов, повышая специфичность в повторяющихся областях. Внутренняя THREAD_COUNT управляется флагом --threads в pipeline_step2_variant_calling.py.
    1. Для выполнения шага 3.3:
      $ python pipeline_step3_statistical_test.py \
      --group1_rna_bams ./output/step1_calibration/control_rep1.бам ... \
      --group2_rna_bams ./output/step1_calibration/treated_rep1.bam ... \
      --final_vcf ./output/step2_variant_calling/project_demo.final.vcf \
      --геном /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /путь/к/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --known_editing /путь/к/rediportal.txt \
      --gene_anno /путь/к/refGene.txt \
      --output_dir ./output/step3_statistical_test \
      --метки Control Treated
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые параметры: samtools mpileup -q 30 (минимальное качество отображения), -Q 17 (минимальное базовое качество); тест на отношение вероятности rMATS-GLMM с срезом Δψ = 0,0001, биномиальной логит-связью с многомерным нормальным штрафом, учитывающим репликацию (rho = 0,9); Бенжамини-Хохберг, исправление ФДР; все они заранее настроены в скрипте конвейера
      Все три шага конвейера поддерживают многопоточное выполнение через флаг --threads (по умолчанию: 4 на шаг). Шаг 2 также принимает --contamination_threads (по умолчанию: 2).

4. Инспекция и визуализация результатов

  1. После завершения рабочего процесса CADRES перейдите в каталог вывода. Основной файл результатов, {prefix}_Result.txt, содержит список всех выявленных дифференциальных вариантов РНК (DVR), включая геномные координаты, аллели, количество аллелей на уровне реплики, редактируемые фракции, различия между группами и связанные статистические показатели (значение P и FDR). Также включены аннотации на уровне гена (символ гена, регион, цепь, тип варианта, известный статус SNP/редактирования). Сопутствующий сводный файл {prefix}_Result_summary.txt содержит подсчёты каждого типа подстановки и их классификацию на SNP-DVR, известные РНК-редактируемые DVR и новые DVR.
  2. (По желанию) Генерируйте стандартные визуализации, запустив скрипт постанализа. Откройте сессию R и войдите:
    R-консоль:
    источник ("Post-analysis.R")
    Сценарий Post-analysis.R включён в https://github.com/junsun-hash/CADRES/.
  3. Появится диалог выбора файла; выберите {префикс}_Result.txt. Сценарий выпускает шесть фигурок из Папуа-Новой Гвинеи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диалог выбора файла требует сессии R на рабочем столе. На безголовых серверах редактировать input_file переменную напрямую (строка 10 в Post-analysis.R) и запускать Rscript Post-analysis.R.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки CADRES в реалистичных экспериментальных условиях мы использовали индуцируемую систему APOBEC3B (A3B) в клетках 293T. В клетки 293T был введён лентивирусный конструкт, реагирующий на доксициклин, экспрессирующий A3B-GFP, и стабильные интегранты были отобраны с пуромицином. Индукция доксициклином в течение 72 часов обеспечила устойчивую экспрессию A3B-GFP, подтверждённую флуоресценцией GFP и повышенным уровнем мРНК A3B. Сопоставленные индуцированные и неиндуцированные образцы за...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рабочий процесс CADRES, представленный здесь, обеспечивает калиброванную, внутренне согласованную стратегию обнаружения дифференциальных событий редактирования РНК с высокой специфичностью, особенно деаминации C>U, катализируемой ферментами APOBEC. Несколько этапов протокола имеют решающее значение для его точности. Согласованное геномное и транскриптомическое секвенирование важно для различия подлинных изменений РНК от базовых полиморфизмов ДНК, а процедура перекалибровки буста защищает...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.S., Z.D. и C.Z. являются сотрудниками Шанхайского института биологических продуктов, организации, занимающейся коммерческой разработкой терапевтических биологических препаратов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано Комиссией по науке и технологиям Шанхая (23S11901100).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BCFtoolsSamtools projectN/AVersion 1.21. Variant calling and VCF manipulation. URL: https://github.com/samtools/bcftools
BedtoolsQuinlan LabN/AVersion 2.31.1. Genome arithmetic operations. URL: https://github.com/arq5x/bedtools2
BiopythonBiopython projectN/AVersion 1.85. Python tools for molecular biology. URL: https://www.biopython.org
BWA-MEMGitHub (lh3/bwa)N/AVersion 0.7.18. DNA-seq alignment. URL: https://github.com/lh3/bwa
CADRES source codeGitHub (junsun-hash/CADRES)N/AVersion 1.0.0. CADRES pipeline scripts. URL: https://github.com/junsun-hash/CADRES
Conda or MinicondaAnaconda Inc.N/AVersion 23.1. Package and environment manager. URL: https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
dbSNP GRCh38 VCFNCBIN/ABuild 155. Common germline variants database. URL: https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/
GATK4Broad InstituteN/AVersion 4.3.0.0. Genome Analysis Toolkit. URL: https://github.com/broadinstitute/gatk
GitSoftware Freedom ConservancyN/AVersion 2.39. Version control system. URL: https://git-scm.com
gnomAD GRCh38 VCFBroad InstituteN/AVersion 3.1. Population allele frequencies. URL: https://gnomad.broadinstitute.org
GTF annotation fileEnsemblN/ARelease 109. Gene annotation for GRCh38. URL: https://www.ensembl.org
Human reference genome GRCh38Ensembl/UCSCN/ARelease 109. Reference genome assembly. URL: https://www.ensembl.org or https://hgdownload.soe.ucsc.edu
Linux workstation or serverVariousN/AUbuntu 20.04. x86_64 architecture required. URL: https://ubuntu.com
pblatUCSC Genome BrowserN/AVersion 2.5.1. Parallel BLAT realignment. URL: https://github.com/ucscGenomeBrowser/kent
PicardBroad InstituteN/AVersion 2.20.8. NGS data manipulation. URL: https://github.com/broadinstitute/picard
PythonPython Software FoundationN/AVersion 3.9.19. Programming language. URL: https://www.python.org
RR FoundationN/AVersion 4.5.2. Statistical computing. URL: https://www.r-project.org
R package: forcatsCRANN/AVersion 1.0.0. Factor manipulation. URL: https://cran.r-project.org/package=forcats
R package: ggplot2CRANN/AVersion 4.0.1. Data visualization. URL: https://cran.r-project.org/package=ggplot2
R package: ggrepelCRANN/AVersion 0.9.5. Text label repulsion. URL: https://cran.r-project.org/package=ggrepel
R package: lme4CRANN/AVersion 1.1.35. Linear mixed-effects models. URL: https://cran.r-project.org/package=lme4
R package: readrCRANN/AVersion 2.1.5. Fast file reading. URL: https://cran.r-project.org/package=readr
R package: stringrCRANN/AVersion 1.6.0. String manipulation. URL: https://cran.r-project.org/package=stringr
REDIportal referenceUniversity of BolognaN/AVersion 2.0. A-to-I RNA editing sites database. URL: http://srv00.recas.ba.infn.it/atlas/
RefGene annotationUCSC Table BrowserN/ARelease 109. Gene structure annotation. URL: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables
SamtoolsSamtools projectN/AVersion 1.21. BAM file manipulation. URL: https://github.com/samtools/samtools
STAR alignerGitHub (alexdobin/STAR)N/AVersion 2.7.11b. RNA-seq alignment. URL: https://github.com/alexdobin/STAR

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

APOBECC to URNA Seq

Похожие статьи