Обзорная статья
Генная терапия с аденоассоциированными вирусами (AAV) требует хорошо охарактеризованных стандартных эталонных материалов (RSM) для обеспечения точных и воспроизводимых аналитических измерений внутри и между лабораториями. Этот обзор рассматривает критическую потребность в RSM, оценивает доступные коммерческие и фармакопейные стандарты и предлагает практические стратегии для внутренней разработки RSM с целью продвижения безопасных и эффективных терапевтических средств AAV.
Адено-ассоциированный вирус (AAV) стал ведущим вектором генной терапии in vivo, в настоящее время восемь продуктов имеют разрешение на маркетинг. По мере быстрого развития отрасли потребность в надёжных аналитических методах для характеристики критических атрибутов качества (CQA) — включая титр капсида, титр генома, содержание капсида (соотношение пустот/полный), идентичность и чистоту — продолжает расти. Эталонные стандартные материалы (RSM) играют ключевую роль, предоставляя хорошо охарактеризованные, стандартизированные партии AAV, которые служат универсальными ориентирами. RSM способствуют валидации новых аналитических технологий, обеспечивают точность и воспроизводимость рутинных анализов, а также обеспечивают межлабораторную сопоставимость. Однако разработка универсальных AAV RSM фундаментально ограничена сложной биологией, разнообразием серотипов, векторных геномов и инженерных вариантов капсидов, что требует стандартов, специфичных для серотипов и применения. Недавние достижения, включая выпуск фармакопеальных эталонных стандартов AAV8, характеризующихся множеством ортогональных методов, представляют собой значимый прогресс в гармонизации измерений. Этот обзор рассматривает критическую потребность в РСМ в генной терапии AAV, оценивает существующие фармакопейные и коммерческие стандарты и определяет практические стратегии внутренней разработки РСМ. Создание надёжных, серотип-специфичных ААВ-РСМ и гармонизированных стандартных операционных протоколов (СОП) необходимо для продвижения генной терапии AAV и обеспечения точности, воспроизводимости и безопасности в исследованиях, разработках и клиническом производстве.
Генная терапия предлагает трансформационную стратегию лечения генетических и приобретённых заболеваний, доставляя функциональный генетический материал в клетки пациента для коррекции или регулирования экспрессии генов. Среди них аденоассоциированные вирусы (AAV) выделяются применением in vivo благодаря разнообразному тропизму тканей в различных серотипах и устойчивой экспрессии эпизомальныхтрансгенов 1.
AAV — это компактные (диаметром ~25 нм) ДНК-вирусы рода Dependoparvovirus семейства Parvoviridae . Эти вирусы не являются патогенными и имеют дефекты репликации, поэтому длярепликации 2 требуются вспомогательные вирусы, такие как аденовирус или вирус простого герпеса. Геном AAV состоит из двух генов — rep и cap, окружённых двумя палиндромными повторами с 145 парами оснований, известных как инвертированные терминальные повторы (ITRs)3. Рекомбинантные векторы AAV (rAAV) создаются путём замены вирусных кодирующих последовательностей на терапевтические кассеты, содержащие промотор, трансген и регуляторные элементы, окружённые ITR. Во время производства гены rep и cap доставляются в транс, что облегчает репликацию и упаковку терапевтической кассеты в вирусные капсиды, а также образует неинтегрирующиеся частицы с дефицитом репликации, которые сохраняют устойчивую способность к трансдукции и предотвращают репликацию вирусов дикоготипа 4. Восемь генных терапий на базе rAAV получили разрешение на маркетинг либо от Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA), либо от Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), и количество клинических испытаний с AAV набирает популярность. По состоянию на январь 2025 года в мире зарегистрировано 343 клинических испытания AAV, что на 34% больше по сравнению с 255 исследованиями в середине 2022года. Это быстрое расширение клиники усиливает необходимость в строгом контроле качества для обеспечения безопасностипациентов 6.
Обеспечение безопасности и эффективности продуктов rAAV для использования человеком требует тщательной характеристики критически важных характеристик качества (CQA), включая количество, мощность, чистоту, идентичность, безопасность и стабильность. Однако характеристика AAV остаётся по своей сути сложной из-за структурных особенностей этих векторов. AAV — это икосаэдрические частицы, состоящие из трёх вирусных капсидных белков (VP1, VP2, VP3), собранных примерно в соотношении 1:1:10, и вариации в составе белка могут влиять на эффективностьтрансдукции 7. Терапевтическая ДНК-нагрузка должна быть упакована в капсид с высокой точностью; Гетерогенные популяции капсидов по своей природе формируются при производстве rAAV, состояя из капсидов с полным геномом (полные капсиды), частичным геномом (частично заполненные капсиды) или без генетического материала (пустые капсиды). Дополняет эту сложность различные серотипы AAV с отличительной эффективностью упаковки, тропизмами тканей и иммунологическими профилями, что требует разработки серотипического анализа. Помимо этих биологических проблем, существует критическая проблема в том, как проводятся измерения. Разные лаборатории используют разные анализы, протоколы и подходы к анализу данных для измерения одного и того же CQA. В результате сообщаемые значения для одинаковых образцов могут различаться на порядки междуучастками 8. Даже внутри одной лаборатории изменения со временем в реагентах, приборах, операторах или настройках анализа могут привести к изменениям результатов из той жепартии 9. Когда измерения несравнимы, установление надёжных связей между CQA и доклиническими или клиническими результатами становится сложно, что усложняет принятие регуляторныхрешений 10,11.
