Протокол дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в первичные клетки, похожие на герминогенные клетки

Краткое содержание

Пошаговое руководство по получению первичных клеток, похожих на зародышевые клетки, из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток надёжным образом с использованием двухмерного монослойного метода с наложением экстракта базальной мембраны.

Аннотация

Использование дифференцировки человеческих плюрипотентных стволовых клеток in vitro значительно расширило понимание событий спецификации линии, происходящих на раннем этапе развития in vivo — период, который чрезвычайно сложно исследовать. Одной из первых эмбриональных линий, определённых в человеческом эмбрионе, является линия зародышевых клеток, отмеченная индукцией первичных зародышевых клеток (PGC). ПГК являются единственной основательской популяцией гамет в более позднем возрасте, и их спецификация — критически важный первый шаг к плодородию организма. Здесь описывается надёжный протокол получения клеток, похожих на PGC (PGCLC) из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), начиная с первоначальной оценки плюрипотентного состояния и клеточных характеристик hiPSC для обеспечения эффективной дифференцировки PGCLC. Для этого обсуждаются эффекты различных плотностей клеток, покрытий пластин и hiPSC, используемых для дифференцировки PGCLC. Наконец, предоставляется рабочий процесс для характеристики и количественной оценки hPGCLC с использованием иммунофлуоресценции и потоковой цитометрии. Протокол дифференцировки ориентирован на состояния, которые легко выявить и проверить в большинстве лабораторий, и которые могут быть скорректированы по мере необходимости. Кроме того, этот протокол работает быстро, позволяя определить, подходят ли hiPSC для дифференцировки PGCLC. Цель протокола — способствовать согласованности и совместимости результатов hPGCLC на различных линиях и платформах культуры hiPSC, обеспечивая надёжные результаты, поддерживающие надёжную характеристику и дальнейшую оптимизацию последующих этапов дифференциации на пути к успешному in vitro гаметогенезу у человека.

Введение

Развитие зародышевой линии человека — это высокоскоординированный процесс, который начинается на ранних этапах эмбрионального развития и начинается с определения первичных зародышевых клеток (PGC), популяции, которая в конечном итоге даёт начало яйцеклеткам и сперматозоидам¹. In vivo спецификация PGC происходит вскоре после^{имплантации 2,3} в ответ на индуктивные сигналы от соседних^{клеток 4,5}. Развитие PGC было широко изучено у грызунов, особенно с помощью генетических исследований, которые показали участие сигнальных путей, таких как BMP, WNT и^TGFβ 6,7,8,9. После спецификации PGC проходят эпигенетическое перепрограммирование, характеризующееся деметилированием ДНК по всему геному и ремоделированием хроматина, чтобы впоследствии определить (специфичную по полу) идентичность зародышевой^линии 10,11,12,13,14.

У млекопитающих спецификация PGC определяется скоординированным перекрёстным взаимодействием между сигнальными путями, и некоторые аспекты эволюционно сохраняются у человека, нечеловеческих приматов, свиней и мышей, включая участие факторов плюрипотентности, таких как POU5F1 и NANOG 9,15,16,17,18 . Несмотря на общие черты, специфические для вида различия в механизмах дифференцировки PGC и регуляционных сетях генов ограничивают прямую трансляцию с животных моделей на человека 9,19,20,21.

Для понимания гаметогенеза у человека необходимы исследования с использованием человеческого материала, но они остаются сложными из-за ограниченного доступа к ранним человеческим эмбрионам. Постоянные достижения в протоколах, позволяющих in vitro дифференцировать человеческие первичные герминогенные клетки (hPGCLC) из человеческих плюрипотентных стволовых клеток, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC), снизили зависимость от человеческой гонадной ткани, а также позволили увеличить масштабирование и генетические^{исследования 18,22}. Большинство устоявшихся стратегий дифференцировки hPGCLC основаны на трёхмерных (3D) агрегатах или эмбриидных^{телах 18}. Используя эти платформы, несколько исследований показали, что hPGCLC воспроизводят ключевые эпигенетические особенности ранних человеческих PGC, включая зародышевые транскрипционные^{программы 23,24} и геномное перепрограммирование метилирования^{ДНК 25}. Вместе эти платформы in vitro обладают значительно продвинутыми знаниями по биологии PGC человека, включая связь с родословной и эпигенетическую перезагрузку. Однако протоколы дифференцировки hPGCLC на основе агрегации остаются сложными, поскольку они занимают много времени, а общий выход hPGCLC для надёжной эпигенетической характеристики, дальнейших дифференциационных тестов или использования в экспериментальных приложениях с высокой производительностью остаётся низким.

