Эпигеномные нокаут-скрины на основе CRISPR-Cas9 на химиорезистентных клетках

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол создания химиорезистентных клеток с помощью метода повышения дозы, а затем проводится скрининг на основе CRISPR/Cas9 с использованием сфокусированной библиотеки sgRNA, направленной на эпигенетические модификаторы для выявления регуляторов приобретённой химиорезистентности. Протокол также предоставляет несколько точек оптимизации, адаптированных к моделям химиоустойчивых клеток, предоставляя надёжную основу для исследователей, изучающих механизмы резистентности.

Аннотация

Устойчивость к химиотерапии остаётся серьёзной проблемой в лечении рака, обусловленной способностью раковых клеток приобретать адаптивные свойства, перестраивать сигнальные пути и изменять структуру хроматина, чтобы избежать цитотоксичности, вызванной лекарствами. Поскольку эти процессы сильно зависят от эпигенетических механизмов, регулирующих организацию хроматина и транскрипционную пластичность, эпигенетические регуляторы стали ключевыми факторами устойчивости к химиотерапии. Для изучения устойчивости к паклитакселу, одному из самых широко используемых химиотерапевтических средств при тройной негативной раке молочной железы (TNBC), мы использовали эпигеномно-ориентированную библиотеку нокаута (EPIKOL), библиотеку на базе CRISPR-Cas9, предназначенную для систематического нарушения генов, участвующих в регуляции хроматина. Химиорезистентные клеточные линии были получены с помощью поэтапного протокола повышения дозы, который повторяет клинически значимую адаптацию лекарств. Однако эти устойчивые клетки демонстрируют фенотип мультилекарственной устойчивости (MDR), что создаёт значительные трудности для эффективной вирусной трансдукции и отбора стабильных популяций клеток. В этом исследовании мы описываем ключевые методологические шаги для достижения высокоэффективной лентивирусной трансдукции и отбора, что позволяет успешно применить скрининги EPIKOL CRISPR в химиорезистентных моделях TNBC. В соответствии с описанным протоколом был проведён эпигеномный CRISPR-скрининг на хеморезистентных клетках TNBC, и были выявлены новые эпигенетические регуляторы хеморезистентности. Этот протокол предоставляет надёжную основу для выявления эпигенетических регуляторов, способствующих приобретённой устойчивости к паклитакселу, с помощью подхода потери функции на основе CRISPR.

Введение

Тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) — это подтип рака молочной железы, который составляет 12–17% всех видов рака молочной^{железы 1}. Он характеризуется нарушенной экспрессией эстрогеновых рецепторов (ЭР), рецептора прогестерона (PR) и эпидермального фактора роста-2 человека (HER2), что сильно ограничивает доступность таргетной терапии и оставляет традиционную химиотерапию основным методом^{лечения 2}. Таксаны и антрациклины широко используются в лечении ТНБК; однако у пациентов обычно развивается^{резистентность 2,3}. Приобретение химиорезистентности — это сложный и многомерный процесс, включающий как генетические, метаболические, транскрипционные и эпигенетические^{адаптации 2,4}. Эпигенетические изменения стали центральными регуляторами клеточной пластичности, способствуя динамическому транскрипционному перепрограммированию, позволяющему раковым клеткам переносить токсичность, вызванную^{химиотерапией 5}.

Таксол (паклитаксел) относится к классу таксанов, вызывает гибель клеток за счёт нарушения динамики микротрубочек и функционирует как антимитотический^{агент 6}. Хотя пациенты с TNBC изначально реагируют на схемы химиотерапии, включая Таксол, резистентность обычно развивается со^{временем 2.} Приобретённая резистентность к таксолу часто связана с гиперэкспрессией транспортеров кассет, связывающих АТФ, в частности ABCB1 (MDR1, P-гликопротеин), которые опосредуют выброс препарата Таксола, что приводит к снижению внутриклеточной токсичности^{препаратов 7}. Поскольку широкий спектр химиотерапевтических препаратов является субстратом этих ABC-транспортеров, их апрегуляция ограничивает использование других химиотерапевтических препаратов, вызывая фенотип мультилекарственной резистентности (MDR)⁸. Ингибирование ABC-транспортеров оказалось в значительной степени неэффективным как стратегия преодоления многолекарственной резистентности в клинических условиях, главным образом из-за их повсеместной экспрессии и важной роли в транспортировке широкого спектра эндогенных и экзогенных^{субстратов 9}. Хотя верапамил, ингибитор ABCB1 первого поколения, продемонстрировал ограниченную или отсутствующую клиническую пользу и был связан с значительной токсичностью в клинических^{испытаниях 10}, он остаётся ценным экспериментальным инструментом для повышения эффективности отбора в in vitro моделях MDR.

Фенотип MDR — это динамический и адаптивный процесс, который в основном проявляется в условиях^{стресса 2}. Экспрессия ABC-транспортеров преимущественно контролируется транскрипционными и эпигенетическими регуляторными механизмами, а не мутационными^{событиями 5,11}. Ограничение прямого нацеливания на ABC-транспортеры подчёркивает необходимость выявления верхних регуляторов этих белков как уязвимости, специфичной для устойчивых клеток. Таким образом, систематический анализ эпигенетических факторов стал важной стратегией для выявления новых регуляторов устойчивости к химиотерапии и разработки комбинированных терапий, направленных на эти уязвимости.

Функциональные нокаут-скрины на основе CRISPR-Cas9 позволяют беспристрастные, систематические геномные нарушения для изучения эффектов потери генов при раке на^{масштабе генома 12}. Однако геномные библиотеки CRISPR предлагают ограниченное представление одной направляющей РНК (sgRNA) на каждый ген, что снижает чувствительность по сравнению с фокусированными^{библиотеками 13}. Важно, что надёжный экран зависит не только от качества возмущений, но и от подходящей модели и оптимизированного экспериментального протокола. В этом контексте изучение динамического и сложного процесса, такого как резистентность к лекарствам, может выиграть от специализированной библиотеки с индивидуальным^{протоколом 13}. В предыдущей работе мы создали библиотеку нокаутирования CRISPR-Cas9, ориентированную на эпигеном, для нацеливания на регуляторы^{хроматина 14}. По сравнению с другими публично доступными эпигеном-ориентированными библиотеками CRISPR, эпигенетическая библиотека нокаута (EPIKOL) содержит 779 генов, состоящих из хроматиновых считывателей, авторов, ластиков и связанных с ними белков, каждый из которых нацелен на 10 sgRNA, что позволяет увеличивать глубину на ген и повышать устойчивость и воспроизводимость хроматино-ориентированных функциональных^{скринингов 14}. EPIKOL доступен как в системе LentiGuide, где Cas9 экспрессируется из другого вектора, так и в системе LentiCRISPR, включающей Cas9, обеспечивающую гибкость в зависимости от клеточной линии. Достижение достаточного охвату библиотек, определяемого как среднее количество клеток на sgRNA (например, 500×–1000×), проще для EPIKOL по сравнению с библиотеками, охватывающими весь геном, что даёт преимущество при изучении медленнорастущих химиоустойчивых клеточных линий.

Хотя скрининг CRISPR предлагает мощный подход к изучению механизмов химорезистентности, стандартные объединённые процессы скрининга не оптимизированы для химиорезистентных клеток с активным вытоком лекарств. Пуромицин, широко используемый селективный антибиотик в лентивирусных системах CRISPR, может выкачиваться из устойчивых клеток с помощью ABC-транспортеров, главным образом ABCB1, препятствуя успешному отбору трансдуцированных^{клеток 15,16}. Это ограничение может привести к гетерогенным популяциям клеток, увеличению фонового шума и, в конечном итоге, ухудшить качество данных. Для решения этой задачи мы оптимизировали этап отбора пуромицина, временно ингибируя ABC-опосредованный препарат с помощью верапамили, что позволило эффективно обогащать клетки, инфицированные sgRNA. Используя эту стратегию, мы выявили бромодомен и PHD Finger Containing 1 (BRPF1) как регулятор экспрессии ABCB1 и таксорезистентности в^{TNBC 17}. Ингибирование BRPF1, генетически или фармакологически, восстановило чувствительность к Таксолу в резистентных клетках, демонстрируя полезность этого оптимизированного протокола для выявления действующих целей при^{хеморезистентности 17}.

Здесь мы описываем ключевые этапы скрининга CRISPR с отрицательной селекцией на химиоустойчивых моделях, уделяя особое внимание техническим проблемам, которые часто упускаются из виду в большинстве протоколов скрининга на хеморезистентность или CRISPR. Протокол сначала демонстрирует поэтапный метод эскалации дозы для создания химиорезистентных клеток, а затем оптимизирует условия доставки и отбора вирусов для преодоления выбросов препарата, опосредованного транспортером ABC. Вместе эти оптимизации обеспечивают эффективное обогащение sgRNA-положительных клеток во время скрининга CRISPR, одновременно эффективно исключая нетрансдуцированные клетки, обеспечивая надёжную и эффективную стратегию трансдукции и отбора в химиорезистентных клетках TNBC. Наконец, протокол подчёркивает основы выявления последствий скрининга CRISPR с помощью секвенирования следующего поколения и биоинформатического анализа.  Вместе этот протокол позволяет эффективно реализовать платформу скрининга EPIKOL для выявления потенциальных терапевтических целей для преодоления^{резистентности} 17,18,19.

