В данном исследовании путем сравнения результатов детекции 24 культур бактериальных суспензий Helicobacter pylori (H. pylori), полученных с помощью методов определения антигена и цифровой ПЦР, мы проанализировали их корреляцию, чтобы изучить их значимость для характеристики стандартных образцов H. pylori и диагностической оценки in vitro.
Исследовательская статья
Корреляция титра антигена H. pylori с количественным определением методом цифровой полимеразной цепной реакции: аналитическая оценка культивированных инактивированных изолятов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Стандартизация диагностики Helicobacter pylori (H. pylori) остается сложной задачей из-за неоднородности используемых методов детекции. Иммунохроматография позволяет обнаруживать специфические антигены H. pylori, но дает только качественные результаты и подвержена влиянию нецелевых растворимых бактериальных белков из-за неспецифического связывания или конкурентного ингибирования. Напротив, цифровая ПЦР (цПЦР) обеспечивает точный количественный анализ копий геномной ДНК, позволяя идентифицировать как жизнеспособные, так и нежизнеспособные бактерии. В данном исследовании сравнивались конечные титры, полученные методом иммунохроматографии (полуколичественные значения, рассчитанные как величина, обратная самому высокому определяемому двухкратному серийному разведению), с количеством копий нуклеиновых кислот, определенным с помощью цПЦР. Двадцать четыре суспензии бактерий H. pylori, культивируемые в течение 72 h при 37 °C на агаре Бруцеллы с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови в микроаэрофильных условиях (85% N2, 10% CO2, 5% O2), были подвергнуты параллельному тестированию на антигены и измерению методом цПЦР. Для статистической оценки применялись корреляция Пирсона и линейная регрессия. Была обнаружена значимая положительная корреляция между титром антигена и количеством копий генома (r = 0.536, n = 24, P = 0.007). Однако низкий коэффициент детерминации (R2 = 0.287) продемонстрировал ограниченную прогностическую способность, так как титр антигена объяснял лишь 29% дисперсии, измеренной с помощью цПЦР, и не может служить основой для надежного прогноза по одному образцу. Расхождения в профилях с высоким значением цПЦР и низким титром могут быть обусловлены наличием нежизнеспособных бактериальных фрагментов или свободной геномной ДНК. Анализы на основе антигенов и нуклеиновых кислот количественно определяют биологически связанные, но не взаимозаменяемые аналиты. Для разработки стандартных образцов и валидации диагностических тестов рекомендуется многопараметрическая характеристика, сочетающая определение колониеобразующих единиц, титров антигенов и количества копий генома. Данная работа подчеркивает необходимость разработки согласованных руководств по H. pylori для устранения диагностических расхождений.
Введение
Helicobacter pylori (H. pylori) представляет собой микроаэрофильную грамотрицательную бациллу, которая обычно колонизирует желудочно-кишечный тракт человека, особенно антральный отдел желудка. Она является основной причиной хронического гастрита, пептических язв и рака желудка1,2. Передача H. pylori между людьми происходит главным образом орально-оральным или фекально-оральным путями; бактерия распространена во всем мире, при этом показатели инфицирования варьируются в зависимости от региона. В развитых странах уровень инфицирования составляет примерно 50%, тогда как в некоторых развивающихся странах он может достигать 80%3. В 1994 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) классифицировала H. pylori как канцероген группы 1 для рака желудка4. Ключевые факторы вирулентности, такие как CagA (цитотоксин-ассоциированный антиген А) и VacA (вакуолизирующий цитотоксин А), вызывают хроническое воспаление и повреждение эпителия, что способствует реализации патогенных механизмов, лежащих в основе ее классификации как канцерогена группы 1. В 2018 году число случаев рака, обусловленных инфекцией H. pylori, достигло 810 000, что превысило суммарное количество случаев рака шейки матки и печени, вызванных вирусом папилломы человека (ВПЧ), вирусом гепатита B (ВГВ) и вирусом гепатита C (ВГС)5. Эта статистика подчеркивает значительный риск развития рака, создаваемый H. pylori, которая, при отсутствии лечения, может привести к раку желудка с вероятностью примерно 1%–3% согласно некоторым исследованиям. Высокая глобальная распространенность инфекции H. pylori делает точность количественного определения — а не просто факт обнаружения — приоритетной задачей общественного здравоохранения, так как точная оценка бактериальной нагрузки может помочь в принятии решений о лечении и позволить избежать излишней или неэффективной эрадикационной терапии. Таким образом, точное обнаружение и количественное определение H. pylori имеют большое значение для эпидемиологических исследований, выбора планов лечения и оценки терапевтической эффективности.
Учитывая значительную нагрузку онкологических заболеваний, обусловленную H. pylori, точное обнаружение и количественное определение этого патогена имеют решающее значение для эпидемиологического надзора, выбора тактики лечения и терапевтического мониторинга. Современные неинвазивные методы включают тест на антиген в кале (SAT), уреазный дыхательный тест и молекулярные анализы. Хотя цифровая ПЦР (дПЦР) обеспечивает высокую точность и абсолютный количественный анализ, ее клиническое применение ограничено более высокой стоимостью, технической сложностью и требованиями к оборудованию по сравнению с SAT. Именно эта разница обуславливает необходимость изучения корреляции между двумя методами с целью улучшения стандартизации SAT, используя дПЦР в качестве количественного эталона.
Цифровая ПЦР (цПЦР), развивающаяся технология абсолютного количественного определения, позволяет напрямую определять абсолютное число копий целевых генов без использования стандартной кривой. В исследованиях H. pylori цПЦР применялась для количественного определения бактерий в образцах слизистой оболочки желудка, слюны и фекалий6,7.
При разработке, оценке качества и регулировании диагностических реагентов in vitro подготовка и калибровка стандартных образцов имеют фундаментальное значение для обеспечения точности, сопоставимости и прослеживаемости результатов. Для бактериальных диагностических реагентов in vitro (например, реагентов для определения антигенов/антител к H. pylori) стандартные образцы часто должны содержать штаммы или клинические образцы с четко определенными концентрациями или единицами активности. Традиционным методом количественного определения бактерий является подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), который напрямую отражает количество жизнеспособных бактерий с пролиферативной способностью и часто используется для определения значений бактериальных стандартных веществ, оценки чувствительности реагентов и сравнения методик8. Несмотря на то, что метод КОЕ все еще широко применяется, он имеет очевидные ограничения с точки зрения времени анализа, расхода материалов и трудозатрат9.
С расширением применения технологий диагностики in vitro молекулярные методы, такие как dPCR, теперь позволяют определять количество патогенов с более высокой точностью и чувствительностью. Одновременно с этим в клинической практике все чаще применяются иммунологические методы, такие как титрование антигенов. Однако на практике большинство собранных клинических изолятов или подготовленных стандартных образцов представляют собой инактивированные или длительно хранимые пробы, что затрудняет или делает невозможным культивирование живых бактерий и подсчет КОЕ10. При подготовке референтных материалов, в целях соблюдения требований биобезопасности и обеспечения долгосрочной стабильности материалов, необходимо проводить инактивацию. Таким образом, количественные методы, основанные на анализе антигенов или нуклеиновых кислот, становятся основными средствами определения значений8,11.
