Стандартизированная подготовка изолированной гладкой мышцы двенадцатиперстного кролика для фармакологической оценки сокращательной активности in vitro

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол стандартизации приготовления изолированной гладкой мышцы кролика на двенадцатерую кишку для фармакологической оценки in vitro , используя горизонтальную систему экспериментов с гладкой мускулатурой при постоянной температуре для записи данных в реальном времени о сокращательной активности.

Аннотация

Координированная сокращательная активность гладкой мышцы желудочно-кишечного тракта формирует физиологическую основу для поддержания нормального пищеварения, всасывания и транспорта, при этом её дисфункция тесно связана с нарушениями подвижности. Метод перфузии изолированных органов устраняет сложные интерференции in vivo — такие как нейронные, эндокринные и гемодинамические факторы — и служат классической моделью для фармакологических исследований. В этом исследовании рассматривается поэтапный протокол стандартизированной подготовки изолированной двенадцатиперстной мышцы кролика. Процедурный процесс подчёркивает ключевые этапы приготовления растворов, эвтаназии кролика, проведения точной асептической лапаротомии средней части живота для быстрого удаления тканей, подвешивания гладкомышечных полос и калибровки преобразователей для фиксации напряжения в реальном времени. Основываясь на этой технической платформе, мы дополнительно проверили метод, оценив влияние пероральной жидкости Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL) на спонтанные сокращения и столбняковые сокращения, вызванные ацетилхолином/хлоридом бария. В заключение, этот протокол обеспечивает надёжную и высоковоспроизводимую методологическую основу, предоставляющую широко применимую платформу скрининга in vitro для фармакологической оценки терапевтических препаратов, нацеленных на моторику желудочно-кишечного тракта.

Введение

Координированная сокращательная активность гладкой мышцы желудочно-кишечного тракта служит физиологической основой для поддержания нормальных пищеварительных и транспортных функций¹. Её дисфункция тесно связана с различными распространёнными клиническими расстройствами, включая синдром раздражённого^{кишечника 2}, функциональную^{диспепсию 3} и послеоперационные нарушения моторики желудочно-кишечного^{тракта 4}. Выяснение молекулярных и фармакологических механизмов, регулирующих активность гладкой мышцы, имеет решающее значение для разработки новых прокинетических или антиспазматических методов терапии. В этой области классической моделью служит метод изолированной перфузии органов. Он приносит практическую ценность, устраняя сложные помехи in vivo, такие как нейронные, эндокринные и гемодинамические факторы, что позволяет напрямую и точно оценить влияние лекарств или активных веществ на гладкий^{мускулатурный тонус 5,6}.

Установление стабильных и надёжных протоколов для in vitro подготовки тканей и записи данных крайне важно для получения воспроизводимых и качественных результатов. Существующие экспериментальные методы мышц кишечника in vitro требуют дальнейшей оптимизации и стандартизации в нескольких областях: стандартизированное управление экспериментальными животными, тщательные хирургические методы извлечения тканей, последовательный контроль перфузионных систем в окружающей среде и автоматизированный сбор данных в сочетании со стандартизированным анализом. Например, температура и уровень pH перфузионной жидкости, механические повреждения во время забора тканей и настройки предварительной нагрузки ткани могут существенно повлиять на жизнеспособность тканей и привести к экспериментальным ошибкам. Эти факторы подрывают достоверность результатов и затрудняют сопоставимость в различных^{исследованиях 7,8}.

Поэтому данное исследование направлено на установление и разработку стандартизированного протокола по приготовлению изолированных образцов гладкой мышцы двенадцатиперстной кишки у кроликов и проведении записи напряжения в реальном времени. Этот протокол систематически описывает весь процесс — от экспериментальной этики и благополучия животных, асептической лапаротомии и точной изоляции кишечных сегментов до достижения контроля окружающей среды, стандартизированных настроек преднатяжения и высокоточного сбора данных с использованием интегрированной горизонтальной системы перфузии с постоянной температурой и многоканальной физиологической системы приёма сигналов. Основываясь на этой стандартизированной технической платформе, мы дополнительно применили методы кумулятивного дозирования для количественной оценки эффекта пероральной жидкости Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), соответствующей стандартам качества Китайской фармакопеи (издание 2025 года)⁹, на спонтанные сокращения и столбняковые сокращения, индуцированные хлоридом ацетилхолина и бария, в изолированной гладкой мышце двенадцатиперстной кишки. Пероральная жидкость Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), пероральная дозировочная форма классической формулы традиционной китайской медицины Huoxiang Zhengqi, широко используется в Китае при желудочно-кишечных расстройствах, что служит обоснованием для оценки её прямого воздействия на изолированную гладкую мышцу кишечника. Это исследование не только предоставляет прямые экспериментальные фармакологические доказательства, объясняющие регуляторное влияние HXZQ-OL на гладкую мышцу желудочно-кишечного тракта, но и служит стандартизированной, воспроизводимой методологической моделью для фармакологического скрининга и экстракорпоральных исследований гладкой мышцы желудочно-кишечного тракта.

Протокол

В этой работе использовались здоровые взрослые новозеландские белые кролики любого пола (весом 2,0–2,5 кг). Все экспериментальные процедуры на животных проводились в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по этике лабораторных животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (No одобрения: [2026070]). Были предприняты все усилия для минимизации страданий животных и сокращения количества используемых животных. Схема рабочих процессов показана на рисунке 1.

1. Подготовка раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Все рабочие растворы, включая раствор Тирода, ацетилхолин (ACh), хлорид бария, атропин и верапамил, должны быть приготовлены свежими непосредственно перед экспериментом.

1. Приготовьте 1 л раствора тирода, растворив 137 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl₂, 0,4 мМ₂PO₄, 1,0 мМ MgCl₂, 12 мМ NaHCO₃ и 5,6 мМ D-глюкозы. Перед использованием насыщайте смесью 95% O₂ / 5% CO₂ в течение 15–30 минут, регулировав pH до 7,3–7,4 (см. таблицу материалов).
2. Приготовьте раствор ACh объемом 1 мм. Возьмите 20 мкл и добавьте до 20 мл раствора Тирода. Тщательно перемешайте, чтобы получить раствор с концентрацией 1 мкм ACh.
3. Приготовьте настоящий раствор хлорида бария (BaCl₂) объемом 1 М. Возьмите 20 мкл и добавьте до 20 мл раствора Тирода. Тщательно перемешайте, чтобы получить раствор BaCl₂ объемом 1 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: BaCl₂ очень токсичен и раздражает. При обращении носите средства индивидуальной защиты в вытяжке и утилизируйте отходы в соответствии с нормативными требованиями.
4. Приготовьте 10 мМ раствор атропина сульфата. Возьмите 20 мкл и добавьте до 20 мл раствора Тирода. Тщательно перемешайте, чтобы получить раствор сульфата атропина с концентрацией 10 мкм.
5. Приготовьте запасной раствор верапамил гидрохлорида объемом 1 мм. Возьмите 2 мкл и добавьте до 20 мл раствора Тирода. Тщательно перемешайте, чтобы получить раствор верапамил гидрохлорида с размером 0,1 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации подготовленных растворов были определены на основе предыдущих^{исследований 6, 10, 11} и дополнительно оптимизированы в ходе наших предварительных экспериментов для обеспечения оптимальных экспериментальных условий.

2. Подготовка in vitro образцов гладко-мышечных образцов двенадцатиперстных кроликов

1. Эвтаназия кроликов
   1. Закрепите кролика в устройстве удержания кролика (рисунок 2A, B и рисунок 3A). Проводите эвтаназию путем передозировки пентобарбитала натрия (120 мг/кг) через ушную вену у кроликов (см. рисунок 2C и рисунок 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная смерть должна быть подтверждена следующими критериями: расширенные зрачки, отсутствие зрачкового светового рефлекса, прекращение дыхания и сердечного ритма, а также потеря плантарного рефлекса.
2. Подготовка и дезинфекция хирургического участка
   1. Закрепите кролика в положении лежа на операционном столе (см. рисунок 2D и рисунок 3C). Используя хирургические ножницы (рисунок 2E) или электробритву, тщательно удаляйте все волосы на животе, чтобы обнажить кожу в назначенной хирургической области (рисунок 3D).
   2. Используя губчатые щипцы (рисунок 2E), возьмите ватный шарик, пропитанный йодом (рисунок 2F,G). Начиная с центра планируемого хирургического разреза, наносите антисептический раствор в концентрическом круговом узоре изнутри наружу (рисунок 3E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зона дезинфекции должна выходить за пределы краёв разреза, чтобы обеспечить полное покрытие всей кожи хирургического поля. После дезинфекции подождите не менее 3 минут, чтобы антисептик естественно высох на поверхности кожи.
   3. Положите стерильную занавеску (рисунок 2H) на дезинфицированную область живота, чтобы открыть хирургическое поле (рисунок 3F).
3. Положение и разрез брюшной полости
   1. С помощью скальпеля (лезвие #23) (рисунок 2E) сделайте продольный разрез длиной 8 см вдоль средней линии брюшка от нижней ксифовидной отростка до верхней части лобкового симфиза.
   2. Вскрытие кожи и подкожной ткани слой за слоем. Следуя линии альба, рассеките переднюю оболочку прямой мышцы живота, мышечные волокна и брюшину слой за слоем, чтобы проникнуть в брюшную полость (рисунок 3G).
   3. ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры избегайте повреждения органов брюшной полости и обеспечьте гемостаз, чтобы предотвратить заражение крови хирургического поля и органов брюшной полот.
4. Двенадцатиперстное отделение
   1. Откройте брюшную полость вдоль разреза (рисунок 3H). Аккуратно втяните головную долю печени с помощью влажной солевой марли (рисунок 2I), чтобы полностью обнажить желудок и двенадцатиперстную кишку (рисунок 3I).
   2. Выберите начальный сегмент двенадцатиперстной кишки (бульбарная или верхняя нисходящая часть), расположенный в 2–3 см от пилора в качестве места сбора ткани.
   3. ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности избегайте прямого тяги или зажатия целевого сегмента кишечника, чтобы минимизировать механические повреждения. Вместо этого используйте тупые щипцы, чтобы аккуратно захватить соседнюю брыжейку, или использовать ватные палочки, увлажнённые физиологическим раствором, чтобы аккуратно манипулировать и расположить ткань.
   4. Используя стерильные офтальмологические ножницы (рисунок 2E), быстро и точно резецируйте сегмент двенадцатиперстной трубки диаметром 1–2 см (рисунок 2J) (рисунок 3J,K).
   5. Немедленно переместить вырезанный кишечный сегмент в посевную чашу (рисунок 2K), содержащую предварительно охлаждённый (4 °C) раствор тирода, постоянно пропитываемый смешанным газом (95% O₂ / 5% CO₂).
5. Обрезание, очистка и временное хранение кишечных сегментов
   1. С помощью офтальмологических щипцов (рисунок 2E) аккуратно вскрыть брыжейку и окружающую жировую ткань, прилипшую к стенке кишечника.
   2. Используя шприц, наполненный холодным раствором Тирода (с тупой иглой) (рисунок 2L), аккуратно вводите раствор клизмы в кишечную полость. Медленно промывайте внутреннюю часть кишечника 2–3 раза, чтобы полностью очистить содержимое.
   3. Поместите очищенные кишечные сегменты в свежий кислородный холодный раствор Tyrode для временного хранения до последующих экспериментов.

3. Запуск и инфузия раствора с горизонтальной гладкой мускулатурой с постоянной температурой

1. Добавьте решение Тайрода в предварительную чашу экспериментальной системы DSQG-1 Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment (рисунок 4B; см. таблицу материалов).
2. Включите питание системы, коснитесь панели управления, чтобы установить температуру ванны на 37 °C, и начните предварительный нагрев (рисунок 4C).
3. Нажмите кнопку «Инфузия », и система автоматически выведет 20 мл раствора Тирода в бак для ванны.
4. Нажмите кнопку дренажа , чтобы полностью слить жидкость в контейнер для сбора отходов.
5. Нажмите кнопку «Полоскание », и система автоматически завершит процесс сначала слива содержимого, а затем заполнения жидкостью.
6. Нажмите кнопку Stop , чтобы немедленно прекратить все текущие процессы инфузии, дренажа и промывания.
7. Нажмите кнопку «Надувать », чтобы непрерывно вводить смешанный газ (95% O₂ / 5% CO₂) в ванну. Скорректируйте скорость потока газа до масштаба 5 , чтобы обеспечить последующее экспериментальное оксигенирование тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шкала 5 показывает расход газа 100 мл/мин. Чрезмерно высокие расходы газа могут привести к увеличению турбулентности раствора, что влияет на стабильность записей натяжения.

4. Связывание многоканальной системы физиологической записи и обработки с программным управлением

1. Подключите кабель передачи данных системы экспериментальной системы горизонтальной постоянной температуры гладкой мускулатуры к каналу 1 многоканальной системы физиологической записи и обработки (рисунок 4D).
2. Включите внешний блок питания для многоканальной физиологической системы записи и обработки и запустите компьютер. Дважды кликните по значку RM6240XC Multi-Channel Physiological Recording and Processing System на рабочем столе, чтобы запустить экспериментальную программную систему (см. таблицу материалов).
3. В меню выберите Эксперимент | Пищеварение | Физиологические характеристики гладкой мышцы кишечника для нагрузки соответствующего экспериментального модуля.
4. Установите следующие параметры: режим канала на Tension, частоту дискретизации 400 Гц, чувствительность до 1,5 g, временную константу DC и частоту фильтра на 30 Гц.
5. Нажмите кнопку Start в правом верхнем углу программного интерфейса, чтобы начать получение и отображение сигналов в реальном времени. Нажмите кнопку «Запись », чтобы одновременно отобразить осциллограф и сохранить полученный сигнал на жёсткий диск в реальном времени.
6. В меню выберите Эксперимент | Быстрое принулирование для настройки сигнала натяжения до базового уровня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если сигнал отклоняется от базовой линии более чем на один вертикальный координатный блок, вручную отрегулируйте нулевой коэффициент натяжения с помощью отвёртки.
7. В меню выберите Эксперимент | Метод отображения данных в реальном времени | Плавающая тарелка. В появляющемся диалоговом окне выберите Normal Realtime Measurement-Fast, чтобыотобразить данные о напряжении кишечной мышцы в плавающем окне.

5. Настройка подвески и натяжения предварительного натяжения двенадцатиперстной мышечной полоски

1. Регулируйте расстояние между тканевыми крючками спереди и назад, поворачивая горизонтальную ручку винта в соответствии с длиной полоски двенадцатиперстной мышцы, чтобы она совпадала с длиной полоски.
2. Поддерживайте сегмент кишечника в его естественной цилиндрической конфигурации и выровняйте линию обзора с круглым поперечным отверстием просвета кишечника.
3. С помощью офтальмологических щипцов аккуратно втяните кишечное отверстие для поддержания проходимости.
4. Аккуратно введите кончик тканевого крючка в просвет кишечника.
5. На расстоянии 2–3 мм от края кишечника проколите верхнюю однослойную стенку кишечника изнутри наружу с помощью кончика крючка для ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевой крюк должен проникать в мышечный слой, чтобы обеспечить надёжное закрепление, избегая поверхностного прикрепления только к серозальному слою, чтобы предотвратить механическое разрезание и разрыв стенки кишечника крюком при применении предварительной нагрузки.
6. Другая сторона стенки кишечника идентична первой. После определения параллельной соответствующей точки проникайте только в однослойную стенку кишечника в этой точке (рисунок 3L).
7. Поверните горизонтальную ручку винта ещё раз, чтобы отрегулировать расстояние между крюками, чтобы полоса двенадцатиперстной мышцы оставалась естественно расслабленной.
8. Постепенно прикладывайте натяжение, регулируя одномерный тонкий регулятор, пока среднее напряжение полосы двеперственальной мышцы не стабилизируется на уровне 0,8 ± 0,1 г (рисунок 4A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально осмотрите всю длину кишечника, чтобы убедиться, что он остаётся прямым и цилиндрическим, без скручиваний, вращений или спиральных складок. Если это не так, немедленно уменьшите натяжение и отрегулируйте точку крепления на одном конце.
9. Перед началом эксперимента уравновесьте полоску двенадцатиперстной мышцы в камере перфузии на 60 минут. В этот период равновесия заменяйте раствор тироды свежим буфером каждые 15–20 минут, пока её спонтанный сокращающийся ритм не стабилизируется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 60-минутный период равновесия считался завершённым только тогда, когда изолированные кишечные сегменты демонстрировали стабильную спонтанную сократительную активность не менее 15 минут подряд. Объективные критерии стабилизации были определены количественно следующим образом: (1) базовый дрейф напряжения в состоянии покоя < ±5%, (2) дисперсия средней амплитуды сокращения < ±10% на последовательных 5-минутных интервалах, и (3) частотная флуктуация < ± 1 цикл/мин.
10. Запишите кривую активности спонтанной сокращения полоски двенадцатиперстной мышцы в качестве базовых эталонных данных для последующих экспериментов.

6. Экспериментальный сбор данных

1. Для текущих экспериментов в строке меню выберите Инструменты | Разделённый вид для проведения статистического анализа в реальном времени захваченных данных волн.
2. Для хранения файлов данных нажмите кнопку «Открыть » на панели инструментов, выберите сохранённый файл данных с расширением .lsd и загрузите исторические записи эксперимента.
3. Нажмите на иконку «Измерить » на панели инструментов, выберите режим «Регион ». Проведите курсор мыши по области формы волны, удержите левую кнопку мыши для выбора любых двух точек — и система отобразит панель данных, показывающую среднее значение натяжения внутри этого сегмента.
4. Нажмите на значок Измерения в панели инструментов, выберите режим Периода . С помощью левой кнопки мыши нажмите на пять последовательных различных пиков волн (пиковых точек) вдоль формы волны. Клик правой кнопкой мыши — и панель вычислит и отобразит частоту сокращения (в бит/мин) (дополнительный рисунок S1).

Результаты

Этот экспериментальный протокол описывает стандартизированный метод подготовки для изолированных полосок мышц двенадцатиперстной кролика и процесс записи их динамического напряжения и изменений частоты в реальном времени с помощью изолированной системы перфузии органов. Следуя этому протоколу, HXZQ-OL последовательно добавлялся с помощью кумулятивной дозировки в растворную ванну Tyrode объёмом 20 мл, достигая конечных концентраций в 10, 20, 30, 40 и 50 мкл/мл в ванне. Ссылаясь на стандарты Китайской фармакопеи (издание 2...

Обсуждение

Методы выделенной перфузии органов и фиксации напряжения представляют собой классические методы изучения физиологии гладкой мускулатуры и фармакологии. Их результаты имеют большое значение для выяснения патофизиологических механизмов, лежащих в основе нарушений моторики желудочно-кишечного тракта, сосудистых заболеваний и дисфункции^матки 12,13,14,15. Используя ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conical centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Acetylcholine chloride	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropine sulfate	Macklin	A822893
Barium chloride	Sigma-Aldrich	342920
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Freezing point osmometer	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Liquid	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Multi-Channel Physiological Recording and Processing System	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
New Zealand White rabbits	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (License No.: SCXK[Su]2022-0004)	either sex (weighing 2.0–2.5 kg)
pH meter	Shanghai Leici	PHS-25
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Povidone-iodine	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Precision balance (0.1 mg)	Sartorius	BCE64i
Saline solution	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium dihydrogen phosphate	Supelco	1063700250
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hydrochloride	Macklin	V820460
Vortex mixer	Kylin-Bell	XW-80A