Протокол

Все реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, приведены в Таблице материалов.

1. Создание таксорезистентных тройных линий клеточных линий рака молочной железы

1. Для определения чувствительности клеток к лекарствам отрегулировать плотность клеток SUM159PT адгерирующих клеток до 2 × 10³ клеток на колодец в 96-луночных чёрных прозрачных пластинах с использованием питательной смеси Ham's F12, дополненной 5% плодовой бычьей сывороткой (FBS), 1% пенициллин-стрептомицином, 5 мкг/мл инсулина, 10 мМ HEPES и 1 мкл/мл гидрокортизона, а также инкубировать клетки в течение 16 часов в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C с 5%_CO2.
2. Приготовьте запас Taxol, растворённый в диметилсульфоксиде (DMSO). Для лечения клеток подготовьте последовательное разбавление Таксола в культурных средах с концентрацией от 0,3 нМ до 10 мкм (например, 0,3 нМ, 1 нМ, 3 нМ, 10 нМ, 30 нМ, 100 нМ, 300 нМ, 1 мкм, 10 мкм) и использовать ДМСО в качестве транспортного контроля.
3. Обрабатывайте клетки 200 мкл увеличивающейся дозы Таксола (подготовленного на шаге 1.2) в виде тройных экземпляров и оставляйте пластину в инкубаторе клеточной культуры на 72 часа при 37 °C с 5%_CO2.
4. После 72 часов лекарственного лечения измеряйте жизнеспособность клетки с помощью люминесцентного анализа на основе аденозинтрифосфата (АТФ). Используйте считыватель микропластин для измерения люминесценции и нормализации значений для управления DMSO. Вычислите значения 10% ингибирующих концентраций (IC10) и IC50 с помощью нелинейной регрессии с использованием четырёхпараметрической модели логистического отклика дозы в соответствующем статистическом программном обеспечении.
5. Чтобы начать формировать химиоустойчивые клетки, высаживайте семя 2 ×^10-15 SUM159PT клеток на каждую скважину в пластинах с 6 колодцами. Инкубировать ночь при 37 °C с 5%_CO2.
6. На следующий день обрабатывайте клетки значениями Таксола IC10 или IC50 в 2 мл культурных сред в течение 72 часов в качестве начальной концентрации.
7. Если клетки переносят текущую концентрацию препарата, разделите их на две ямы. Поддерживайте один колодец в качестве резервного контроля в свежей среде и заменяйте среду во второй яме на среду с концентрацией таксола вдвое выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки нуждаются в восстановлении из-за морфологических изменений, вызванных стрессом, таких как аномальные клеточные проекции, обширное округление и отслоение, или заметное снижение пролиферации, держите их в безлекарственной среде и ждите, пока клетки станут здоровыми и не соберутся. Затем повторяйте шаги, начиная с шага 1.7.
8. При создании резистентных клеток проходят родительские клетки с помощью среды, содержащей ДМСО, в качестве контроля. Скорректируйте объём DMSO, чтобы соответствовать объёму DMSO, присутствующего в соответствующей обработке Taxol.
9. Измерять жизнеспособность клеток в шагах 1,2–1,4 каждые 3–4 недели и продолжать эту процедуру до достижения значительной разницы (p < 0,05 или 10–50 раз в зависимости от применяемого препарата) между значениями IC50 у родительских и резистентных клеточных линий. Процедура увеличения дозы обычно занимает 6–9 месяцев, в зависимости от используемого препарата.
10. После получения стабильных резистентных клеток поддерживайте их в поддерживающей дозе (последняя применённая доза) препарата, одновременно культивируя для сохранения устойчивого фенотипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация химиорезистентных клеток методом увеличения дозы — это трудоёмкий процесс, длительность которого зависит от нескольких факторов, включая клеточную линию, внутреннюю скорость роста и конкретный используемый химиотерапевтический агент. Обычно это занимает 6–9 месяцев, в зависимости от клинически значимого уровня резистентности. Альтернативный способ определения значительных различий в уровнях резистентности — оценить минимальную концентрацию лекарств, при которой устойчивые клетки выживают, но родительские клетки — нет.
11. Характеристика резистентных клеток: проведение секвенирования РНК, вестерн-блоттинга, количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) и тестов жизнеспособности клеток с помощью лекарственного лечения (например, анализ формирования колоний) для характеристики фенотипа устойчивых клеток. Обязательно переоцените устойчивый фенотип после нескольких отрывков, чтобы показать, что повышенный фенотип IC50 стабилен со временем.

2. Производство лентивируса

1. День 0: Семена HEK293T клетки в виде 4 × 10⁶ на 100 мм тканевую культуру с модифицированным орловым медиумом Dulbecco (DMEM), дополненным 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина, чтобы на следующий день достичь 90% слияния.
2. День 1: Подготовьте полиэтилениминовые (ПЭИ) и ДНК-смеси в безсывороточном DMEM (-/-) отдельно для каждого вируса. Используйте таблицы 1 и 2 для корректировки объёма и концентраций PEI и ДНК в соответствии с желаемой вирусной выходностью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PEI используется в четыре раза больше общего количества ДНК (например, в пластине диаметром 100 мм используйте 30 мкл PEI, что в сумме составляет 7,5 мкг ДНК). В этом протоколе следуется производство вирусов в 100-мм тарелках, а вирус, полученный из 5–10 100-мм тарелок, позволит выполнять несколько экранов. Для валидационных экспериментов или мелкомасштабных инфекций достаточно одной колодцы из 6-колодцевой пластины или антенны на 60 мм. Поскольку линейный полиэтилениминовый гидрохлорид является токсичным трансфекционным агентом, убедитесь, что слияние клеток на момент трансфекции составляет 90%.
   1. После тщательного смешивания добавьте ДНК-смесь в пробирку PEI. Хорошо перемешайте и дайте комплексам PEI-ДНК постоять 30 минут при комнатной температуре.
   2. Затем добавьте 600 мкл комплекса PEI-ДНК в HEK293T по каплям. Поставьте пластины в вирусный инкубатор на 16 часов при 37 °C с 5%_CO2.
3. День 2: Заменить среду инфицированных клеток аспирированием среды с PEI и вирусом и добавить 8 мл полного DMEM на каждую 100-мм чашу для культуры тканей. Инкубировать клетки для получения вирусного образования.
4. День 3: Проведите первую сборку вирусов, аккуратно убрав 8 мл супернатанта в соответствующую пробирку центрифуги и храните при 4 °C. Если существует несколько пластин для производства вируса, объединяйте супернатанты. Затем добавьте 8 мл свежего полного DMEM в каждую порцию и возвращайте тарелки в вирусный инкубатор.
5. День 4: Повторяйте шаги сбора и комбинируйте с супернатантами с третьего дня.
   1. Приготовьте 50% (w/v) раствор полиэтиленгликоля (PEG)-8000 в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) для получения 5× PEG наложного раствора. Автоклав для растворения и стерилизации.
   2. Центрифугуйте собранные вирусные супернатанты в концентрации 300 г в течение 5 минут до гранулирования остаточных клеток, затем переходите к фильтрации.
   3. Фильтруйте 16 мл вирусного супернатанта с помощью фильтра 0,45 мкм (либо шприца, либо вакуумного фильтра на 50 мл) в пробирку с 4 мл раствора ПЭГ для достижения конечной концентрации 1× ПЭГ и удаления оставшихся мусора и клеток.
   4. Закрывайте лампу и смешивайте с помощью инверсии. Повторите этот шаг для всех вирусных препаратов. Храните на ночь при 4 °C в темноте с небольшим перемешиванием.
   5. На следующий день должны быть видимые осадки. Центрифугуйте трубки при 1400 x g в течение 20 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные гранулы, осаждённые ПЭГ, могут храниться при 4 °C до 5 дней до центрифуга; однако вирусный титр может уменьшаться при длительной инкубации.
   6. После центрифугирования аккуратно сбросьте супернатант, оставив в трубке небольшой объём (примерно 100 мкл), чтобы не нарушать гранулу.
   7. Центрифугуйте трубки 5 минут при 300 x g, чтобы собрать как можно больше жидкости с боков трубки. Затем аккуратно избавляйтесь от оставшихся супернатантов.
   8. Чтобы концентрировать вирус в 100 раз, добавьте PBS к 1/100 начального объёма вирусного супернатанта к грануле и ресуспендировать гранулу с помощью пипетирования (например, если начать с 16 мл вирусного супернатанта, добавить 120–140 мкл PBS к грануле для достижения конечного объёма 160 мкл, учитывая объём гранулы). Избегайте интенсивного пипетирования; Аликот вирус.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый титр после концентрации ПЭГ составляет >1 × 10⁸ инфекционных частиц/мл (ip/mL) для системы LentiGuide и >1 × 10⁷ для системы LentiCRISPR. Снижение титра на порядок величины всё ещё может быть приемлемым, но их следует проверять на уровень инфекции целевой клеточной линии и необходимый объем вируса.
   9. Если концентрация вируса не требуется, используйте его аликвот, чтобы минимизировать циклы замораживания и оттаивания. Храните концентрированный или неконцентрированный вирус при -80 °C. Отбеливатель и мусорные тарелки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробного описания производства и обращения с лентивирусом читателям обращаются к установленным^{протоколам 20}. Для распространённых проблем, возникающих при производстве лентивируса, см. Дополнительную таблицу 1.