Это поднимает практический вопрос относительно корреляции и эквивалентности этих двух различных количественных подходов: существует ли стабильная и измеримая взаимосвязь между результатами этих двух методов при использовании детекции антигена и dPCR для оценки стандартных веществ? Предварительные эксперименты с использованием ограниченного набора образцов инактивированных H. pylori продемонстрировали устойчивую положительную корреляцию между интенсивностью сигнала иммунохроматографического анализа и количеством копий ДНК, определенным с помощью dPCR. Мы выдвинули гипотезу о наличии значимой и устойчивой положительной корреляции между титром антигена H. pylori, измеренным с помощью иммунохроматографического анализа, и количеством копий ДНК, определенным с помощью dPCR, в образцах инактивированных бактерий. Наличие такой корреляции позволило бы преобразовывать качественные результаты, основанные на определении антигена, в количественные эквиваленты нуклеиновых кислот. Это создаст важную основу для оценки эффективности реагентов, разработки стандартов, назначения стандартных образцов и интерпретации результатов клинических тестов в случаях, когда традиционный посев невозможен.
В настоящее время исследования взаимосвязи между результатами определения антигена H. pylori и содержанием нуклеиновых кислот недостаточны, и наблюдается дефицит систематических данных для поддержки работ по обзору, регулированию и стандартизации. Для проверки этой гипотезы в данном исследовании было проведено параллельное тестирование 24 культур бактериальных суспензий H. pylori с целью систематического анализа корреляции между титром антигена, определенным коллоидным иммунохроматографическим методом, и результатом абсолютного количественного анализа dPCR. На основании полученных результатов мы представили рекомендации по оценке эффективности реагентов для детекции H. pylori и присвоению значений стандартным материалам.
Протокол
Все изоляты Helicobacter pylori, включенные в данное исследование, были первоначально выделены из биоптатов слизистой оболочки желудка и образцов кала человека в Пятой аффилированной больнице Чжэнчжоуского университета, которая предоставила полностью обработанные анонимизированные бактериальные суспензии для наших экспериментов in vitro. Все исходные процедуры (сбор клинических образцов, выделение бактерий и первичная криоконсервация) были одобрены Комитетом по этике Пятой аффилированной больницы Чжэнчжоуского университета (номер этического одобрения: KY2026080). До сбора образцов от всех участников было получено информированное согласие; все процедуры строго соответствовали Хельсинкской декларации и соответствующим национальным этическим рекомендациям по биомедицинским исследованиям. Вся информация, позволяющая идентифицировать пациентов, была окончательно удалена больницей-источником перед передачей образцов, и личность отдельного пациента не может быть установлена на основании экспериментальных материалов или результатов, представленных в данном исследовании.
Настоящее исследование не требует дополнительного независимого этического одобрения или информированного согласия. Все эксперименты включают только анализы in vitro с использованием анонимизированных бактериальных суспензий без доступа к исходным образцам человека, клиническим записям пациентов или частной личной информации. В соответствии с государственными правилами этики биомедицинских исследований, неинтервенционные исследования in vitro с использованием полностью анонимизированных микробных изолятов соответствуют критериям освобождения от этического контроля. Первоначальное этическое одобрение от Пятой аффилированной больницы Университета Чжэнчжоу уже охватывает все законные вторичные академические применения этих анонимизированных штаммов, что было официально подтверждено институциональным комитетом по этике.
Все эксперименты с H. pylori in vitro проводились в лабораториях с действующей сертификацией по биобезопасности (уровень биобезопасности 2, BSL-2, регистрационный номер лабораторной биобезопасности Комиссии по здравоохранению района Дунчэн города Пекина [2020] № 059) в соответствии с институциональными стандартными операционными процедурами и при соблюдении всех требований по проверке и авторизации биобезопасности. Разрешение по биобезопасности для данного исследования распространяется на все процедуры с использованием термоинактивированного материала H. pylori, включая работу с материалом, который не был полностью инактивирован (т. е. содержит остаточные жизнеспособные организмы, определенные с помощью ПЦР на жизнеспособность). На протяжении всего исследования строго соблюдались стандартные микробиологические правила, требования к средствам индивидуальной защиты (СИЗ) и процедуры дезактивации отходов. Все образцы бактерий были надлежащим образом инактивированы перед утилизацией в соответствии с институциональными рекомендациями по обращению с биоопасными отходами. Подробные сведения о всех реагентах, оборудовании и программном обеспечении, использованном для статистического анализа, приведены в Таблице материалов.
Штамм и культивирование
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: H. pylori является патогеном для человека 2-й группы риска. Все манипуляции с жизнеспособными культурами (инокуляция, инкубация и приготовление суспензии) должны проводиться в сертифицированном боксе биологической безопасности в условиях лаборатории уровня BSL-2 с использованием лабораторного халата, перчаток и средств защиты глаз.
Термическая инактивация при 56 °C в течение 25 мин значительно снижает, но не устраняет полностью жизнеспособные организмы (см. раздел 1); с частично инактивированными суспензиями следует продолжать работать в условиях BSL-2. Все биологические отходы и контаминированные расходные материалы перед утилизацией должны быть автоклавированы (121 °C, ≥30 мин) или продезинфицированы в соответствии с институциональными процедурами по биобезопасности. Описанные здесь работы уровня BSL-2 были санкционированы в рамках того же заявления о биобезопасности (регистрационный номер по биобезопасности лабораторий Комиссии по здравоохранению района Дунчэн города Пекина [2020] № 059).
The Helicobacter pylori Штаммами, использованными в данном исследовании, были 24 культивированные бактериальные суспензии, которые изначально были получены из биоптатов слизистой оболочки желудка и образцов кала человека в Пятой аффилированной больнице Чжэнчжоуского университета, а затем переданы в виде бактериальных суспензий в коллекцию штаммов In vitro Диагностический отдел инфекционных заболеваний Национального института по контролю за оборотом наркотиков (NIDC), Пекин, Китай; вся экспериментальная работа в данном исследовании проводилась в NIDC (Пекин, Китай). Эти штаммы высевали на чашки с питательной средой Бруцелла с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови и культивировали в микроаэрофильных условиях (85% N₂, 10% CO2₂, 5% O₂₂) при 37 °C в течение 72 ч. Данное время культивирования соответствует стационарной фазе роста, при которой экспрессия антигенов каждого штамма относительно стабильна. Затем собирали бактериальные суспензии.
Термическая инактивация проводилась с использованием цифровой водяной бани при 56 °C в течение 25 мин. Данная процедура была выполнена для соблюдения требований биобезопасности и обеспечения долгосрочной стабильности стандартных материалов. Термическая инактивация при 56 °C в течение 25 мин резко снижает жизнеспособность бактерий, но не устраняет полностью все жизнеспособные организмы, что было подтверждено последующим ПЦР-анализом на жизнеспособность, который показал медианную долю остаточных жизнеспособных клеток 4,6% (диапазон 0,00%–33,00%) для 24 культур бактериальных суспензий (см. раздел 6 «Результаты» и «Обсуждение»). Разрешение по биобезопасности для данного исследования распространяется на работу с материалом, который не подвергся полной инактивации (см. «Заявление об этике и биобезопасности»). Потенциальное влияние термической инактивации на определение антигенов считается минимальным, так как температура обработки ниже порога денатурации большинства поверхностных антигенов H. pylori; тем не менее, это может повлиять на целостность некоторых термолабильных белковых антигенов. При количественном определении ДНК термическая инактивация не приводит к деградации геномной ДНК и может фактически повысить эффективность экстракции за счет разрушения клеточных мембран.