Недавно двухмерный монослойный метод без питания с использованием разбавленной базальной мембраны экстракта (BMEx) в сочетании с низкими уровнями BMP4 для дифференцировки hiPSC в hPGCLC оказался относительно простым для масштабирования в пластинах тканевой культуры и достиг высокой эффективности (~55%) за короткое окно дифференцировки (5 дней)²⁶. По сравнению с другими двумерными системами, требующими промежуточного этапа праймирования Activin A перед индукцией и использовавшими более высокие концентрации BMP4 (40–50 нг/мл^)27,28, этот подход BMEx не требовал этапа предварительной индукции и использовал более низкие уровни BMP4 (10 нг/мл), при этом сохраняя сопоставимую эффективность и улучшенную масштабируемость.

Здесь представлено подробное, пошаговое руководство по двумерному протоколу дифференцировки BMEx hPGCLC, начиная с первоначальной оценки поддержания hiPSC, включая плюрипотентность и клеточные характеристики, а затем тестирование влияния различных покрытий пластин hiPSC и плотности клеток на дифференциацию hPGCLC. Также описывается дальнейшая характеристика с помощью анализа потоковой цитометрии и иммунофлуоресценции. Предоставляются критические точки обработки и рекомендации по устранению неполадок для снижения отклонений в лаборатории, что позволяет исследователям регулярно воспроизводить дифференциацию hPGCLC в этом двумерном формате.

Протокол

Этот протокол соответствует руководящим принципам и нормативам Лейденского университетского медицинского центра (LUMC), Биобанка и биоматериалов LUMC (TCBio) и Центра LUMC Leiden hiPSC (по BB24.037). Все материалы и управляющие мужские (XY) линии hiPSC (M54 и M199), используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов. Все процедуры по культуре тканей проводились в специализированной комнате для биологической безопасности уровня 2, оснащённой увлажнённым нормоксичным инкубатором (37 °C, 5%_CO2), многофункциональной настольной центрифугой (ротор с поворотным ведром) и шкафом для биобезопасности класса II со стереомикроскопом.

ВНИМАНИЕ: Не все линии hiPSC могут различаться на hPGCLC^{26, 29}. Однако если для дифференцировки PGCLC используются другие hiPSC и наблюдаются PGCLC, описанный здесь метод (рисунок 1A) позволит масштабировать производство hPGCLC.

1. Покрытие пластин для культуры тканей для культуры hiPSC

Этот протокол описывает покрытие пластин для культуры тканей как разбавленной BMEx, так и витронектином.

1. Покрытие экстрактом базальной мембраны (BMEx)
   1. Разморозить аликвот BMEx на льду. Это может быть Geltrex, Cultrex или Matrigel.
   2. Разведите аликвот базального мембранного экстракта в холодном DMEM/F12 до конечной концентрации 1% (v/v) и аккуратно суспенгируйте.
   3. Покрыть желаемое количество скважин пластины с 6 лунками 1 мл разбавленной BMEx на каждую скважину.
   4. Инкубировать покрытую пластину не менее 30 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: покрытые пластины можно хранить при 2–8 °C до 1 недели. При использовании покрытых пластин при 2–8 °C инкубировать тарелку не менее 10 минут при 37 °C перед дальнейшим использованием.
2. Покрытие с витронектином
   1. Разморозить аликвот витронектина при комнатной температуре (RT) в течение 10–15 минут.
   2. Разведите витронектин до конечной концентрации 5 мкг/мл в DPBS без кальция и магния (DPBS -/-) и аккуратно суспенгируйте.
   3. Покрыть количество желаемых скважин пластины с 6 колодцями 1 мл разбавленной витронектина на каждую скважину.
   4. Инкубировать покрытую пластину с 6 лунками в течение 1 часа при RT.