	1 колодец из 6 пластин	Пластина диаметром 60 мм	Пластина диаметром 100 мм	Пластина диаметром 150 мм
Объём PEI (стандартный 1 мг/мл)	6 мкл	9 мкл	30 мкл	60 мкл
DMEM (-/-) том	54 мкл	100 мкл	270 мкл	540 мкл

Таблица 1: Требуемые объёмы PEI и DMEM для разных пластин для смеси PEI.

	1 колодец из 6 пластин	Пластина диаметром 60 мм	Пластина диаметром 100 мм	Пластина диаметром 150 мм
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Гаг-Пол	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Целевой вектор	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) отрегулировать итоговую громкость на	60 мкл	100 мкл	300 мкл	600 мкл

Таблица 2: Требуемые объемы плазмидных и DMEM для различных пластин для смеси ДНК.

3. Установление оптимизированного отбора пуромицинов для клеток MDR

ПРИМЕЧАНИЕ: В хеморезистентных клетках с гиперэкспрессией ABCB1 отбор пуромицинов не проходит из-за активного выделения пуромицина, опосредованного ABCB1, что препятствует эффективному отбору клеток, инфицированных sgRNA. Для преодоления этого ограничения верапамил вводят совместно с пуромицином для временного ингибирования вытока, опосредованного ABCB1, что позволяет внутриклеточному накоплению пуромицина и эффективно удаляет неинфицированные клетки.

1. Определить концентрацию верапамила, которая блокирует выброс препарата, опосредованный ABCB1, не влияя на жизнеспособность клеток. Для этого используйте химиотерапевтическое средство, к которому была приобретена резистентность (в данном случае таксол), в сочетании с увеличением доз верапамила.
   1. Семена SUM159PT Таксорезистентные и родительские клетки до 96-колодцевых чёрных прозрачных нижних пластин по 2 × 10³ клеток на колодец в тройном экземпляре. Инкубировать клетки ночью при 37 °C с 5%_CO2.
   2. Лечить клетки серийными разбавлениями верапамила (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 и 80 мкм) при поддержании постоянной концентрации Таксола (например, поддерживающей дозы) во всех условиях.
   3. После 72 часов лечения оценивайте жизнеспособность клетки с помощью люминесцентного анализа АТФ-квантовой оценки жизнеспособности. Определите концентрацию верапамила, которая сама по себе не снижает жизнеспособность (≥90–95% по сравнению с необработанными контролями), но восстанавливает чувствительность в резистентных клетках.
2. Чтобы найти концентрацию пуромицина в сочетании с верапамилом, семена SUM159PT таксорезистентные клетки в пластину на 96 лунок при 2 ×^{10 3}клеток на колодцу. Инкубировать тарелку 16 часов при 37 °C с 5%_CO2.
   1. Подготовьте серийные разбавления пуромицина (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 и 40 мкг/мл) в среде с ранее определённой концентрацией верапамила и соответствующим образом обработайте клетки.
   2. Через 72 часа измерить жизнеспособность клеток с помощью люминесцентного анализа АТФ-клетки и определить минимальную концентрацию пуромицина, которая устраняет все клетки (≤5% жизнеспособности) в присутствии верапамила. Эта концентрация будет использоваться для отбора во время CRISPR-скрининга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы оптимизации концентрации лекарств зависят от клеточной линии и контекста. Такие факторы, как внутренняя чувствительность препаратов, уровень экспрессии ABC-транспортеров и скорость роста, могут влиять на эффективные концентрации. Поэтому выполните эту оптимизацию для каждой новой модели ячеточной линии и сопротивления. (Для справки: 5 мкг/мл пуромицина в сочетании с 20 мкм верапамила используется для таксорезистентных клеток, используемых^{в этом исследовании 17}). Для устранения неполадок при выборе пуромицина + верапамила см. Дополнительную таблицу 1.

4. Расчёт титрации вирусов и множественности инфекции (MOI)

1. День -1: Семена SUM159PT таксорезистентных клеток по 2 × 10⁵ в каждую яме пластины на 6 лунок с полной смесью питательных веществ Ham's F12.
2. День 0: Проведите четыре последовательных разбавления вируса в питательной смеси F12 Хэма, содержащей сульфат протамин (PS) при 8 мкг/мл. (Для концентрированных вирусов начинайте с 1 мкл и разбавляйте в десять раз при каждом разбавлении как 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. Для неконцентрированных вирусов соответственно корректируйте объёмы (например, 100 мкл > 10 мкл > 1 мкл > 0,1 мкл).
   1. Введите по 1 мл вируссодержащей среды в каждую из четырёх скважин. Оставьте один колодец для контроля селекции пуромицинов, а другой — нелечённый.
3. День 1: Замените вирусную среду на 2 мл свежего материала через 16 часов после заражения.
4. День 2: Перенесите содержимое клеток каждой скважины в 100-мм контейнер с питательной смесью F12 Ham, содержащей пуромицин + верапамил в концентрациях, определённых на этапе 3.2. Если невыбранные ячейки слишком сходятся, засейте определённую дробь (например, 1/2), и это будет учтено при финальных вычислениях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости пополняйте среду свежим пуромицином + верапамилом в течение следующих 3-4 дней, пока все клетки в контрольной пластине не погибнут.
5. Дни 4–5: Когда клетки в контрольной пластине мертвы, определите пластины, в которых достаточно ячеек для подсчёта. Трипсинизуйте клетки, подсчитайте и определите общее количество ячеек.
6. После подсчёта жизнеспособных клеток рассчитайте эффективность трансдукции и множинность инфекций (MOI) следующим образом (используйте дополнительную таблицу 2 в качестве шаблона):
   1. Рассчитайте скорость трансдукции (доля инфицированных клеток) по формуле ниже
      
      
      N_Selected: общее количество клеток после отбора пуромицинов в инфицированных колодцах
      _{N Control}: общее количество клеток в нетрансдуцированной, невыбранной контрольной яме
      p: Скорость трансдукции (доля инфицированных клеток).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если была засеяна только часть необработанных контрольных ячеек, учитывайте это при расчёте N_Control
   2. Рассчитайте MOI. Во время лентивирусной трансдукции инфекции следуют распределению Пуассона. Таким образом, доля клеток, инфицированных хотя бы одним вирусом, определяется как:
      p =1- e ^-MOI
      Таким образом, вычислим MOI как:
      MOI = - ln(1-p)
   3. Вычислите титр лентивируса (инфекционная частица/миллилитр, IP/mL) на основе количества инфицированных клеток:
      Титр (IP/mL) = (MOI x_{N старт})/ Объём вируса
      N_старт: количество клеток, засеянных для заражения
      Объём вируса: объём добавленного вируса на скважину (в мл)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте титр лентивируса для каждой инфекции отдельно и определите окончательный титр, взяв среднее значение колодцев с пропорциональным количеством вируса и значениями титра. Скважины, показывающие насыщение или отклонение от пропорционального масштабирования, следует исключать из расчетов титра.

5. Генерация и/или валидация стабильной клеточной линии, экспрессирующей Cas9

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим при использовании LentiGuide_EPIKOL. Если уже доступна валидированная Cas9-стабильная линия или используется LentiCRISPR_v2_EPIKOL, перейдите напрямую к разделу 6.

1. Произведите лентивирус Cas9 с помощью LentiCas9_blast вектора, как описано в разделе 2.
2. Заражать клетки на следующий день, нацеливаясь на MOI 10. Рассчитать количество вируса в соответствии с предполагаемым MOI в разделе 4, использовать рассчитанное количество вирусного объёма и ввести его непосредственно в клетки пластины, содержащей культурную среду, содержащую 8 мкг/мл протамин сульфат (PS).
3. Замените вирусную среду на свежую через 16 часов после заражения
4. На следующий день применяйте селекционный отбор бластицидина, вдавая клетки в культурную среду с ранее установленной концентрацией бластицидина (окончательная концентрация определяется для каждой клеточной линии с помощью теста на жизнеспособность клетки, как описано в разделе 3), пока неинфицированные клетки не будут исключены (обычно 6–7 дней).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки, экспрессирующие Cas9, культивируются в течение длительного времени перед скринингом, повторите отбор бластицидина для устранения Cas9-отрицательных клеток.
5. Валидация Cas9 (рекомендована): Валидация активности Cas9 с использованием контрольных sgRNA, направленных на важные гены (последовательности sgRNA доступны в библиотеке EPIKOL; см. дополнительную таблицу 3) или репортерных систем, таких как зелёный флуоресцентный белок (GFP), для оценки эффективности и кинетики knockout. Подробные методы валидации можно найти в предыдущем^{исследовании 19}.

6. Эпигеномная CRISPR нокаутная лентивирусная инфекция и скрининг

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точного отображения генотипа на фенотип объединённые CRISPR-скрины требуют низкого уровня заражения MOI и достаточного охвачения библиотек (обычно 500×–1000), в зависимости от экспериментальной строгости и поведения клеточных линий. Общие принципы объединённых рабочих процессов скрининга CRISPR на уровне всего генома, включая проектирование библиотек и экспериментальную установку, см. ранее опубликованные^{протоколы 21,22}. Для EPIKOL настоятельно рекомендуется поддерживать покрытие >500x на протяжении всего скрининга, так как снижение этого порога увеличивает риск стохастического выпада sgRNA, особенно в группе лекарственного лечения скрининга. Для определения начального количества клеток, эффективности трансдукции и объёма вируса, необходимых для проведения инфекции с низким уровнем MOI, необходимы следующие расчёты.

1. День -1: Посейте общее количество ячеек, рассчитанных ниже, в контейнерах для культуры клеток диаметром 100 мм или 150 мм с соответствующим количеством клеток на тарелке.
   1. Рассчитайте количество успешно заражённых ячеек для достижения желаемого охвату библиотеки (используйте дополнительную таблицу 2 в качестве шаблона):
      _{N инфицировано} = (количество sgRNAs) × (охват целевых целей)
   2. Вычислите начальное количество клеток на каждую реплику, чтобы компенсировать долю неинфицированных клеток при низком MOI (0,3–0,4) инфекции:
      N_начало = N_{инфицировано}/p
      где p — скорость трансдукции (доля инфицированных клеток), определяемая на основе распределения Пуассона (см. шаг 4.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта корректировка гарантирует, что в пуле при заражении с низким уровнем MOI будет достаточное количество отдельных клеток, инфицированных sgRNA, чтобы достичь желаемого охват библиотеки.
2. День 0 — Трансдукция
   1. Рассчитайте требуемый объем вируса на одну реплику
      Требуемый вирусный объём = (_{N начиная} × MOI) / (Вирусный титр (ранее определенный ip/mL))
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность трансдукции на целевом диапазоне MOI 0,3–0,4 примерно соответствует
      26–33% клетки, устойчивые к пуромицину, до отбора.
   2. Инфицировать клетки рассчитанным вирусным объёмом в полной культурной среде, содержащей 8 мкг/мл сульфата протамин (PS). Уменьшить объём среды для увеличения контакта вируса и клеток во время инфекции (например, 8 мл вместо 10 мл для пластины 100 мм)
   3. Подготовьте независимые инфекционные смеси для каждого биологического размножения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется как минимум две биологические реплики; Предпочтительно три варианта. Биологические репликаты должны трансдуцироваться, отбираться и поддерживаться отдельно (включая изменения среды и передачу) и не должны объединяться ни на одном этапе до секвенирования.
3. День 1 — заменить вирусные среды свежими после 16 часов и инкубировать при 37 °C с 5%_CO2
4. День 2 — Отбор трансдуцированных клеток: применить селекцию пуромицинов в присутствии верапамила (концентрации определены на шаге 3.2) для обогащения клеток, инфицированных sgRNA, в SUM159PT клетках с резистентностью к таксолу. Продолжайте отбор до тех пор, пока все клетки в неинфицированной контрольной пластине не будут устранены (обычно ~3 дня).
5. День 5 — T₀ Референсный отбор проб: После завершения отбора пуромицина + верапамила трипсинизуйте клетки и собирайте первичную гранулу с временем ноль _{(T 0}) из каждой биологической реплики, соответствующую уровню покрытия, определённому во время трансдукции. Поскольку он служит ориентиром для первоначального распределения библиотеки, собирайте клеточные гранулы сразу после завершения отбора, до того, как произойдёт какая-либо потеря клеток. Посейте достаточное количество ячеек, чтобы сохранять покрытие постоянно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После отбора пуромицина + верапамила количество выживших трансдуцированных клеток будет варьироваться в зависимости от времени удвоения клеточной линии и достигнутой эффективности трансдукции. Выжившая популяция обычно восстанавливается до исходной плотности посева после завершения отбора и может превысить её в более быстрорастущих клеточных линиях. Если сохранившееся количество ячеек позволяет, соберите несколько гранул T₀ и заморозьте резервные образцы при -80 °C. Кроме того, клетки, инфицированные EPIKOL, можно криоконсервировать в жидком азоте при сохранении покрытия. Эти резервные запасы могут быть разморажены в случае неожиданного отказа скрининга или для будущих альтернативных экспериментальных подходов (например, тестирования дополнительных лекарственных методов). Проверьте эффективность трансдукции с помощью неинфицированной управляющей пластины, чтобы убедиться, что запланированная эффективность достигнута (см. раздел 4). Если наблюдаемая эффективность трансдукции выше ожидаемой, эксперимент заново запускается, чтобы трансдукция была выполнена при низком MOI, что предотвращает интеграцию множества sgRNA на клетку.
6. Выполнение скрининга: после завершения редактирования генома с помощью Cas9, на срок, определённый в разделе 5, клетки разделят на группы обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это занимает 7–9 дней после трансдукции, так как максимальная эффективность выбивания достигается примерно на 7-й день трансдукции^23-го дня. Для эпигенетических мишень 9-дневное окно также допускает изменения на уровне хроматина до начала отбора препарата.
   1. Разделите клетки на экспериментальные группы с сохранением покрытия: одна — контрольная группа, принимающая базовое состояние DMSO, а другая — лечебная группа, получающая таксол.
   2. Сохраняйте культуры для удвоения населения 14–16 человек. Уровень удвоения населения (PDL) рассчитывается как:
      PDL =_{PDL s} + 3,322 (Log C_f – log C_i)
      _{PDL s} = начальный уровень удвоения населения
      C_i = начальный номер ячейки с засеянными
      C_f = общее количество клеток в конце периода роста
   3. На каждом этапе отслеживайте жизнеспособность и кинетику роста, избегая узких мест, поддерживая достаточное количество клеток. Корректируйте интенсивность лечения, если происходит чрезмерная гибель клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь собирать резервные ячейки в каждом проходе, еженедельно или на определённых PDL во время экрана. Эти резервные образцы могут служить альтернативными временными точками для секвенирования или оптимизационными образцами для процесса экстракции геномной ДНК. Периодически криоконсервируйте клетки, чтобы избежать неожиданной потери.
7. _{T-финальный} отбор: По достижении желаемого PDL собирайте финальные временные гранулы (_{T final}) для каждого повторения и условия, поддерживая покрытие библиотеки для каждой гранулы. Храните гранулы при -80 °C до последующего удаления gDNA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь завершать экран при сопоставимых PDL между руками, даже если продолжительность посева различается в зависимости от состояния.

7. Экстракция геномной ДНК

1. Экстракция геномной ДНК (гДНК) с использованием валидированного метода (например, MN NucleoSpin Tissue Kit), с незначительными корректировками протокола для повышения эффективности лизиса крупных, объединённых клеточных гранул.
   1. Следуйте тканевому протоколу, а не клеточному из-за большого размера гранул. При необходимости рассмотрите увеличение объёма реагентов и использование нескольких спиновых колонок на одну ячейку (не превышайте 5 ×^{10 6} элементов на колонку), чтобы обеспечить эффективную лизу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед лизисом повторная суспензия гранулы с минимальным количеством PBS (~50 мкл) может повысить эффективность лизиса. Неполный лизис гранулы может засорить спин-колонну, что приводит к снижению выхода ДНК.
   2. Следуйте рекомендациям по элюированию с высокой и высокой концентрацией. Элюйте гДНК в уменьшенном объёме буфера элюции (примерно 2/3 рекомендуемого объёма) на колонку, особенно если клеточные гранулы разделены на несколько колонок.
2. Измерять качество и количество gDNA (например, Nanodrop).