Стандартизация направлена на решение этой проблемы, обеспечивая сопоставимость измерений. В фармацевтической аналитике стандартизация включает два ключевых аспекта: использование общих физических эталонных стандартных материалов (RSM) и соблюдение гармонизированных подробных письменных стандартных операционных процедур (SOPs), что гарантирует, что разные лаборатории последовательно измеряют титр, идентичность, качество, эффективность ичистоту 12. RSM — это хорошо охарактеризованные образцы, которые служат эталоном. Проверяя анализы по одному и тому же RSM, лаборатории закрепляют свои измерения на общей точке отсчёта. Это снижает вариабельность между лабораториями и позволяет надёжно сравнивать результаты различных исследований, продуктов и производственныхплощадок 13. Кроме того, он служит внутренним органом контроля для мониторинга эффективности анализов и согласованности современем 14. SOPs дополнительно обеспечивают последовательное выполнение аналитических методов в лабораториях, минимизируя вариабельность, возникающую из-за различий в предварительной обработке образцов, инструментах, стратегии калибровки, обработке данных и практикеоператора 8,9,12. Вместе эти два компонента составляют основу надёжной аналитической стандартизационной системы.
Этот обзор систематически рассматривает ключевые аспекты стандартизации в аналитике AAV. Мы исследуем типы РСМ и их аналитические применения, оцениваем доступные в настоящее время специфические для AAV РСМ на их пригодность к назначению и предоставляем обобщённые практические рекомендации по внутреннему производству, очистке, характеристике и хранению РСМ. Мы дополнительно выявляем существующие производственные проблемы и аналитические ограничения. Понимая, что одних RSM недостаточно, мы также обсуждаем гармонизированные SOPs как дополняющий и не менее важный компонент стандартизации. Вместе этот обзор предназначен как практический справочник для аналитических учёных, специалистов по качеству и производителей, стремящихся продвинуть гармонизацию измерений и поддерживать научно обоснованное принятие нормативных решений в генной терапии AAV.
1. RSM: определения и потребность
РСМ организованы иерархически, с двумя основными типами: первичными и вторичными РСМ. Согласно ISO Guide 30, первичный стандарт определяется как «стандарт, который признан или широко признан обладающим наивысшими метрологическими качествами и чья ценность принимается без ссылки на другие стандарты того же объёма в определённом контексте». Например, RSM из Фармакопеи США (USP), Европейской фармакопеи (Ph. Eur), Британской фармакопеи (BP) и др., которые были широко охарактеризованы в ходе многолабораторных исследований, считаются первичными RSM. Отдельные производители впоследствии используют эти первичные RSM для калибровки и квалификации собственных рабочих эталонных материалов, которые служат вторичными RSM для рутинного тестирования качества12,15. Таким образом, ISO определяет вторичный RSM как «стандарт, значение которого присваивается в сравнении с первичным стандартом той же величины». Такой иерархический подход обеспечивает прослеживаемость: внутренние измерения восходят к первичным стандартам, которые, в свою очередь, характеризуются с помощью современных аналитическихметодов 16. Использование RSM предоставляет общие ориентиры, позволяющие производителям калибровать и валидировать свои аналитические методы по одной и той же точке отсчёта, что приводит к более точным измерениям. Регуляторные органы, соответственно, поощряют использование первичных RSM для калибровки внутренних RSM и валидации методов тестирования, что повышает согласованность во всём производствеAAV 17,18. Это позволяет стандартизировать различные аналитические методы, что приводит к лучшему сравнению результатов характеристик rAAV между лабораториями и различнымипродуктами 17,19. Улучшенная сравнимость углубляет понимание рисков безопасности, потенциально связанных с высокими дозами или примесиями, связанными с продуктом, такими как пустые и частично заполненные капсиды. В конечном итоге эти инсайты могут повлиять на формулировку научной нормативной политики, например, минимальный порог полного количества капсидов, аналогичный критерию ≥70% жизнеспособных клеток для соматических клеточных терапий, тем самым способствуя созданию более безопасных и надёжных продуктов генной терапии 13,20,21.