Детекция антигена
24 собранных бактериальных суспензий развели в 100 раз с помощью PBS для подготовки образцов для определения антигена. Начальное разведение в 100 раз приводит концентрацию антигена в линейный диапазон детекции коммерческих наборов и минимизирует влияние матричного эффекта, обеспечивая тем самым надежные и точные результаты анализа. Такое разведение также позволяет сэкономить объем образца. Эти образцы протестировали с использованием восьми зарегистрированных наборов для определения антигена H. pylori (Таблица 1), включая методы с использованием коллоидного золота, латексный метод и иммунохроматографический метод. Если результат был положительным, разведенный образец подвергали серийному разведению (1:2, 1:4, 1:8 и т. д.) и тестировали до получения отрицательного результата. Наивысшее разведение, при котором результат оставался положительным, фиксировали и определяли как «конечный положительный коэффициент разведения антигена» (например, 1:64). Двукратные серийные разведения готовили в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS, 0.01 M, pH 7.2–7.4). После нанесения образца каждую полоску инкубировали при комнатной температуре в течение 15–20 мин перед считыванием; результат оценивали визуально обученным оператором по контрольной линии, а конечной точкой считали самое высокое разведение, при котором была видна тестовая линия. Поскольку полоски с коллоидным золотом считываются визуально, точка отсечки зависит от оператора.
Для каждого образца, протестированного с помощью нескольких коммерческих наборов для обнаружения антигена, конечный титр определяется как медиана всех индивидуальных титров, полученных с помощью данных наборов. Поскольку восемь наборов в этом исследовании были разработаны с использованием различных целевых антигенов и принципов детекции, коэффициент каппа Коэна или CV% не использовались для количественной оценки согласованности между наборами, так как эти показатели предполагают наличие общего эталонного стандарта. Таким образом, наблюдаемая вариабельность между наборами отражает истинную биологическую и аналитическую неоднородность, а не ошибки измерения. Медиана, как робастная мера центральной тенденции, может эффективно нивелировать отклонения, специфичные для конкретного набора. Для всех 24 образцов разброс между самым высоким и самым низким титрами среди наборов варьировался от 2-кратного до 16-кратного (медиана — 4-кратный): в шести образцах различие между наборами составило 2 раза, в четырнадцати — 4 раза, в трех — 8 раз и в одном — 16 раз. Минимальные, медианные и максимальные титры для каждого образца по каждому набору приведены в Дополнительной таблице 1.
Количественное определение методом цифровой ПЦР
Собранные 24 бактериальные суспензии подвергались 500-кратному разведению в PBS, после чего использовались в качестве образцов для количественного определения методом dPCR. Абсолютный количественный анализ этих разведенных образцов был проведен в четырех лабораториях dPCR (Таблица 2). dPCR выполняли с использованием запатентованных наборов праймеров и зондов, специфичных для каждой платформы и нацеленных на консервативные геномные последовательности H. pylori. Наборы для dPCR-детекции, использованные в данном исследовании, представляют собой универсальные наборы реагентов, применимые к нескольким патогенам и нескольким мишеням. Каждая платформа независимо разработала и оптимизировала специфические последовательности праймеров/зондов и целевые области генов, которые являются ее основной интеллектуальной собственностью. Эти последовательности не раскрывались конечным пользователям. Нам сообщили лишь, что специфической мишенью для детекции H. pylori является консервативный геномный регион, пригодность которого для специфического обнаружения была подтверждена. Последовательности гена 23S рРНК 24 штаммов Helicobacter pylori были представлены в NCBI GenBank под номером BioProject PRJNA1520048. Эти последовательности были представлены для подтверждения идентичности штаммов и не являются мишенью для количественного определения методом dPCR. Поскольку дизайн праймеров/зондов, химия амплификации и подсчет разделений на основе распределения Пуассона являются запатентованными технологиями каждой платформы, эти этапы зависят от платформы и не могут быть воспроизведены без доступа к ресурсам производителя; напротив, описанные выше процедуры разведения образцов, репликации экстракции и агрегации данных не зависят от платформы и полностью специфицированы. Абсолютные значения количества копий рассчитывали с помощью алгоритма распределения Пуассона, реализованного в запатентованном программном обеспечении для анализа прибора. Конкретные вычислительные параметры и исходный код являются собственностью производителя и не раскрывались конечным пользователям. Наконец, абсолютное количество копий (копий/mL) целевого гена в исходном растворе рассчитывали на основе распределения Пуассона и коэффициента разведения.
В данном исследовании приняли участие четыре независимые лаборатории dPCR (Sniper, Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd., Ustar Biotechnologies Ltd. и TargetingOne), каждая из которых использовала собственные наборы для экстракции и реагенты для dPCR, оптимизированные для соответствующей инструментальной платформы; все они были направлены на консервативные геномные последовательности H. pylori. Каждая платформа получила неразбавленную бактериальную суспензию и подготовила образцы согласно собственному протоколу: Ustar использовала неразбавленную суспензию напрямую, в то время как Sniper, Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. и TargetingOne разбавляли ее в 500 раз в PBS перед экстракцией. Для каждого изолята на каждой платформе было проведено два независимых выделения нуклеиновых кислот из одной и той же суспензии бактерий, разбавленной в 500 раз, и каждый экстракт тестировался в трех повторностях, что дало шесть измерений для каждого изолята на каждой платформе (за одним исключением для Ustar, где одно выделение дало только две валидные повторности). Реакция классифицировалась как невалидная и исключалась, если количество положительных капель оказалось ниже нижнего предела обнаружения прибора или если в контроле без матрицы наблюдалась неспецифическая амплификация; невалидные реакции повторяли один раз, и при сохранении ошибок всё выделение исключалось. Необработанные данные по каждой платформе представлены в Дополнительной таблице 1.
Агрегирование данных проводилось по двухэтапной процедуре: во-первых, все валидные необработанные измерения (copies/µL) в рамках каждой платформы усреднялись и пересчитывались в исходную концентрацию неразбавленной бактериальной суспензии (copies/mL) с использованием формул конверсии, специфичных для конкретной платформы; во-вторых, четыре полученные на разных платформах концентрации для каждого изолята усреднялись (арифметическое среднее) для получения итогового единого значения количества копий. Такая структура обеспечивает равный вклад каждой платформы независимо от вариабельности повторностей внутри платформы, одновременно снижая систематические погрешности, присущие отдельным приборам или системам реагентов.
Каждую культивируемую бактериальную суспензию количественно определяли параллельно на четырех платформах dPCR, и для каждого изолята рассчитывали коэффициент вариации (CV) логарифмически преобразованных (log₁₀) значений числа копий между платформами для оценки межлабораторной вариабельности. Соответствующие результаты представлены в разделе «Результаты».
Статистический анализ
Титр антигена H. pylori определяли как величину, обратную максимальному коэффициенту разведения образца, при котором наблюдался положительный результат (например, разведение 1:64 соответствует титру 64). Для каждого изолята восемь показателей титра антигена, полученных с помощью различных наборов, объединяли путем вычисления медианы, а четыре концентрации, полученные методом dPCR на разных платформах, — путем вычисления среднего арифметического, чтобы получить одно репрезентативное значение для каждого изолята для последующего корреляционного анализа. Эта стратегия сокращения данных методологически обоснована, поскольку: (i) восемь наборов для определения антигена обнаруживают один и тот же аналит с использованием сопоставимых принципов иммуноанализа, а медиана является робастной оценкой, устойчивой к спорадическим выбросам; (ii) каждая из четырех платформ dPCR количественно определяет консервативный геномный локус H. pylori, а среднее арифметическое оценок концентрации с логнормальным распределением дает несмещенную меру центральной тенденции; и (iii) такое объединение соответствует основной цели исследования — оценке согласованности между методами количественного определения на основе титра антигена и на основе ДНК на уровне изолята, а не оценке аналитических характеристик между наборами или платформами. Корреляция между титром антигена и количественным определением методом dPCR (copies/mL) сначала оценивалась с помощью корреляционного анализа Пирсона. Обе переменные после логарифмического преобразования имеют приблизительно нормальное распределение (коэффициент асимметрии: log10 dPCR = −0.66; log2 титра антигена = −0.60; асимметрия остатков регрессии = −0.16), что удовлетворяет допущениям для корреляции Пирсона. Титр антигена подвергали log2-преобразованию для линеаризации двукратного серийного разведения, в то время как результаты dPCR подвергали log10-преобразованию, что также соответствует формату отчетности для стандартов бактериальной нагрузки. Впоследствии для оценки линейной связи проводились корреляционный анализ Пирсона и линейный регрессионный анализ с использованием log2-преобразованного титра антигена и log10-преобразованных результатов dPCR. Для всех анализов применялся уровень значимости (α) 0,05, при этом P < 0,05 считалось статистически значимым. Все статистические анализы проводились с использованием онлайн-платформы статистического анализа SPSSPRO.
Результаты
Сравнение H. pylori титр антигена и результаты абсолютного количественного определения методом цифровой ПЦР
Из 24 выращенных бактериальных суспензий общий титр антигена варьировал от 8 до 256 с медианным значением 32 (Таблица 1). Результаты количественного определения методом dPCR варьировались от 2,67 × 107 копий/мл до 2,04 × 109 копий/мл, медиана log₁₀ = 8.61 (≈4.09 × 108 копий/мл) (Таблица 2). В исходных данных зависимость имела нелинейный характер, что указывало на степенную или экспоненциальную связь, что обосновывало последующее логарифмическое преобразование значений титра антигена и данных количественного определения с помощью dPCR.
Линейная связь между логарифмически преобразованным титром антигена и количественными результатами цифровой ПЦР
Чтобы проверить наличие значимой корреляции между результатами двух методов детекции, мы применили логарифмическое преобразование и провели анализ корреляции по Пирсону, поскольку обе переменные имеют приблизительно нормальное распределение после логарифмического преобразования. Как показано в Рисунок 1, после трансформации титр антигена (с логарифмом по основанию 2) и абсолютный количественный результат dPCR (с логарифмом по основанию 10) демонстрировали значимую умеренную положительную линейную корреляцию (r = 0,536, n = 24, P = 0.007).
Количественное моделирование взаимосвязи между титром антигена и количеством копий в цифровой ПЦР
Для количественной оценки взаимосвязи между двумя методами детекции и анализа потенциала их взаимного прогнозирования мы применили линейный регрессионный анализ к логарифмически преобразованным данным с целью использования регрессионной модели для прогнозирования бактериальной нагрузки по титру антигена в будущем. Анализ выявил линейную зависимость между величинами в логарифмическом масштабе2 (титр антигена) и логарифм10 (дПЦР), дающее уравнение: log10(дПЦР) = 0,1588 × логарифм2(титр) + 7,7988 (R2 = 0,287). Коэффициенты регрессии (со стандартными ошибками и 95% доверительными интервалами): наклон 0,1588 ± 0,053 (95% ДИ 0,048–0,270) и пересечение 7,7988 ± 0,292 (95% ДИ 7,193–8,404); стандартная ошибка остатка составила 0,318 логарифмических единиц10 единиц, и общая регрессия была значимой (F(1,22) = 8,84, P = 0,007). Это означает, что при каждом удвоении титра антигена количество копий в dPCR возрастает лишь в 1,441 раз (100.1588). Однако при заданном титре антигена 95% доверительный интервал результатов dPCR может охватывать почти два порядка величины (например, при титре 1:32 доверительный интервал составляет приблизительно 8,3 × 107 до 1,85 × 109копий/мл). Это указывает на то, что в практических приложениях титр антигена в отдельности не может точно предсказать количество копий нуклеиновой кислоты в одном образце, однако использование данной модели может обеспечить приблизительную оценку порядка величины при сравнении групп, хотя её применимость ограничена при прогнозировании для отдельных образцов из-за умеренной объясняющей способности (R2 = 0.287).
Межплатформенная изменчивость количественного определения с помощью dPCR и анализ чувствительности корреляции
Межлабораторную изменчивость оценивали по логарифму10- преобразованные концентрации с учетом логнормального распределения данных количественного определения микроорганизмов. Коэффициент вариации (%) по четырем платформам, полученным в результате логарифмирования10 концентрации варьировались от 0,9% до 8,3% (медиана 1,8%, среднее 2,5%) среди 24 изолятов. Один выброс (Hp06, CV = 8,3%) показал >30-кратное расхождение между Sniper (5,93 × 108 копий/мл) и TargetingOne (1,50 × 107 копий/мл); исключая этот изолят, коэффициенты вариации находились в диапазоне от 0,9% до 6,4%. Чтобы убедиться, что этот выброс не определял наблюдаемый антиген–корреляция dPCR, был проведен анализ чувствительности с исключением Hp06, который показал r = 0,479, R2 = 0,230, и P = 0,021 (n = 23) — сопоставимо с первичным анализом, включающим все 24 изолята — подтверждая, что указанная корреляция не зависит от этого изолята. Такая дисперсия отражает систематические различия между платформами по эффективности экстракции, чувствительности реагентов и калибровке приборов, а не случайные погрешности измерений, что обосновывает усреднение данных между платформами для снижения присущего каждой платформе смещения.
Определение и классификация результатов с использованием пороговых значений двух методов
На основании приведённого выше анализа и исследовательских, специфичных для набора данных критериев, в настоящем исследовании в качестве порогового значения для высокого уровня выявления антигена был установлен медианный титр детекции антигена 1:32, что обусловлено ненормальным распределением данных о титрах антигена, и выбрана фактическая медианная величина log₁₀(кПЦР) = 8,61 (≈4.09 × 108 копий/мл) в качестве порогового значения для высокого содержания нуклеиновых кислот. Эти пороговые значения являются предварительными, специфичными для набора данных, отсечками, полученными на основе данных о культивируемых изолятах, и не представляют собой валидированные клинические диагностические критерии. Следовательно, любое применение этих пороговых значений к другим наборам образцов или аналитическим контекстам потребует их повторного определения на основе соответствующих данных, а не прямого переноса.
Использование пороговых значений для скрининга (титр антигена ≥ в 1,32 раза выше, ≤ 1:16 как низкое значение; логарифм dPCR₁₀ ≥ 8,61 — высокая концентрация нуклеиновых кислот), четырёхсекторная классификация 24 культивированных бактериальных суспензий (Рисунок 2, Таблица 3) следующее: 9 образцов (Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25) относятся к группе с высокой антигенной активностью–категория с высоким содержанием нуклеиновых кислот (37,5 %); 3 образца (Hp09, Hp26, Hp27) отнесены к категории с низким содержанием антигена–высокое содержание нуклеиновой кислоты (12,5%); в 8 образцах (Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17) обнаружено высокое содержание антигена–низкое содержание нуклеиновой кислоты (33,3%); и 4 образца (Hp06, Hp07, Hp12, Hp20) относятся к низкому уровню антигена–категория с низким содержанием нуклеиновой кислоты (16,7%). Поскольку 24 изолята были разделены на шесть групп по титрам, в каждой из которых в среднем было лишь по 4 образца, формальное сравнение между группами (например, с применением теста Краскела-Уоллиса) было бы недостаточно статистически мощным; поэтому приводятся только описательные сводки количественных результатов dPCR по группам титров.
Остаточная жизнеспособная фракция после инактивации нагреванием (ПЦР жизнеспособности)
Для количественной оценки жизнеспособных бактерий, оставшихся после тепловой инактивации, для всех 24 изолятов использовали систему реагентов для ПЦР-анализа жизнеспособности. Вкратце, каждую суспензию, инактивированную нагреванием (200 мкл), µL) инкубировали с мембранонепроницаемым реагентом Viability PCR (10 µМ конечной концентрацией) при 37 °при 37 °C в течение 75 мин с параллельным контролем без добавления реагента (−VR) одинаково обработанных. Затем реагент был химически инактивирован путем добавления буфера нейтрализации для ПЦР-анализа жизнеспособности (20 µЛ, 10×) и инкубацией при комнатной температуре в течение 15 мин. Геномную ДНК выделяли из образцов +VR и −аликвоты VR, и ПЦР в режиме реального времени была проведена для каждого экстракта; жизнеспособная фракция была рассчитана как отношение +VR к −Копийный номер ВР × 100 %. Медианная величина жизнеспособной фракции составила 4,6 % (диапазон 0,00 %)–33,00 %; полные результаты по каждому изоляту в Дополнительная таблица 2). Процент жизнеспособных клеток не коррелировал значимо с титром антигена (r = 0,03, P = 0,90) или с количеством копий dPCR (r = 0,37, P = 0.08).
НАЛИЧИЕ ДАННЫХ:
Последовательности гена 23S рРНК 24 Helicobacter pylori штаммы были депонированы в NCBI GenBank под номером проекта PRJNA1520048. Эти последовательности использовались исключительно для подтверждения идентичности штаммов и не представляют собой цель количественного определения методом dPCR, которой является консервативный геномный участок, принадлежащий производителю и описанный в Протоколе.
Сырые данные о титрах антигена, специфичные для набора, полученные с использованием восьми коммерческих иммунохроматографических наборов с коллоидным золотом, и количественные значения цифрового ПЦР, специфичные для платформы, полученные на четырёх приборах цифровой ПЦР, не могут быть размещены в публичном репозитории из-за коммерческой конфиденциальности, соглашений о неразглашении с производителями и регуляторных ограничений, связанных с наличием знака СЕ/утверждением Национального управления по лекарственным средствам in vitro диагностические продукты
Дополнительные ограниченные данные могут быть предоставлены конфиденциально при необходимости и с учетом применимых ограничений, касающихся конфиденциальности и регулирования.
Рисунок 1: Корреляция между Helicobacter pylori титр антигена и количественное определение цифровой полимеразной цепной реакцией (dPCR) На диаграмме рассеяния с линией регрессии показана зависимость между титром антигена и количеством копий ДНК в 24 суспензиях культивируемых бактерий (n = 24). Титры антигена определяли с помощью иммунохроматографического анализа с коллоидным золотом с визуальной оценкой результата. Исследовали серийные разведения каждого образца, а титр выражали как наибольший коэффициент разведения, при котором получали положительный результат (указан на оси абсцисс как log2преобразованные, безразмерные значения). Количество копий ДНК было определено с помощью цифровой ПЦР (dPCR) и представлено на оси ординат в логарифмическом масштабе10- преобразованные концентрации (логарифм)10 копий/мл). Каждая точка соответствует отдельному образцу бактериальной суспензии. Сплошная синяя линия представляет линейную регрессионную модель. Заштрихованная область вокруг линии регрессии соответствует 95% доверительному интервалу для оценённого среднего отклика. Пунктирные вертикальная и горизонтальная линии обозначают пороговые значения для предварительной классификации (log₂ титр = 5, т.е. 1:32; log₁₀ dPCR = 8,61, т.е. 4,09 × 108 копий/мл), использованных на рисунке 2 и в таблице 3. Оценку корреляции проводили с использованием коэффициента корреляции Пирсона, который составил r = 0,536, P = 0,007, R2 = 0,287, что указывает на статистически значимую положительную корреляцию между двумя методами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Аналитическая классификационная модель для H. pylori тестирование комбинирования результатов антигенного теста с количественным определением методом dPCR На этом рисунке показана четырехквадрантная классификация 24 суспензий культивируемых бактерий (n = 24) на основе согласованности между титром антигена по иммунохроматографии и количественными результатами dPCR. Использованы пороговые значения, определённые эмпирически для конкретного набора данных (титр антигена ≥ в 1,32 раза выше ≤ 1:16 как низкое значение; логарифм dPCR₁₀ ≥ 8,61 как высокая концентрация нуклеиновой кислоты), образцы классифицируются как: высокий уровень антигена–высокое содержание нуклеиновой кислоты (n = 9, 37,5%), высокое содержание антигена–низкое содержание нуклеиновой кислоты (n = 8, 33,3%), низкий уровень антигена–высокое содержание нуклеиновой кислоты (n = 3, 12,5%) и низкое содержание антигена–низкое содержание нуклеиновой кислоты (n = 4, 16,7%). Эти пороговые значения являются предварительными отсечками, полученными на основе данных о выделенных культурах, и не представляют собой подтверждённые клинические диагностические критерии. Предложенная классификационная схема демонстрирует согласованность и несоответствия между иммунологическими и молекулярными методами детекции. Категории с расхождениями могут отражать такие факторы, как стабильность антигена, жизнеспособность бактерий или вариабельность копий ДНК. Данная схема предназначена исключительно для аналитического сопоставления и не является рекомендацией по клинической диагностике или лечению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Нет. | Реагент для детекции | Производитель |
| 1 | Набор для выявления антигена Helicobacter pylori (коллоидно-золотой метод) | Bioneovan Co., Ltd |
| 2 | Комплект для обнаружения антигена Helicobacter pylori (HP) в желудке (метод коллоидного золота) | Shanghai Chemtron BIOTECH Co., Ltd |
| 3 | Набор для обнаружения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | Цзянсу Моле Биосайенс Ко., Лтд |
| 4 | Набор для обнаружения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | Ханчжоу Дженисис Байодетектон & Биоконтроль Лтд |
| 5 | Набор для обнаружения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | ЦЗЯНСУ КОУИН БИОТЕК КО., ЛТД |
| 6 | Реагент для выявления антигена Helicobacter pylori (латексный метод) | ABON Biopharm (Hangzhou) Co. Ltd |
| 7 | Реагент для определения антигена Helicobacter pylori (HP) (иммунохроматографический метод) | GUANGZHOU WONDFO BIOTECH CO., LTD |
| 8 | Набор для обнаружения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | Beijing Core Technology Co., Ltd |
Таблица 1: Список Helicobacter pylori Реагенты для выявления антигенов и их производители. В таблице перечислены восемь коммерчески доступных иммунохроматографических тест-систем для выявления H. pylori антиген, которые оценивались в данном исследовании. Для каждого продукта указан номер (предоставленный производителем), коммерческое обозначение реагента для детекции и производитель'названия представлены. Эти наборы были выбраны на основании их широкого использования в клинической диагностике и тестировании на месте проведения. Вся информация была получена от производителей' вкладыши от производителей и официальные веб-сайты (дата обращения март 2026 г.). Включение этих реагентов не означает их одобрения; они являются примером разнообразия доступных тестов.
| Нет. | Модель прибора | Платформы цифровой ПЦР |
| 1 | DQ24 | Снайпер |
| 2 | Bio Rad QX200 Droplet Digital PCR | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd |
| 3 | DQ24 Pro | Ustar Biotechnologies (Hangzhou) Ltd |
| 4 | Система цифровой ПЦР TD-1 | TargetingOne |
Таблица 2: Список платформ цифровой ПЦР (dPCR) и моделей приборов. В данной таблице перечислены четыре лабораторные платформы, оснащённые системами цифровой ПЦР (dPCR), а также соответствующие модели приборов, использованных для тестирования. Эти платформы были выбраны с учётом их технологического разнообразия и репрезентативности современных реализаций dPCR. Вся информация предоставлена соответствующими платформами. Включение этих платформ не означает их официальной поддержки; они просто отражают спектр существующих систем dPCR.
| Тип | Количество случаев | Пропорция | Номер образца |
| Высокое содержание антигена — высокое содержание нуклеиновой кислоты | 9 | 37.5% | Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25 |
| Низкое содержание антигена — высокое содержание нуклеиновой кислоты | 3 | 12.5% | Hp09, Hp26, Hp27 |
| Низкое содержание антигена — низкое содержание нуклеиновой кислоты | 4 | 16.7% | Hp06, Hp07, Hp12, Hp20 |
| Высокий уровень антигена — низкий уровень нуклеиновой кислоты | 8 | 33.3% | Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17 |
Таблица 3: Классификация и доля результатов теста на антиген и теста на нуклеиновую кислоту в данном исследовании. В данной таблице 24 культивируемых бактериальных суспензии классифицированы в соответствии с согласованностью между титром антигена (определяемым иммунохроматографическим анализом, выраженным как наибольший коэффициент разведения, при котором результат остаётся положительным) и абсолютными количественными результатами цифровой полимеразной цепной реакции (dPCR) (выраженными в логарифмических единицах)₁₀ копий/мл). Используя пороговое значение титра антигена 1:32 (высокий ≥ 1:32, низкое ≤ 1:16) и пороговое значение количественного определения методом dPCR 4,09 × 108 копий/мл (логарифм)₁₀ = 8,61) в качестве пороговых значений для предварительного анализа, специфичных для набора данных, изоляты были разделены на четыре подгруппы: высокий уровень антигена — высокий уровень нуклеиновой кислоты, низкий уровень антигена–Высокое содержание нуклеиновой кислоты, высокий уровень антигена–низкий уровень нуклеиновой кислоты и низкий антиген — низкий уровень нуклеиновой кислоты. Среди 24 образцов 9 были отнесены к категории высокий антиген–Высокое содержание нуклеиновой кислоты (37,5 %; Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25), 3 как низкий антиген–Высокое содержание нуклеиновой кислоты (12,5 %; Hp09, Hp26, Hp27), 8 — высокое содержание антигена–Низкое содержание нуклеиновой кислоты (33,3 %; Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17) и 4 как низкий антиген–Низкое содержание нуклеиновой кислоты (16,7 %; Hp06, Hp07, Hp12, Hp20). В таблице для каждой категории указано количество случаев (n), доля относительно общего размера выборки (%) и номера образцов в каждой категории. Данная классификация демонстрирует согласованность и несоответствие между иммунологическими и молекулярными методами детекции; категории с расхождениями могут отражать такие факторы, как стабильность антигена, жизнеспособность бактерий или вариабельность числа копий ДНК, что позволяет глубже интерпретировать результаты аналитических тестов.
Дополнительная таблица 1: Сводный набор данных по обнаружению антигена и количественной оценке методом dPCR для 24 Helicobacter pylori изоляты Лист 1 (Обнаружение антигена): конечные титры на основе наборов из восьми коммерческих иммунохроматографических наборов с коллоидным золотом для каждого изолята, с минимальным, медианным и максимальным титром на образец, а также диапазоном кратности внутри образца. Лист 2 (Количественное определение методом цифровой ПЦР): концентрации дПЦР, специфичные для каждой платформы (копий/мл), для каждого изолята, с итоговыми статистическими данными между платформами (медиана, минимум, максимум и коэффициент вариации % в логарифмическом масштабе)₁₀трансформированные концентрации Лист 3 (Корреляционный и регрессионный анализ): лог-уровень штамма₂трансформированные титры антигена и логарифм₁₀преобразованные концентрации dPCR, результаты корреляции Пирсона и линейной регрессии (r, R2, уравнение регрессии), анализ чувствительности с исключением выброса Hp06 и подробная статистика регрессии (стандартные ошибки, 95 % доверительные интервалы, стандартная ошибка остатков, F-статистика и Pзначение). Идентификаторы, специфичные для набора и платформы, анонимизированы в целях коммерческой конфиденциальности; набор данных содержит все значения, необходимые для воспроизведения рисунка 1–2 и таблица 3.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 2: Результаты ПЦР на жизнеспособность для 24 Helicobacter pylori изоляты Копий на изолят по данным цифровой ПЦР с реагентом жизнеспособности–обработанный (+VR) и без реагента (−аликвоты VR после инактивации при нагревании при 56 °C °при 37 °C в течение 25 мин с расчетом жизнеспособной фракции (%) и эквивалентом ΔCq для каждого изолята. Медиана жизнеспособной фракции по всем изолятам составила 4,6 % (диапазон 0,00 %)–33.00%).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Обсуждение
В данном исследовании 24 культурных изолятов H. pylori иммунохроматографический титр антигена и число геномных копий, определенное методом dPCR, продемонстрировали умеренную, но значимую положительную корреляцию (r = 0.536, P = 0.007); однако титр антигена объяснял лишь 29% дисперсии числа копий dPCR (R2 = 0.287), следовательно, эти два показателя взаимосвязаны, но не взаимозаменяемы. Основным ограничением данного исследования является малый размер выборки (n = 24), что ограничивает статистическую мощность и объясняет поисковый характер используемых ниже пороговых значений классификации.
В данном исследовании был проведен количественный анализ титра антигена в культурах H. pylori и количества копий нуклеиновых кислот, определенного методом dPCR, что выявило умеренную, но значимую корреляцию между результатами детекции этими двумя методами (r = 0.536, P = 0.007). Несмотря на то, что на популяционном уровне наблюдается значимая корреляция между двумя методами, в клинической практике часто встречаются расхождения на индивидуальном уровне. Это связано с тем, что различные мишени детекции отражают разные биологические характеристики патогенов. В частности, тесты на антиген выявляют белки, которые могут сохраняться после элиминации бактерий, в то время как тесты на нуклеиновые кислоты обнаруживают ДНК, которая может присутствовать на низком уровне даже после уничтожения жизнеспособных бактерий. Подобное несоответствие хорошо задокументировано для различных инфекционных заболеваний. Например, при клинической диагностике инфекции Clostridioides difficile у некоторых носителей обнаруживаются положительные результаты при детекции гена токсина, но отрицательные — при детекции антигена белка токсина, что приводит к ошибочному диагнозу инфекции, избыточному лечению и возникновению лекарственной устойчивости. Поэтому Общество инфекционных болезней Америки (IDSA)12 в своих рекомендациях четко разграничило клиническую значимость «детекции токсина» и «детекции гена токсина» для Clostridioides difficile. Диагностики инфекции только с помощью тестирования на нуклеиновые кислоты недостаточно; рекомендуется использовать методы, позволяющие напрямую определять активный белок токсина. Кроме того, при внебольничной пневмонии после антибиотикотерапии бактериальная нагрузка ДНК в мокроте пациента быстро снижается, тогда как антиген в моче остается положительным после выздоровления и сохраняется от нескольких недель до нескольких месяцев13. Аналогичные явления наблюдаются при диагностике и лечении инфекции H. pylori. В 2022 году лаборатории Mayo Clinic установили, что у 223 пациентов в ходе последующего наблюдения после антибиотикотерапии метод PCR оказался относительно чувствительным в определении низкого уровня остаточной ДНК в образцах кала. У некоторых пациентов, несмотря на клиническое выздоровление и отрицательный результат теста на антиген, результаты PCR оставались положительными в течение нескольких недель14. Все это дополнительно подтверждает биологические различия между разными мишенями детекции.
В данном исследовании установление количественной корреляции и эквивалентности между титром антигена H. pylori, определяемым иммунохроматографическим методом, и значениями количественного анализа dPCR служит практическим руководством для характеристики референсных материалов H. pylori и оценки диагностических реагентов in vitro. 1) Совершенствование модели оценки характеристик продукта: в настоящее время при клинической оценке реагентов для определения антигена H. pylori применяется слепое синхронное сравнение с клиническими «золотыми стандартами», такими как гистология, культуральный метод или уреазный дыхательный тест15. В данной работе предлагается, чтобы регулирующие органы обязывали предприятия предоставлять в регистрационных документах соответствующие данные о корреляции между результатами их тестов и количественными методами анализа нуклеиновых кислот, а также четко определять характеристики продуктов в «диапазоне несоответствующих результатов», чтобы более реалистично отразить диагностическую способность продукта в сложных клинических сценариях и более полно определить LOD реагента. 2) Это открывает новый подход к присвоению значений бактериальным референсным материалам: референсные материалы для контроля качества и калибровки могут быть преобразованы из одного показателя «CFU» в «многомерные характеристические значения»8, включающие титр антигена и количество копий нуклеиновых кислот. Регрессионная модель, разработанная в этом исследовании, позволяет получить грубую оценку порядка величины взаимосвязи между этими двумя значениями, обеспечивая количественную основу для использования референсных материалов и проведения межлабораторных сравнений.
Мы рекомендуем производителям указывать не только предел обнаружения (LOD) в аналитических единицах (например, CFU/mL или титр антигена), но и его эквивалент в геномных копиях, определенных методом цифровой ПЦР (dPCR), чтобы результаты можно было сравнивать и сопоставлять между различными лабораториями и платформами. Такое представление данных в двух единицах измерения соответствует требованиям метрологической прослеживаемости ISO 175118 и принципам оценки способности к обнаружению согласно CLSI EP17-A216.
Потенциальные причины появления образцов с «низким содержанием антигена и высоким содержанием нуклеиновых кислот» заключаются в следующем: 1) Генетическая вариабельность штамма: если аминокислота в антигенном эпитопе заменена или если секреторный белок блокируется в процессе транспорта и секреции, может возникнуть феномен «ускользания» при определении антигена17. 2) Метод dPCR разработан для таргетирования и амплификации консервативных последовательностей генов. Специфический ген, на который нацелен dPCR в данном исследовании, не был раскрыт в документации производителя. Однако коммерческие наборы для определения антигенов могут быть нацелены на разные антигены H. pylori (например, VacA, уреазу, флагеллярные белки или цельноклеточные антигены), и любое несоответствие между целевым геном dPCR и антигеном, распознаваемым конкретным набором, может проявляться как количественное расхождение в четырех квадрантах диаграммы рассеяния — высокий dPCR/низкий антиген, низкий dPCR/высокий антиген, высокая конкордантность (высокий-высокий) или низкая конкордантность (низкий-низкий), а не как бинарные расхождения положительного/отрицательного результатов18. 3) Ограничения метода детекции: технология определения антигенов ограничена крайне низкими или крайне высокими концентрациями антигенов, что ослабляет сигнал из-за недостаточного сродства с антителами или перенасыщения, а также подвержена влиянию матрикса образца. 4) Асимметрия пределов обнаружения: нижний предел обнаружения (LOD) dPCR может достигать 10–100 copies/mL, в то время как предел обнаружения коллоидного иммунохроматографического метода для уреазы составляет примерно 104–105 CFU/mL. Когда количество бактерий находится на критическом уровне, склонно проявляться явление «низкого содержания антигена и высокого содержания нуклеиновых кислот». 5) Влияние статуса инфекции на клинические исходы существенно, особенно при дифференциации бактериальных инфекций от вирусных. В процессе инфекции число копий гена и уровень экспрессии антигена не имеют постоянной соответствующей зависимости. После успешного лечения уровни нуклеиновых кислот могут быстро снижаться, тогда как элиминация антигенов может быть задержана на некоторое время19.
Бактериальные суспензии, использованные в данном исследовании, были получены как из образцов биопсии слизистой желудка, так и из проб кала, что представляет собой различные матричные среды с разным профилем интерференции. Изоляты из биопсии желудка в значительной степени свободны от ингибиторов ПЦР, характерных для кала, но могут подвергаться воздействию остаточного пепсина в процессе обработки образцов. Напротив, пробы кала содержат ингибиторы ПЦР (например, желчные соли, сложные полисахариды, продукты распада гемоглобина), которые могут снизить эффективность амплификации и привести к занижению количественных показателей цПЦР, а также кишечные протеазы, которые могут разрушать целевые антигены даже при сохранении целостности бактериальной ДНК. Эти матрично-специфические эффекты действуют независимо от механизмов несовпадения в целевой области, описанных выше, и указывают на то, что при интерпретации количественных расхождений в клинических образцах протоколы подготовки и валидация метода должны соответствовать типу образца.
Для экспериментального количественного определения соотношения жизнеспособных и нежизнеспособных бактерий после тепловой инактивации для всех 24 культивированных изолятов была проведена ПЦР на жизнеспособность с использованием соответствующей системы реагентов. Данный реагент действует аналогично пропидиуммоноазиду (PMA): он селективно проникает в клетки с поврежденными мембранами и ковалентно модифицирует их геномную ДНК, блокируя последующую амплификацию. Процент жизнеспособных бактерий рассчитывали по формуле: % жизнеспособных = (копий ДНК/µL с применением реагента жизнеспособности (VR)) / (копий ДНК/µL без VR) × 100. Для всех изолятов медианная доля жизнеспособных клеток после тепловой инактивации составила 4,6% (диапазон: 0,00%–33,0%), что подтверждает, что наша процедура тепловой инактивации при 56 °C в течение 25 мин резко снижает жизнеспособность бактерий, но не приводит к полному уничтожению жизнеспособных организмов. Эти данные о жизнеспособности убедительно подтверждают наше заключение о том, что расходящиеся профили с высоким уровнем dPCR и низким титром антигена обусловлены прежде всего остаточной внеклеточной ДНК и ДНК внутри нежизнеспособных бактериальных частиц, а не целыми жизнеспособными H. pylori. Полные результаты количественного определения жизнеспособности для всех 24 штаммов обобщены в Дополнительной таблице 2.
В данном исследовании классификация по четырем квадрантам (основанная на исследовательских порогах, специфичных для данного набора данных) показала, что 8 образцов характеризовались высоким содержанием антигена при низком содержании нуклеиновой кислоты, 4 образца относились к категории с низким содержанием антигена и низким содержанием нуклеиновой кислоты, а также было выявлено 9 образцов в категории «высокий–высокий» и 3 в категории «низкий–высокий».
Данное исследование ограничено малым размером выборки (n = 24), что делает статистическую мощность недостаточной для проведения надежного анализа подгрупп. Выборка была разделена на шесть групп по титру, в каждой из которых в среднем находилось всего по 4 образца, поэтому формальные межгрупповые сравнения не обладают достаточной статистической мощностью для выявления значимых различий. Следовательно, тест Краскела-Уоллиса не применялся, чтобы избежать представления результатов инференциальной статистики при недостаточной мощности. Кроме того, все образцы представляли собой культуральные изоляты и не учитывали более сложные матричные эффекты, характерные для клинических образцов, таких как слизистая оболочка желудка, фекалии или слюна.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.
При написании, редактировании, статистическом анализе, разработке кода или подготовке иллюстраций к данной рукописи инструменты ИИ не использовались.
ВКЛАД АВТОРОВ:
Все авторы подтвердили свой соответствующий вклад в данную работу. Индивидуальные роли авторов перечислены ниже. Все авторы ознакомились с окончательным вариантом представленной рукописи, утвердили его и несут полную ответственность за точность и целостность данных исследования. Wenwen Sun: исследование, курирование данных, формальный анализ, методология, написание черновика, привлечение финансирования; Xiaona Han: исследование, методология; Jin Zhang: исследование, методология; Xinxin Duan: исследование, методология; Tingting Li: концептуализация, руководство; Manyu Li: концептуализация, руководство, написание — рецензирование и редактирование; Haiwei Zhou: концептуализация, руководство, написание — рецензирование и редактирование.
Благодарности
Данное исследование финансируется Фондом исследований в области развития молодежи Национальных институтов по контролю за оборотом наркотиков (NIDC) (грант № 2025C5).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2X dPCR Probe Master Mix Plus (Rox) | Sniper | RT021096A | Реагент для количественного определения методом цифровой ПЦР |
| Набор для экстракции бактериальной геномной ДНК | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd. | Y2213/DP302-02 | Экстракция бактериальных нуклеиновых кислот |
| Система капельной цифровой ПЦР Bio-Rad QX200 | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | QX200 | Количественное определение методом цифровой ПЦР |
| Интегрированная система цифровой ПЦР | Sniper | DQ24 | Количественное определение методом цифровой ПЦР |
| Интегрированная система цифровой ПЦР | Ustar Biotechnologies (Hangzhou) Ltd. | DQ24 | Количественное определение методом цифровой ПЦР |
| Цифровая водяная баня | Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Тепловая инактивация бактериальных суспензий при 56 °C |
| Прямой праймер | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | Амплификация нуклеиновых кислот методом цифровой ПЦР |
| Набор для определения антигена Helicobacter pylori в желудке (метод коллоидного золота) | Shanghai Chemtron Biotech Co., Ltd. | B202301020 | Определение антигена H. pylori |
| Агаровая среда для Helicobacter pylori (твердая) | Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd. | HB8647 | Культуральная среда для H. pylori |
| Набор для определения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | Bioneovan Co., Ltd. | 202403001 | Определение антигена H. pylori |
| Набор для определения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | Jiangsu Mole Bioscience Co., Ltd. | 20240310 | Определение антигена H. pylori |
| Набор для определения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | Hangzhou Genesis Biodetection & Biocontrol Ltd. | GG230601021 | Определение антигена H. pylori |
| Набор для определения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd. | 28223 | Определение антигена H. pylori |
| Набор для определения антигена Helicobacter pylori (метод коллоидного золота) | Beijing Core Technology Co., Ltd. | 2415810 | Определение антигена H. pylori |
| Реагент для определения антигена Helicobacter pylori (иммунохроматографический метод) | Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd. | W028402001 | Определение антигена H. pylori |
| Реагент для определения антигена Helicobacter pylori (латексный метод) | ABON Biopharm (Hangzhou) Co., Ltd. | 0000805308 | Определение антигена H. pylori |
| Трехгазовый инкубатор Heracell | Thermo Fisher Scientific | N/A | Микроаэрофильное культивирование; газовый состав: 5% O2, 10% CO2, 85% N2 |
| Микроцентрифужные пробирки (1.5 mL / 2 mL) | Axygen Scientific Inc. | MCT-150-C / MCT-200-C | Разведение образцов и экстракция нуклеиновых кислот |
| Реагенты для экстракции или очистки нуклеиновых кислот | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | SDK60105 | Экстракция бактериальных нуклеиновых кислот |
| Реагент для экстракции нуклеиновых кислот | TargetingOne | Pathogens TNA-B1 (11019) | Экстракция бактериальных нуклеиновых кислот |
| PBS, 1X (pH 7.2-7.4, 0.01 M, для культивирования клеток) | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1020 | Разведение образцов |
| Чашки Петри (90 mm) | Beekman Biotech | N/A | Стерильные культуральные чашки для изоляции и субкультивирования бактерий |
| Наконечники для пипеток (10 uL / 200 uL / 1000 uL) | Axygen Scientific Inc. | T-300 / T-200-Y / T-1000-B | Стерильные наконечники с фильтром для разведения образцов и дозирования реагентов |
| Зонд | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | Амплификация нуклеиновых кислот методом цифровой ПЦР |
| Обратный праймер | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | Амплификация нуклеиновых кислот методом цифровой ПЦР |
| Онлайн-платформа статистического анализа SPSSPRO | SPSSPRO | Веб-ресурс (https://www.spsspro.com/; доступ в августе 2026 г.) | Статистический анализ: корреляция Пирсона, линейная регрессия |
| Стерилизованная дефибринированная кровь овцы | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | TX0030-100 mL | Добавка для культуральных чашек с H. pylori |
| Система цифровой ПЦР TD-1 | TargetingOne | TD-1 | Количественное определение методом цифровой ПЦР |
| Система реагентов для ПЦР-определения жизнеспособности | Promega | A8881 | Оценка жизнеспособности теплоинактивированных H. pylori методом ПЦР |
| Вортексный миксер | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | Гомогенизация бактериальных суспензий |
Ссылки
- Ndip RN, et al. Helicobacter pylori isolates recovered from gastric biopsies of patients with gastro-duodenal pathologies in Cameroon: current status of antibiogram. Trop Med Int Health. 2008;13(6):848-54.
- Malfertheiner P, et al. Management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht VI/Florence consensus report. Gut. 2022;71(9):1724-62.
- Hooi JKY, et al. Global prevalence of Helicobacter pylori infection: systematic review and meta-analysis. Gastroenterology. 2017;153(2):420-9.
- International Agency for Research on Cancer. Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1994;61:1-241.
- de Martel C, et al. Global burden of cancer attributable to infections in 2018: a worldwide incidence analysis. Lancet Glob Health. 2020;8(2):e180-90.
- Wang YK, et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection: current options and developments. World J Gastroenterol. 2015;21(40):11221-35.
- Hindson BJ, et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 2011;83(22):8604-10.
- International Organization for Standardization. ISO 17511:2020, In vitro diagnostic medical devices—requirements for establishing metrological traceability of values assigned to calibrators, trueness control materials and human samples. International Organization for Standardization; Geneva; 2020.
- Morisset D, et al. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR. PLoS One. 2013;8(5):e62583.
- World Health Organization. WHO international standard for SARS-CoV-2 RNA, NIBSC code 20/146. World Health Organization; Geneva; 2020.
- Forootan A, et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomol Detect Quantif. 2017;12:1-6.
- Johnson S, et al. Clinical practice guideline by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA): 2021 focused update guidelines on management of Clostridioides difficile infection in adults. Clin Infect Dis. 2021;73(5):e1029-44.
- Hyams C, Williams OM, Williams P. Urinary antigen testing for pneumococcal pneumonia: is there evidence to make its use uncommon in clinical practice? ERJ Open Res. 2020;6(1):00223-2019.
- Marrero Rolon R, et al. Erratum for Marrero Rolon et al., “Clinical evaluation of a real-time PCR assay for simultaneous detection of Helicobacter pylori and genotypic markers of clarithromycin resistance directly from stool.” J Clin Microbiol. 2022;60(2):e0245221.
- China Food and Drug Administration. Technical review guidelines for registration of Helicobacter pylori antigen/antibody detection reagents. China Food and Drug Administration; Beijing; 2018.
- Clinical and Laboratory Standards Institute. EP17-A2, Evaluation of detection capability for clinical laboratory measurement procedures; approved guideline. 2nd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute; Wayne, PA; 2012.
- Yamaoka Y, Graham DY. Helicobacter pylori virulence and cancer pathogenesis. Future Oncol. 2014;10(8):1487-500.
- Leal YA, et al. Utility of stool sample-based tests for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2011;52(6):718-28.
- Devonshire AS, et al. The use of digital PCR to improve the application of quantitative molecular diagnostic methods for tuberculosis. BMC Infect Dis. 2016;16:366.