2. Проход для обслуживания hiPSC

1. Приготовьте культурную среду: безсывороточную клеточную культурную среду mTeSR Plus, дополненную раствором для предотвращения загрязнения микоплазмой (MycoZap (1:1000)).
2. Аспирируйте культурную среду из клеток, готовых к прохождению.
3. Добавьте в каждую скважину 0,5 мл человеческого PSC селекции и проходящего агента (ReLeSR) и аспирируйте его в течение 1 минуты. Убедитесь, что на ячейках остался очень тонкий слой.
4. Инкубировать клетки в течение 6 минут при 37 °C.
5. Постучите по стенкам пластины с 6 лунками несколько раз.
6. Аккуратно отделяйте клетки с помощью культурной среды 1 мл, пипетируя пипеткой p1000, и регулярно проверяйте размер фрагментов колонии, чтобы поддерживать их размер в диапазоне 50–200 мкм.
7. Возьмите предварительно покрытые пластины с 6 колодцями и удалите раствор покрытия (шаг 1).
8. Добавьте в каждую колодцу по 2 мл культуры.
9. Перенесите культурную среду, содержащую отделённые фрагменты колонии hiPSC, в новую скважину в нужном пропорции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное соотношение для расщепления фрагментов колонии hiPSC составляет 1:6–1:50, что позволяет проводить проход каждые 4–7 дней.
10. Поместить клеточную культурную пластину вместе с фрагментами колонии проходящих hiPSC в увлажнённый нормоксический инкубатор (37 °C, 5%_CO2).
11. Обновляйте культурную среду через день с 2 мл, пока hiPSC не будут готовы к повторному проходу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 4 мл посевной среды вместо 2 мл в каждую 6-колодцу, чтобы избежать необходимости обновлять его в выходные.
    ВНИМАНИЕ: Не проходите хиПСК, когда слияние слишком низко, и выбрасывайте культуру, когда слияние слишком высокое, чтобы поддерживать здоровую культуру hiPSC и избежать спонтанной дифференцировки.

3. Дифференциация hPGCLC

1. Подготовка перед дифференциацией hPGCLC (День 0).
   1. Обновите культурную среду hiPSC за 1 час перед началом дифференциации hPGCLC.
   2. Подготовьте раствор покрытия: 1% раствора BMEx разведён в v/v в холодном DMEM/F12.
   3. Покрыть нужное количество скважин 12-луночной пластины раствором покрытия 0,5 мл.
   4. Инкубировать покрытую пластину не менее 30 минут при 37 °C перед началом дифференцировки.
   5. Подготовьте субстрат: 2% (v/v) раствор BMEx в холодной культуре и дополните его послеразмораживающим восстанавливательным материалом (RevitaCell) (1:100).
      ВНИМАНИЕ: Оставляйте среду на льду во время подготовки и накладки hiPSC.
2. Пластины hiPSC для дифференцировки hPGCLC (День 0).
   1. Удалите посевную среду из 6-колодца, содержащего hiPSC для дифференцировки hPGCLC. Начинайте с высококачественных hiPSC при слиянии 50–80%, без признаков спонтанной дифференцировки.
   2. Добавьте 1 мл раствора трипсина (TrypLE) на каждую скважину.
   3. Инкубировать hiPSC в течение 5 минут при 37 °C.
   4. Создайте суспензию с одной ячейкой, аккуратно подвешивая колонии hiPSC 2–3 раза пипеткой p1000.
   5. Проверьте под инвертированным микроскопом, получена ли суспензия с одной ячейкой. Если нет, подвесьте колонии hiPSC ещё 1–2 раза с помощью пипетки p1000.