8. Подготовка библиотеки секвенирования EPIKOL из геномной ДНК

1. Используйте отдельный кабинет ПЦР для выполнения всех этапов библиотеки ПЦР с целью предотвращения заражения плазмидами во время ПЦР с gDNA, так как шаблоны плазмиды амплируются эффективнее, чем геномная ДНК, и могут искажать распределение sgRNA.
   1. Очистите рабочее пространство, микропипетки и стойки 10% отбеливателя и 70% этанола соответственно.
   2. Аликвотируйте все реагенты (особенно праймеры) в одноразовых объёмах перед использованием, чтобы снизить риск перекрёстного загрязнения и циклов заморозки-оттаивания.
   3. Храните реагенты при -20 °C и держите их на льду во время подготовки ПЦР.
2. Оптимизируйте начальный входной объем gDNA, нацелившись на 200×–500× покрытие на одну sgRNA для поддержания соответствующей сложности библиотеки. Пример: для библиотеки EPIKOL гДНК предпочтительно извлекаются из клеточных гранул, собранных с покрытием 1000× а окончательное покрытие 250× используется для амплификации гДНК.
   1. Рассчитайте необходимый вход gDNA для желаемого покрытия следующим образом.
      Количество gDNA = (Количество sgRNA) × охват × (66 пг ДНК/ядро)
      Пример: 8000 гРНК × (охват 250×) × (6,6 пг ДНК/ядро) = 13,2 мкг гДНК/образец должно быть амплифицировано.
   2. Проведите тестовую ПЦР с использованием внешних и внутренних условий реакции ПЦР в таблицах 3, 4, 5 и 6 с увеличением количества гДНК на одну реакцию (например, 1 мкг, 3 мкг, 6 мкг) для определения оптимального количества гДНК на пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаток ввода gDNA или чрезмерное циклирование ПЦР могут привести к смещению амплификации и искажению покрытия sgRNA.
   3. Проведите гель 2% агарозы для анализа внутренних ПЦР-продуктов. Убедитесь, что наблюдается яркая полоса примерно на 350 п.п.
   4. Исходя из оптимального количества gDNA на пробирку, определите общее количество ПЦР-реакций на образец для достижения желаемого охватов библиотеки, при этом избегая чрезмерного количества gDNA на каждую реакцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется 13,2 мкг общего гДНК и 3,3 мкг гДНК за реакцию даёт оптимальную амплификацию, подготовьте четыре параллельные ПЦР-реакции с 3,3 мкг гДНК в объёме реакции 100 мкл. В такой ситуации объём гДНК не должен превышать 10% от объёма реакции, чтобы избежать ингибирования ПЦР из-за чрезмерного входа шаблона.
3. Амплифицировать sgRNA кассеты из gDNA-шаблона (первый/внешний ПЦР)
   1. Амплифицировать геномные области, содержащие стабильно интегрированную лентивирусную sgRNA кассету, используя праймеры, перечисленные в дополнительной таблице 2. Проведите ПЦР-реакции с количеством gDNA, определённым на шаге 8.2 (см. Таблицу 3), используя условия реакции ПЦР из таблицы 4. Подготовьте ПЦР-контрольную трубку без шаблонной ДНК для проверки возможного загрязнения и держите пробирки на льду постоянно.
   2. В конце добавьте ДНК-полимеразу, хорошо перемешайте с помощью набора или пипетирования и ненадолго прокрутите ПЦР-трубки вниз перед тем, как вставить их в термический циклер. Выполните горячий старт, чтобы предотвратить неспецифическое усиление.
   3. После завершения внешнего ПЦР все реакции ПЦР объединяют в одну микроцентрифугную трубку. Очистка ПЦР или визуализация гелем после внешней ПЦР не требуется. Используйте пулированный продукт ПЦР напрямую в качестве шаблона во втором (внутреннем) ПЦР. Храните продукты ПЦР при -20 °C.

Реагент	Объём на реакцию
dNTP (по 10 мМ каждая)	2 мкл
Фузионная полимераза	1 мкл
6' GC Buffer	20 мкл
Прямой капсуль (10 мкм)	5 мкл
Обратная грунтовка (10 мкм)	5 мкл
гДНК	X μL
Вода без нуклеазы	до 100 мкл (67–X μL)
Total	100 мкл

Таблица 3: Обязательные реагенты для первой/внешней ПЦР.

Номер цикла	Денатура	Отжиг	Продление
1	95 °C, 3 минуты
2–19	95 °C, 25 с	65 °C, 20 с	72 °C 15 с
20			72 °C 3 мин

Таблица 4: Условия ПЦР для первого/внешнего ПЦР.

4. Выполнять индексное штрихкодирование (Second/Internal PCR) и экстракцию геля
   1. Во время второго (внутреннего) ПЦР для штрихкодирования образцов используется праймер обратного индекса; поэтому для каждого образца используйте разные индексные праймеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для библиотек, сгенерированных с использованием основной основы pLentiCrispr v2 , используйте обратные индексные праймеры, заканчивающиеся CT-основанием, помеченными как lenticrisprv2_rev(index X) (см. дополнительную таблицу 2).
   2. Для библиотек, сгенерированных с использованием основной базы pLentiGuide , используйте индексы, заканчивающиеся на основания GT и помеченные как rev_index_X в Дополнительной таблице 2.
   3. Приготовьте смесь грунта с пошаговым расположением вперёд, смешав по 2 мкл из каждого из девяти поэтапных праймеров (стандартный 100 мкм) и добавив 162 мкл воды без нуклеазы в стерильную микроцентрифугальную трубку. Итоговая концентрация смеси праймера составит 10 мкм.
   4. Используйте объединённый внешний продукт ПЦР в качестве входа и проведите две параллельные внутренние реакции ПЦР по 100 мкл на образец, используя инструкции из таблицы 5 и 6. Подготовьте реакцию контроля ПЦР с использованием контроля «No template DNA» от внешнего ПЦР (шаг 7.3) в качестве входа для мониторинга возможного загрязнения.
   5. Добавьте в конце ДНК-полимеразу, хорошо перемешайте с помощью набора или пипетирования, ненадолго прокрутите ПЦР-трубки перед тем, как вставить их в термальный циклер. Выполните горячий старт, чтобы предотвратить неспецифические усиления.
   6. Объедините и проведите внутренние ПЦР-реакции в 2% агарозном геле, чтобы отделить целевой ампликон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В контролях ПЦР без шаблонов не должно быть обнаружено полос. Следует соблюдать отдельную полосу около 337 п.п. для LentiCrispr_V2 и 357 п.п. для библиотек LentiGuide. Также может присутствовать верхняя неспецифическая полоса примерно 500 п.п. и должна быть исключена из дальнейшей обработки.
   7. Загрузите 12 мкл (10 мкл продукта ПЦР + 2 мкл нагрузочного красителя) на внутренний продукт ПЦР для визуализации полос, затем загрузите остальную часть продукта ПЦР в объединённые или соседние скважины, предназначенные для экстракции геля. Минимизировать толщину агарозы для максимизации извлечения ДНК. Избегайте чрезмерного экспонирования дорожек экстракции геля во время визуализации, чтобы минимизировать повреждение ДНК, вызванное УФ-воздействием, во время удаления геля.
   8. Очищайте ПЦР-продукты из агарозного геля с помощью специального набора для экстракции геля (например, NucleoSpin Gel и PCR Clean-up) согласно инструкциям производителя. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. Храните продукты ПЦР при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильного секвенирования необходима минимальная концентрация >20 нг/мкл после экстракции геля. Если необходимый результат не удаётся достичь даже при трёх параллельных внутренних реакциях ПЦР, выделяйте новую gDNA и повторяйте процесс.

Реагент	Объём на реакцию
dNTP (по 10 мМ каждая)	2 мкл
Фузионная полимераза	1 мкл
6' GC Buffer	20 мкл
Праймер Forward Stagger Mix (10 мкм)	5 мкл
Реверсный индексный праймер (10 мкм)	5 мкл
Внешняя ПЦР	5 мкл
Вода без нуклеазы	62 мкл
Total	100 мкл

Таблица 5: Обязательные реагенты для второй/внутренней ПЦР.

Номер цикла	Денатура	Отжиг	Продление
1	95 °C, 3 минуты
2–25	95 °C, 25 с	65 °C, 20 с	72 °C 15 с
26			72 °C 3 мин

Таблица 6: Условия ПЦР для второй/внутренней ПЦР.

9. Последовательность

1. Определите необходимое количество отображаемых чтений на основе покрытия библиотеки, определённого в начале экрана. При условии эффективности отображения 60–70%, требуется большее количество общих чтений для компенсации потерь чтения. Для 1000× покрытия библиотеки EPIKOL требуется ~8 миллионов картированных чтений, что соответствует 10–12 миллионам прочтений.
2. Проведите контроль качества библиотек секвенирования с помощью Tapestation или Bioanalyzer перед секвенированием для подтверждения размера и целостности библиотеки.
3. Объединяйте библиотеки секвенирования из разных сэмплов перед секвенированием, так как они уникально штрихкодированы с индексными праймерами.
4. Подтвердите структуру чтения (ориентацию R1/R2) и требования к демультиплексированию с помощью функции секвенирования. 2× Парное секвенирование 150 bp рекомендуется в Illumina HiSeq, Novaseq или аналогичной платформе секвенирования, совместимой с Illumina. Рассмотрите возможность запросить как минимум 5% вспышки PhiX для улучшения разнообразия секвенирования.

10. Обзор анализа секвенирования для EPIKOL

1. Используйте конвейер анализа MAGeCK для анализа парных FASTQ^{файлов 24}. Организуйте каждую биологическую реплику как отдельный входный файл.
2. Используйте вводный файл sgRNA EPIKOL, совместимый с MAGeCK, в качестве справочной библиотеки (предоставлен в дополнительной таблице 4), и примените функцию подсчёта для количественной оценки чтений sgRNA из отдельных FASTQ-файлов с целью создания исходных файлов счёта для каждого репликирования и состояния.
   1. Нормализуйте каждый файл с помощью нормализации чтения на миллион (RPM) для проверки качества и распределения каждого образца, визуализируя нормализованные графики sgRNA¹⁴.
3. Выполните вторую функцию -count , чтобы объединить подсчета в один файл с помощью нормализации медианы с настройками по умолчанию.
4. Запустите функцию -test для выявления изменений на уровне генов с помощью объединённых исходных файлов подсчёта. Для оценки эффективности скрининга сравните_{окончательные} образцы T с образцами_{T 0} и проверьте распределение нетаргетируемых контрольных и важных генно-таргетируемых sgRNA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно оценить истощение положительных контрольных генов в каждой группе скрининга для оценки эффективности скрининга. Ожидается, что будет наблюдаться биологическая вариабельность между репликами в группе скрининга, так как воздействие лекарств может вызывать стохастические различия в клеточном ответе. Эта вариабельность присуща экранам с хеморезистентностью и не обязательно указывает на плохое качество экрана. Поэтому во время вызова хитов необходимо проанализировать как минимум три биологических повтора вместе, и попадания должны определяться как гены, имеющие не менее 6 эффективных sgRNA из 10.
5. Для выявления лекарственно-индуцированных изменений в количестве sgRNA и генных эффектах сравните образцы, обработанные T_final-Taxol, с_{T final-DMSO}, используя DMSO-группу в качестве контрольной группы.
6. Примените порог FDR < 0,05 для выявления истощённых генов в группе лечения, чтобы выявить гены, способствующие приспособленности или устойчивости клеток, устойчивых к таксолу.

Результаты

Для изучения эпигенетических регуляторов хеморезистентности в ТНБК общий протокол с использованием SUM159PT клеточной линии показан на рисунке 1. Во-первых, значения Таксола IC₁₀ и_{IC 50} в SUM159PT клетках были определены путём обработки клеток с увеличением концентрации Таксола (рисунок 2A). Для получения SUM159PT клеток, устойчивых к таксолу, был использован поэтапный метод эскалации дозы. Спустя несколько месяцев сдвиг значений IC50 иллюстрирует успешное формирование устойчивого фенотипа с использованием этого протокола по сравнению с контрольными клетками, проходившими параллельно без воздействия таксола (рисунок 2B).

Рисунок 1: Схема скрининга EPIKOL в клетках с таксорезистентными SUM159PT. Общий процесс скрининга EPIKOL в сгенерированных клетках SUM159PT к таксолу. Фигура была создана с помощью BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигурки.

После установления устойчивых клеток было проведено несколько экспериментов для характеристики их фенотипических и молекулярных изменений. Пролиферационная способность резистентных клеток под обработкой таксолом оценивалась с помощью анализа формирования колоний в сравнении с родительскими клетками. Как показано на рисунке 2C,D, резистентные клетки сохраняют свою пролиферативную способность при лечении Таксолом, тогда как родительские клетки не могут выжить. Этот анализ является одним из важных этапов характеристики резистентных клеток и демонстрирует, как пролиферативная способность при лекарственном лечении может оцениваться между родительскими и резистентными клетками.

В рамках характеристики резистентных клеток было проведено секвенирование РНК на родительских и резистентных клетках для анализа транскриптомических изменений, связанных с хеморезистентностью (рисунок 2E). Одним из наиболее повышенных генов в резистентных клетках был ABCB1, за ним последовали ещё несколько ABC-транспортеров, включая ABCB4 и ABCA5. Повышение экспрессии ABCB1 было подтверждено количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR), что иллюстрирует, как изменения экспрессии кандидатов генов можно проверить с помощью qPCR (рисунок 2F).

Рисунок 2: Образование резистентных клеток и их характеристика. (A) Схема, показывающая генерацию таксорезистентных SUM159PT клеток с помощью метода эскалации дозы. (B) Кривая отклика на дозу, показывающая разницу между значениями IC50 у родительских и генерируемых устойчивых клеток. Родительский IC50 = 6 нМ, а таксорезистентный IC50 = 355,4 нМ. (C) Анализ формирования колоний в присутствии Taxol. (D) Количественная оценка площадей колоний в (C) Двусторонний анализ дисперсии (ANOVA) с помощью пост-хок теста Tukey был применён с помощью Prism 8 (GraphPad Software). Уровни значимости были установлены как *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Диаграммы вулкана, показывающие дифференциально экспрессируемые гены в клетках Taxol-Res по сравнению с родительскими клетками, с порогом LFC>2 и p<0.001. (F) qPCR-валидация экспрессии мРНК ABCB1 в родительских и Taxol-Res клетках. P значений, определяемых двухсторонним t-тестом Студента в сравнении с контрольной группой; **P < 0.01. Панель A была создана вместе с BioRender.com. Фигура панели E была изменена с разрешения Йедье-Байрама и ^др.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

После выявления гиперэкспрессии ABCB1 и других ABC-транспортеров в клетках, устойчивых к таксолу, и учитывая широкий спектр субстрата ABCB1, было оценено наличие MDR-фенотипа. С этой целью клетки, устойчивые к таксолу, были обработаны несколькими препаратами, которые являются известными субстратами транспортера ABCB1 и имеют разные механизмы действия, и их чувствительность к лекарству была оценена (рисунок 3A,B). В соответствии с наблюдаемым профилем экспрессии ABC-транспортеров, таксорезистентные клетки также проявили устойчивость к доксорубицину и винкристину, что подтверждает наличие профиля MDR и иллюстрирует, как фенотип мультилекарственной устойчивости может быть функционально оценен.

Фенотип MDR представляет собой сложность для подхода скрининга на основе CRISPR — EPIKOL, поскольку библиотека требует отбора пуромицина для обогащения трансдуцированных клеток. Поскольку пуромицин может выкачиваться из клеток с помощью ABCB1-опосредованных препаратов, отбор пуромицинов может быть неэффективен в резистентных клетках (рисунок 3C). Таким образом, нетрансдуцированные клетки могут пережить отбор, что запутывает результаты скрининга.

Для устранения этого ограничения процесс отбора химиорезистентных клеток с профилем MDR был оптимизирован перед скринингом EPIKOL. Верапамил, ингибитор ABCB1 первого поколения, был использован для блокировки выделения препарата, опосредованного транспортером ABC, что позволило внутриклеточному накоплению химиотерапевтических препаратов или пуромицина (рисунок 3D). Хотя сам по себе верапамил не влиял на жизнеспособность клеток, он восстанавливал чувствительность к лекарствам при сочетании с химиотерапевтическими препаратами (рисунок 3E,F). Аналогично, кривые уничтожения пуромицина в сочетании с нетоксичными дозами верапамила показали, что ингибирование ABCB1 восстанавливает чувствительность к пуромицину (рисунок 3G,H). Это гарантирует, что клетки, пережившие отбор, будут успешно трансдуцированы, а не клетки, избегающие отбора из-за вытока препарата, вызванного ABCB1. Создание эффективного процесса отбора в хеморезистентных клетках крайне важно для надёжных результатов скрининга EPIKOL.

Рисунок 3: Фенотип мультилекарственной устойчивости и влияние верапамила на резистентные клетки. Кривые дозового ответа, показывающие разницу между значениями IC50 у родительских и генерируемых резистентных клеток с (A) доксорубицином, (B) винкристином, (C) пуромицином. (D) Схема, показывающая отбор таксорезистентных SUM159PT клеток с верапамилом и без. Фигура была создана с помощью BioRender.com. (E) Анализ жизнеспособности клеток с клетками Taxol-Res для определения оптимальной концентрации верапамила с помощью Taxol. (F) Верапамил ресенсибилизирует таксорезистентные клетки к таксолу. (G) Верапамил не изменяет реакцию родительских клеток на пуромицин. (H) Верапамил восстанавливает чувствительность к пуромицину в клетках Taxol-Res. Панели A, B и F были повторно использованы с разрешения Йедье-Байрама и ^др.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Для поиска новых регуляторов хеморезистентности в ТНБК был проведён скрининг EPIKOL с клетками таксол-резистентности SUM159PT, как показано на рисунке 4A. Поскольку резистентные клетки растут медленнее, чем^{родительские клетки 17}, уровни удвоения популяции отслеживались на протяжении всего скрининга как в группах с Таксолом, так и в группах, обработанных с ДМСО, чтобы определить время, необходимое для достижения 16 удвоения популяций (рисунок 4B). Соответственно, скрининг EPIKOL для группы, обработанной ДМСО, был завершён примерно на 35-й день, а группа, обработанная таксолом, была выведена ещё 15 дней, чтобы достичь того же удвоения популяции.

После секвенирования был использован аналитический конвейер MAGeCK для объединения эффекта sgRNA, нацеленных на один и тот же ген, чтобы выявить изменения на уровне генов при^{нокауте 24}. Библиотека EPIKOL включает sgRNA, направленные на важные гены, как положительные контрольные элементы; первым этапом контроля качества было оценить, были ли эти sgRNA истощены ожидаемо. Диаграммы водопадов иллюстрируют изменения существенных генов в Log2 при различных сравнениях (рисунок 4C–E). При сравнении финальных образцов временных точек из состояний, обработанных ДМСО или Таксолом, с исходной точкой времени почти все необходимые гены были истощены после выведения из воды, что указывает на эффективную работу скрининга (рисунок 4C,D). Однако это истощение не наблюдается чётко при сравнении двух конечных образцов (обработанных DMSO и обработанных таксолом), как и ожидалось, поскольку для выживания клетки при обоих условиях необходимы существенные гены (рисунок 4E).

Альтернативной визуализацией результатов на экране является диаграмма вулкана, которая отображает изменения сгибов Log2 вместе со статистической значимостью (значения p-значения или FDR). В скрининге EPIKOL, проведённом в клетках с резистентностью к таксолу, было выявлено несколько положительных контрольных генов как значительно истощенные, что дополнительно подтверждает надёжность скрининга, поскольку истощение sgRNA, направленных на положительные контрольные гены, иллюстрирует типичный контроль качества успешного скрининга (см. рисунок 4F). Помимо основных генных контролей, библиотека EPIKOL включает контекстно-специфические позитивные контрольные sgRNA, направленные на несколько генов ABC-транспортёров. Как и ожидалось, нормализованные подсчёты sgRNA ABCB1 в разных группах выявили значительное истощение sgRNA, нацеленных на ABCB1, особенно в группе, обработанной таксолом (рисунок 4G). В целом это демонстрирует, как изменения на уровне sgRNA могут интерпретироваться для выявления кандидатных генов, связанных с ответом на лекарства.

Рисунок 4: Скрининг EPIKOL приводит к появлению таксорезистентных клеток и примеров графиков. (A) Схема протокола экрана EPIKOL. (B) Уровень удвоения популяции (PDL) клеток Taxol-Res. (C–E) Диаграммы водопадов, показывающие результаты скрининга EPIKOL на клетках Taxol-Res, выделяющие существенные гены, группа, обработанная DMSO, по сравнению с начальной временной точкой панели C, группа, обработанная таксолом, по сравнению с начальной временной точкой в панели D, группа, обработанная таксолом, по сравнению с группой, обработанной DMSO, в панели E. (F) Диаграмма вулкана, показывающая изменения генов в образцах, обработанных таксолом, по сравнению с начальной временной точкой. Гены с p<0.05 были окрашены и маркированы. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей^{публикацией 17}. (G) Считывание на миллион (об/мин) 10 различных графиков ABCB1 sgRNA из EPIKOL. Панель A была создана вместе с BioRender.com. Панель E была повторно использована с разрешения Йедье-Байрама и ^др.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительная таблица 1: таблица устранения неполадок.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Расчёт вирусного титра и MOI.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 3: список sgRNA библиотеки EPIKOL.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 4: Буквары, используемые при подготовке библиотек секвенирования EPIKOL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Объединённые методы скрининга на основе CRISPR-Cas9 хорошо зарекомендованы в различных клеточных контекстах. Однако скрининг в химиорезистентных клетках представляет собой серьёзные сложности и требует дополнительной оптимизации. Поскольку хеморезистентные клетки служат ценными моделями для изучения уязвимостей хеморезистентных опухолей, важно учитывать эти ограничения в стратегиях скрининга для надёжного выявления генетических или эпигенетических регуляторов хеморезистентности.

Само создание химиорезистентных клеточных линий может быть громоздким и сильно зависит от используемого химиотерапевтического агента. Хотя клетки легко адаптируются к определённым препаратам, они могут быть очень восприимчивы к^{другим 25}. Поэтому важно определить значения IC50-специфичных для клеточных линий до внедрения протокола генерации резистентных клеточных линий. В случаях, когда клетки не переносят воздействие препаратов уровня IC50 на протяжении нескольких проходов, возможно начать с более низкой концентрации препарата (например, IC10-20) (см. раздел 1 протокола)¹⁷. Поскольку приобретение резистентности является стохастическим событием, можно одновременно обрабатывать несколько колодцев/пластин клеток для увеличения вероятности получения резистентных клеток. Крайне важно всесторонне охарактеризовать полученную популяцию лекарственно-устойчивых клеток, чтобы описать транскрипционные и фенотипические изменения во время процедуры эскалации дозы по сравнению с их наивным состоянием. Глобальные подходы профилирования, такие как RNA-seq, могут использоваться для выявления дифференциально экспрессированных генов относительно родительской линии. Функционально приобретённая лекарственная устойчивость должна быть подтверждена с помощью тестов жизнеспособности и пролиферации клеток, чтобы показать, что резистентные клетки сохраняют выживаемость при условиях лекарственного лечения, цитотоксичных для родительских клеток. Также потенциальные изменения в их пролиферативной способности и скорости роста следует измерять по сравнению с родительской клеточной линией для расчёта соответствующих PDL. Поскольку известно, что приобретённая резистентность к таксолу опосредована, по крайней мере частично, за счёт ABC-опосредованного вытока препарата, экспрессию ключевых ABC-транспортеров (например, ABCB1) следует оценивать на уровнях мРНК и белка с помощью qPCR и вестерн-блотинга, а также дополнять транскриптомические данные. Исходя из профиля экспрессии транспортера ABC, следует учитывать наличие фенотипа MDR, а также оценить устойчивость к другим химиотерапевтическим средствам. В нашем предыдущем исследовании мы охарактеризовали таксорезистентные клеточные линии и определили ABCB1 как один из наиболее повышенных генов, а также пришли к выводу, что мультирезистентность, опосредованная ABCB1, может вызвать отказ при выборе^{пуромицинов 17}. Поэтому после генерации резистентных клеток необходимо оценивать экспрессию ABC-транспортеров и MDR-фенотипа перед любой процедурой трансфекции.

Метод повышения дозы имеет преимущества по сравнению с протоколами воздействия при высоких дозах, поскольку клетки можно криоконсервировать на каждом этапе перед увеличением дозы, обеспечивая гибкость и защиту от потери культуры. Кроме того, постепенное увеличение дозы позволяет со временем приобретать фенотипы устойчивости, способствуя адаптивной эволюции; в отличие от острого высокодозированного лечения, которое приводит к отбору уже существующих резистентных субпопуляций. Её поэтапное развитие позволяет исследователям сознательно выбирать желаемый уровень сопротивления для прекращения отбора и оценивать свойства полученного фенотипа. Кроме того, промежуточные этапы эскалации дозы могут быть использованы для изучения механизмов приобретённого сопротивления в течение времени. Согласно основному биологическому вопросу, можно получить разные уровни устойчивости для изучения либо ранних адаптивных механизмов с низким уровнем устойчивости, либо стабильных и полностью устоявшихся фенотипов устойчивости в более устойчивых клетках. Кроме того, клинически значимые пороги устойчивости существенно различаются в зависимости от препарата, клеточной линии и скорости внутренней пролиферации; поэтому сроки повышения дозы могут различаться соответственно (в нашем случае создание клеток-резистентных к таксолу заняло примерно 6 месяцев). В соответствии с этой логикой, в предыдущем исследовании мы установили два разных уровня устойчивости SUM159PT клеток и сравнили их отличительные и общие^{признаки 17}. Поэтому мы рекомендуем исследователям определить целевой диапазон IC50 интересующего препарата в соответствии с клинической и биологической значимостью.

Хорошо известно, что отмена давления лекарства может привести к потере химиорезистентности, поскольку клетки могут перепрограммировать свой эпигеном и^{транскриптом 25}. По этой причине рекомендуется оценивать стабильность фенотипа резистентности в течение нескольких месяцев. Если клетки склонны возвращаться к чувствительному состоянию после отмены препарата, резистентные клетки могут культивироваться в присутствии поддерживающей дозы, обычно соответствующей конечной концентрации препарата при генерации резистентности, чтобы сохранить их фенотип устойчивости. Хотя модели химиорезистентных клеток in vitro практичны, воспроизводимы и широко используются для изучения приобретённой химиорезистентности, они могут не полностью воспроизводить фенотипическую гетерогенность, наблюдаемую у опухолей пациентов, и не имеют микросреды опухоли, иммунных взаимодействий и пространственной^{гетерогенности 3,4,25}. Кроме того, длительное пассирование во время генерации резистентности может привести к генетическим и эпигенетическим изменениям, отклоняющимся от наблюдаемых в образцах пациентов, что потенциально ограничивает трансляционную значимость выявленных попаданий. Поэтому кандидатские гены и механизмы, выявленные с помощью этого протокола, должны быть дополнительно подтверждены в более клинически значимых экспериментальных системах, таких как модели ко-культуры, органоиды, полученные пациентами, или исследования in vivo. EPIKOL даёт преимущества своей сфокусированности, если на этих моделях проводятся комплементарные скрининги, где максимальное количество клеток, которое можно получить, по своей природе ограничено.

Хеморезистентные клетки часто растут медленнее, чем их родительские аналоги, что может представлять практическую проблему для экранов по всему геному, требующих больших популяций клеток для поддержания охватки библиотеки. Специализированные библиотеки, такие как EPIKOL, дают преимущество при проведении скрининга с меньшим количеством исходного материала, одновременно увеличивая глубину sgRNA на каждый ген, тем самым повышая чувствительность и воспроизводимость в пределах определённого целевого пространства. Однако по замыслу EPIKOL фиксирует только механизмы эпигенетической устойчивости и не охватывает неэпигенетические факторы, способствующие химиорезистентности. Выбор библиотеки должен основываться на предыдущих экспериментах и конкретном биологическом вопросе. Пользователи этих библиотек должны знать о ограничениях специализированных библиотек и интерпретировать результаты в рамках библиотеки.