Для rAAV несколько CQA ясно иллюстрируют необходимость стандартизации. Титр векторного генома напрямую определяет дозу пациента; Неточные титры рискуют недозащитной или передозировкой. Количественное ПЦР (qPCR) и цифровое ПЦР (dPCR) широко используются для измерения титра, но результаты могут отличаться для одной и той же выборки, если используются разные стандартные калибры или протоколыкривой 11. Содержание капсидов (соотношение полных, частично заполненных и пустых капсидов) — ещё один критический CQA, так как пустые и частично заполненные капсиды могут способствовать иммуногенности или снижатьэффективность 6. Для измерения содержания капсидов используется более десяти различных методов, включая аналитическую ультрацентрифугировку (AUC), хроматографию с исключением размеров в сочетании с многоугольным световым рассеянием (SEC-MALS), масс-фотометрию (MP), масс-спектрометрию обнаружения заряда (CDMS), электронную микроскопию (EM), анионообменную (AEX) хроматографию, капиллярную изоэлектрическую фокусировку (cIEF), ультрафиолетово-видимую спектроскопию (UV/Vis) и др. Кроме того, содержание капсидов часто оценивается косвенно с помощью соотношения титра векторного генома к вирусному титру частиц, определяемого с помощью qPCR или dPCR и ELISA соответственно (PCR/ELISA)22. Каждая техника измеряет разные физические свойства и может сообщать разные значения содержания капсидов для одних и тех же образцов. Недавнее межлабораторное исследование NIST, сравнивающее UV/VIS, AUC, SEC-MALS и PCR/ELISA, показало значительную изменчивость между методами и между лабораториями, при этом PCR/ELISA показали особенно низкую воспроизводимость, а AUC — значительную дивергенцию между лабораториями, несмотря на широкое признание эталонногометода 8. Эти результаты показывают, что для снижения вариабельности аналитики AAV требуется как общие RSM, так и гармонизированные аналитические рабочие процессы, как обсуждается в разделе 5.
2. Ландшафт rAAV RSM
Попытки создать RSM для AAV привели к появлению двух источников, предоставляющих первичные AAV RSM. Среди фармакопейных источников USP в настоящее время является единственным поставщиком первичного AAV RSM. Помимо USP, основные AAV RSM также доступны из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Также доступен растущий ассортимент коммерческих вторичных RSM для нескольких серотипов, что отражает продолжающиеся усилия сообщества по устранению проблемы отсутствия стандартизации, присущей характеристике AAV. Таблица 1 обобщает доступные в настоящее время материалы AAV RSM и их ключевые характеристики.
3. Стратегии производства RSM:
Производство высокочистых AAV RSM представляет собой врождённые сложности. Достижение 100% пустых капсульных препаратов осложняется тем, что «пустые» капсиды могут содержать остаточный генетический материал. Аналогично, получение чистых препаратов полного капсида затруднено, поскольку пустые и частично заполненные капсиды имеют схожие физические характеристики и совместно очищаются с полными капсидами в процессахразделения 10. Несмотря на эти трудности, значительные достижения в производственных технологиях теперь позволяют обогащать преимущественно полные или преимущественно пустые популяции капсидов. В следующем разделе представлен всесторонний обзор современных технологий производства и разделения, а также методов характеристики и условий формулировки, которые могут использоваться для производства, характеристики и хранения AAV RSM.
4. Аналитическая характеристика: определение стандарта
После того как RSM был создан, очищен и сформулирован, проводится комплексная аналитическая характеристика. Этот этап обеспечивает качество RSM и его применимость в качестве эталона для различных аналитических методов. Использование ортогональных аналитических методов для оценки одних и тех же характеристик качества особенно важно для обеспечения устойчивости и поэтому настоятельно рекомендуется. Ключевые качества, специфичные для AAV RSM, можно разделить на три категории: титр, идентичность и чистота, как указано в Таблице 2.
5. Гармонизированные СОП как второй столп аналитической стандартизации AAV
Помимо доступности хорошо охарактеризованных RSM, значимая стандартизация в аналитике AAV также требует гармонизированных и достаточно детальных стандартных процедур. Даже при применении одного и того же аналитического метода результаты могут существенно различаться в разных лабораториях из-за различий в предварительной обработке образцов, настройках инструмента, стратегии калибровки, обработке данных и критериях интерпретации — факторах, которые, как показано, способствуют межлабораторной изменчивости независимо от самой аналитическойплатформы 8,9.