   6. Перенесите подвеску ячейки hiPSC на трубку объёмом 15 мл.
   7. Добавьте 4 мл медиума DMEM-F12 к трубке объёмом 15 мл.
   8. Центрифугуйте подвеску ячейки hiPSC при давлении 200 x g на 5 минут.
   9. Аспирируйте супернатант и аккуратно ресуспензируйте клетки hiPSC в среде с объёмом 0,5–1,0 мл.
   10. Подсчитайте количество hiPSC с помощью клеточного счётчика или гемоцитометра и рассчитывайте количество hiPSC, необходимых в каждой яме для дифференцировки hPGCLC.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отправной точки можно использовать плотность покрытия 40–80K ячеек/^см² . Однако для каждой ячеточной линии и при каждом номере прохода рекомендуется оптимизация плотности покрытия для достижения оптимального выхода. Здесь hiPSC покрывались с плотностью пластины от 10K до 100K ячеек/^см².
   11. Аккуратно реуспензировать необходимое количество hiPSC в соответствующем объёме покрытия (1 мл на одну скважину 12-ямеченной пластины) и обеспечить однородную ячейку с помощью пипетки p1000.
   12. Возьмите покрытую пластину на 12 лунок из инкубатора и удалите раствор покрытия.
   13. Добавьте 1 мл ячейной суспензии в каждую скважину пластины с 12 лунками.
   14. Аккуратно встряхните пластину, чтобы клетки равномерно распределены в колодце.
   15. Поместите пластину с 12 лунками в увлажнённый нормоксический инкубатор (37 °C, 5%_CO2) на 16–24 часа.
3. Дифференциация hPGCLC (День 1–2)
   1. Приготовьте базальную среду RB27: продвинутую RPMI160 с B-27 (1:100), 1X аминокислотной замены (Glutamax), 1X незаменительные аминокислоты MEM и раствор для предотвращения загрязнения микоплазмой (1:1000).
   2. Приготовьте дифференцировочную среду: 2% (v/v) раствор BMEx в холодной базальной среде RB27 и добавьте BMP4 к конечной концентрации 10 нг/мл. Экстракт базальной мембраны необходим для индуцирования люменогенеза и запуска спецификации PGCLC in vivo.
      ВНИМАНИЕ: Дифференциационную среду держите на льду или при температуре 4 °C. Дифференциационные среды могут быть подготовлены для 1-го и 2-го дней протокола дифференцирования.
   3. В первый день (в течение 16–24 часов после нанесения HIPSC) возьмите пластину из инкубатора и уберите среду.
   4. Промывайте колодцы, добавляя по 0,5 мл базального материала RB27 на каждую скважину.
   5. Аспирируйте базальную среду RB27 и добавьте 1 мл дифференциационной среды на каждую скважину.
   6. Поместите пластину с клетками обратно в увлажнённый нормоксический инкубатор (37 °C, 5%_CO2).
   7. На второй день дифференцировки обновите клетки средой для дифференцировки по 1 мл на каждую скважину.
4. Дифференциация hPGCLC (Дни 3–5)
   1. Подготовьте среду для переключения: базальная среда RB27, дополненная BMP4 (10 нг/мл), LIF (10 нг/мл), SCF (50 нг/мл) и EGF (50 нг/мл). Коммутаторная среда отражает переход in vivo от спецификации hPGC к выживанию и пролиферации. BMEx опускается, потому что люменогенез больше не нужен.
   2. На третий и четвёртый день обновляйте каждую скважину средним запасом 1 мл.
   3. На пятый день дифференцировки hPGCLC можно охарактеризовать с помощью иммунофлуоресценции или проточной цитометрии.

4. Характеристика hPGCLC с помощью иммунофлуоресценции и потоковой цитометрии

1. Характеристика с помощью иммунофлуоресценции.
   1. Приготовьте раствор для проницаемости: 0,3% Triton X-100, разбавленный в PBS.
   2. Раствор для стирки: 0,05% Tween 20 in PBS (PBST)
   3. Приготовьте блокирующий раствор: 1% бычий сывороточный альбумин (BSA) в PBST.
   4. Удалите переключательную среду из скважин, используемых для дифференцировки hPGCLC.
   5. Промывайте клетки с 1 мл на одну скважину DPBS (-/-).
   6. Фиксируйте клетки с 1 мл на скважину 4% параформальдегид (PFA) в PBS в течение 15 минут при RT.
   7. Промой клетки три раза по 5 минут PBS, используя по 1 мл на каждую скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе пластины можно хранить при 4 °C перед началом иммунофлуоресценции.
   8. Пермеабилизуйте клетки раствором проницаемости в течение 15 минут при RT, используя 1 мл на каждую скважину.
   9. Промывайте клетки три раза по 5 минут раствором для стирки, используя 1 мл на каждую скважину.
   10. Блокируйте клетки с блокирующим раствором на 1 час при RT, используя 1 мл на одну скважину.
   11. Приготовьте первичный раствор антител: разбавьте первичные антитела, представляющие интерес для блокирования раствора.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались следующие две комбинации антител для маркеров PGC: козья анти-SOX17 и кролика анти-TFAP2C, а также козья анти-SOX17 и мышиная анти-POU5F1 (Таблица материалов).
   12. Удалите блокирующий раствор, добавьте 0,4 мл раствора первичных антител в каждую лунку и инкубируем на ночь при 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Важно включать отрицательные контроли для оценки связывания неспецифических антител. Для этого оставляйте его на ночь в блокирующем растворе, исключая первичные антитела, но затем хорошо окрашивайте его вторичным антителом.
   13. На следующий день удалите первичный раствор антител и промыйте клетки три раза в течение 5 минут с помощью PBST.
   14. Приготовьте вторичный раствор антител: разведите интересующие вторичные антитела (таблица материалов) и DAPI (1:500) в блокирующем растворе.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичный раствор антител чувствительный к свету и следует хранить в темноте.
   15. Удалите PBST и добавьте 0,4 мл вторичного раствора антител в каждую скважину в течение 1 часа при RT в темноте.
   16. Промой клетки три раза по 5 минут PBS, используя по 1 мл на каждую скважину.
   17. Сделайте визуализацию клеток (объектив 20x).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентные изображения были получены с помощью объектива 20x на микроскопе Airyscan, а изображения яркого поля — с помощью 4x и 10x объектива на микроскопе EVOS.
2. Характеристика с помощью потоковой цитометрии
   1. Подготовьте буфер FACS: 0,5% BSA в DPBS (-/-)
   2. Извлеките переключательную среду из скважин с помощью hPGCLC.
   3. Промывайте ячейки с 1 мл DPBS (-/-).
   4. Добавьте по 0,5 мл предварительно подогретой аккутазы на каждую скважину и инкубировать 15 минут при 37 °C. Для диссоциации предпочтительнее раствора трипсина, так как hPGCLC очень чувствительны к диссоциации.
   5. Создайте суспензию на одной ячейке, аккуратно подвешивая ячейки 2–3 раза с помощью p1000.
   6. Проверьте под инвертированным микроскопом, получена ли суспензия с одной ячейкой. Если нет, подвесьте ячейки ещё 1–2 раза пипеткой p1000.
   7. Фильтруйте суспензию ячейки через сито 40 мкм в трубку на 15 мл.
   8. Промой сито 40 мкм с буфером FACS на 5 мл.
   9. Центрифугуйте суспензию ячейки при 300 x g в течение 5 минут.
   10. Удалите супернатант.
   11. Суспензируйте клеточную гранулу в буфере FACS объемом 0,3 мл в трубке объемом 1,5 мл.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Считать клетки необязательно с помощью счётчика клеток или гемоцитометра. Если ячейки подсчитать, ожидайте около 1 миллиона клеток на одну скважину пластины с 12 лунами.
   12. Подготовьте адекватные контрольные образцы для проточной цитометрии (неокрашенные и однократные контроли). Для этого пересадите 15–30 мкл суспензии ячейки в трубки объёмом 1,5 мл и заполните до 100 мкл с помощью буфера FACS.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования было подготовлено 3 одиночных окраски: EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200) и 7AAD (1:200). Растворы, содержащие сопряжённые антитела и 7AAD, чувствительны к свету и следует хранить в темноте.
   13. Добавьте сопряжённые антитела, представляющие интерес, непосредственно в клеточную суспензию для достижения достаточного разбавления. Здесь вместе использовались следующие сопряжённые антитела к маркерам PGC: EPCAM-PEcy7 (1:200) и ITGA6-BV421 (1:200) (Таблица материалов).
   14. Инкубировать клетки с сопряжёнными антителами в течение 30 минут на льду в темноте.
   15. Добавьте 1 мл буфера FACS в образцы, неокрашенные контрольные и одно-антителы, и центрифугуйте при 300 х г в течение 5 минут.
   16. Удалите супернатант.
   17. Повторная суспензия образцов в 0,5 мл и контрольные образцы в 0,2 мл буфера FACS с содержанием 1 мМ EDTA. Это предотвращает слипание клеток.
   18. Добавьте образцы и контрольные вещества в 5-мл FACS пробирку с крышкой сита клетки, затем пропустите их через сито.
   19. Добавьте 7AAD непосредственно к каждому образцу за несколько минут до измерения в потоковом цитометре.
   20. Измеряйте образцы с помощью потокового цитометра. Здесь для измерения образцов использовался флуоресцентный клеточный анализатор, данные собирались с помощью программного обеспечения FACSDiva (v9.0), а программное обеспечение FlowJo (v10.10.0) — для анализа данных.
   21. Используйте контрольные образцы (неокрашенные и одноантителные контроли) для установки гейтинговой стратегии и, при необходимости, проведения компенсации.
   22. Перед тем, как положить образцы в машину, закрутите образцы.
   23. Извлеките популяцию ячеек из всех событий, сначала установив элемент на основе площади [прямая область рассеяния (FSC-A) и боковая область рассеяния (SSC-A)].
   24. Из этой популяции клеток извлекают отдельные клетки по размеру [ширина FSC (FSC-W) и FSC-высота (FSC-H)] и гранулярность [SSC-W и SSC-H].
   25. Исключить мёртвые клетки из дальнейшего анализа, установив элемент для 7AAD-отрицательных клеток.
   26. Используйте образец, чтобы проверить, правильно ли установлены ворота, и при необходимости отрегулировать их.
   27. Проанализируйте интересующие маркеры из этой популяции живых клеток. Здесь клетки, положительные на EPCAM, и на ITGA6, соответствовали hPGCLC.

Результаты

Качество и стабильное состояние hiPSC важны для дальнейшей дифференцировки
hiPSC поддерживались в пластинах с 6 лунками как минимум 3 прохода (в разных покрытиях) перед дифференциационными экспериментами и анализом. hiPSC проходили, когда клеточные колонии достигали слияния 70–80% (рисунок 1B), что также является оптимальным сосхожением hiPSC для инициации дифференцировки hPGCLC. Здоровые культуры hiPSC демонстрировали равномерную морфологию колонии без тёмных или дифференцированных участков, видимых на ярких полях (рисунок 1B). Однако качество hiPSC снижалось, когда клеточные колонии не поддерживались в оптимальном сосхождении или проявляли признаки дифференцировки (рисунок 1B). При низком слиянии hiPSC продолжал размножаться, и требовалось больше времени для формирования колоний до тех пор, пока слияние не стало пригодным для экспериментов по пассажированию или дифференцировке. При высокой совпадении hiPSC росли друг на друге, при этом появлялись дифференцированные области. Состояние плюрипотентности hiPSC было подтверждено экспрессией SOX2 или POU5F1, оба транскрипционных фактора, необходимых для поддержания плюрипотентности и самообновления в^{hiPSC 30}, и, что важнее всего, SOX2 не экспрессируется hPGCLC³¹. Для оценки организации цитоскелета и морфологии колоний использовалось окрашивание фаллоидина, что свидетельствует о качестве hiPSC. Обратите внимание, что различия в морфологии клеток связаны с восстановлением SOX2 или POU5F1 (рисунок 1B).

Влияние субстрата для поддержания hiPSC на дифференциацию hPGCLC
Чтобы оценить, влияет ли содержание hiPSC на различных подложках покрытия на дифференциацию по hPGCLC, hiPSC культивировали на различных субстратах (Geltrex, Matrigel, Cultrex и vitronectin) (Рисунок 2). На всех субстратах hiPSC демонстрировали устойчивые и однородные уровни ядерного SOX2 или POU5F1, что свидетельствует об их плюрипотентном состоянии. колонии hiPSC, содержащиеся на Geltrex, Matrigel и Cultrex, имели сопоставимую морфологию, включая чётко очерченные границы колоний и неправильную форму колоний в целом, по сравнению с круглыми колониями на витронектине (рисунок 2). hiPSC, достигшие 70–80% совпадевания, были покрыты плотностью 40K клеток/^см² и дифференцировались в hPGCLC на Geltrex²⁶. На пятый день яркие изображения показали характерные колонии hPGCLC во всех условиях (рисунок 3). Кроме того, во всех условиях были выявлены тройные положительные SOX17/TFAP2C/PDPN или двойной положительный SOX17/POUF51 hPGCLC (см. рисунок 3). Это свидетельствует о том, что протокол дифференцировки может использоваться с hiPSC, культивируемыми при различных условиях.

Влияние начальной плотности клеток hiPSC на дифференцировку hPGCLC
Важно проверить оптимальную плотность посева для оптимальной дифференцировки hPGCLC (на Geltrex), так как у разных hiPSC разные скорости размножения. Кроме того, если эффективность дифференцировки hPGCLC снижается из-за непрерывного прохода hiPSC, рекомендуется корректировать плотность посевной ячейки hiPSC. Для оценки влияния плотности ячеек посева на эффективность дифференцировки hPGCLC hiPSC были засеяны с разной плотностью — от 10K до 100K клеток/^см² (рисунок 4A). На пятый день процент hPGCLC оценивался с помощью потоковой цитометрии с использованием двух различных конъюгированных антител к человеческим PGC-маркерам — EPCAM и интегрина α6 (ITGA6)³². Анализ потоково-цитометрии следовал стандартной последовательной стратегии гейтинга, показанной для M199 hiPSC с засеянными 40K клеток/^см² (рисунок 4B). Кратко: общая популяция клеток (все события) была ограничена для исключения обходов (площадь частиц), затем отдельные клетки были выбраны по размеру (FSC) и гранулярности (SSC), и, наконец, мёртвые клетки были исключены на основе окрашивания 7AAD. Затем был установлен элемент для количественной оценки клеток, экспрессирующих EPCAM-cy7 и ITGA6-BV421, используя окрашенные и неокрашенные образцы (рисунок 4B).

Сравнение эффективности дифференцировки hPGCLC с использованием различных плотностей клеток посева и использования hiPSC, культивируемого на разных субстратах, выявило тенденцию, зависящую от плотности (рисунок 4C). При плотности посева 20–40K клеток/^см² hiPSC M54 и M199 показали наибольшую долю двойно-положительных hPGCLC EPCAM+/ITGA6+, достигнутых на основе hiPSC, поддерживаемых на Geltrex и Cultrex. Интересно, что более высокая плотность приводила к снижению эффективности дифференцировки. Результаты иммунофлуоресценции с использованием маркеров PGC SOX17/TFAP2C/PDPN или SOX17/POUF51 на hPGCLC подтвердили результаты потоковой цитометрии (см. рисунок 4D). Эти результаты показали, что для достижения оптимальной эффективности дифференцировки важно корректировать плотность посева под конкретные hiPSC. Сочетание иммунофлуоресценции и потоковой цитометрии повышает устойчивость дифференциационного анализа hPGCLC.

Рисунок 1: рабочий процесс дифференциации hPGCLC и качество hiPSC .(A) Схема рабочего процесса, использованного в этом исследовании. hiPSC поддерживались (в культурной среде) и достигали 60–80% слияния в день дифференцировки (день 0, D0). На D0 hiPSC диссоциировали на отдельные клетки и покрывались с нужной плотностью посева (в покрытии). На следующий день клетки обработали средой дифференцировки (D1–D3), затем переключательной средой (D3–D5). На D5 для иммунофлуоресценции или проточной цитометрии использовались hPGCLC. (B) изображения Brightfield (верхний ряд — 4-кратное увеличение); иммунофлуоресценция для SOX2, окрашивание фаллоидином и DAPI-окрашивание (средний ряд); а для POU5F1, PHALLOIDIN-окрашивание и DAPI-окрашивание (нижний ряд) показывают hiPSC с разной конфлюенцией. Масштабные планки = 50 мкм. Рисунки на рисунке 1A были созданы авторами с использованием базовых инструментов для рисования в Adobe Illustrator; платное программное обеспечение или инструменты не использовались. Поэтому лицензия на авторское право не требовалась. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Влияние различных подложок покрытия во время культуры hiPSC. Изображения Brightfield (верхний ряд); иммунофлуоресценция для SOX2, окрашивание фаллоидином и DAPI-окрашивание (средний ряд); а для POU5F1, окрашивание по фаллоидину и DAPI-окрашивание (нижний ряд) показывают культуры hiPSC на различных подложках покрытия. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Влияние различных покрытий во время культуры hiPSC на дифференциацию hPGCLC. Изображения яркого поля (увеличение верхнего ряда в 10 раз); иммунофлуоресценция для SOX17, TFAP2C, PDPN и DAPI-окрашивание (средний ряд); а также для дифференцировки hPGCLC по POU5F1, SOX17 и DAPI-окрашиванию (нижний ряд) hPGCLC (с использованием Geltrex) на пятый день, начиная с hiPSC, культивируемых на разных подложках покрытия. Жёлтая пунктирная линия выделяет регионы с hPGCLC. Масштабные планки = 25 мкм (верхний ряд) и 50 мкм (средний и нижний ряды). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Влияние плотности посева hiPSC на дифференциацию hPGCLC. (A) Яркие изображения на 1-й (D1) и D3-й день дифференцировки hPGCLC с использованием различных плотностей посева hiPSC (40K клеток/^см², 60K/см², 80K клеток/^см²). Масштабные планки = 250 мкм. Увеличение в 4 раза. (B) Репрезентативные графики потоковой цитометрии, показывающие стратегию гейтинга для количественной оценки процента EPCAM+/ITGA6+ hPGCLC. Для этого использовались M199 hiPSC (на Geltrex) с плотностью посева 40K ячейки/^см². (C) Столбочный график, показывающий процент EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLC при D5 при использовании hiPSC (M199 и M54), культивируемых на разных покрытиях и засеянных с разной плотностью. (D) Иммунофлуоресценция для SOX17, TFAP2C, PDPN и DAPI-окрашивание (левые панели); а также дифференциация SOX17, POU5F1 и DAPI-окрашивание (правые панели) на D5 hPGCLC с помощью hiPSC (M199 и M54, на Geltrex), засеянных на 40K и 80K ячейки/см². Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Гаметогенез in vitro представляет собой мощную экспериментальную платформу для изучения развития зародышевой линии у человека, репродуктивной токсичности и бесплодия в условиях контролируемых культур и на индивидуальной основе пациента. Хотя было зафиксировано множество протоколов для различия hPGCLC от^{hiPSC 18}, прогресс в этой области был замедлен ограниченным доступом стандартизированных, масштабируемых и воспроизводимых подходов в лабораториях. Недавние исследования описывают упрощённые и эффективные методы индукции hPGCLC, включая микропаттернированную дифференциацию^на основе BMP4, быструю двухмерную монослойную платформу, позволяющую генерировать hPGCLC в течение 3,5 дней²⁸, а также систему 3D-культуры, моделирующую развитие периимплантации и паракринную нишовую^{сигнализацию 33}. Хотя эти протоколы эффективно поддерживали дифференциацию hPGCLC, им всё же не хватает возможности служить высокопроизводительными платформами. Чтобы исследования на основе hPGCLC были широко применимы, особенно для репродуктивных токсикологических скринингов, протоколы должны быть надёжными, технически доступными и совместимыми с количественными анализами на следующих этапах. Здесь представлен пошаговый анализ протокола дифференцировки BMEx hPGCLC с акцентом на критические технические параметры, определяющие воспроизводимость и производительность.

Основным фактором успешной дифференцировки является начальное состояние плюрипотентности hiPSC. Количество проходов, состояние клеток, специфические к линиям характеристики и условия культуры до дифференцировки могут влиять на результаты дифференцировки hPGCLC. Изначально, во время обслуживания hiPSC, внимание уделяется субстрату покрытия, плотности ячеек посева и формату культивной пластины, которые вместе определяют архитектуру колонии и сигнальные среды на этапе дифференцировки hPGCLC. Настоящее исследование демонстрирует влияние использования hiPSC, культивируемых на различных покрытиях, и на разную плотность посева на дифференцировку hPGCLC (на Geltrex). Обе линии hiPSC, протестированные здесь, показали максимальную эффективность дифференцировки при плотности посева от 20 000 до 40 000 клеток/^см² . Это подчёркивает необходимость определения оптимальной плотности посева при введении новых клеточных линий, после длительной передачи или изменении экспериментальных схем или форматов культивационных пластин. Даже, казалось бы, незначительные изменения в соотношении площади поверхности к объёму или кинетике роста могут потребовать оптимизации для сохранения высокой эффективности дифференцировки. Соответственно, рекомендуется проводить маломасштабные пилотные эксперименты для определения оптимальных условий дифференцировки hPGCLC.

Несмотря на надёжность, у метода есть ограничения, которые следует учитывать. Хотя эффективность дифференцировки совместима с несколькими покрытиями и плотностями, она остаётся чувствительной к внутренним свойствам hiPSC, включая эпигенетическое состояние и историю прохождения, которые не поддаются полному контролю. Несколько протестированных hiPSC, похоже, не смогли отличиться от hPGCLC²⁶. Самое главное, в отличие от витронектина, который является полностью определённым продуктом, BMEx — это продукт животного происхождения, подверженный вариативности от партии к партии, что может влиять на воспроизводимость. Хотя различные партии Matrigel, Cultrex и Geltrex ранее были протестированы и дали стабильные^{результаты 26}, это остаётся проблемой, и следует рассмотреть полностью определённые альтернативы BMEx для обеспечения будущей воспроизводимости и переносимости. Здесь использовались две мужские (XY) линии hiPSC, но этот протокол был протестирован как с женскими (XX), так и с мужскими (XY)^{линиями 26}. Наконец, хотя протокол привёл к появлению hPGCLC, которые транскрипционно схожи с hPGC и обладают компетентностью для дальнейшего^{развития 26,34}, дальнейшее созревание на более поздних стадиях зародышевых клеток здесь не рассматривалось. Хотя масштабируемость была продемонстрирована для приложений в стиле скрининга, автоматизационная адаптация и межлабораторная валидация в более широком спектре линий hiPSC ещё больше усилят трансляционную полезность.

По сравнению с существующими стратегиями дифференцировки hPGCLC этот протокол обладает рядом преимуществ. В отличие от высокоспециализированных или матрично ограниченных подходов, он учитывает широко используемые субстраты для обслуживания hiPSC и форматы культивных пластин, тем самым снижая технические барьеры. Акцент на оптимизации плотности и контроле качества на ранних стадиях дополнительно повышает воспроизводимость, что является постоянной проблемой в области гаметогенеза in vitro .

Методологическая рамка, описанная здесь, особенно актуальна для репродуктивной токсикологии, моделирования бесплодия и биологии развития. Его совместимость с масштабируемыми форматами обеспечивает средне- и высокопроизводительный скрининг соединений, а воспроизводимость способствует сравнению кросс-исследований и совместным консорциумам. В более широком смысле, систематическая стандартизация протоколов индукции hPGCLC в лабораториях, сравнивая характеристики и функциональные конечные^{точки 18,35}, будет необходима для продвижения in vitro гаметогенеза в сторону предиктивных платформ, релевантных для человека.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Equipment for flow cytometry
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Dissolve in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Dilute to in cold DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Equipment for imaging
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Equipment for cell counting
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Dilute to in cold DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Dissolve to 8% PFA in water first; and dilute to 4% (1:1) with 0.2 M phosphate buffer
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stock concentration of 100 µg/mL in 4 mM HCL containing 0.1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Stock concentration of 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Stock concentration of 100 µg/mL in 0.1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Stock concentration of 100 µg/mL in PBS
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872
RevitaCell Supplement	Gibco	A26445-01