Основным препятствием в CRISPR-скрининге химиорезистентных моделей является появление MDR-фенотипа в связи с повышением ABC-транспортера ^9,10. Разные ABC-транспортеры опосредуют расход различных субстратов. После формирования лекарственно-устойчивой клеточной линии важно оценить, распространяется ли устойчивость на другие химиотерапевтические препараты. Резистентность к пуромицину в основном вызвана гиперэкспрессией ABCB1, что влияет на процесс отбора объединённых методов скрининга CRISPR, поскольку большинство этих библиотек содержат кассеты с пуромициновым отбором для обогащения трансдуцированных клеток. Здесь мы использовали верапамил — ингибитор ABCB1 первого поколения — для облегчения внутриклеточного накопления пуромицина и выборочного устранения нетрансдуцированных резистентных клеток, которые иначе могли бы избежать отбора из-за выброса препарата, опосредованного ABCB1. Поскольку верапамил обратимо связывается с ABCB1, функция ABCB1 восстанавливается в течение нескольких часов после удаления верапамила. Таким образом, верапамил не создаёт дополнительной уязвимости к резистентным клеткам на последующей фазе лекарственного лечения скрининга. Однако следует признать ряд ограничений верапамила. Поскольку верапамил является ингибитором кальциевых каналов и других транспортеров, он может влиять на клеточную физиологию за пределами ингибитора^{ABCB1 10}. Кроме того, эффективная концентрация верапамила варьируется между клетовыми линиями и моделями MDR в зависимости от уровня экспрессии ABCB1 и активности других транспортеров. Поэтому концентрация верапамила должна быть оптимизирована для каждой клеточной линии, а также рассмотреть новое поколение ингибиторов ABCB1, более специфичных для ABCB1, если внецелевые эффекты вызывают опасения. В качестве ещё одного критического шага вирусное титрирование следует проводить непосредственно на резистентной клетке, а не на родительских аналогах, поскольку инфективность и селективность часто различаются для устойчивых клеток.

Ещё один важный момент — определить подходящую продолжительность скрининга, поскольку химиорезистентные клетки часто растут медленнее, чем их родительские^{аналоги 26}. Чтобы учесть эту разницу, мы использовали расчёты уровня удвоения популяции (раздел 6 протокола), чтобы оценить, когда контрольная и лечебная группы достигли желаемого порога PDL. Поэтому скрининги могут быть прекращаются в разные дни, что позволяет сопоставимо удвоить популяцию и обеспечивает более безопасную интерпретацию эффектов sgRNA в группе лечения.

Подготовка к библиотеке ПЦР имеет большое значение для точности идентификации последующих ударов. Смещение, вызванное низким входом gDNA и увеличением циклов ПЦР, может привести к амплификации некоторых последовательностей sgRNA, вызывая ложноположительные обогащения или истощение. Для снижения этой проблемы мы рекомендуем использовать максимально возможное количество gDNA, соблюдать показатели циклов ПЦР, предлагаемые этим протоколом, и проводить параллельные реакции с пулом перед секвенированием. По возможности охват библиотек не должен опускаться ниже рекомендуемых порогов (>300× охват) для обеспечения надёжного обнаружения истощённых sgRNA, а не стохастических выпадков низкого количества sgRNA из-за низкого покрытия.

После секвенирования мы использовали рамочную структуру анализа MAGeCK и провели несколько последующих анализов контроля качества и этапов интерпретации данных²⁴. Во-первых, анализ основных компонентов (PCA) был использован для оценки распределения и воспроизводимости биологических репликатов (данные не показаны, выход MAGeCK). В PCA ожидается репликационная кластеризация внутри каждой руки; Однако более высокая вариабельность в лечебной руке является распространённой чертой скринингов на химиорезистентность, поскольку препарат может вызывать стохастические изменения. Если положительные и отрицательные контрольные элементы ведут себя как ожидается в каждой группе, эта вариабельность не мешает выявлению истинноположительных попаданий. Далее была применена нормализация считывания на миллион (RPM) уровней sgRNA на начальных и последних временных точках для оценки того, истощены ли sgRNA, нацеленные на существенные гены, как^{ожидалось 14}. Впоследствии медианная нормализация использовалась для агрегирования эффектов на уровне sgRNA, что позволило выявить истощение на уровне^{генов 24}. Показатели истощения на уровне генов визуализировались с помощью графиков водопадов, которые ранжируют гены от наиболее истощённых к обогащённым. Изменения числа копий и полиплоидия, возникающие из-за длительного воздействия лекарств, могут запутать результаты скрининга из-за неэффективного или чрезмерного сечения Cas9²⁷. Хотя EPIKOL нацелена на регуляторы хроматина, которые обычно не подвержены амплификациям, вызванным таксолом, мы рекомендуем оценить состояние плоидности и изменения количества копий в резистентных клетках перед скринингом. Если подозревают изменения номера копирования, во время анализа MAGeCK могут применяться инструменты вычислительной коррекции, такие как CRISPRcleanR или CERES.

В скринингах с участием двух экспериментальных групп, контрольной и лечебной групп, требуются различные сравнения для правильной интерпретации эффективности скрининга и биологических^{зависимостей 17}. Сравнения от начала до конца подходят для оценки эффективности скрининга, включая ожидаемое поведение ключевых генов и нетаргетируемых контрольных групп. Сравнение конечной точки контрольной группы (DMSO) с начальной временной точкой позволяет определить гены, необходимые для роста и приспособленности резистентных клеток при отсутствии давления лекарств. В отличие от этого, сравнение двух конечных образцов — медикаментозно обработанных (Taxol) и контрольных (DMSO) — выявляет конкретные гены, необходимые для устойчивости к препарату, а не общую приспособленность. Следует отметить, что прямое сравнение двух конечных образцов приводит к искажённому распределению основных генных контролей, поскольку они необходимы для выживания в обеих группах. Альтернативным методом визуализации может быть график вулкана, который отображает лог2-кратные изменения вместе со значениями значимости, позволяя идентифицировать значительно истощённые гены. После идентификации кандидатов-генов полезны нормализованные подсчета sgRNA и графики визуализации для выбора наиболее эффективных sgRNA для последующих валидационных тестов. Для скрининга EPIKOL мы рекомендуем отдавать приоритет кандидатным генам, поддерживаемым согласованным поведением как минимум 6 из 10 sgRNA, так как это повышает уверенность в генетических эффектах.

Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол проведения скрининга EPIKOL на таксорезистентных клеточных линиях с повышенным уровнем ABCB1 и проявлением MDR-фенотипа. Этот протокол широко применим к любой химиорезистентной модели, демонстрирующей перекрёстную устойчивость к пуромицину или другим селективным антибиотикам, что позволяет проводить скрининг CRISPR в этих клетках. Практические рекомендации по наиболее распространённым техническим трудностям, встречающимся на всех этапах протокола, приведены в Дополнительной таблице 1.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 мм плита	Corning	353003	Культура клеток
Фильтр 45 µм	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Культура клеток
6-лунковый планшет	Corning	3506	Культура клеток
96-лунковые чёрные прозрачные пластинки с плоским дном	Sigma-Aldrich	CLS356259	Для CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
Бластицидин	Thermo Fisher	A1113903	Для селекции
Люминесцентный анализ вирулентности клеток CellTiter-Glo	CellTiter-Glo, Promega	G7570	Для CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
DMEM	Gibco		Культура клеток
ДМСО	PanReac AppliChem	A3672,0050	Культура клеток
FBS	Gibco	16140071	Культура клеток
Смесь питательных веществ Ham's F12	Gibco	11765054	Культура клеток
Клетки HEK293T			Вежливый подарок от Robert Weinberg (MIT, Бостон, США)
ГЕПЕС	Thermo Fisher	15630080	Культура клеток
Гидрокортизон	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Культура клеток
Инсулин	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Культура клеток
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Для создания стабильной клеточной линии Cas9
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	Основа для клонирования gRNA
Комплект для извлечения геномной ДНК MN NucleoSpin tissue	Macherey-Nagel	740952.5	Для извлечения геномной ДНК
PBS	Gibco	10010023	Культура клеток
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140122	Культура клеток
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	Основа для клонирования gRNA
Полиэтиленгликоль (ПЭГ)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	Для концентрации лентивируса
Полиэтиленимины, линейные (ПЭИ)	Sigma-Aldrich	765090-1G	Для производства лентивируса
Сульфат протамина (ПС)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	Для инфицирования лентивирусом
psPAX2	Addgene	# 12260	Для производства лентивируса
Пуромисин	Thermo Fisher	A1113803	Для селекции
Адгезивные клетки SUM159PT			Вежливый подарок от Robert Weinberg (MIT, Бостон, США)
Таксол	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	Для создания и поддержания рес клеток
Трипсин-ЭДТА (0,05%)	Gibco	25300054	Культура клеток
Верапамил	Selleck Chemicals	S4202	Для селекции
VSV-G	Addgene	# 8454	Для производства лентивируса