Это иллюстрируется совместным межлабораторным исследованием NIST, Национального института инноваций в производстве биофармацевтики (NIIMBL) и USP, в ходе которого шесть лабораторий оценивали одни и те же образцы AAV5 и AAV8 на содержание капсидов четырьмя методами. Оптические методы, включая SEC-MALS и UV/VIS, показали самое сильное межлабораторное согласование, тогда как PCR-ELISA показали низкую воспроизводимость и считались непригодными для количественного использования без дальнейшей гармонизации. Несмотря на широкое признание метода золотого стандарта, SV-AUC демонстрировал большую межлабораторную вариабельность, чем SEC-MALS, и последующие усилия по разработке стандартизированных процедур SV-AUC были определены как важный следующийшаг 8,81.
Похожий вывод был достигнут и для определения титра генома с помощью dPCR, где предварительная обработка образцов, стратегия экстракции, платформа прибора, условия разбавления, время лизиса капсидов и история заморозки-оттаивания могут влиять на представленные значения. Важно отметить, что более строгий процедурный контроль значительно снижает вариабельность, что ещё больше подчёркивает ценность гармонизированныхSOPs 9.
Поэтому RSM и SOPs следует рассматривать как дополняющие столпы аналитической стандартизации AAV. RSM обеспечивают якорь измерения, необходимый для прослеживаемости и калибровки, тогда как SOPs снижают процедурную вариабельность и помогают обеспечить последовательное воспроизведение назначенных значений в аналитиках, приборах и лабораториях.
rAAV-генная терапия развивается быстрее, чем способность отрасли стабильно определять качественные характеристики. Этот обзор показывает, что основным препятствием для сопоставимой характеристики AAV является не отсутствие аналитических инструментов, а отсутствие общих якорей измерений и гармонизированных рабочих процессов. РСМ решают эту проблему, преобразуя метод-зависимые измерения в прослеживаемые, сопоставимые значения. RSM позволяют валидировать методы, улучшать межлабораторную воспроизводимость и обеспечивать постоянный контроль для обнаружения дрейфа анализов. Однако производство высококачественных AAV RSM остаётся технически сложным из-за сложности получения чисто пустых и полных капсидных популяций, необходимости комплексной ортогональной характеристики и необходимости долгосрочной стабильности при определённых условиях хранения. Недавние достижения в производстве и технологиях очистки позволили производить преимущественно пустые и полные капсидные препараты, которые могут использоваться для создания собственных РСМ, а текущие предложения от фармакопейных организаций (USP), совместных консорциумов (ATCC) и коммерческих поставщиков представляют собой значимый прогресс. Однако разработка универсальных AAV RSM фундаментально ограничена разнообразием серотипов, векторных геномов и всё чаще инженерных вариантов капсидов. В отличие от моноклональных антител, гетерогенность AAV требует серотип-специфических и прикладно-специфичных RSM. Эта сложность дополнительно усиливается гибридными и/или инженерными капсидами, которые требуют от разработчиков поддерживать собственные внутренние первичные RSM, тем самым фрагментируя ландшафт измерений. Кроме того, другие атрибуты качества, такие как посттрансляционные модификации (PTM), были выделены как потенциальные CQA и не имеют хорошо охарактеризованных RSM для PTM, что создаёт критический разрыв в понимании этого векторного атрибута. Помимо доступности RSM, гармонизированные стандартные процедуры (SOP) не менее важны. Область выиграла бы от компендиальных методов — стандартизированных, подробных протоколов, опубликованных фармакопеевыми организациями — которые обеспечивают во всех лабораториях последовательное и контролируемое тестирование для AAV CQA. Письменные инструкции, описывающие лучшие практики для широко используемых методов, дополнительно сократят межлабораторные вариации и гармонизируют аналитические рабочие процессы. Создавая отслеживаемые RSM измерения AAV и внедряя последовательные, точные практики характеризации, сообщество может укрепить научную основу, связывающую CQA с безопасностью и эффективностью, поддерживать уверенное принятие регуляторных решений и, в конечном итоге, предоставлять пациентам более безопасные и надёжные генные терапии.
Таблица 1: В настоящее время доступные rAAV RSM и их характеристики
В этой таблице представлены доступные материалы эталонных стандартов rAAV и их ключевые характеристики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Рекомендуемый набор аналитических методов для внутренней характеристики RSM
В этой таблице представлены аналитические методы, рекомендованные для внутренней характеристики RSM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Авторы заявляют, что конфликты интересов не возникают
Этот проект получил финансирование от Рамочной программы исследований и инноваций Европейского союза, Horizon Europe, в рамках Грантового соглашения No 101119880. Этот проект был профинансирован субсидией «Устойчивость Фландрии» от правительства Фландрии, исходящей из «Европейского фонда восстановления и устойчивости» (RRF) (VV021/13).
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение